Zweidimensionale Auftrennung yon Proteinen durch Kombination der DLinnschicht-Gelfiltration (DG F) mit der Diinnschicht-iso-elektrischen Fokussierung (D I E F)

Two-Dimensional Separation of Proteins by Combination of Thin-Layer Gel Filtration With Thin-Layer Isoelectric Focussing

S~paration bi-directionnelle de prot~ines sur couche mince par combinaison d'une chromatographie de permeation sur gel et d'une 61ectrophor~se bas~e sur la focalisation iso~lectrique

F. Drawert / W. M~ilter Institut fiJr Chemisch-technische Analyse und chemische Lebensmitteltechnologie der Technischen Universit~it Mfinchen, D-8050 F reising-Weihenstephan

Summary: Various proteins were separated according to their molecular weights and to their isoetectric properties by means of two-dimensional chromatography, i.e. by thin-layer gel f'dtration combined with thin-layer isoelectric focussing.

With Sephadex G 200 as the layer material, good agree- ment was found between the migration paths of the individual proteins and the logarithms of their molecular weights, up to a molecular weight of approx. 250,000.

Zusammenfassung: Verschiedene Proteine wurden mit Hilfe einer zweidirnensionalen Chromatographie, der Diinnschicht-Gelfiltration (DGF) in Kombination mit der Dimnschicht-isoelektrischen Fokussienmg (DIEF), nach Molekulargewicht mad isoelektrischen Eigenschaften getrennt. Es ergab sich bei Verwendmag yon Sephadex G 200 eine gute tYoereinstimmmag der Wanderungsstrecken der ein- zelnen Proteine mit dem Logarithrnus ihres Molekularge- wichts bis zu einem MG yon ca. 250.000.

R6sum6: Diverses prot6ines diff6rentes ont 6t6 s6par6es en fonction de leurs poids mol6culaires et de leurs pro- pri6t6es iso61ectriques/l l'aide d'une technique d'analyse bidirectionnelle sur couche mince de gel soit une chro- matographie de perm6ation sur gel combin6e avec une 61ectrophor~se bas6e sur la focalisation iso61ectrique.

En utilisant le S6phadex G 200, on a trouv6 qu'il existait une bonne concordance entre le d6placement des diverses prot6ines individuelles et le logarithme de leur poids mol~culaire et ceci jusqu'~ un poids mol6culaire d'environ 250.O00.

Einleitung

Ftir die Trennung yon Makromolekiilen, insbesondere yon Proteinen, erlangen verschiedene neuere Trennme- thoden wachsende Bedeutung, z.B. die Dtinnschicht- Gel/titration, die Disk-Elektrophorese und die ha letzter Zeit entwickelte Diinnschicht'is~ Fokussierung.

Die Diinnschicht-Gdf'dtration (DGF) trermt die Proteine mit Hilfe eines Molekularsiebeffektes nach ihrer Molektil- gr6t~e und -gestalt. Die Disk-Elektrophorese kombiniert diesen Molekularsiebeffekt mit einem Konzentrierungs- effekt mad der elektrophoretischen Beweglichkeit der Proteine. Sie zeichnet sich durch hervorragende Trenn- sch~rfe auf kttrzester Wegstrecke aus.

Die Diinnschicht-isoelektdsehe Fokussiemng schlieNich erm6glicht es, die Proteine nach ihren Ladungseigenschaf- ten mittels ehaer physikalisch-chemischen Konstanten, ihrem isoelektrischen Punkt zu charakterisieren. Die Disk-Elektrophorese wurde ausfdarlich yon Maurer [ 1] beschrieben. Stellvertretend Far die zahlreichen Ver6ffent- lichmagen fiber die DGF werden hier die Arbeiten yon Radola [2, 3] mad Jaworek [4] genannt. Ober die DIEF erschienen bisher zwei Ver6ffentlichungen yon Radola [5, 61.

Es lag nun nahe, die in der Papier- und Diinnschicht- Chrornatographie bekannte zweidimensionale Technik auf die DGF und DIEF anzuwenden. So ist zur Trennung yon Proteinen schon die Gel-Chromatographie in Verbin- dung mit der freien Elektrophorese [7, 8, 9] bekannt. Die einfache und rasche Trennung der Proteine aufgrund ihres Molekulargewichts mit Hilfe der DGF (I. Dimension) und die nachfolgende weitere Auftrennung mittels ihrer iso- elektrischen Punkte mit der DIEF (II. Dimension), die ebenfaUs kurze Trennzeiten gestattet, iiberdies eine her- vorragende Trennsch~irfe aufweist und der Disk-Elektro- phorese gleichkommt, shad Gegenstand dieser Mitteilung.

Material und Methoden

Material und Ge~te

Proteine: Cytochrom C MG = 13 000, Ovalbumin MG = 45 000, Aldolase MG = 147 000, Katalase MG = 230 000 (Protein-Eichsatz der Fa. Boehringer Mannheim), Myo- globin aus Pferdeherz 2 x cryst. MG = 17 800, Ferritin aus Pferdemilz 2 x cryst. MG = 465 000 (Fa. Fluka AG, Buchs/Schweiz).

Chromatographia 4, 1971 Originals 23

Diinnsehieht-Gelfiltration: Chromat ogr aphie-Au sriistung der Fa. Boehringer Mannheim.

Isoelektrisehe Fokussierung: Elektrophoresekammer der Fa. Desaga, Heidelberg.

Kfihlung: Kiiltethermostat Type K2 RD, Met~geriitewerk Lauda.

pH-Messungen: pH-Meter der Fa. Knick, Berlin mit einer Ingold-Einstabmeflkette mit Flachmembrane LOT 403-30-M8. Sephadex G 200 ,,superfine" der Fa. Deutsche Pharmacia, Frankfurt. Ampholine(~ Triigerampholyte pH-Bereich 3-10 fiber Fa. Colora Met~technik, Lorch.

Diirmschicht-GelFdtration (DGF)

Herstellung der Sclfiehten

4 g Sephadex G 200 ,,superfine" werden in 100 ml 1%iger Ampholytel6sung pH 3--10 aufgeschliimmt und zur Quel. lung mindestens 96 Std. im Kfihlschrank bei ca. + 4 ~ stehen gelassen. FOr die Beschichtung der Glasplatte 20 x 20 cm eignet sich gut das Streichger~it der Fa. Boehringer; die Schichtdicke betriigt 0,8 mm (die ange- gebene Menge reicht fiir ca. 3 Platten 20 x 20 cm). Die Konsistenz des Gels soil so beschaffen sein, dal~ die Schicht beim Ausstreichen nicht unterbrochen wird und das Gel einen wenig fliet~baren Brei bildet. Dies ist bei Einhaltung der angegebenen Mengen meist der Fall. Ist das Gel zu fest, wird mit 1%iger AmpholytelOsung verdtimtt. Bei zu dfinn- fliissigem Gel kann die Suspension mit Hilfe eines Vakuums (Wasserstrahlpumpe) unter gleichzeitigem, leichtem Er- w~men eingedickt werden (Saugflasche).

Die Platte wird so lange an der Luft liegen gelassen, bis die Oberfl~che der Schicht ihren ant'~glich starken Glanz ver- liert und nur noch ein schwach glgnzendes Aussehen be- sitzt. In Chromatographierichtung wird an den beiden Sei- ten der Platte die Schicht in einer Breite yon ca. 5 mm vom Rand, am besten mit einer Rasierklinge, entfernt.

Auftragen der Substanzen

Ca. 3 cm vom Rand werden etwa in der Mitte der Platte 5 #1 der Testl6sung punktf6rmig aufgetragen. Die 1%ige Ampholytel6sung enthielt die Proteine in einer Konzen- tration yon jeweils 2 %. Nach dem Auftragen wird die StartlLrlie auf det Unterseite der Glasplatte mit einem Filzschreiber markiert.

Chromatographie

Unter Verwendung des Dtinnschicht-Chromatographiege- r~tes [4] yon Boehringer Marmheim wurde in einem Win- kel yon 25 ~ absteigend solange chromatographiert, bis das auf der Platte gut sichtbare Cytochrom (Leitprotein) eine Wanderungsstrecke yon 4--5 cm zurfickgelegt hatte. Als ein anderer Anhaltspunkt flit die Beendigung der Chromatographie gilt der Zeitpunkt, zu dem das Protein mit dem h6chsten MG - Ferritin - kurz vor dem unteren Plattenende angekommen ist.

Um Flie~mittel (1%ige Ampholytel6sung) zu sparen, kann man in den sog. Elutionsmitteltrog zur Volumen- verringerung 2 Glasstreifen steilen (18 cm lang, 0,7 cm breit, 2 cm hoch) und die nach der Chromatographie ver- bleibende Ampholytel6sung wieder verwenden. Die Chro- matographie dauert 3 -6 Std.

Diinnschicht-isoelektrische Fokussiemng (DIEF)

Elektrophorese

Nach der Gel-Chromatographie wird entlang der oberen und unteren Kante der Glasplatte die Gelschicht in einer Breite yon 1,5-2 cm entfemt und die Platte sofort in die Elektrophoresekammer gebracht. Die isoelektrische Fo- kussierung erfolgte irn Prinzip nach der yon Raclola [5, 6] beschriebenen Methode:

Die beiden Elektrodenkammem sind mit 0,2 m H2SO4 als Elektrolyt auf der anodischen und mit 0,4 m Athylen- diamin auf der kathodischen Seite gefiillt. Der Kontakt mit der Gelsckicht wird durch Papierbriicken hergestellt, wobei die Briicke, die auf der Platte aufliegt, in einem Dialysierschlauch steckt, der eine direkte Bertihrung der Elektrolyten mit dem Gel verhindert. Start dessen kann auch eine Folie arts Cellulose-Acetat verwendet werden. Der Kiihlblock der Elektrophoresekammer wird mit Was- set yon ca. 4 ~ (Ktiltethermostat) gekiihlt. Die Elektro- denspannung betrug konstant 15 V/cm urtd die Fokussie- rungsdauer 3-5 Std.

pH-Messung

Die pH-Messungen wurden am Rande der Gelschicht durchgeffihrt. Sie sollten nicht zu lange dauem, um ein Austrocknen der Gelschicht zu vermeiden. Die Met~stel- len markiert man mit einem Filzschreiber am Rand der Glasplatte.

Herstellung des Abklatsches

Ein ca. 19 x 19 cm grot~er Bogen Filterpapier (Whatmann No. 3) wird vom Plattenrand aus fiber die Schicht abge- rout. Nach einer Kontaktzeit yon 1 2 min ist die fliissige Phase vonder Gelschicht in das Papier eingedrungen. In dieser Zeit tibertr~t man die Startlinie und die pH-Mef~- stellen mit Bleistift auf das Papier. Der Abldatsch wird schneU getrocknet.

Anfarben der Proteine

Vor dem Anfgrben der Proteine mit Coomassie Brillant Blue R 250 (Serva, Heidelberg) mtissen die Ampholyte ausgewaschen werden, da sie ebenfalls eine Farbreaktion eingehen. Hierffir eignen sich gut 20 x 20 cm groge Plexi- glasschalen (Haushaltsware).

Sie werden durch Einlegen des Abklatschefin 20 %ige Sulfosalicyls~iure fiber Nacht ausgewaschen (Denaturierung tier Proteine). Diese Zeitdauer kann durch mehrmaliges Wechseln der Sulfosalicylsiiure auf ca. 1 Std. verktirzt werden.

Danach wird zweimal mit wenig Methanol : Eisessig = 9:1 nachgespiilt, das Papier an der Luft oder mit Hilfe eines

24 Ckromatographia 4, 1971 Originals

F6ns getrocknet und mit Coomassie Blue (0,3 % in

Methanol : Eisessig = 9:1) 10 min lang angef'firbt. Die tiber- schiissige Farbstoffl6sung wird kurz mit fliefiendem Lei- tungswasser herausgesptilt und der Abkla tsch mi t Methanol: Eisessig:Wasser = 5:1:5 solange entf~rbt, bis sich die Pro- teinflecke gegen den hellen Untergrund des Papiers scharf abheben. Bei 6fterem Wechsel der Entt 'arbel6sung dauert die Entfarbungszeit ca. 1 Std. Das Gemisch kann nach Filtration tiber Aktivkohle wieder verwendet werden.

Auswertung des Chromatogramms Bei der Verwendung von Sephadex G 200 bleibt das Gel im Gegensatz zu G 75 nicht vol lkommen auf der Glasplatte haften. Deshalb wird bei Anfertigung des Abklatsches ein Tell des Gels vom Papier aufgenommen und ftih/t spiiter zu einer leichten Verwaschung der Proteinbanden auf der dem Gel zugekehrten Seite. Auf der Riickseite des Papiers aber sind die Konturen der Flecke deutl ich zu sehen, so daft es sich empfiehlt , die Auswertung hier vorzunehmen.

Die Mitte der Flecken wird ausgemessen und die Wande- rungsstrecke der einzelnen Proteine auf die des Cytochroms C bezogen. Dos Verhiiltnis wird als Reyt-Wert ausgedri]ckt.

Wanderungsstrecke des Proteins

Rcyt - Wanderungsstrecke von Cytochrom C

Die Rcyt-Werte, aufgetragen gegen den Logarithmus des MG, ergeben eine Gerade.

Ergebnisse und Diskussion

Fig. 1 zeigt ein Chromatogramm, das durch die zweidi. mensionale Auftrennung erhalten wurde. In der 1. Rich- tung verlief die Diinnschicht-Gelfdtration (DGF), in der 2. Richtung die Diinnschicht-isoelektrische Fokussierung (DIEF). Myoglobin trennte sich hierbei in 2 Komponen- ten. Der nicht bezeichnete Fleck ist eine Verunreinigung des Ovalbumins mit einem stiirker yon diesem abweichen- den Molekulargewicht und isoelektrischem Punkt, wie in einem weiteren Fraktionierversuch mit einem engeren pH-Bereich yon 3 - 6 nachgewiesen werden konnte.

Die Reyt-Werte der einzelnen Proteine, aufgetragen iiber den Logarithmus der Molekulargewichte (Fig. 2) ergaben eine gute Obereinstimmung, wobei nur Ferri t in eine Aus- nahme bildete. Wiederholte Versuche brachten stets das gleiche Ergebnis. Bis zu einem MG yon 230 000 lagen die Rcyt-Werte auf einer Geraden; Ferr i t in blieb stets die einzige Ausnahme. Diese Beobachtung deckt sich mit der von Radola [3], der bei Verwendung yon Sephadex G 200 eine lineare Abhiingigkeit zwischen Wandertmgs- strecke und MG nur bis zu einem MG yon ca. 240 000

II DIEF

Start

La. tD C~

Ovolb

! I I I

Fig. 1 <o 47 5,~

�9 Two-dimensional separation of proteins

Myo Cyt

at Fer

6,7 7,7 8,4 p

I thin-layer chromatography, II thin-layer isoelectric focussing. Fer= Ferritin, Cat = Catalase, Aid = Aldolase, Ovalb = Ovalbumin, Myo = Myoglobin, Cyst = Cytochrom C, O = contamination of Ovalbumin.

�9 2-dimensionale Auftrennung yon Proteinen 1 Diinnschicht-Chromatographie, II Diinnschicht-isoelektrische Fokussierung. Fer = Ferritin, Cat = Catalase, Aid = Aldolase, Ovalb = Ovalbumin, Myo = Myoglobin, Cyst = Cytochrom C, O = Verunreinigung des Ovalbumins.

�9 S6paration bi-directionnelle de prot6ines 1 ehromatographie de perm6ation (gel) sur couehe mince (DGF), II 6lectrophor~se bas6e sur la focalisation iso61ectrique sur couche mince (DIEF). Fer= Ferritine, Cat = Catalase, Aid = Aldolase, Ovalb = Ovalbumine, Myo = Myoglobine, Cyst = Cytochrome C, O = impuret6 de l'Ovalbumine.

L~

3,O

2.5

2,0

1,5-

Fig. 2

5,

2+

I i ,

4,2 4,4 4,6 ,~,8 5.0 5.2 5fi Rcy t

Rcy t values versus logarithm of the molecular weight. 1 = Myo- globin, 2 = Ovalbumin, 3 = Aldolase, 4 = Catalase, 5 -- Ferritin.

Rcyt-Werte in Abhiingigkeit vom Logarithmus des Molekular- gewichts. 1 = Myoglobin, 2 = Ovalbumin, 3 = Aldolase, 4 = Catalase, 5 = Ferritin.

Valeurs Rcy ten fonction des logarithmes du poids mol6culaire. 1 = Myoglobine, 2 = Ovalbumine, 3 = Aldolase, 4 = Catalase, 5 = Ferritine.

Chromatographia 4, 1971 Originals 25

fand. Bei Versuchen mit Sephadex G 75, das auch haufig in der Gelfdtration Anwendung findet, kormte keine Line- arit~t zwischen Rcyt-Wert und MG beobaehtet werden.

Bei der Elektrofokussierung ist zu beachten, da6 der pH- Gradient keinen linearen Verlauf zeigt. Es wurden deshalb die pH-Messungen in Abstanden yon je 2 cm durchgefftihrt. Bei der Verwendung der Ampholyte pH 3 -10 konnte in der Schicht der Gradient nur bis zu einem pH yon ca. 9 gemessen werden, pH 10 lag schon unter dem Filterpa- pierstreifen, der zur KontakthersteUung zwischen Elektro- denkammer und Gel dient. Aus diesem Grund wurde die Elektrofokussienmg abgebrochen, wenn Cytochrom C kurz vor dem Rand dieses Papierstreifens angelangt war. Dadurch ergeben sich ftir die einzelnen Proteine nicht ihre ganz genauen isoelektrischen Punkte. Durch die Ver- wendung yon Myoglobin start Cytochrom C als Referenz- protein kann dieser Fehler ausgeschaltet werden.

Zur FeststeUung der genauen isoelektdschen Punkte wird das Arbeiten mit Ampholyten in einem engeren pH-Be- reich empfohlen. Es stehen hierf~ die pH-Bereiche 3 -6 , 5 - 8 und 7-10 zur Verftigung (LKB-Produkter AB Bromma 1, Schweden - deutsche Vertretung: Colora

Met~technik, Lorch). Dadurch gelingt eine weitere Auf- trennung einzelner Proteine in verschiedene Komponen- ten. So wurden z.B. ffir Katalase, das im pH-Bereich 3 -1 0 nur als einziger Fleck in Erscheinung tritt, im pH- Bereich 5 -8 4 Fraktionen gefunden. Eine andere M6glich. keit zur besseren Fraktionierung besteht in der Verwen- dung yon 20 x 40 cm Glasplatten.

Literatur

[1 ] Maurev, I-1. R., Disk-Elektrophorese. Verlag Walter de Gruyter & Co., Bezlin 1968.

[2] Radola, B. J., J. Chromatogr. 38, 61 (1968). [3] Radola, B. J., J. Chromatogr. 38, 78 (1968). [4] Jaworek, D., Chromatographia 7, 289 (1969). [5 ] Radola, B. Z, Biochim. Biophys. Acta 194, 335 (1969). [6 ] Radola, B. jr., Biochim. Biophys. Acta 200, 404 (1970). [7 ] Hanson, L. A., Johansson, B. G. und Rymo, L., Clin.

Chim. Acta 14, 391 (1966). [8 ] Hanson, L. A., Johansson, B. G. und Rymo, L., Protides

of the Biological Fluids 14,579 (1966). [9 ] Davis, S., Glynn, F. 1I. und Platt, 1-1. S., Clin. Chim. Acta

21,357 (1968).

Received: Nov. 9, 1970 Accepted: Nov. 23, 1970

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