Ação do hormônio tireoidiano e de seu receptor sobre o promotor do
fator de necrose tumoral alfa
Nome: Fellipe Erick Campos Orientadora: Angélica Amorin Amato
Eixo hipotálamo-hipófise-tireoide
Tireoide
Hipófise
T4 + T3
Circulação
Tecidos
Hipotálamo
Tecidos
• Desenvolvimento• Homeostase• Proliferação e diferenciação celular
Efeitos fisiológicos do hormônio tireoidiano
SNC
Temperatura corporal
Consumo de oxigênio
Frequência cardíaca
Metabolismo de nutrientes
Sistema Nervoso Central
Atividade de outros hormônios
SNCFunção
reprodutiva
Histonas desacetiladas
Histonas acetiladas
Transcrição
- T3
+ T3
Mecanismo de ação do hormônio tireoidiano
HIPOTIREOIDISMO
• Bradicardia
• Pele ressecada e fria
• Hipoglicemia
• Hipercolesterolemia
• Redução da taxa metabólica basal
HIPERTIREOIDISMO
• Taquicardia
• Pele quente e úmida
• Hiperglicemia
• Hipocolesterolemia
• Aumento da taxa metabólica basal
Deficiência x excesso de hormônio tireoidiano
• Hipotireoidismo franco e aparelho cardiovascular
– frequência e contratilidade cardíaca
– expressão de genes que codificam enzimas que regulam
contratilidade e relaxamento cardíaco
• Thyroid hormone and the cardiovascular system: from theory to practice. J Clin Endocrinol Metab 1994; 78:1026.
• Biochemical basis of thyroid hormone action in the heart. Am J Med 1990; 88:626.
Hipotireoidismo x doença cardiovascular
• Subclinical hypothyroidism is an independent risk factor for atherosclerosis and myocardial infarction in elderly women: the Rotterdam Study. Ann Intern Med 2000: 132:270.
• Risk for ischemic heart disease and all-cause mortality in subclinical hypothyroidism. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89: 3365.
• Subclinical hypothyrodism is associated with a low-grade inflammation, increased triglyceride levels and predicts cardiovascular disease in males below 50 years. Clin Endocrinol (Oxf) 2004; 61:232.
• Impaired endothelium-dependent vasodilation in subclinical hypothyroidism: beneficial effect of levothyroxine therapy. J Clin Endocrinol Metab 2003; 88:3731
• Hipotireoidismo subclínico e aparelho cardiovascular
– incidência de doença aterosclerótica
– mortalidade cardiovascular
Hipotireoidismo x doença cardiovascular
• resistência vascular periférica piora de hipertensão arterial
sistêmica
• Hipercolesterolemia
• Hiperhomocisteinemia
Doença cardiovascular aterosclerótica x inflamação sistêmica
O hormônio tireoidiano e seu receptor poderiam influenciar o processo inflamatório?
Por que o hipotireoidismo aumenta o risco de doença cardiovascular?
Há outras condições que compartilham
alterações do eixo HHT e alterações
inflamatórias?
Síndrome do T3 baixo
• Função tireoidiana em doenças não tireoidianas– T3– TSH normal ou baixo
• Correlação T3 e marcadores inflamatórios
• Association between serum interleukin-6 and serum 3,5,3’-triiodothyronine in nonthyroidal illness. J Clin Endocrinol Metab 1993;77(6):1695–9.
• Relationship of the increased serum interleukin-6 concentration to changes of thyroid function in nonthyroidal illness. J Endocrinol Invest 1994;17:269–74.
• Role of cytokines in the pathogenesis of the euthyroid sick syndrome. Eur J Endocrinol 1998; 138:603–14.• Relating circulating thyroid hormone concentrations to serum interleukins-6 and -10 in association with
non-thyroidal illnesses including chronic renal insufficiency. BMC Endocr Disord 2008;8:1.
Insuficiência cardíaca
• Correlação negativa T3 x IL-6, TNF- e proteína C reativa
Controle T3L > 2 T3L < 2
TNFa (pg/mL)
T3L
(pg
/mL)
P < 0,05, r = -0,14
• Relationship between triiodothyronine and proinflammatory cytokines in chronic heart failure. Biomedicine & Pharmacotherapy 2010; 64:165-169.
Doença renal crônica
• Função tireoidiana na doença renal crônica
– T3
– TSH normal, T3 reverso normal
• Correlação T3 x marcadores inflamatórios (IL-6, TFN-alfa)e sobrevida
• Clinical and biochemical implications of low thyroid hormone levels (total and free forms) in euthyroid patients with chronic kidney disease. J Intern Med 2007; 262:690–701.
• Low triiodothyronine: a new facet of inflammation in end-stage renal disease. J Am Soc Nephrol 2005; 16: 2789–2795.
• Low triiodothyronine and survival in end-stage renal disease. Kidney Int 2006; 70:523–528.
• Subclinical hypothyroidism is linked to micro-inflammation and predicts death in continuous ambulatory peritoneal dialysis. Nephrol Dial Transplant 2007; 22:538–544.
Hormônio tireoidiano x inflamação
T3 Inflamação
Relação causa – efeito?
Direcionalidade?
Receptores Nucleares
• O que são?
– Uma superfamília 48 genes 75 proteínas
– São complexos de sinalização que atuam de várias maneiras, modulando a ativação e a repressão de sinais.
Ligação ao DNA
Ligante
Transativação
Ligação ao ligante
A/B C D E F
Domínio amino - terminal
Dobradiça (Hinge)
Domínio carboxi - terminal
AF - 1 DBD LBD
Histonas desacetiladas
Histonas acetiladas
Transcrição
- T3
+ T3
Mecanismo de ação do hormônio tireoidiano
Modelo de estudo
• Fator de necrose tumoral alfa (TNF-)
Macrófagos e monócitos
Adipócitos, células mesangiais
Receptor de membrana
Inflamação sistêmica
Indução de apoptose e inibição de
tumorigênese
Inibição da replicação viral
Doenças humanas
Resistência insulínica, síndrome metabólica, doença cardiovascular aterosclerótica
Objetivo
• Objetivo Geral: – Estudar o efeito do T3 e de seu receptor sobre a atividade
transcricional no promotor do gene do TNF-α e esclarecer os mecanismos moleculares envolvidos na regulação desse gene.
• Objetivos Específicos:– Estudar o efeito do T3 na regulação da atividade transcricional do receptor do hormônio
tireoidiano no promotor do gene do TNFα.
– Estudar o efeito das diferentes isoformas de TR (TRα e TRβ).– Avaliar a importância da interação direta de TR com o promotor do
TNFα.– Avaliar o efeito do T3 na síntese de proteína TNFα.
Construções de plasmídeos repórteres contendo promotor do TNF (inteiro ou fragmentos)
-125LUC
-82
TNF RE
LUC
-1044
(-125/-82) 3X
+93
LUC
TK LUC
0
5
10
15
20
Veículo VeículoT3 100 nM T3 100 nM
TR TR
*
Tax
a d
e at
ivaç
ão
Receptor 1 mcg + (-1044)TNF-Luc 4 mcg
0
25
50
75
100
125
150
175
vetor vazio
TR alfa
TR beta
LBDTR beta
T3 100 mM + + + +- - - -
a
a
bb
a
a
c
a
Tax
a d
e a
tiv
aç
ão
Células U937
TR e (-1044) TNF-Luc
LUC
-1044 +93
Transfecção
• O que é?– Introdução de moléculas exógenas em células – DNA plasmidial
• Em geral, a transfecção é seguida pela expressão de um ou mais genes presentes no DNA introduzido– Ensaio de gene repórter
• Métodos– Precipitação do fosfato de cálcio– Lipossomos– Eletroporação
Ensaio Gene Repórter
• Pra que serve o ensaio?– Para estudar a expressão dos genes – Avaliando o efeito de uma seqüência regulatória de um determinado
gene
• O que podemos realizar com o ensaio?– Delimitar os elementos regulatórios– Avaliar os efeitos de agentes hormonais– Estudar impactos em mutações gênicas
Procedimento
Processos: Lavagem (PBS 1x); Tripsina (0,5%);DMEN inibir a Tripsina
Centrifugar: 5 min a 2000 rpm.
Procedimento
Pellet: célulasSobrenadante: meio
de cultura
1. Suspensão das células em solução tampão(PBS, cálcio, glicose)
Mistura da suspensão de células ao DNA plasmidial
Transferência da suspensão de células + DNA plasmidial para cuvetas de 0,4 cm
Eletroporação
DNA plasmidialTR
TRE-luciferase
+ 500 L suspensão de células
(10 x 106 células)
500 L /cuveta(10 x 106 células)
950 F e 0,3 kV
Ressuspensão das células eletroporadas em meio de cultura
Distribuição da suspensão de células em placas de 12 poços e tratamentos
1 mL/poço
Veículo T3 10-
5MT3 10-
6MT3 10-
7M
Avaliação da expressão do gene repórter
37oC e 5% CO2 24h
10 μL do lisado celular +
10 μL do substrato da enzima luciferase
Luminômetro
LUC
-1044 +93
Células U-937
Transfecção TRb e (-1044)TNFLuc 1:2
0
20
40
60
80
100
120
Veículo
TR (g)+ T3 100 nM
0,5 1,0 2,0 4,0 8,0
*
*** *
* p < 0,001 vs veículo
Ta
xa
de
ati
vaç
ão
x v
eíc
ulo
(1
00
%)
LUC
-1044 +93
Células U-937
Células U-937
-125 LUC-82
TNF RE
LUC-1044
(-125/-82) 3X
+93
LUC
TK LUC
0
20
40
60
80
100
120
TR e -125 TNFLuc (1:2)
Veículo
T3 100 nM
+ + +
+ + +
pCMX
TR
TR*
*T
axa
de
ativ
ação
Transfecção: TR 1 mcg, TNFRE-Luc 2 mcg
0
25
50
75
100
TR alfaTR beta
Veículo VeículoT3 100 nM T3 100 nM
Tax
a d
e at
ivaç
ão
Células U-937
-125 LUC-82
TNF RE
LUC-1044
(-125/-82) 3X
+93
LUC
TK LUC
O TR interage diretamente com o promotor do TNF-?
• Ensaio de anisotropia de fluorescência
wtTNFRE(CACTACCGCTTCCTCCAGATGAGCTCATGGGTTTCTCCACCAAG)
DBD-TR+
Próximos passos…
• Ensaios de gene repórter com mutantes do TRb– Papel da dimerização na repressão do promotor do TNFa: L422R– Papel da superfície de interação com correpressores na repressão do
promotor do TNFa: G345R e F451X.
• Avaliação da expressão do TNFa em resposta ao tratamento com T3– Cultura de células: células mesangiais humanas
• Interação TR e promotor do TNFa in vitro (gel shift)
L422R (Mutante do TR beta – Leucina 422 trocada por uma
Arginina) – diminuição da capacidade de dimerização
G345R (Mutante no domínio de Ligação ao Ligante – LBD –
Glicina 355 trocada por uma Arginina) – perda da afinidade
do TR ao T3, não afetando ligação de dímeros ao TREs.
F451X (Mutante TR beta – 10 ultimos aa apartir da
Fenilalanina 451, foram deletados – Hélice 12 foi
eliminado, superfície de ligação ao correpressor foi exposta. )
Obrigado!!!