UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO - MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Martina Stojković
ANTIMIKROBNA AKTIVNOST METANOLNIH, ETIL ACETATNIH, ACETONSKIH I VODENIH EKSTRAKATA
ODABRANIH VRSTA RODA ERYNGIUM
MASTER RAD
Niš, 2015
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO - MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Antimikrobna aktivnost metanolnih, etil acetatnih, acetonskih i vodenih ekstrakata odabranih vrsta roda
Eryngium
MASTER RAD
Kandidat: Mentor:
Martina Stojković 81 dr Zorica Stojanović-Radić
Niš, 2015
UNIVERSITY OF NIŠ
FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS
DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
The antimicrobial activity of methanol, ethyl acetate, acetone and water extracts of the selected Eryngium species
MASTER THESIS
Candidate: Mentor:
Martina Stojković 81 PhD Zorica Stojanović-Radić
Niš, 2015
ZAHVALNICA
Nasrdačnije se zahvaljujem svojoj mentorki dr Zorici Stojanović-Radić
na ukazanom poverenju, pomoći i
sugestijama tokom laboratorijskih israživanja i izradi ovog rada.
Posebnu zahvalnost iskazala bih svojoj porodici koja mi je pružila nesebičnu
ljubav, podršku i razumevanje tokom studiranja.
Hvala.
BIOGRAFIJA
Martina Stojković rođena je 21. juna 1990. u Nišu. Osnovnu školu “Vuk
Karadžić” u Pukovcu završila je 2005. godine. Iste godine upisuje Medicinsku
školu “dr Milenko Hadžić” u Nišu, smer laboratorijski tehničar. Nakon završetka
srednje škole, 2009. godine upisuje osnovne akademske studije na Prirodno-
matematičkom fakultetu Univerziteta u Nišu, na Departmanu za biologiju i
ekologiju. Osnovne akademske studije završava 2012. godine sa diplomom
osnovnih studija i zvanjem ,,biolog“. Iste godine upisuje master akademske studije
na Departmanu za biologiju i ekologiju Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu,
smer Biologija.
Sažetak
U ovom radu ispitana je antimikrobna aktivnost metanolnih, etil acetatnih,
acetonskih i vodenih ekstrakata vrste Eryngium campestre, Eryngium palmatum,
Eryngium srebicum i Eryngium amethystinum u odnosu na osam vrsta bakterija i
jednu vrstu gljiva. Testiran spektar mikoorganizama obuhvatao je Gram pozitivne
bakterijske vrste Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Streptococcus pyogenes; Gram negativne bakterije Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, dok je jedina
testirana fugalna vrsta bila kvasac Candida albicans. Mikrodilucionom metodom
određena je minimalna inhibitorna koncentracija (MIK). Rezultati su ukazali na
značajnu antimikrobnu aktivnost testiranih ekstrakata koja se kretala u opsegu
koncentracija 0.004-20.00 mg/ml, pri čemu su najveću inhibitornu aktivnost
pokazali etil acetatni ekstrakt Eryngium palmatum i acetonski ekstrakt vrste
Eryngium campestre. U odnosu na ostale ispitivane ekstrakte, uočen je veoma
značajan inhibitorni efekat svih ekstrakata Eryngium campestre na testiran kvasac.
Ključne reči: antimikrobna aktivnost, biljni ekstrakti, Eryngium campestre,
Eryngium palmatum, Eryngium serbicum, Erygium amethystinum
Abstract
In this study antimicrobial activity of methanol, ethyl acetate, acetone and aqueous
extracts of the species Eryngium campestre, Eryngium palmatum, Eryngium
srebicum and Eryngium amethystinum was tested against eight bacterial and one
fungal species. Tested spectrum of microorganisms included the Gram positive
bacterial species Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Streptococcus pyogenes; Gram negative bacteria Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, while yeast
Candida albicans represented the only tested fungal species. Minimum inhibitory
concentration (MIC) was determined using broth microdilution method. Results
showed significant antimicrobial activity of the tested extracts which ranged 0.004-
20.00 mg/ml, where ethyl acetate extract of Eryngium palmatum and acetone
extract of Eryngium campestre exhibited the highest inhibitory activities. In
comparison to the other tested extracts, there was a very significant inhibitory
effect of all four Eryngium campestre extracts against the tested yeast species.
Key words: antimicrobial activity, plant extracts, Eryngium campestre,
Eryngium palmatum, Eryngium serbicum, Erygium amethystinum
SADRŽAJ
1. UVOD ................................................................................................. 1
1.1. Opšte karakteristike familije Apiaceae .......................................... 4
1.2. Opšte karakteristike roda Eryngium L. .......................................... 5
1.2.1. Eryngium campestre L. – poljski kotrljan ................................... 6
1.2.2. Eryngium amethystinum L. – plavi kotrljan ................................ 7
1.2.3. Eryngium palmatum Pančić & Vis– palmolisni kotrljan ............ 8
1.2.4. Eryngium serbicum Pančić – srpski kotrljan .............................. 9
1.3. Lekovita svojstva vrsta roda Eryngium ....................................... 10
1.3.1. Hemijski sastav vrsta roda Eryngium ....................................... 12
1.3.2. Dosadašnja istraživanja bioloških aktivnosti roda Eryngium ... 14
1.4. Opšte karakteristike ispitivanih mikroorganizama ...................... 17
2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA............................................................... 25
3. MATERIJAL I METODE ................................................................ 26
3.1. Priprema rastvora, podloga i reagenasa ....................................... 26
3.2. Biljni materijal ............................................................................. 27
3.2.1. Priprema biljnih ekstrakata ....................................................... 28
3.3. Bakterijske kulture ....................................................................... 28
3.4. Mikrodiluciona metoda ............................................................... 29
4. REZULTATI I DISKUSIJA ............................................................. 31
4.1. Prinos dobijenih ekstrakata .......................................................... 31
4.2. Antimikrobna aktivnost ekstrakata testiranih vrsta roda Eryngium 32
4.2.1. Antimikrobna aktivnost ekstrakata vrste Eryngium campestre 32
4.2.2. Antimikrobna aktivnost ekstrakata vrste Eryngium palmatum . 37
4.2.3. Antimikrobna aktivnost ekstrakata vrste Eryngium serbicum .. 40
4.2.4. Antimikrobna aktivnost ekstrakata vrste Eryngium amethystinum ....................................................................................... 43
5. ZAKLJUČAK ................................................................................... 50
6. LITERATURA ................................................................................. 52
MasterradMartinaStojković
1
1. UVOD
Kroz čitavu istoriju čovečanstva, biljke su uvek predstavljale najznačajniji
izvor lekovitih supstanci. Čovek je kroz svoj evolutivni razvoj istovremeno sticao i
razvijao veštine u nalaženju lekovitih biljaka, u njihovom gajenju i upotrebi pri
lečenju (Matović, 2000). Najstarija pisana svedočenja o lekovitim biljkama potiču
iz vremena od oko 6000 godina p.n.e., a danas je poznato oko 60 000 lekovitih i 18
000 aromatičnih biljaka (Kitić, 2010). Bez obzira na pojavu modernih lekova
četrdesetih godina prošlog veka, biljke su se održale i u sadašnjosti kao značajan
deo procesa lečenja ljudi. Ovo je posebno zastupljeno u zemljama poput Kine, za
koju se pretpostavlja da u okviru svoje medicinske prakse koristi preko 5000 biljnih
vrsta.
Danas je poznato i naučno dokazano da biljke poseduju antimikrobnu i
antioksidativnu aktivnost zahvaljujući sposobnosti produkcije sekundarnih
metabolita. Sekundarni metaboliti predstavljaju supstance sintetisane od strane
biljaka, specifične za dati tip ćelije, a koje nisu neophodne za osnovne metaboličke
procese ili reprodukciju biljaka. Uloga sekundarnih metabolita je višestruka i
značajna. Mnogi produkti sekundarnog metabolizma su bakteriocidi, repelentne
supstance ili su čak otrovi za štetočine i biljojede. Sekundarni metaboliti biljaka su
hiljadama godinama unazad bili poznati i korišćeni od strane ljudi, a kada su
različitim metodama izolovani iz biljke, nazivaju se biljni preparati. Oni se dalje u
zavisnosti od načina izolovanja (ekstrakcija, destilacija, ceđenje, prečišćavanje,
koncentrisanje ili fermentacija) i posledičnim fizičko hemijskim karakteristikama
mogu podeliti na sprašene droge, tinkture, ekstrakte, etarska ulja, masna ulja,
ceđene sokove i prerađene eksudate. Ovako dobijeni metaboliti biljaka se koriste
MasterradMartinaStojković
2
direktno ili nakon izvesnih hemijskih modifikacija kada predstavljaju početni
materijal za izradu lekova. Procenjeno je da oko 40% lekova vode poreklo od
biljnih sekundarnih metabolita. U najveću grupu biljnih metabolita spadaju brojni
polifenolni sastojci biljaka (jednostavni polifenoli, fenolne kiseline, lignani, hinoni,
flavonoidi, tanini, kumarini), terpenoidi i etarska ulja, alkaloidi, polipeptidi,
poliacetileni, masne kiseline pa čak i neki jednostavni šećeri ili organske kiseline.
Najčešće proučavani biljni preparati su etarska ulja i biljni ekstrakti koji se
smatraju najznačajnim izvorima biljnih biološki aktivnih materija. Za razliku od
sintetskih lekova koji uglavnom sadrže jednu, biljni ekstrakti i ulja sadrže veliki
broj aktivnih komponenti. Prirodna jedinjenja sadržana u ovim “biljnim koktelima”
mogu delovati sinergistički unutar ljudskog tela i mogu imati izvanredna terapijska
dejstva uz minimalne ili nikakve neželjene efekte (Huie, 2002). Etarska ulja mogu
biti izolovana iz različitih delova biljke, pri čemu se njihov hemijski sastav, a
samim tim i biološka aktivnost može značajno razlikovati u zavisnosti od dela
biljke iz kojih su dobijena. Istraživanja su pokazala da je specifični hemijski sastav
etarskih ulja odgovoran za lekovitost mnogih aromatičnih biljaka. Za razliku od
njih, lekovite biljke koje nisu aromatične ne sadrže aktivne supstance u etarskim
uljima, već su one ne/ravnomerno raspoređene u njihovim različitim delovima,
odakle se mogu izolovati različitim metodama. Najčešće primenjivana metoda je
metoda ekstrakcije različitim rastvaračima, kojima se zahvaljujući razlikama u
polarnosti izoluju različiti tipovi jedinjenja u svakoj zasebnoj ekstrakciji. Ovo dalje
omogućava određivanje grupe jedinjenja koje su odgovorne za ispitivanu aktivnost
na osnovu toga koji je ekstrakt pri testiranju ispoljio najveću efikasnost.
U okviru familije Apiaceae, koja predstavlja familiju bogatu aromatičnim
vrstama, vršena su mnoga ispitivanja kako hemijskog sastava, tako i same biološke
MasterradMartinaStojković
3
aktivnosti različitih etarskih ulja, ali i biljnih ekstrakata. Utvrđeno je da su
pripadnici ove familije značajni izvori antimikrobnih jedinjenja koji mogu biti
polazna tačka za pronalaženje novih, prirodnih i neškodljivih antibiotika koji bi
poslužili kao alternativa zvaničnoj antimikrobnoj terapiji. Pošto su dosadašnja
istraživanja bila fokusirana na dobro poznate začinske i lekovite biljke, dok se
manje poznatim rodovima bavio manji broj istraživanja, javlja se potreba za
ispitivanjem i ovih, pomalo zapostavljenih biljnih vrsta. Do sada je utvrđeno da se
u ekstraktima velikog broja vrsta roda Eryngium nalaze značajne bioaktivne
supstance i to terpenoidi, triterpenoidni saponozidi, kumarini, poliacetileni i
steroidi. Ovi ekstrakti su pokazali citotoksičnu, antibakterijsku, antifungalnu,
antiinflamatornu, antimalarijsku, antioksidativnu i antihiperglikemijsku aktivnost
(Wang et al., 2012).
Eryngium campestre, E. amethystinum, E. palmatum i E. serbicum pripadaju
relativno neispitanoj grupi biljaka i ima malo informacija o njihovom delovanju. U
ovom radu ispitana je antimikrobna aktivnost njihovih različitih ekstrakata na širok
spektar bakterijskih sojeva.
MasterradMartinaStojković
4
1.1. Opšte karakteristike familije Apiaceae
Familija Apiaceae u našem narodu je poznata kao familija štitonoša, zbog
karakterističnih tipova cvasti koje se nazivaju štitovi. U familiji Apiaceae
preovlađuju većinom zeljaste biljke, samo se mali broj vrsta razvija u obliku
grmlja, a vrlo retko se razvijaju drvenasti oblici. Štitonoše ili štitare mogu biti
jednogodišnje, dvogodišnje i višegodišnje zeljaste biljke. Imaju šuplje, rebrasto
stablo sa naizmeničnim listovima, ređe naspramnim. Liska je različito deljena,
najčešće perasto, retko cela (Eryngium, Bupleurum) ili usečena, koja pri osnovi
prelazi u lisni rukavac. Cvetovi su sitni, petočlani i aktinomorfni, grupisani u
štitastu cvast. Plod je šizokarpijum koji se posle sazrevanja cepa na dve orašice.
Građa ploda je bitna za sistematiku štitara.
Ova familija obuhvata 300 rodova sa oko 3.000 vrsta. Morfološki su
mezofite ili kserofite (npr. Eryngium). Štitonoše su vrlo bogate etarskim uljem ili
smolama, pa stoga porodica sadrži mnoštvo aromatičnih predstavnika.
Pripadnici ove familije se najčešće mogu naći u zemljama sa umerenom i
suptropskom klimom severne hemisfere. Flora Balkanskog poluostrva uključuje 82
roda i 334 vrsta ove familije, od kojih su 49 isključivo balkanski endemiti (Tadić,
2002). U Srbiji je familija Apiaceae pristna sa 53 roda i 138 vrsta (Nikolić, 1973).
Vrste ove familije najčešće se koriste u ishrani (šargarepa, celer, paškanat),
kao začini (peršun, mirođija, kim, korijander) i kao lekovite i ukrasne biljke. Ovoj
familiji takođe, pripadaju korovske i otrovne vrste, kao na primer kukuta (Conium
maculatum) (Jančić & Stojanović, 2004).
MasterradMartinaStojković
5
1.2. Opšte karakteristike roda Eryngium L.
Rod Eryngium je najveći rod iz familije Apiaceae. Obuhvаtа oko 250 vrstа
(Calvino et al., 2008). Vrste ovog roda su rasprostranjene nа severnoj i južnoj
hemisferi. Područje najvećeg diverziteta su Severna, Centralna i Južna Amerika. U
Srbiji rаste 5 vrstа (Nikolić, 1973).
Biljke ovog roda su jednogodišnje, dvogodišnje ili višegodišnje. Neke su
visoke do nekoliko cm, dok druge mogu da porastu i do 3 m. Listovi celi, prosto ili
perаsto deljeni. Cvetovi su nа vrlo krаtkim peteljkаmа ili sedeći u zbijenoj prostoj
štitаstoj cvаsti glаvičаstog oblikа. Plod je jajast, obаo, sа ljuspаmа ili brаdаvičаst
(Nikolić, 1973). Latinski naziv roda Eryngium potiče od grčke reči erum (odbrana)
čime se ukazuje na bodljikavost listova.
Vrste koje pripadaju ovom rodu sadrže acetilene, kumarine, flavonoide i
triterpenske saponine (Erdelmeier & Sticher, 1986). U etnomedicini raznih zemalja,
vrste roda Eryngium se koriste kao antispazmolitici, dijaforetici, ekspektoranti,
stimulansi, afrodizijaci i aromatici (Usta et al., 2014).
MasterradMartinaStojković
6
1.2.1. Eryngium campestre L. – poljski kotrljan
Višegodišnja, grmolika biljka, žućkastozelenkaste boje. Stablo je uspravno,
debelo i može da naraste do 1 m visine. Listovi su različito ili višestruko perasto
deljeni i bodljikavo nazubljeni. Cvetovi su grupisani u zelene glavičaste štitove,
ispod kojih stoje zrakasto rašireni i bodljikavi ovojni listići. Cveta od jula do
septembra. Mladi izdanci i prizemni listovi se koriste kao aromatično i ukusno
prolećno povrće, dok se koren koristi kao začin.
Tabela 1. Sistematika Eryngium
campestre L.
Rasprostranjen je širom Evrope, Severne Amerike i Severne Afrike. Biljka
raste na kamenitom i neplodnom tlu, uz šume i puteve. Sadrži saponozide, tanine,
fenolne kiseline, flavonoide, kumarine i etarsko ulje.
Carstvo Plantae
Razdeo Magnoliophyta
Klasa Magnoliopsida
Red Apiales
Rod Eryngium
Vrsta Eryngium campestre
Slika 1. Eryngium campestre L. (preuzeto sa http://www.apatita.com/herbario/)
MasterradMartinaStojković
7
1.2.2. Eryngium amethystinum L. – plavi kotrljan
Plavi kotrljan je višegodišnja biljka. Ima razgranato stablo, koje može da
naraste od 30 do 50 cm visine. Listovi su uski, duguljasti i završavaju se oštrim
vrhom, zbog čega su bodljikavi. Cvetovi su plavi, sakupljeni u glavičaste cvasti.
Cveta u julu i avgustu.
Tabela 2. Sistematika Eryngium
amethystinum L.
Rasprostranjen je na jugoistoku Evrope. Raste na suvom i kamenitom
području. Latinsko ime amethystinum odnosi se na sličnost biljke sa bojom
ametista, poludragog kamena ljubičaste boje.
Carstvo Plantae
Razdeo Magnoliophyta
Klasa Magnoliopsida
Red Apiales
Rod Eryngium
Vrsta Eryngium
amethystinum
Slika 2. Eryngium amethystinum L. (preuzeto sa
http://www.actaplantarum.org/floraitaliae/)
MasterradMartinaStojković
8
1.2.3. Eryngium palmatum Pančić & Vis– palmolisni kotrljan
Višegodišnja, endemska biljka, visine od 30 do 80 cm. Stablo je uspravno i
zeleno, sa 1-2 grane pri vrhu. Prizemni listovi su perasto deljeni na 5-7 jajasto
izduženih režnjeva, koji su na vrhu trodelni, nazubljeni i sa bodljama. Gornji listovi
su na stabljici na kraćim drškama, sa užim režnjevima, koji su nazubljeni sa
bodljama. Mladi cvetovi su bele boje, dok su stariji plavičaste.
Slika 3. Eryngium palmatum Pančić & Vis
(preuzeto sa http://luirig.altervista.org/pics/display.php?pos=14595)
Eryngium palmatum je endemit Balkanskog poluostrva, rasprostranjen u
Srbiji, Crnoj Gori, Bugarskoj, Makedoniji i Albaniji. Raste na suvim mestima i
šumama, ređe se javlja na travnjacima i kamenjarima.
MasterradMartinaStojković
9
1.2.4. Eryngium serbicum Pančić – srpski kotrljan
Višegodišnja, endemska biljka, visine 40-75 cm. Prizemni listovi se nalaze na
dugačkim drškama i perasto su deljeni na 5-7 dugih režnjeva. Listovi na stabljici
imaju kratke drške i perasto su usečeni na 5-7 bodljikavih listića. Gornji listovi su
sedeći i sitni. Cvetovi sakupljeni u glavičastu cvast, veličine do 1.5 cm. Mlada
biljka je zelene boje a kasnije je plavičasta.
Slika 4. Eryngium serbicum Pančić
(preuzeto sa http://www.hlasek.com/eryngium_serbicum_6542.html)
Eryngium serbicum je endemit centralnog dela Balkanskog poluostrva (Srbija
i Albanija). Raste na skeletnim zemljištima, na suvim i sunčanim kamenjarima i
kamenjarskim pašnjacima, na serpentinskoj podlozi i na rubovima svetlih bukovih
šuma i šikara.
MasterradMartinaStojković
10
1.3. Lekovita svojstva vrsta roda Eryngium
Mladi izdanci i prizemni listovi Eryngium campestre koji nisu bodljikavi,
upotrebljavaju se kao aromatično i ukusno povrće. Ukus mu je sličan mrkvi, ali
dosta je gorak i ljut. Nadzemni deo biljke i koren koriste se kao antitusik, diuretik,
stimulans i afrodizijak (Baytop, 1999). U narodnoj medicini ova biljka se koristi za
lečenje velikog kašlja, urinarnih infekcija, poremećene funkcije bubrega,
eliminaciju kamena i peska iz bubrega i za regulisanje rada prostate. Koren biljke
koristio se za ublažavanje menstrualnih problema i želudačnih bolesti, a poznat je i
kao antispazmotik, aromatik, dijaforetik, diuretik, ekspektorans i stimulans (Petkov,
1982). Preporučivan je i za lečenje plućnih bolesti, skorbuta i upala usne šupljine.
U Turskoj se vodeni ekstrakt E. campestre koristi kao lek protiv ujeda škorpiona.
Slične upotrebe E. campestre su pronađene u starim dokumentima iz srednjeg veka,
kada se koristio kod opekotina, bolova, hemoroida i polnih bolesti (Lev, 2002), kao
i u afrodizijačke svrhe. Naučna istraživanja potvrdila su da ova biljka ima
antinociceptivnu, antiinflamatornu i antimikrobnu aktivnost (Kupeli et al., 2006;
Usta et al., 2014).
U narodnoj medicini koren Eryngium amethystinum se koristi kao diuretik i
laksativ. Takođe se koristi u lečenju urinarnih infekcija, edema, acidoze i za
poboljšanje varenja (Valnet, 1977). U tradicionalnoj medicini koren ove biljke se
koristi kao dijaforetik i protiv celulita (Mazza, 2000).
Mladi korenovi i izdanci vrste E. maritimum L. koriste se u ishrani kao
povrće, dok se mladi listovi upotrebljavaju kao salata u severnoj Evropi i Grčkoj. U
Nemačkoj je ova vrsta zaštićena zbog opasnosti od istrebljenja. Kandirani koren
vrste E. maritimum, kao i vrste E. campestre L. koriste se u obliku tonika kao
afrodizijak pretežno u Engleskoj. Vrsta E. foetidum L. je bitna za Latinsku Ameriku
MasterradMartinaStojković
11
jer se koristi u kuhinji kao začin, a sve veću primenu ima i u jugoistočnoj Aziji.
Mladi listovi vrste E. creticum Lam. se koriste u ishrani kao povrće (De Guzman &
Siemonsma, 1999) dok se vrsta E. aquaticum L. ponekad sreće kao gajena.
Korenovi vrsta E. maritimum, E. creticum i E. foetidum koriste se u narodnoj
medicini kao diuretici i spazmolitici (Ping et al., 2012). Pojedine vrste ovog roda se
gaje kao ukrasne kao npr. E. caucasicum (Khoshbakht et al., 2007).
U Turskoj narodnoj medicini, razne vrste roda Eryngium se koriste u lečenju
mnogih bolesti. Koren se koristi protiv raznih inflamatornih poremećaja, edema,
urinarnih infekcija, upale, ujeda zmija ili škorpiona; koren i listovi za neplodnost, a
nadzemni deo za zarastanje rana (Sezik et al., 1997; Yesilada & Sezik, 2003).
Nadzemni delovi i koren E. planum se u narodnoj medicini koriste kao antitusik,
afrodizijak, diuretik i stimulans (Duke et al., 2002). U Južnoj Americi i Zapadnoj
Indiji E. foetidum je autohtona biljka koja se pretežno koristi u lečenju groznice,
prehlade, gripa, a takođe ima primenu i u ushrani (Duke, 2009). U Kini se E.
foetidum koristi u lečenju inflamatornih poremećaja (Benco, 1999). Ekstrakt lista
ove vrste deluje kao antikonvulzant, antiinflamatorno i ima analgetski efekat
(Simon & Singh, 1986; Saenz et al., 1998). U Argentini E. elegans Cham. &
Schltdl. se koristi kao diuretik (Goleniowski et al., 2006). Koren E. aquaticum se
koristi kao emetik, diuretik, protivotrov i u lečenju polnih bolesti (Moerman, 2009).
U Jordanu se E. creticum koristi u narodnoj medicini kao lek za ujed škorpiona u
ruralnim oblastima i kao hipoglikemični faktor (Jaghabir, 1991). U Iranu listovi
vrste E. caucasicum se koriste u medicini i prehrambenoj industriji (Khoshbakht et
al., 2006).
MasterradMartinaStojković
12
1.3.1. Hemijski sastav vrsta roda Eryngium
Vrste roda Eryngium sadrže terpenoide, triterpenoidne saponine (Kartal et al.,
2006), flavonoide (Hohmann et al., 1997; Glowniak et al., 2004), kumarine
(Erdlmeier, 1985), poliacetilene (Lam et al., 1992; Ayoub, 2006), fenolne kiseline
(Le Claire, 2005) i etarsko ulje (Ayoub et al., 2006; Wajs et al., 2006).
Etarska ulja su više ili manje složene smeše različitih mono-, seskviterpena i
fenilpropanskih jedinjenja (Kovačević, 2004). Na osnovu ranijih istraživanja
pokazano je da etarsko ulje vrste E. serbicum sadrži kao glavne komponente
germakren D (19.7%), β-elemen (10.0%) i spatulenol (6.9%), a E. palmatum
seskvicineol (21.3%), kariofilen-oksid (16.0%), spatulenol (16%), sabinen (5.5%)
(Capetanos et al., 2007). Glavna komponenta etarskog ulja nadzemnih delova
Eryngium amethystinum L. je seskviterpen β-kariofilen (19.7%), dok E. alpinum
sadrži seskviterpen β-kariofilen oksid (21.6%) (Dunkić et al., 2013). Seskviterpeni
su izolovani iz etarskog ulja nadzemnih delova E. maritimum (Darriet et al., 2012).
Gotovo sva ulja više ili manje intezivno sprečavaju razvoj mikroorganizama i tako
suzbijaju širenje infekcija u biljkama u kojima nastaju (Kovačević, 2004).
Terpenoidi predstavljaju grupu isparljivih jedinjenja u biljkama. Daju
specifičan miris biljkama. Dele na monoterpene i seskviterpene. Monoterpeni
pokazuju antibakterijsku, antifugalnu, sedativnu, antivirusnu, diuretičnu,
hipoglikemijsku, spazmolitičnu i antiinflamatornu aktivnost (Marin, 2003).
Identifikovani su i izolovani seskviterpeni kod vrste E. creticum i to iz
heksan/etarskog ekstrakta nadzemnih delova biljke (Ayoub et al., 2003) i etanolnog
ekstrakta semena vrste E. giganteum (Muckenstur et al., 2010).
MasterradMartinaStojković
13
Saponozidi su organska glikozidna jedinjenja koja su vrlo rasprostranjena u
biljnom svetu. Utvrđeno je da metanolni ekstrakt korena (Kartal et al., 2005; Kartal
et al., 2006) i nadzemnih delova biljke (Zhang et al., 2008) E. campestre sadrže
triterpenske saponine. Saponini su klasa komponenti odgovorna za antiinflamatorni
efekat ekstrakta iz korena E. campestre, kao i za biljne ekstrakte korena E.
maritinum, E. kotschii i E. creticum (Lisciani et al., 1984; Kupeli et al., 2006).
Smatra se da biljke sintetišu saponozide kao fitoaleksine, odnosno kao zaštitu od
različitih bakterijskih i gljivičnih infekcija.
Flavonoidi su polifenoli široko rasprostranjeni u biljnom svetu. Nalaze se u
svim biljnim organima, a najviše u kori voća i povrća. Capasso i saradnici (2005)
su potvrdili da ekstrakti biljaka sadrže fenolne kiseline, flavone, izoflavone,
flavanole, katehine, tokoferole, tanine, terpene i da pokazuju antineoplastična,
antiviralna, antiinflamatorna, antialergijska i antioksidativna svojstva. Hemijska
istraživanja metanolnog ekstrakta nadzemnih delova E. campestre L. potvrdila su
prisustvo jedanaest poznatih flavonoidnih glikozida (Hawas et al., 2013).
Metanolni ekstrakt korena E. palmatum sadrži katehin, epikatehin, hlorogensku,
ruzmarinsku i galnu kiselinu (Marčetić et al., 2013). Prisustvo hlorogenske kiseline
dokumentovano je i u listovima i cvetovima E. bourgatii (Cádiz-Gurrea et al.,
2013), listovima E. foetidinum (Mekhora et al., 2012), listovima i korenu E. planum
(Kikowska et al., 2012). Listovi E. alpinum sadrže flavonoide, kvercentin i
kempferol (Crowden, Harborne, Heywood, 1969). Astragalin, kempferol i
izokvercetin izolovani su iz nadzemnih delova E. maritimum (Hiller et al., 1981). Iz
nadzemnih delova E. octophyllum izolovan je rutin, dok je iz nadzemnih deova E.
macrocalyx izolovan kempferol (Ikramov et al., 1971). Listovi E. giganteum sadrže
izokvercetin i kempferol (Zarnack et al., 1979). Iz heksan/etarskog ekstrakta
MasterradMartinaStojković
14
nadzemnih delova E. yuccifolium identifikovani su poliacetileni (Ayoub et al.,
2006), dok su kod E. agavifolium izolovani iz etanolnog ekstrakta cele biljke.
Značajna uloga flavonoida i fenolnih kiselina je njihovo učešće u
odbrambenom mehanizmu biljke. Pokazano je da su flavonoidi značajni i efikasni
“hvatači” slobodnih radikala u biljnom tkivu i da poseduju jaka antioksidativna
svojstva. Veoma su važni u životu čoveka radi zaštite od kancera, kao i u prevenciji
koronarnih i drugih oboljenja (Marin, 2003).
Kumarini su veoma rasprostranjeni u prirodi. Lokalizovani su u svim
nadzemnim i podzemnim organima biljaka. Neki od njih inhibiraju, a neki
stimulišu rast biljaka. Imaju narkotičan i toksičan efekat (Lajšić & Grujić-Injac,
1998). Erdelmeier & Sticher (1985) su identifikovali kumarine iz korena E.
campestre. Tandon et al. (1995) su potvrdili da kumarini smanjuju permeabilnost
zidova kapilara i limfnih sudova i da se koriste kod inflamatornih procesa, kao i za
smanjenje eksudacija i edema. Neki kumarini deluju kao diuretici. Takođe
povećavaju broj melanocita i pospešuju pigmentaciju pa se koriste u terapiji vitiliga
i psorijaze.
1.3.2. Dosadašnja istraživanja bioloških aktivnosti roda Eryngium
U okviru familije Apiaceae, vršena su mnoga ispitivanja kako hemijskog
sastava, tako i same biološke aktivnosti različitih ekstrakata. Ovi ekstrakti su
pokazali citotoksičnu, antibakterijsku, antifungalnu, antiinflamatornu,
antimalarijsku, antioksidativnu i antihiperglikemijsku aktivnost (Wang et al.,
MasterradMartinaStojković
15
2012). U Jordanu se E. creticum koristi u narodnoj medicini kao lek za ujed
škorpiona u ruralnim oblastima i kao hipoglikemični faktor (Jaghabir, 1991).
Vodeni ekstrakti, sveže i sušeno korenje, kao i sveži listovi E. creticum daju 100%
inhibiciju hemolitičke aktivnosti zmija i škorpiona. Etanolni ekstrakti listova i
korena inhibiraju hemolitičku aktivnost otrova na eritrocite (Alkofahi, 1997).
Ekstrakti dobijeni iz korena i nadzemnog dela vrsta roda Eryngium
(Apiaceae) koriste se u svetu kao narodni lek za lečenje mnogih inflamatornih
bolesti. U Turskoj su ispitivani etanolni i vodeni ekstrakti dobijeni iz nadzemnog
dela i korena osam vrsta iz roda Eryngium (E. campestre, E. creticum, E. davisii, E.
falcatum, E. isauricum, E. kotschyi, E. maritimum i E. trisectum). Ispitivanje je
vršeno in vivo i utvrđena je njihova antiinflamatorna i antinociceptivna aktivnost.
Rezutati su pokazali da izuzev ekstrakata vrste E. falcatum, etanolni ekstrakti
nadzemnog dela i korena ostalih ispitivanih vrsta pokazuju antiinflamatornu
aktivnost (Kupeli et al., 2006). Hlorogenska i rozmarinska kiselina, fenolne
komponente za koje je već poznato da imaju antioksidativnu aktivnost, opisane su
kod mnogih vrsta iz roda Eryngium.
Isparljivi ekstrakti E. duriaei subsp. juresianum pokazali su antifungalnu
aktivnost sa MIK vrednostima od 0.16-0.32 μl/ml protiv nekoliko vrsta gljiva
(Trichophyton mentagrophytes, T. rubrum, Epidermophyton floccosum; T.
verrucosum, T. mentagrophytes var. interdigitale, Microsporum canis i M.
gypseum) (Carlos et al., 2011). Hloroformni i metanolni ekstrakti E. maritimum
pokazali su antimikrobnu aktinost protiv 12 bakterijskih sojeva i kvasca, pri čemu
je hloroformni ekstrakt bio aktivniji (Laetitia et al., 2008).
Antimikrobna aktivnost etanolnih ekstrakata lista i korena izolovanih iz tri
vrste roda Eryngium L. (E. planum, E. campestre, E. maritimum) poreklom iz
MasterradMartinaStojković
16
Poljske testirana je metodom serije razblaženja na dve Gram pozitivne bakterije
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 6633 i pet vrsta
gljiva. Ekstrakti su analizirani pomoću TLC (Thin Layer Chromatography –
tankoslojna hromatografija) metode čime je potvrđeno prisustvo fenolne kiseline,
triterpenoida, saponina, flavonoida i acetilena. Istraživanje je pokazalo da etanolni
ekstrakti inhibiraju rast Staphylococcus aureus kao i rast svih testiranih gljiva
(Thiem et al., 2010).
Za vrstu E. alpinum L. je dokazano da ekstrakt korena pokazuje snažniju
antioksidativnu aktivnost u odnosu na nadzemni deo iste biljke (le Claire et al.,
2005). Marčetić i saradnici (2013) su dokazali antimikrobnu aktivnost ekstrakta E.
palmatum na osam bakterijskih sojeva (Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Micrococcus luteus, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis,
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae) i jedan kvasac
(Candida albicans). Metanolni i hloroformni ekstrakt su pokazali antimikrobnu
aktivnost pri MIC vrednostima u opsegu 3.5-15.6 µg/ml. Najveća antimikrobna
aktivnost je dobijena sa metanolnim ekstraktom nadzemnih delova i to na M. luteus
(MIK = 3.5 µg/ml). Ovaj efekat je verovatno izražen zbog sadržaja flavonoida koji
su otkriveni u njegovom sastavu, a koji sačinjavaju kempferol, apigenin i njegovi
glikozidi. Kempferol i apigenin su dokazani i ranije kao antimikrobne supstance i
imaju više ciljnih mesta delovanja u mikrobnoj ćeliji (Marčetić et al., 2013).
Farmakološka aktivnost roda Eryngium zavisi uglavnom od visokog sadržaja
saponina, ali takođe važnu ulogu ima i prisustvo flavonoida, odnosno glikozida
kempferola i kvercetina, kao i fenolne kiseline. Istraživanja su pokazala da saponini
imaju antigljivičnu i antibakterijsku aktivnost (Sparg et al., 2004). Mnoge grupe
flavonoida kao i fenolne kiseline, uglavnom ruzmarinska kiselina imaju
MasterradMartinaStojković
17
antibakterijska svojstva (Petersen & Simmonds., 2003; Cushine & Lamb., 2005),
dok poliacetileni poseduju antibakterijska, antifungalna i antimikrobna svojstva
(Schinkovitz et al., 2008). Vodeni ekstrakti lista i cveta E. bourgatii Gouan
pokazuju antioksidativnu i antiinflamatornu aktivnost (Cadiz-Gurrea et al., 2013).
Etanolni ekstrakti raznih vrsta roda Eryngium imaju antiinflamatornu i
antinociceptivnu aktivnost (Kupeli et al., 2006).
1.4. Opšte karakteristike ispitivanih mikroorganizama
Bakterije su najzastupljenija grupa mikroorganizama u prirodi. One su
kosmopoliti, uglavnom saprofiti ili paraziti, ali ima i autotrofnih predstavnika.
Razlika u građi ćelijskog zida omogućava podelu svih bakterija na Gram
pozitivne i Gram negativne. Gram negativne bakterije imaju jedan sloj
lipopolisaharida koji pokriva njihov ćelijski zid i boje se crveno diferencijalnim
bojenjem po Gramu, dok Gram pozitivne bakterije nemaju taj sloj i boje se
ljubičasto. Zbog opisane razlike u građi i sastavu ćelijskog zida, Gram pozitivne i
Gram negativne bakterije razlikuju se i prema osetljivosti na antibiotike.
Antimikrobna aktivnost ekstrakata vrste roda Eryngium ispitana je na
patogenima koji pripadaju grupi Gram pozitivnih bakterija, Gram negativnih
bakterija, kao i grupi gljiva.
MasterradMartinaStojković
18
Enterococcus faecalis ATTC 19433
Enterococcus faecalis je nepokretna, Gram pozitivna, okrugla bakterija.
Može se javiti pojedinačno, u parovima ili u obliku kratkih lanaca. Ova vrsta je
prvo identifikovana kao Streptococcus faecalis zbog svog karakterističnog Strep D
specifičnog antigena u sastavu ćelijskog zida. Tek 1984. je klasifikovan kao
Enterococcus. Na krvnom agaru formiraju sitne, sjajne, sivkaste kolonije, često bez
zone hemolize, ali mogu biti i hemolitičke.
Bakterija je fakultativno anaerobna sa fermentacionim metabolizmom. Može
da izdrži nepovoljne uslove sredine. Optimalna temperatura za rast je 10-45 °C, a
pH 9.6. Nalaze se u crevima i u fekalijama čoveka i toplokrvnih životonja, pa se
koriste kao indikator fekalne kontaminacije vode i namernica. Postoje sojevi koji
daju neprijatan miris ali imaju i neke osobine zbog kojih se koriste u prehrambenoj
industriji.
Izaziva piogene infekcije, bakterijski endokarditis, meningitis, infekcije
urinarnog trakta, takođe se može naći kod infekcija rana zajedno sa drugim
bakterijama. Ima visoku rezistenciju na antibiotike i na veliki broj hemijskih
sredstava i jedan je od glavnih uzročnika multirezistentnih intrahospitalnih
infekcija.
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Staphylococcus aureus je nepokretna, Gram pozitivna koka koja formira
nepravilne, grozdaste formacije. Ime je dobio po karakterističnom pigmentu koji
kolonijama daje zlatnožutu boju. Raste dobro na jednostavnim hranljivim
podlogama koje sadrže 7-10% NaCl. Kolonije su obično okrugle, glatke, uzdignute,
MasterradMartinaStojković
19
beličaste ili žuto prebojene. Na krvnom agaru se oko kolonija obrazuje uža i šira
zona beta hemolize. Samo mali procenat sojeva je nehemolitički (Hukić, 2005).
Bakterija je asporogena i fakultativno anaerobna. Optimalna temepratura za
rast je 35 °C, a pH 7.4. Obzirom da S. aureus ispoljava veliku tolerantost prema
visokim koncentracijama soli i šećera, često se javlja kao kontaminent slanih i
slatkih namirnica. Široko je rasprostranjen u prirodi, nalazi se u prašini, vazduhu,
vodi, hrani. Oko 50% ljudske populacije ima S. aureus u sastavu normalne
mikroflore respiratornih organa i kože. Sintetiše različite toksine, od kojih su neki
veoma opasni po zdravlje ljudi i životinja. Da bi produkovao toksine potrebno je da
postoje odgovarajući uslovi: aerobni uslovi (T 6-46 °C; pH 4-7.3) i anaerobni
uslovi (T 6-46 °C; pH> 5.3) (Bem, 1991). Sintetiše intracelularne (protein A, faktor
nagomilavanja, fibronektin vezujući protein) i ekstracelularne metabolite (α, β, γ i δ
toksini i superantigeni egzotoksini). Stafilokoke su najčešći uzročnici
intrahospitalnih infekcija i epidemija i veoma su značajne kao mikroorganizmi
otporni na veliki broj postojećih antibiotika.
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
Staphylococcus epidermidis nepokretna, Gram pozitivna bakterija, loptastog
oblika, sa ćelijama grupisanim u grozdaste formacije. Na krvnom agaru ne stvara
zone hemolize. Kolonije su bele, ravne, prečnika 1-2 mm.
Bakterija je fakultativno anaerobna. Optimalna temperatura za rast je 30-37
°C. Nalazi se uglavnom na koži i sluzokoži čoveka i toplokrvnih životinja, gde
pripada normalnoj bakterijskoj flori. Tipičan je predstavnik oportunističkih
bakterija. Prisutan je u kliničkim uzrocima kao kontaminant i izazivač je
MasterradMartinaStojković
20
intrahospitalnih infekcija. Produkuje biofilm i lako kontaminira katetere i
implantate. S. epidermidis je razvio otpornost na mnoge antibiotike (meticilin,
novobiocin, klindamicin, benzil, penicilin).
Streptococcus pyogenes ATCC 19615
Streptococcus pyogenes je nepokretna, Gram pozitivna bakterija, loptastog
oblika čije su ćelije grupisane u lance. Dijametar koke je 0.6-1.0 μm. Sadrži
kapsulu sastavljenu od hijaluronske kiseline. To je beta hemolitički streptokok
serološke grupe A. Sadrži grupni C-antigen i tipski specifični antigen (M, T i R).
Na krvnom agaru formira sitne, prozračne kolonije, koje imaju izgled kapljice rose
i okružene su širokom zonom beta hemolize. U bujonu raste stvarajući talog, bez
zamućenja; hidrolizuje hipurat i može imati žuto crvenkasti pigment.
Organizam je aerotolerantan i zahteva obogaćen medijum koji sadrži krv kako
bi mogao da raste. Optimalna temperatura za rast je 37 °C. Piogeni streptokok je
najčešći patogen ljudi, procenjuje se da je 5-15% ove bakterije normalno prisutno u
respiratornom traktu bez znakova bolesti. U prošlom veku, infekcije S. pyogenes –
om su ugrozile mnoge živote kada je ona predstavljala glavni uzrok porodiljske
groznice (sepse posle porođaja). Izaziva oboljenja respiratornog trakta, šarlah,
kožne infekcije, sepsu i meningitis.
Escherichia coli ATCC 8739
Escherichia coli je pokretna, Gram negativna bakterija, štapićastog oblika,
dužine 2-6 μm, širine 1.1-1.5 μm. Javlja se pojedinačno, u parovima i nepravilnim
MasterradMartinaStojković
21
skupinama. Većina je pokretna peritrihalnim flagelama, a mnogi imaju fimbrije.
Mnogi sojevi mogu stvarati makrokapsule, koje doprinose njihovoj virulentnosti
(Garrity et al., 2005).
Raste dobro na mnogim hranljivim podlogama. Na Endo agaru stvara kolonije
crvene boje sa zelenkastim metalnim sjajem, a na Mac Conkey agaru roze obojene
kolonije. Raspolaže velikom respiratornom (oksidativnom) i fermentativnom
aktivnošću. Fermentiše šećer laktozu, pri čemu produkuje kiselinu i gas. Pripada
grupi fakultativnih anaeroba. Escherichia coli je otporna na niske temperature, dok
je optimalna temperatura za rast od 21-37 °C. Neutrofilna je i raste u sredinama sa
pH rasponom od 5.0-9.0.
Bakterije vrste Escherichia coli imaju složenu antigensku građu: somatski O-
antigen (termostabilan); flagelatni H-antigen (termolabilan) i kapsularni K-antigen.
Predstavlja deo crevne flore ljudi i životinja i neophodna je za varenje ugljenih
hidrata i sintezu nekih supstanci (vitamin K i B12). Većina sojeva su bezopasni, ali
određeni sojevi mogu biti uzočnici bakterijskih infekcija čoveka. Na osnovu
patogenosti i faktora virulencije razlikuju se nekoliko tipova enteropatogenih E.
coli: enterotoksigene (ETEC), enteropatogene (EPEC), enteroinvazivne (EIEC),
enterohemoragične (EAEC). Svaka klasa se manifestuje drugačijom patogenezom i
simptomima. Pored pomenutih infekcija gastrointestinalnog sistema, ešerihija može
izazvati i infekcije urogenitalnog trakta i kože, sepsu, meningitis i zapaljenje pluća
(Duraković, 1996). Izražena je pojava rezistencije na brojne antimikrobne lekove,
zbog prenosa R-plazmida konjugacijom (Rolhion & Darfeuille-Michaud, 2007;
Todar, 2007).
MasterradMartinaStojković
22
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031
Predstavnici vrste Klebsiella pneumoniae su nepokretni, kratki, Gram
negativni bacili sa velikom polisaharidnom kapsulom. Izolati iz humanog uzorka
imaju kokobacilarni oblik. Često se javljaju u parovima, nepokretni su i ne
obrazuju spore. Fimbrije sa adherentnim svojstvima i kapsula predstavljaju
značajne faktore virulencije. Poseduju somatske O i polisaharidne kapsularne K
antigene.
Dobro rastu na hranljivim podlogama širokog spektra na kojima porastu u
vidu velikih, sjajnih, sivkastobeličastih kolonija viskozne konzistencije. Na
diferencijalnim podlogama stvaraju laktoza-pozitivne kolonije. Fermentišu ugljene
hidrate, produkujući kiselinu i gas. Na krvnom agaru ne stvaraju zonu hemolize.
Ova vrsta pripada grupi fakultativnih anaeroba.
Klebsiella pneumoniae ima široko rasprostranjenje u prirodi, nalazi se u
zemlji, vodi, kao i u intestinalnom traktu ljudi i životinja. Pripada grupi
oportunističkih bakterija i oboljenja izaziva pretežno kod osoba sa smanjenom
odbrambenom sposobnošću. Najčešće izaziva oboljenja respiratornog i urinarnog
trakta. Kod prevremeno rođene dece, čest je uročnik neonatalne sepse. Ova vrsta
ima sojeve koji su razvili mehanizme rezistencije na veliki broj antibiotika.
Proteus mirabilis ATCC 12453
Proteus mirabilis je Gram negativna bakterija, štapićastog oblika. Izuzetno je
pokretna, zahvaljujući prisustvu brojnih peritrihalnih flagela. Na čvrstoj podlozi
pokazuju fenomen rojenja, tipičan za ovaj rod, pri čemu se kolonije koncentrično
MasterradMartinaStojković
23
šire po podlozi. Biohemijski su aktivni, razgrađuju glukozu i druge ugljene hidrate
do kiselina. Poseduju somatske O i flagelarne H antigene.
Proteus vrste se razmnožavaju na temperaturi od 0 do 43 °C. Mogu se
razvijati u namirnicama u kojima je pH iznad 4.0. Pripadaju grupi fakultativnih
anaeroba. Široko su rasprostranjeni u prirodi. Nalaze se u zemlji, otpadnim
materijama i vodama, kao i u intestinalnom traktu ljudi i životinja. Prilagođeni su i
parazitskom načinu života. Izazivaju urinarne infekcije, meningitis i infekcije rana.
Sojevi P. mirabilis osetljivi su na ampicilin, karbenicilin i cefalosporine (Švabić-
Vlahović, 2005).
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Pseudomonas aeruginosa je Gram negativna bakterija, štapićastog oblika,
dužine 1-3 μm i širine 0.5 -0.8 μm. Pokretna je pomoću polarno postavljene flagele.
Ne formira kapsulu, a neki sojevi imaju sluzavu ovojnicu. Kolonije pseudomonasa
su krupne, razlivene i stvaraju karakterističan pigment plavo zelene boje, koji se
naziva piocijanin ili žuto zeleni pioverdin. Pri rastu stvara karakterističan jak miris
lipe. Faktori virulencije su endotoksini i egzotoksini. Egzotoksin inhibira sintezu
proteina. Produkuje i veliki broj egzoenzima koji oštećuje tkiva. Imaju somatski O-
antigen i flagelatni H-antigen.
Optimalna temperatura za rast ove bakterije je 28 °С, dok kiseli uslovi sredine
nepovoljno utiču na rast ove bakterije. Pseudomonas aeruginosa ima ima široko
rasprostranjenje (zemlja, voda i namirnice).
Ova bakterija dovodi do upale, infekcije rana, pluća, kože i sepse (Duraković,
1996). Uzročnik je folikulitisa i teških formi akni (Todor, 2008). Takođe je jedan
MasterradMartinaStojković
24
od uzročnika infekcija postoperativnih i drugih rana (Onche & Adedeji, 2004;
Masaadeh & Jaran, 2009). Kod novorođenčadi dovodi do smrtonosne sepse.
Candida albicans ATCC 24433
Rod Candida je gljiva koja pripada podrazdelu Ascomycotina. Ćelije
kandide su ovalnog oblika, glatke, beložute boje, dijametra oko 4 μm. Ova vrsta
pripada kvascima. Razmnožava se pupljenjem, formirajući blastokonidije.
Optimalna temperatura za rast je 25 °C, a dobro uspeva i na 37 °C. Vrsta je
pleomorfna, a promena oblika zavisi od velikog broja faktora: temperature, pH,
odnosa koncentracije CO2 i O2, veličine inokuluma i sastava podloge za rast (Deva,
2010).
Patogena je za čoveka i izaziva oboljenje kandidijazu. Nalazi se u koži,
ustima i unutrašnjim organima (Ranković, 1996). Dovodi do kvarenja mlečnih
proizvoda, voća i povrća. Takođe je jedan od uzročnika superinfekcija do kojih
dolazi u toku i posle antibiotske terapije.
MasterradMartinaStojković
25
2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA
sakupljanje i obrada biljnog materijala
ekstrakcija suvog biljnog materijala nadzemnog dela vrsta Eryngium campestre, E. amethystinum, E. palmatum i E. serbicum upotrebom metanola, etil acetata, acetona i vode kao rastvarača
određivanje minimalne inhibitorne koncentracija dobijenih ekstrakata mikrodilucionom metodom u odnosu na gram pozitivne bakterije, gram negativne bakterije i kvasac, koji su humani patogeni
poređenje dobijenih aktivnosti ekstrakata po vrstama
poređenje dobijenih aktivnosti ekstrakata po tipu rastvarača
MasterradMartinaStojković
26
3. MATERIJAL I METODE
3.1. Priprema rastvora, podloga i reagenasa
Trifenil-tetrazolijum-hlorid (TTC) je pravljen rastvaranjem 0.5 g
supstance u 100 ml destilovane vode.
Fiziološki rastvor je 0.9% (m/V) rastvor natrijum hlorida u destilovanoj
sterilisanoj vodi. Dobija se rastvaranjem 0.9 g NaCl u 100 ml destilovane vode.
Miler Hinton bujon (Müeller Hinton Broth, HiMedia, M391) je
podloga namenjena za određivanje minimalnih inhibitornih koncentracija
(MIK) antimikrobnih agenasa metodom dilucije u bujonu. Sastav ove podloge
na 1000 ml je sledeci: mesni ekstrakt 30.00 g, kazein hidrolizat 17.50 g, štirak
1.50 g (konačna pH vrednost 7.4±0.2 na 25 °C). Priprema ove podloge vršena
je suspendovanjem 21.00 g suve podloge u 1000 ml destilovane vode. Nakon
stajanja od 15 minuta i inicijalnog zagrevanja na rešou radi potpunog
rastvaranja, vršena je sterilizacija podloge autoklaviranjem u trajanju od 20
minuta na 121 °C.
Hranljivi agar (Torlak) je podloga namenjena za kultivisanje širokog
spektra mikroorganizama. Sastav ove podloge na 1000 mL je sledeci: pepton
15.00 g, mesni ekstrakt 3.00 g, natrijum hlorid (NaCl) 5.00 g, kalijum fosfat
0.30 g, agar-agar 18.00 g (konačna pH vrednost 7.3 na 25 ºC). Priprema ove
podloge vršena je suspendovanjem 38.00 g suve podloge u 1000 ml destilovane
vode. Nakon stajanja od 15 minuta i inicijalnog zagrevanja na rešou radi
MasterradMartinaStojković
27
potpunog rastvaranja, vršeno je razlivanje podloge i autoklaviranje u trajanju
od 20 minuta na 121 °C.
3.2. Biljni materijal
Biljni materijal korišćen u ovom radu sakupljan je i determinisan od
strane doc. dr Bojana Zlatkovića i prof. dr Zorana Krivošeja. Vaučeri
determinisanih vrsta se nalaze u Herbarijumu Departmana za biologiju sa
ekologijom Prirodno matematičkog fakulteta u Nišu (HMN). Vaučerski brojevi
i lokaliteti sakupljanja navedeni su u Tabeli 1.
Tabela 3. Podaci o sakupljanim biljnim vrstama
biljna vrsta vaučerski
broj u HMN
lokalitet sakupljanja
datum sakupljanja
E. campestre L. var. tenuifolium Boiss. 10801 Makedonija,
Vitoša 09.06.2013.
E. palmatum Pančić & Vis. 10802 Srbija, Niš, Trošarina 27.06.2012.
E. serbicum Pančić 10803
Srbija, Sićevačka
klisura, Višegrad
29.06.2012.
E. amethystinum L. 10804 Srbija, Kosovska Mitrovica
17.06.2003.
MasterradMartinaStojković
28
3.2.1. Priprema biljnih ekstrakata
Biljni ekstrakti su koncentrovani pripravci dobijeni iz biljnih ili animalnih
droga. Mogu biti u tečnom, polutečnom i čvrstom stanju (Kovačević, 2004). Pre
procesa ekstrakcije droga mora biti usitnjena do konzistencije grubog praška. Kao
sredstvo za ekstrakciju se koristi: alkohol različitih koncentracija, voda, aceton,
heksan, glicerol, masna ili mineralna ulja.
Osušeni i usitnjen biljni materijal (10 g) ekstrahovan je korišćenjem četiri
različitih organskih rastvarača koji se razlikuju po polarnosti i to vode, metanola,
etil-acetata i acetona (100 ml). Ekstrakcija se odvijala na tamnom mestu tokom 24
h, pri čemu je tokom prvog i poslednjeg sata predviđenog vremena ona vršena u
ultrazvučnom kupatilu. Posle filtriranja i ispiranja odgovarajućim rastvaračima
ekstrakti su upareni korišćenjem vakum uparivača do potpune evaporacije
rastvarača. Ekstrakti su zatim spakovani u bočice i čuvani u frižideru do momenta
korišćenja. Za dobijanje vodenog ekstrakta, biljni materijal je ekstrahovan vodom
na prethodno opisan način a zatim liofiliziran u aparatu za liofilizaciju. Dobijeni
liofilizat je čuvan do korišćenja u frižideru.
3.3. Bakterijske kulture
Za ispitivanje antimikrobne aktivnosti korišćeni su sledeći sojevi bakterija:
Gram pozitivne bakterije (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes), Gram negativne bakterije
(Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Klebsiella
pneumoniae) i jedan kvasac (Candida albicans).
MasterradMartinaStojković
29
Tabela 4. Prikaz testiranih mikroorganizama
3.4. Mikrodiluciona metoda
Metoda dilucije se koristi za određivanje antimikrobne aktivnosti ispitivane
supstance. Cilj ove metode je da se utvrdi minimalna inhibitorna koncentracija, tj.
najniža koncentracija koja će inhibirati rast mikroorganizama. Izvodi se u
mikrodilucionim pločama koje sadrže 96 bunarčića – 12 kolona i 8 redova (A – H).
Od biljnih ekstakata napravljena je serija razređenja u dimetil – sulfoksidu
(100% DMSO) u ultrazvučnom kupatilu uz zagrevanje. Rastvaranje je rađeno u
posebnoj ploči, tako što je u 90 μl zasejanog bujona ubacivano po 10 μl štok
rastvora. Kao negativna kontrola korišćen je 10% DMSO, jer je u svakom
Testirani sojevi mikroorganizama
Gram-pozitivne bakterije Gram-negativne bakterije Sojevi gljiva
Soj Referentni
broj
Soj Referentni
broj
Soj Referentni
broj
Enterococcus faecalis ATCC 19433 Escherichia coli ATCC 8739 Candida albicans ATCC 24433
Staphylococcus
Aureus
ATCC 6538 Klebsiella pneumonia ATCC 10031
Staphylococcus
Epidermidis
ATCC 12228 Proteus mirabilis ATCC 12453
Streptococcus pyogenus ATCC 19615 Pseudomonas
aeruiginosa
ATCC 9027
MasterradMartinaStojković
30
bunarčicu to bila njegova finalna koncentracija. Testirana je antimikrobna aktivnost
biljnih ekstrakata u rasponu od 2.5 do 0.001 mg/ml. Mikrotitarske ploče su
inkubirane tokom noći na 37 °C. Kao pozitivna kontrola korišćeni su antibiotici
streptomicin i nistatin.
MasterradMartinaStojković
31
4. REZULTATI I DISKUSIJA
4.1. Prinos dobijenih ekstrakata
Ekstrakcijom biljnog materijala četiri vrsta iz roda Eryngium dobijen je
prinos koji je predstavljen u Tabeli 5. Najveći prinos imali su vodeni i metanolni
ekstrakti, dok su prinosi etil acetatnih i acetonskih ekstrakata kod svih vrsta bili
znatno niži.
Tabela 5. Prinosi ekstrakata ispitivanih biljnih vrsta
BILJNA VRSTA METANOLNI
(g)
ETIL ACETATNI
(g)
ACETONSKI
(g)
VODENI
(g)
E. amethystinum L. 1.043 0.133 0.192 1.664
E. campestre L. var. tenuifolium Boiss. 0.772 0.135 0.133 1.560
E. palmatum Pančić & Vis. 1.503 0.185 0.047 1.824
E. serbicum Pančić 1.043 0.186 0.275 0.993
MasterradMartinaStojković
32
4.2. Antimikrobna aktivnost ekstrakata testiranih vrsta roda Eryngium
U ovom radu ispitana je antimikrobna aktivnost metanolnog, etil acetatnog,
acetonskog i vodenog ekstrakta vrsta Eryngium campestre, Eryngium palmatum,
Eryngium serbicum i Eryngium amethystinum u odnosu na osam vrsta bakterija i
jednu vrstu gljiva. Efekat ekstrakata je testiran na Gram pozitivne vrste bakterija i
to Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Streptococcus pyogenes; Gram negativne bakterije Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Proteus mirabilis i Pseudomonas aeruginosa, dok je testirana
fungalna vrsta bila kvasac Candida albicans. Mikrodilucionom metodom
određena je minimalna inhibitorna koncentracija (MIK), koja predstavlja najnižu
koncentraciju testirane supstance koja je izvršila vidljivu inhibiciju rasta
tretiranog mikroorganizma.
4.2.1. Antimikrobna aktivnost ekstrakata vrste Eryngium campestre
Ekstrakti vrste Eryngium campestre pokazali su antimikrobni efekat u
opsegu koncentracija od 0.004-20.00 mg/ml. MIK metanolnog ekstrakta vrste E.
campestre iznosio je 0.03-20.00 mg/ml, sa najvećom aktivnošću ispoljenom
protiv kvasca C. albicans. Za etil acetatni ekstrakt izmerene su MIK vrednosti u
rasponu od 0.007-5.000 mg/ml sa najvećim inhibitornim efektom ostvarenim na
C. albicans. MIK acetonskog ekstrakta iznosio je 0.004-2.500 mg/ml, na koji se
najosetljivijim pokazao soj P. mirabilis. Vodeni ekstrakt pokazao je antimikrobno
delovanje sa opsegom minimalnih inhibitornih koncentracija od 0.03-20.00
MasterradMartinaStojković
33
mg/ml, na koji je najveću senzitivnost pokazao kvasac C. albicans. Rezultati
antimikrobne aktivnosti metanolnog, etil acetatnog, acetonskog i vodenog
ekstrakta vrste Eryngium campestre prikazani su u Tabeli 6. kao MIK izražene u
mg/ml. U poređenju sa antibioticima koji su služili kao pozitivne kontrole,
vidljivo je da je njihovo dejstvo znatno jače od dejstva testiranih ekstrakata.
Iz Tabele 6. se može videti da nema značajne razlike u delovanju u
odnosu na Gram reakciju testiranih bakterija, iako su gram pozitivne bakterije
pokazale nešto veću rezistenciju sa po dva soja (S. pyogenes i E. faecalis)
otporna na najviše testirane koncentracije etil acetatnog i acetonskog ekstrakta
ove vrste. Na iste ekstrakte, rezistentan je bio samo po jedan gram negativan soj i
to P. aeruginosa.
Najosetljivi soj na dejstvo svih ekstrakata bio je kvasac Candida albicans, dok je
zapažen veći broj rezistentnih sojeva, i to S. pyogenes, E. facealis, S. epidermidis
i P. aeruginosa, za čiju je inhibiciju bilo neophodno primenjivati najviše testirane
koncentracije ekstrakata ili pri njima inhibicija nije ni ostvarena. Radovi koji su
do sada ispitivali antimikrobnu aktivnost ove vrste su veoma oskudni i do sada su
istraživanja na ovu temu publikovali samo nekoliko autora. Thiem et al., (2010)
testirali su antimikrobnu aktivnost etanolnih ekstrakata lista i korena izolovanih iz
tri vrsta roda Eryngium i to E. planum, E. campestre i E. maritimum. Istraživanje
je vršeno na dve gram pozitivne bakterijske vrste (Staphylococcus aureus i
Bacillus subtilis), kao i na pet vrsta gljiva (Candida albicans, Candida glabrata,
Cryptococcus neoformans, Aspergillus niger i Trichophyton mentagrophytes).
MasterradMartinaStojković
34
Tabela 6. Antimikrobna aktivnost metanolnog, etil acetatnog, acetonskog i vodenog ekstrakta
Eryngium campestre na različite sojeve bakterija i gljiva
Soj bakterija Ekstrakti
(MIK u mg/ml)
Antibiotik
(MIK u µg/ml)
Metanolni
Etil acetatni
Acetonski Vodeni
Gram (+) bakterije
S. aureus 5.00 0.04 0.01 >20.00 0.04
S. pyogenes 20.00 >5.00 >2.50 20.00 0.04
E. facealis 5.00 >5.00 >2.50 2.50 0.09
S. epidermidis 2.50 5.00 2.50 20.00 0.04
Gram (-) bakterije
E. coli 0.07 0.01 0.01 0.07 0.09
K. pneumoniae 10.00 2.50 1.25 >20.00 0.09
P. mirabilis 5.00 0.07 0.004 10.00 0.04
P. aeruginosa 20.00 >5.00 >2.50 20.00 0.09
Fugalni soj
C. albicans 0.04 0.07 0.02 0.04 0.06
MasterradMartinaStojković
35
Etanolni ekstrakt korena E. campestre pokazao je antimikrobno delovanje na S.
aureus i na C. albicans pri minimalnoj inhibitornoj koncentraciji od 900 µg/ml.
Etanolni ekstrakt korena E. campestre pokazao je antimikrobno delovanje na S.
aureus i na C. albicans pri minimalnoj inhibitornoj koncentraciji od 900 µg/ml.
Nešto viša koncentracija ekstrakta lista od 1900 µg/ml bila je neophodna za
inhibiciju rasta vrste S. aureus. U ovom istraživanju ekstrakcija je vršena drugim
rastvaračima što je automatski uticalo na hemijski sastav ekstrakata i njihovu
aktivnost. Ipak, pošto su u oba istraživanja testirane dve iste vrste
mikroorganizama (S. aureus i C. albicans), prema ovde dobijenim inhibitornim
koncentracijama se može reći da je ovde utvrđena aktivnost na kvasac C. albicans
znatno veća (MIC svih ekstrakata kretala se u opsegu koncentracija od 7.00-30.00
µg/ml). Posmatrajući aktivnosti na vrstu S. aureus, etanolni ekstrakt lista E.
campestre imao je slabiju aktivnost od etil acetatnog i acetonskog ekstrakta koji
su imali aktivnost pri 10-30 µg/ml. Zbog toga se može tvrditi da etanolni ekstrakt
(i korena i lista) E. campestre ima nižu aktivnost u odnosu na ovde testirane
ekstrakte iste biljne vrste osim u slučaju vodenog i metanolnog ekstrakta (na S.
aureus).
Usta et al. (2014) su ispitivali antimikrobnu i antitumorsku aktivnost
metanolnih, etanolnih i vodenih ekstrakata jedanaest različitih biljnih vrsta
sakupljanih na području Turske, među kojima je bila i E. campestre. Istraživanje je
vršeno disk difuzionom metodom u odnosu na set od šest mikroorganizama i to na
S. aureus, S. epidermidis, S. pyogenes, P. aeruginosa, K. pneumoniae i E.coli.
Utvrđeno je da je vodeni ekstrakt ove vrste pokazao najslabiju aktivnost, jer je
delovao na samo jednu vrstu (P. aeruginosa) pri čemu je zona inhibicije bila jako
mala (11.33 mm). Metanolni ekstrakt je delovao na vrste S. pyogenes, P.
MasterradMartinaStojković
36
aeruginosa i E. coli (zone inhibicije 9.00, 10.60 i 17.33 mm), dok je etanolni
pokazao najbolju aktivnost delujući na sve vrste osim na S. aureus i K. pneumoniae
sa zonama inhibicije u rasponu od 11.30-28.67 mm. Najosetljivija vrsta na dejstvo
metanolnog i etanolnog ekstrakta bila je E. coli, koja se i u našem istraživanju
pokazala kao jako senzitivna na sve ekstrakte vrste E. campestre.
MasterradMartinaStojković
37
4.2.2. Antimikrobna aktivnost ekstrakata vrste Eryngium palmatum
Ekstrakti vrste Eryngium palmatum pokazali su antimikrobni efekat u
opsegu koncentracija od 0.004-20.00 mg/ml. MIK metanolnog i vodenog
ekstrakta vrste Eryngium palmatum iznosio je 0.004-20.00 mg/ml sa najvećom
aktivnošću ispoljenom protiv sojeva E. coli i P. mirabilis. Za etil acetatni i
acetonski ekstrakt izmerene su MIK vrednosti u rasponu od 0.004-2.50 mg/ml, sa
najvećim inhibitornim efektom ostvarenim na soj P. mirabilis. Rezultati
antimikrobne aktivnosti metanolnog, etil acetatnog, acetonskog i vodenog
ekstrakta vrste Eryngium palmatum prikazani su u Tabeli 7. kao MIK izražena u
mg/ml. Najveći antimikrobni potencijal ispoljio je etil acetatni ekstrakt sa MIK
vrednostima od 0.004-1.25 mg/ml. Najosetljiviji sojevi na dejstvo svih ekstrakata
ove vrste bili su E. coli i P. mirabilis. Najveću toleranciju na dejstvo testiranih
ekstrakata pokazali su sojevi K. pneumoniae, P. aeruginosa i kvasac Candida
albicans. Sojevi koji su pokazali rezistenciju na najviše testirane koncentracije
ekstrakata javili su se samo pri tretmanu vodenim ekstraktom, što ukazuje na
veliki antimikrobni potencijal ostalih ekstrakata, koji su uglavnom imali efekat
pri znatno nižim koncentracijama.
Dosadašnje jedino istraživanje na temu antimikrobne aktivnosti ove vrste
ispitivalo je metanolne i hloroformne ekstrakte nadzemnih delova i korena E.
palmatum (Marčetić et al., 2013). U pomenutoj studiji testirane su antioksidativna
i antimikrobna aktivnost metanolnog i hloroformnog ekstrakta u odnosu na osam
bakterijskih sojeva (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Micrococcus luteus, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Pseudomonas
MasterradMartinaStojković
38
aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia) i jedan kvasac (Candida
albicans). Ekstrakti su ispitivani u opsegu koncentracija od 1.80-100.0 μg/ml i
ispoljili su aktivnost pri MIC vrednostima od 3.5-15.6 µg/ml, pri čemu su
pokazali efikasnost i na Gram pozitivne i na Gram negativne bakterije. Najveća
antimikrobna aktivnost u ovom radu je dobijena sa metanolnim ekstraktom
nadzemnih delova i to na M. luteus (MIK = 3.5 μg/ml). Ovaj efekat je verovatno
izražen zbog sadržaja flavonoida koji su otkriveni u njegovom sastavu, a koji
sačinjavaju kempferol, apigenin i njegovi glikozidi. Metanolni ekstrakt korena
koji je pokazao aktivnost pri 7.8-15.6 μg/ml sadrži katehin za koji je dokazano da
inhibira rast mikroorganizama. Iako je objavljeno da katehini imaju veću
aktivnost prema Gram pozitivnim bakterijama nego prema Gram negativnim
bakterijama (Cushnie & Lamb, 2005), u ovom radu je pokazano da metanolni
ekstrakt korena inhibira rast obe bakterijske grupe. Ova aktivnost je verovatno
zanovana na sinergističkoj aktivnosti fenolnih jedinjenja.
U istom istraživanju testirani su i nepolarni hloroformni ekstrakti iz korena i
nadzemnog dela iste vrste. Pri tome je utvrđeno da su i oni pokazali značajnu
antimikrobnu aktivnost i to pri koncentracijama od 7.8 -15.6 µg/ml, što je
pripisano sadržaju masnih kiselina (linoleinske i palmitinske) u ekstraktu iz
nadzemnog dela i zasićenih alkohola koji su nađeni u ekstraktu iz korena ove
biljke.
U poređenju sa našim rezultatima, slična aktivnost sa rezultatima Marčetić
et al. se može uočiti kod etil acetatnog i acetonskog ekstrakta ove vrste, dok su
metanolni i vodeni ekstrakti u našem istraživanju imali znatno nižu efikasnost.
MasterradMartinaStojković
39
Tabela 7. Antimikrobna aktivnost metanolnog, etil acetatnog, vodenog i acetonskog ekstrakta
Eryngium palmatum na različite sojeve bakterija i gljiva
Soj bakterija Ekstrakti
(MIK u mg/ml)
Antibiotik
(MIK u µg/ml)
Metanolni
Etil acetatni
Acetonski Vodeni
Gram (+) bakterije
S. aureus 10.00 0.02 0.04 >20.00 0.04
S. pyogenes 2.50 1.25 2.50 10.00 0.04
E. facealis 5.00 0.01 0.04 10.00 0.09
S. epidermidis 1.25 1.25 0.62 20.00 0.04
Gram (-) bakterije
E. coli 0.07 0.01 0.07 0.07 0.09
K. pneumoniae 2.50 0.62 0.31 >20.00 0.09
P. mirabilis 0.07 0.004 0.01 5.00 0.04
P. aeruginosa 20.00 0.31 0.62 >20.00 0.09
Fugalni soj
C. albicans 20.00 1.25 1.25 20.00 0.06
MasterradMartinaStojković
40
4.2.3. Antimikrobna aktivnost ekstrakata vrste Eryngium serbicum
Ekstrakti vrste Eryngium serbicum pokazali su aktivnost u opsegu
koncentracija od 0.15-20.00 mg/ml. MIK metanolnog ekstrakta vrste Eryngium
serbicum iznosio je 0.15-2.50 mg/ml sa najvećim inhibitornim efektom
ostvarenim na soj E. coli, što je ujedno bila i najniža efikasna inhibitorna vrednost
svih testiranih ekstrakata ove vrste. Najveću antimikrobnu aktivnost od svih
ekstrakata pokazao je upravo metanolni ekstrakt, jer nije bilo sojeva otpornih na
koncentracije do 2.50 mg/ml. Sa druge strane, vodeni ekstrakt pokazao je
relativno umerenu aktivnost sa inhibitornim efektom pri koncentracijama od 2.50-
10.00 mg/ml. Isti ekstrakt je ispoljio neefikasnost pri najvišoj testiranoj
koncentraciji na čak četiri soja. U slučaju etil acetatnog i acetonskog ekstrakta,
količina dobijenog ekstrakta (prinos) ograničavala je visinu testiranog opsega pa
su najviše testirane koncentracije oba ekstrakta iznosile 2.50 mg/ml. Rezultati su
pokazali da je efikasniji bio acetonski ekstrakt ove vrste jer je delovao pri nižim
koncentracijama (MIC=0.31-2.50 mg/ml) i imao tri rezistentnih vrsta, za razliku
od etil acetatnog koji nije ispoljio inhibitorni efekat na čak pet vrsta, a delovao je
pri koncentracijama od 1.25-2.50 mg/ml. Sva četiri ekstrakta bila su efikasna na
samo dva soja i to na S. aureus i S. epidermidis, ali su za njihovu inhibiciju bile
neophodne nešto više koncentracije svih ekstrakata (1.25-10.00 mg/ml). Soj koji
se pokazao kao najotporniji na dejstvo ekstrakata vrste E. serbicum bio je S.
pyogenes, koji je pokazao osetljivost samo na dejstvo metanolnog ekstrakta i to
pri koncentraciji od 1.25 mg/ml.
Matejić (2013) je ispitala antimikrobnu aktivnost metanolnih, etil acetatnih,
acetonskih i vodenih ekstrakata dvanaest različitih biljnih vrsta, među kojima je
MasterradMartinaStojković
41
bila Eryngium serbicum. Istraživanje je vršeno mikrodilucionom metodom u
odnosu na set od šest mikroorganizama (Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Salmonella enteritidis, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes,
Staphylococcus aureus) i jednu vrstu gljiva (Candida albicans). Ekstrakti su
ispitivani u opsegu koncentracija od 1.56-25.00 mg/ml. Najveća antimikrobna
aktivnost u ovom radu je dobijena metanolnim i etil acetatnim ekstraktom
nadzemnih delova i to na S. aureus (MIK=1.56 mg/ml). U poređenju sa našim
rezultatima gde je vodeni ekstrakt pokazao relativno umerenu aktivnost, u ovom
radu je utvrđeno da vodeni ekstrakt ove vrste nije pokazao aktivnost na testirane
patogene.
MasterradMartinaStojković
42
Tabela 8. Antimikrobna aktivnost metanolnog, etil acetatnog, vodenog i acetonskog ekstrakta
Eryngium serbicum na različite sojeve bakterija i gljiva
Soj bakterija Ekstrakti
(MIK u mg/ml)
Antibiotik
(MIK u µg/ml)
Metanolni
Etil acetatni
Acetonski Vodeni
Gram (+) bakterije
S. aureus 1.25 2.50 2.50 10.00 0.04
S. pyogenes 1.25 >2.50 >2.50 >10.00 0.04
E. facealis 0.31 >2.50 >2.50 2.50 0.09
S. epidermidis 1.25 2.50 2.50 2.50 0.04
Gram (-) bakterije
E. coli 0.15 1.25 0.31 >10.00 0.09
K. pneumoniae 1.25 >2.50 2.50 5.00 0.09
P. mirabilis 0.62 1.25 0.31 >10.00 0.04
P. aeruginosa 2.50 >2.50 >2.50 10.00 0.09
Fugalni soj
C. albicans 0.31 >2.50 0.31 10.00 0.06
MasterradMartinaStojković
43
4.2.4. Antimikrobna aktivnost ekstrakata vrste Eryngium amethystinum
Ekstrakti vrste Eryngium amethystinum pokazali su aktivnost u opsegu
koncentracija od 0.31- 20.00 mg/ml, među kojima je etil acetatni ispoljio najveći
antimikrobni potencijal sa aktivnošću pri 0.31-0.62 mg/ml i sa samo jednom
rezistentnom vrstom (S. pyogenes). Vodeni ekstrakt je pokazao slabu inhibitornu
aktivnost delujući samo pri visokim koncentracijama od 10.00-20.00 mg/ml, dok
su dva soja (E. coli i P. mirabilis) bila otporna na dejstvo ovog ekstrakta.
Metanolni i acetonski ekstrakt pokazali su sličnu aktivnost gde je za nijansu bolju
efikasnost imao acetonski ekstrakt koji je uglavnom delovao pri duplo nižim
koncentracijama od metanolnog, osim u slučaju vrste E. coli, gde su se aktivne
koncentracije značajno razlikovale (Tabela 9).
Na dejstvo ekstrakata vrste Eryngium amethystinum bio je najosetljiviji soj
K. pneumoniae. Sa druge strane, vrsta S. pyogenes pokazala je najveću otpornost,
gde ni najviše koncentracije svih testiranih ekstrakata nisu dovele do inhibicije
rasta.
Istraživanja na temu antimikrobne aktivnosti ove vrste nisu do sada
publikovana, tako da su ovo prvi rezultati o efikasnosti ekstrakata nadzemnog
dela ove biljke.
MasterradMartinaStojković
44
Tabela 9. Antimikrobna aktivnost metanolnog, etil acetatnog, vodenog i acetonskog ekstrakta
Eryngium amethystinum na različite sojeve bakterija i gljiva
Soj bakterija Ekstrakti
(MIK u mg/ml)
Antibiotik
(MIK u µg/ml)
Metanolni
Etil acetatni
Acetonski Vodeni
Gram (+) bakterije
S. aureus 2.50 0.62 1.25 20.00 0.04
S. pyogenes >20.00 >2.50 >10.00 20.00 0.04
E. facealis 2.50 0.62 1.25 10.00 0.09
S. epidermidis 2.50 0.31 2.50 10.00 0.04
Gram (-) bakterije
E. coli 20.00 0.62 2.50 >20.00 0.09
K. pneumoniae 2.50 0.31 0.62 20.00 0.09
P. mirabilis 5.00 0.62 2.50 >20.00 0.04
P. aeruginosa 5.00 0.62 2.50 10.00 0.09
Fugalni soj
C. albicans 2.50 0.62 2.50 10.00 0.06
MasterradMartinaStojković
45
Posmatrajući ukupnu aktivnost testiranih ekstrakata vrsta roda Eryngium,
može se reći da su najveću efikasnost pokazali ekstrakti E. palmatum, dok su
najslabiju aktivnost imali ekstrakti vrste E. amethystinum.
Pri poređenju aktivnosti svih testiranih metanolnih ekstrakata može se uočiti
da su svi bili aktivni sa izuzetkom ovog ekstrakta vrste E. amethystinum u odnosu
na vrstu S. pyogenes (Grafik 1).
Grafik 1. Uporedni prikaz minimalnih inhibitornih koncentracija metanolnih ekstrakata vrsta
Eryngium campestre, Eryngium palmatum, Eryngium serbicum i Eryngium amethystinum.
Nedostatak stupca ukazuje na rezistenciju organizma na ekstrakt te vrste roda Eryngium.
Aktivne koncentracije su se kretale u opsegu od 0.07-20.00 mg/ml. Takođe
se može uočiti da je među ovim ekstraktima onaj izolovan iz vrste E. serbicum
ispoljio najveću antimikrobnu aktivnost, delujući na sve testirane vrste pri najnižim
MasterradMartinaStojković
46
koncentracijama. Vrste na koju su metanolni ekstrakti pokazali najbolji efekat bile
su E. coli (sa izuzetkom ekstrakta vrste E. amethystinum koji je delovao pri visokoj
koncentraciji, svi su inhibirali rast ove bakterije pri koncentracijama manjim od 1
mg) i S. epidermidis.
Na Grafiku 2 može se videti uporedni pregled inhibitornih koncentracija etil
acetatnih ekstrakata svih ispitivanih vrsta roda Eryngium, koji su inhibirali rast
testiranih bakterija pri koncentracijama od 0.004-5.00 mg/ml. Na dejstvo svih
ekstrakata bile su osetljive vrste P. mirabilis (najosetljivija), E. coli, S. aureus i S.
epidermidis. Najveću otpornost na dejstvo etil acetatnih ekstrakata pokazala je vrsta
S. pyogenes, na koju je efekat ispoljio samo ekstrakt vrste E. palmatum. Među
testiranim ekstraktima, po efikasnosti se izdvojio ekstrakt E. palmatum koji je
inhibirao rast svih testiranih mikroorganizama pri jako niskim koncentracijama
(0.004-5.00 mg/ml). Nasuprot ovom ekstraktu, najniži antimikrobni efekat ispoljio
je etil acetatni ekstrakt vrste E. serbicum koji je delovao na svega 4 soja i to pri
višim koncentracijama opsega utvrđenim za ove ekstrakte (1.25-2.50 mg/ml).
MasterradMartinaStojković
47
Grafik 2. Uporedni prikaz minimalnih inhibitornih koncentracija etil acetatnih ekstrakata vrsta
Eryngium campestre, Eryngium palmatum, Eryngium serbicum i Eryngium amethystinum.
Nedostatak stupca ukazuje na rezistenciju organizma na ekstrakt te vrste roda Eryngium.
Pri poređenju aktivnosti acetonskih ekstrakata vrsta roda Eryngium
(Grafikon 3) može se uočiti da je opseg koncentracija veoma nizak i kreće se od
0.004-2.50 mg/ml. Od svih ekstrakata najveću aktivnost pokazao je ekstrakt vrste
E. palmatum koji je inhibirao sve testirane organizme u koncentracionom opsegu
0.01-2.50 mg/ml. Iako su E. campestre i E. serbicum pokazali sličnu aktivnost, pri
čemu su na oba ova ekstrakta S. pyogenes, E. faecalis i P. aeruginosa pokazali
rezistenciju, acetonski ekstrakt E. campestre je na senzitivne sojeve delovao pri
višestruko nižim koncentracijama. Finalno, E. amethystinum je inhibirao sve sojeve
osim S. pyogenes, ali su njegove aktivne koncentracije bile u proseku najviše u
odnosu na ostale ekstrakte. Na acetonske ekstrakte najrezistentnija vrsta bila je S.
pyogenes, dok je najveću osetljivost pokazala vrsta P. mirabilis.
MasterradMartinaStojković
48
Grafik 3. Uporedni prikaz minimalnih inhibitornih koncentracija acetonskih ekstrakata vrsta
Eryngium campestre, Eryngium palmatum, Eryngium serbicum i Eryngium amethystinum.
Nedostatak stupca ukazuje na rezistenciju organizma na ekstrakt te vrste roda Eryngium.
Vodeni ekstrakti roda Eryngium imali su inhibitornu aktivnost u opsegu
0.07-20.00 mg/ml, pri čemu su najniže aktivne koncentracije ispoljili E. campestre
i E. palmatum na vrste C. albicans i E. coli. Najbolji efekat od svih ekstrakata imao
je vodeni ekstrakt E. campestre, koji je imao inhibitorno dejstvo na sedam od devet
vrsta mikroorganizama pri koncentracijama 0.07-20.00 mg/ml. Na isti broj
mikroorganizama delovao je i ekstrakt vrste E. amethystinum, ali pri znatno višim
koncentracijama u rasponu od 10.00-20.00 mg/ml.
MasterradMartinaStojković
49
Grafik 4. Uporedni prikaz minimalnih inhibitornih koncentracija vodenih ekstrakata vrsta
Eryngium campestre, Eryngium palmatum, Eryngium serbicum i Eryngium amethystinum.
Nedostatak stupca ukazuje na rezistenciju organizma na ekstrakt te vrste roda Eryngium.
MasterradMartinaStojković
50
5. ZAKLJUČAK
1. Prilikom ekstrakcije iz biljnog materijala četiri vrsta iz roda Eryngium,
dobijen ukupan prinos može se predstaviti na sledeći način: E. palmatum >
E. amethystinum > E. campestre > E. serbicum. Prinos u odnosu na
rastvarače koji su primenjivani za ekstraciju bio je vodeni > metanolni >
acetonski > etil acetatni.
2. Antimikrobna aktivnost svih ekstrakata bila je ujednačena i nije pokazivala
selektivnost u odnosu na Gram reakciju organizama, a kretala se u opsegu
koncentracija od 0.004-20.00 mg/ml
3. Ekstrakti su delovali višestruko slabije od antibiotika koji je služio kao
pozitivna kontrola
4. Ekstrakti vrste E. campestre bili su aktivni pri koncentracijama od 0.004-
20.00 mg/ml, a najaktivniji od njih bio je acetonski koji je delovao u opsegu
od 0.004-2.50 mg/ml. Drugi po aktivnosti ekstrakt ove vrste bio je etil
acetatni, dok je vodeni pokazao najnižu antimikrobnu aktivnost.
5. Od ekstrakata vrste E. palmatum koji su delovali pri koncentracijama od
0.004-20.00 mg/ml, najaktivniji je bio etil acetatni ekstrakt sa MIC
vrednostima od 0.004-1.25 mg/ml. Drugi po aktivnosti bio je acetonski
ekstrakt, a najmanje aktivan bio je vodeni ekstrakt ove vrste.
6. Testirani ekstrakti vrste E. serbicum bili su efikasni pri koncentracijama od
0.15-20.00 mg/ml, a najbolju inhibiciju rasta testiranih mikroorganizama
ostvario je metanolni ekstrakt sa aktivnim koncentracijama od 0.15-2.50
MasterradMartinaStojković
51
mg/ml. Drugi po aktivnosti bio je acetonski, dok je vodeni pokazao najnižu
antimikrobnu aktivnost.
7. Ekstrakti vrste E. amethystinum delovali su u rasponu koncentracija od 0.31-
20.00 mg/ml, od koji je najbolju aktivnost imao etil acetatni ekstrakt ove
vrste sa MIK vrednostima od 0.31-0.62 mg/ml. Posle ovog ekstrakta najbolju
aktivnost imao je acetonski, dok je i kod ove vrste vodeni ekstrakt pokazao
najniži antimikrobni potencijal.
8. Od svih metanolnih ekstrakata, najbolji efekat imao je onaj izolovan iz vrste
E. serbicum; ekstrakt E. palmatum pokazao je najveću efikasnost od svih etil
acetatnih ekstrakata, dok su vodeni i acetonski ekstrakti vrste E. campestre
imali najbolju antimikrobnu aktivnost u poređenju sa ostalim ekstraktima
izolovanih vodom i acetonom.
9. Na osnovu svih rezultata, može se zaključiti da su ekstrakti ispitivanih vrsta
efikasni antimikrobni agensi koji se mogu koristiti za kontrolu humanih
patogena, a posebno E. coli i P. mirabilis-a, koji su bili veoma osetljivi na
dejstvo ovih ekstrakata.
10. Značajan inhibitorni efekat svih ekstrakata vrste E. campestre na kvasac C.
albicans je veoma bitan pokazatelj prisustva jedinjenja koja deluju na
fungalne ćelije u hemijskom sastavu sva četiri ekstrakta. Ovo bi moglo da
usmeri dalja istraživanja ka izolovanju i identifikaciji ovih jedinjenja i
njihovog daljeg testiranja na gljive u cilju pronalaženja efikasnog, prirodnog
i neškodljivog antimikotika.
MasterradMartinaStojković
52
6. LITERATURA
Alkofahi A., Sallal A. J., Disi A. M. 1997: Effect of Eryngium creticum on the hemolytic activities of snake and scorpion venoms. Phytotherapy research 11(7): 540-542.
Andersone U., Druva-Lusite I., Ieviņa B., Karlsons A., Ņečajeva J., Samsone I., Ievinsh G. 2010: The use of nondestructive methods to assess a physiological status and conservation perspectives of Eryngium maritimum L. – Journal of Coastal Conservation 4: 509-522.
Ayoub A., Al-Azizi M., König W., Kubeczka K. H. 2006: Essential oils and a novel polyacetylene from Eryngium yuccifolium Michaux. (Apiaceae). – Flavour and fragrance journal 21(6):864-868.
Ayoub N. A., Kubeczka K. H., Nawwar M. A. M. 2003: An unique n-propyl sesquiterpene from Eryngium creticum L. (Apiaceae). – Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences 58(9): 674-676.
Baytop T., 1999. T¨urkiye’de Bitkilerle Tedavi-Gec¸mis¸ten Bug¨une (Therapy with Medicinal Plants in Turkey-Past and Present), 169., 2nd ed. Nobel Tıp Basımevi, Istanbul, Turkey.
Bencao, E. C. O. Z. 1999: Zhonghua Bencao. Shanghai Science and Technology Press: Shanghai, Vol. 5.
Bem Z. & Adamič J. 1991: Mikrobiologija mesa i proizvoda od mesa, Univerzitet u Novom Sadu, Tehnološki fakultet.
Boršić I., Nikolić I. 2006: Flora, Zagreb. Cádiz-Gurrea M. L., Fernández-Arroyo S., Joven J., Segura-Carretero, A. 2013:
Comprehensive characterization by UHPLC-ESI-Q-TOF-MS from an Eryngium bourgatii extract and their antioxidant and anti-inflammatory activities. – Food Research International 50(1), 197-204.
MasterradMartinaStojković
53
Calvino C.I., Martinez S.G., Downie S.R. 2008: The evolutionary history of Eryngium (Apiaceae, Saniculoideae): Rapid radiations, long distance dispersals, and hybridizations. – Molecular phylogenetics and evolution 46: 1129–1150.
Capasso F., Gaginella TS., Grandolini G., Izzo AA. 2005: Fitoterapija – Priručnik biljne medicine. Prometej, Novi Sad.
Capetanos C., Saroglou V., Marin P. D., Simić A., Skaltsa H. D. 2007: Essential oil analysis of two endemic Eryngium species from Serbia. – Journal of the Serbian Chemical Society 72(10): 961-965.
Cavaleiro C., Goncalves M. J., Serra D., Santoro G., Tomi F., Bighelli A., Salgueiro L., Casanova J. 2011: Composition of a volatile extract of Eryngium duriaei subsp. juresianum (M. Lainz) M. Lainz, signalised by the antifungal activity. – Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 54: 619-622.
Crowden R. K., Harborne J. B., Heywood V. H. 1969: Chemosystematics of the Umbelliferae - A general survey. – Phytochemistry 8: 1963-1984.
Cushnie T.T., Lamb A. J., 2005: Antimicrobial activity of flavonoids. – International Journal of Antimicrobial Agents 26(5): 343–356.
Darriet F., Bendahou M., Desjobert J. M., Costa J., Muselli, A. 2012: Bicyclo [4.4.0] decane oxygenated sesquiterpenes from Eryngium maritimum essential oil. – Planta Medica 78:386-389
De Guzman C. C & Siemosma J.S. (1999) Spices, No. 13. Prosea, Leiden.
Deva R. 2010: Metabolism of arachidonic acid and formation of novel 3-hydroxyoxylipins by Candida albicans and interaction of HeLa cells-Candida albicans as a model for vulvovaginal candidiasis: redundancy of signaling pathways for activation of COX-2. PhD Disertation, Faculty of Human Medicine. Freie Universität Berlin.
MasterradMartinaStojković
54
Duraković S., Opća mikrobiologija, Prehrambeno- tehnološki inženjering, Zagreb, 1996.
Duke J. A., Bogenschutz-Godwin M. J., duCellier J Duke, P-AK. 2002: Handbook of medicinal herbs. London:277-278.
Duke J. A. 2009: Duke's handbook of medicinal plants of Latin America. USA: CRC Press, Taylor and Francis: 298–300.
Dunkić V., Vuko E., Bezić N., Kremer D., Ruščić M. 2013: Composition and Antiviral Activity of the Essential Oils of Eryngium alpinum and E. amethystinum. – Chemistry & biodiversity 10(10): 1894-1902.
Erdelmeier C.A & Sticher O. 1985: Coumarin derivatives from Eryngium campestre. – Planta medica 51(5), 407-409.
Erdelmeier C.A & Sticher O. 1986: A cyclohexenone and a cyclohexadienone glycoside from Eryngium campestre. – Phytochemistry 25: 741–743
Flamini G., Tebano M., Cioni P. L. 2007: Composition of the essential oils from leafy parts of the shoots, flowers and fruits of Eryngium amethystinum from Amiata Mount (Tuscany, Italy). – Food Chemistry 107: 671-674.
Garrity G.M., Brenner D.J., Krieg N.R., Staley J.R. 2005. Bergey's manual of systematic bacteriology, The Proteobacteria, Parts A - C.. Springer,Verlag. Vol 2.
Glowniak K., Madej A., Zak D. 2004: Chromatographic analysis of petroleum ether extract and methanol extract from fruits of Eryngium campestre L. 4th International Symposium on Chromatography of Natural Products, Lublin–Kazimierz Dolny (Poland), 106.
Goleniowski M. E., Bongiovanni G. A., Palacio L., Nuñez C. O., Cantero J. J. 2006: Medicinal plants from the “Sierra de Comechingones”, Argentina. – Journal of Ethnopharmacology 107(3), 324-341.
Hashemabadi D., Kaviani B., Erfatpour M., Larijani K. 2010: Comparison of essential oils compositions of eryngo (Eryngium caucasicum Trautv.) at
MasterradMartinaStojković
55
different growth phases by hydrodistillation method. – Plant Omics Jurnal 3(4): 135-139.
Hawas W. U., El-Kassem T., Lamia A., Awad M. H., Taie, A. A. H. 2013:. Anti-Alzheimer, Antioxidant Activities and Flavonol Glycosides of Eryngium campestre L. Current Chemical Biology 7(2): 188-195.
Hiller K., Pohl B., Franke P. 1981: Flavonoid spectrum of Eryngium maritimum L. Part 35. Components of some Saniculoideae. – Pharmazie 36(6): 451-452.
Hohmann J., Pall Z., Gunther G., Mathe I.1997: Flavonolacyl glycosides of the aerial parts of Eryngium campestre.– Planta Medica 63: 96.
Huie C., 2002: A review of modern sample-preparation techniques for the extraction and analysis of medicinal plants. – Analytical Bioanalytical Chemistry: 373: 23-30
Ikramov M.T., Bandyukova V.A., Khalmatov K.K. 1971: Flavonoids of some Eryngium species. – Himiya Prirodnyk Soedinenii 7(1): 117-118.
Jaghabir M. 1991: Hypoglycemic effects of Eryngium creticum. – Archives of Pharmacal Research 14(4): 295-297.
Jančić, R. 2004. Botanika farmaceutika, Službeni list SCG, Beograd.
Jančić, R., Stojanović, D. 2008. Ekonomska botanika, korisne biljke i njihovi proizvodi, Zavod za udžbenike, Beograd.
Karakaševoć B., Aleraj D. 1967: Priručnik standardnih metoda za mikrobiološki rutinski rad. – Medicinska knjiga, Beograd.
Kartal M., Mitaine-Offer A.C., Abu-ASsaker M., Miyamoto T., Calis I., Wagner H., Lacaille-Dubois M.A. 2005: Two New Triterpene Saponins from Eryngium campestre. – Chemical and pharmaceutical bulletin 53(10): 1318-1320.
MasterradMartinaStojković
56
Kartal M., Mitaine-Offer A. C., Paululat T., Abu-Asaker M., Wagner H., Mirjolet J. F., Guilbaud N., Lacaille-Dubois M. A. 2006: Triterpene saponins from Eryngium campestre. Journal of natural products 69: 1105-1108.
Kayaoglu G., Ørstavik D. 2004: Virulence factors of Enterococcus faecalis: relationship to endodontic disease. – Critical Reviews in Oral Biology & Medicine 15(5): 308-320.
Kikowska M., Budzianowski J., Krawczyk A.,Thiem B. 2012: Accumulation of rosmarinic, chlorogenic and caffeic acids in in vitro cultures of Eryngium planum L. Acta physiologiae plantarum 34: 2425–2433.
Kitić, D. 2010. Etarska ulja. Studentski Medicinski Glasnik, 1(1): 149-156.
Khoshbakht K., Hammer K., Pistrick K. 2007: Eryngium caucasicum Trautv. cultivated as a vegetable in the Elburz Mountains (Northern Iran). – Genet Resour Crop Evol 54: 445–448.
Kovačević N (2004): Osnovi farmakognozije. Treće izdanje. Institut za farmaknognoziju, Farmaceutski fakultet, Univerzitet u Beogradu. Srpska školska knjiga, Beograd.
Küpeli E., Kartal M., Aslan S., Yesilada E. 2006: Comparative evaluation of the anti-inflammatory and antinociceptive activity of Turkish Eryngium species. – Journal of ethnopharmacology 107(1): 32-37.
Laišić S. & Grujić-Injac B. 1998: Hemija prirodnih proizvoda, Tehnološki fakultet, Novi Sad.
Laetitia M.D., Le Floch G., Magne C. 2008: Radical scavenging, antioxidant and antimicrobial activities of Halophytic species. – Journal of Ethnopharmacology 116(2): 258-262.
Lam J., Christensen L. P., Thomasen T.1992: Actylenes from roots of Eryngium bourgatti. – Phytochemistry 31:2881-2.
MasterradMartinaStojković
57
Le Claire E., Schwaiger S., Banaigs B., Stuppener H., Gafner F. 2005: Distribution of a New Rosmarinic Acid Derivative in Eryngium alpinum L. and Other Apiaceae. – Jurnal of Agricultural and Food Chemistry 53: 4367-4372.
Lev E. 2002: Reconstructed materia medica of the Medieval and Ottoman al-Sham. Journal of Ethnopharmacology 80: 167–179.
Lisciani R., Fattprusso E., Surano V., Cozzolino S., Giannattasio M., Sorrentino L. 1984: Antiinflammatory activity of Eryngium maritimum L. rhizome extracts in intact rats. – Journal of ethnopharmacology 12: 263-270.
Marčetić M. D., Petrović S. D., Milenković M. T., Niketić M. S. 2013: Composition, antimicrobial and antioxidant activity of the extracts of Eryngium palmatum Pančić and Vis. (Apiaceae). – Central European Journal of Biology 9(2): 149-155.
Marin P. D 2003: Biohemijska i molekularna sistematika biljaka. NNK international, Beograd.
Masaadeh H. A. & Jaran A. S. 2009: Incident of Pseudomonas aeruginosa in post-оperative wound infection. – American Journal of Infectious Diseases 5(1): 1-6.
Matejić J. 2003: Biološka aktivnost etarskih ulja i ekstrakata odabranih vrsta iz familije Apiaceae. Doktorska disertacija, Biološki fakutet, Univerzitet u Beogradu.
Matović M. 2000: Lekovita moć bilja. EDITPRINT, Beograd
Mazza F. 2000: Itinerari alla scoperta delle erbe officinali del Monte Amiata. Abbadia S. Salvatore, Siena, Italy: Stampa.
Mekhora C., Muangnoi C., Chingsuwanrote P., Dawilai S., Svasti S., Chasri K., Tuntipopipat S. 2012: Eryngium foetidum suppresses inflammatory mediators produced by macrophages, Asian Pacific. – Journal of Cancer Prevention 13: 653-664.
MasterradMartinaStojković
58
Moerman D. E. 2009: Native American medicinal plants: an ethnobotanical dictionary. Timber Press: Portland.
Muckensturm B., Boulanger A., Farahi M., Reduron J.P. 2010: Secondary metabolites from Eryngium species. Natural product research 24 (5), 391-397.
Nebija F., Stefkov G., Karapandzova M., Stafilov T., Panovska T. K., Kulevanova S. 2009: Chemical characterization and antioxidant activity of Eryngium campestre L., Apiaceae from Kosovo. – Macedonian pharmaceutical bulletin, 55 (1, 2): 22-32.
Nikolić V. (1973) Fam. Apiaceae. In: Josifivić M. (Ed.), Flora SR Srbije 5. Beograd, Srbija, SANU, pp. 183-348.
Nikolić T. 2013: Sistematska botanika. Alfa, Zagreb. 779-782.
Onche I., & Adedeji О. 2004: Microbiology of post-operative wound infection in implant surgery. – Nigerian Journal of Surgical Research 6(1-2): 37-40.
Pala-Paul J., Perez-Alonso M. J., Velasco-Negueruela A., Vadare J., Villa A. M., Sanz J., Brophy J.J. 2005: Essential oil composition of the different parts of Eryngium bourgatii Gouan from Spain. – Journal of Chromatography A 1074: 235-239.
Palá-Paúl J., Pérez-Alonso M. J., Velasco-Negueruela A., Vadaré J., Villa A. M., Sanz, J., Brophy J. J. 2005: Analysis of the essential oil composition from the different parts of Eryngium glaciale Boiss. from Spain. – Journal of Chromatography A 1094: 179-182.
Palá-Paúl J., Copeland L. M., Brophy J. J., Goldsack R. J. 2006: Essential oil composition of Eryngium rosulatum PW Michael ined.: A new undescribed species from eastern Australia. – Biochemical systematics and ecology 34(11): 796-801.
Paul J. H. A., Seaforth C. E., Tikasingh T. 2011: Eryngium foetidum L.: a review. – Fitoterapia 82(3): 302-308.
MasterradMartinaStojković
59
Petersena M. & Simmonds M.S.J. 2003: Rosmarinic acid.– Phytochemistry 62:121–125.
Petkov, V. 1982. Sovremena fitoterapija, Medicina i fiskultura, Sofija, 297-298.
Ping W., Zushang S., Wei Y., Guangrui D., Shiyou L. 2012: Phytochemical constituents and pharmacological activities of Eryngium L. (Apiaceae). – Pharmaceutical Crops 3: 99-120.
Ranković B. 1996. Sistematika gljiva. Prirodno matematički fakultet. Kragujevac.
Rolhion N., & Darfeuille‐Michaud A. 2007: Adherent‐invasive Escherichia coli in inflammatory bowel disease. – Inflammatory bowel diseases 13(10): 1277-1283.
Saenz M. T., Fernandez M. A., Garcia M. D. 1998: Anti-inflammatory and analgesic properties from leaves of Eryngium foetidum L. (Apiaceae). – Phytotherapy Research 11: 380-383.
Samokovlija A., Đuričić B. 2009: Escherichia coli – Old problem, new pathology. – Veterinarski glasnik 63: 113-123.
Schinkovitz A., Stavri M., Gibbons S., Bucar F.2008: Antimycobacterial
polyacetylenes from Levisticum officinale. Phytotherapy Research 22: 681-684.
Sezik E., Yesilada E., Tabata M., Honda G., Takaishi Y., Fujita T., Tanaka T.,
Takeda Y. 1997: Traditional medicine in Turkey VIII. Folk medicine in East Anatolia; Erzurum, Erzincan, Agri, Kars, Igdir provinces. – Economic Botany 51: 195–211.
Simić. D. 1968: Mikrobiologija I – Naučna knjiga, Beograd. 124-128.
Simon O. R. & Singh N. 1986: Demonstration of anticonvulsant properties af an aqueous extract of spirt weed (Eryngium foetidum L.). – West Indian medical journal 35: 121-125.
MasterradMartinaStojković
60
Sparg S., Light M. E., Van Staden J. 2004: Biological activities and distribution of plant saponins. – Journal of enthopharmacoly 94:219-43.
Švabić-Vlahović M., Đukić-Ivančevič S., Dakić I., Mijač-Vasiljević V., Opavski N. 2005: Medicinska bakteriologija. Savremena adminnistracija, Beograd. 166-264.
Stevens D. L. Streptococcus pyogenes (Group A β-hemolytic Streptococcus). http://www.antimicrobe.org/b239.asp
Tadić B., Blečić V. 2002: Sistematika i filogenija viših biljaka, drugo izdanje – Zavod za udžbenike i nastavna sredstva, Beograd. 262-264.
Thiem B., Goslinsla O., Kikowska M., Budzianowski J. 2010: Antimicrobal activity of three Eryngium L. Species ( Apiaceae). – Herba Polonica 4(56). 53-57.
Todar K. 2008, http://www.textbookofbacteriology.net/staph.html.
Todar, K. (2007): "Pathogenic E. coli". Online Textbook of Bacteriology. University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology. http://www.textbookofbacteriology.net/e.coli.html.
Usta C., Yildirim A. B., & Turker A. U. 2014: Antibacterial and antitumour activities of some plants grown in Turkey. –Biotechnology & Biotechnological Equipment 28(2): 306-315.
Valnet J. (1977). Cura delle malattie con le piante. Giunti Editore, Firenza.
Wajs A., Kurowska A., Thiem B., Kalemba D. 2006: Composition of Essentials oil of Eryngium planum L. 37th International Symposium on Essential Oils ISE O Grasse-Opio, 116.
Wang P., Su Z., Yuan W., Deng G., Li S. 2012: Phytochemical constituents and pharmacological activities of Eryngium L. (Apiaceae). – Pharmaceutical Crops 3: 99-120.
MasterradMartinaStojković
61
Wörz A. 2006: Systematics and distribution patterns of the Balkan species of Eryngium (Apiaceae, Saniculoideae). – Phytologia Balcanica 12(2): 221-230.
Yesilada E., & Sezik E. 2003: A survey on the traditional medicine in Turkey: Semi-quantitative evaluation of the results. – Recent progress in medicinal plants 7: 389-412.
Zarnack J., Hildebrandt B., Hiller K., Otto A. 1979: To the knowledge of the compounds contained in some Saniculoideae. part XXXIII. isolation of flavonol glycosides from Eryngium giganteum M. B. – Zeitschrift fuer Chemie 19(6): 214-215.
Zhang Z., Li S., Ownby S., Wang P., Yuan W., Zhang W., Beasley R. S. 2008: Phenolic compounds and rare polyhydroxylated triterpenoid saponins from Eryngium yuccifolium. – Phytochemistry 69: 2070-2080.
Прилог 4/1
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редни број, РБР:
Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: монографска
Тип записа, ТЗ: текстуални / графички
Врста рада, ВР: Мастер рад
Аутор, АУ: Мартина Стојковић
Ментор, МН: Зорица Стојановић Радић
Наслов рада, НР: Антимикробна активност метанолних, етил ацетатних, ацетонских и водених екстраката одабраних врста рода Eryngium
Језик публикације, ЈП: Српски
Језик извода, ЈИ: Енглески
Земља публиковања, ЗП: P. Србија
Уже географско подручје, УГП: P. Србија
Година, ГО: 2015.
Издавач, ИЗ: ауторски репринт
Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.
Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)
61 страна, 9 табела, 4 слика, 4 графика.
Научна област, НО: Биологија
Научна дисциплина, НД: Микобиологија
Предметна одредница/Кључне речи, ПО: антимикорбна активност, биљни екстракти, Eryngium campestre, Eryngium palmatum, Eryngium serbicum, Erygium amethystinum
УДК
Чува се, ЧУ: Библиотека
Важна напомена, ВН:
Извод, ИЗ: У овом раду испитана је антимикробна активност метанолних, етил ацетатних, ацетонски и водених екстраката врсте Еryngium campestre, Eryngium palmatum, Eryngium serbicum, Eryngium amethystinum у односу на осам врста бактерија и једну врсту гљива. Резултати су указали на значајну антимикробну активност тестираних екстраката која се кретала у опсегу концентрација 0.004-20.00 mg/ml, при чему су највећу активност показали етил ацетатни екстракт Eryngium palmatum и ацетонски екстакт врсте Eryngium campestre.
Датум прихватања теме, ДП:
Датум одбране, ДО:
Чланови комисије, КО: Председник:
Члан:
Члан, ментор:
Прилог 4/2
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO: Identification number, INO:
Document type, DT: Monograph
Type of record, TR: textual / graphic
Contents code, CC: Master thesis
Author, AU: Martina Stojković
Mentor, MN: Zorica Stojanović Radić
Title, TI: The antimicrobial activity of methanol, ethyl acetate, acetone and water extracts of the selected Eryngium species
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: English
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2015.
Publisher, PB: Author’s reprint
Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.
Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)
61 pages, 9 tables, 4 pictures, 4 graph
Scientific field, SF: Biology
Scientific discipline, SD: Microbiology
Subject/Key words, S/KW: antimicrobial activity, plant extracts, Eryngium campestre, Eryngium palmatum, Eryngium serbicum, Erygium amethystinum
UC
Holding data, HD: Library
Note, N:
Abstract, AB: In this study antimicrobial activity of methanol, ethyl acetate, acetone and aqueous extracts of the species Eryngium campestre, Eryngium palmatum, Eryngium serbicum, Erygium amethystinum was tested against eight bacterial and one fungal species. Results showed significant antimicrobial activity of the tested extracts which ranged 0.004-20.00 mg/ml, where ethyl acetate extract of Eryngium palmatum and acetone extract of Eryngium campestre exhibited the highest inhibitory activities.
Accepted by the Scientific Board on, ASB:
Defended on, DE:
Defended Board, DB: President:
Member:
Member, Mentor: