ASIMILACIJA AZOTA,
SUMPORA I FOSFORA
• Više biljke, kao autotrofni organizmi, mogu da
sintetišu organske supstance iz neorganskih, koje
usvajaju uglavnom iz zemljišta.
• Inkorporacija mineralnih elemenata (nutrijenata,
hranljivih supstanci za biljke) u organska jedinjenja
kao što su pigmenti, enzimski kofaktori, lipidi,
nukleinske kiseline i aminokiseline, tj. jedinjenja
koja su od krucijalnog značaja za život biljaka,
označava se terminom asimilacija nutrijenata.
• Asimilacija ugljenika u organska jedinjenja (šećere i
druge ugljene hidrate) obavlja se u procesu
fotosinteze.
• Za biljke je, međutim, od velikog značaja i
asimilacija azota, sumpora i fosfora.
• Procesi redukcije nitrata i nitrita i redukcije sulfata i sulfita, koji
su deo asimilacije azota i sumpora kod viših biljaka, zajedno
sa fotosintezom čine najvažnije metaboličke procese kod
biljaka. Smatra se da ti procesi čine biljke autotrofima i da su specifični za biljke.
• Asimilacija azota i sumpora zahtevaju niz biohemijskih
reakcija koje spadaju u reakcije sa velikim energetskim zahtevima (za njih se troši mnogo molekula ATP-a).
• Za asimilaciju azota iz nitrata (NO3-), pri čemu se azot u formi nitrata
konvertuje u energijom bogatiju formu nitrita (NO2-), a zatim u
energijom još bogatiju formu amonijuma (NH4+) i najzad u amidni oblik
(NH2) azota u sastavu glutamina, potrebna je energija ekvivalentna
onoj koju sadrži 12 molekula ATP po jednom atomu azota koji se
asimiluje.
• Za proces biološke fiksacije azota (konverzija N2 u NH3), kod biljaka
koje zahvaljujući simbiozi sa bakterijama diazotrofima imaju tu
mogućnost, zajedno sa potonjom asimilacijom amonijaka u
aminokiseline potreban je utrošak energije ekvivalentne onoj koju
sadrži 16 molekula ATP, po svakom atomu azota koji se asimiluje.
• Za asimilaciju SO42-
u aminokiselinu cistein, posredstvom dva puta
pronađena kod biljaka, troši se ekvivalent energije koji sadrži 14
molekula ATP.
• Asimilacija drugih nutrijenata, a naročito katjona kao što su Ca2+
, Mg2+
i Mo6+
, potrebno je formiranje kompleksa sa organskim jedinjenjima
(Ca2+
se vezuje za pektine ćelijskog zida, Mg2+
za hlorofil, a Mo6+
za
enzime kao što su nitrat reduktaza i nitrogenaza), koji su veoma
stabilni. Uklanjanje nutrijenata iz tih kompleksa obično dovodi do
gubitka funkcije organskih jedinjenja koja su u kompleksu sa
nutrijentima.
• U biosferi se nalazi više različitih oblika azota: kao gas,
molekularni N2 (oko 78%) u atmosferskom vazduhu, u obliku
neorganskih jona NO3- i NH4
+ ulazi u sastav zemljišta, kao
sastojak mnogih organskih jedinjenja rasprostranjen je u celom
živom svetu.
• Svi oblici azota se u prirodi neprekidno transformišu jedan u
drugi i te promene su povezane u ciklus azota.
• Za većinu živih organizama najveći rezervoar azota (vazduh)
nije direktno dostupan. Snabdevanje azotom iz atmosfere
podrazumeva raskidanje izuzetno stabilne trostruke kovalentne
veze između dva atoma azota u molekulu gasovitog azota,
kako bi nastali amonijum (NH4+) i nitratni (NO3
-) joni. Te hemijske
reakcije su poznate pod nazivom fiksacija azota i mogu da se
odvijaju i industrijskim (Haber-Bosch-ov proces proizvodnje amonijaka) i prirodnim (električna pražnjenja u atmosferi,
fotohemijske reakcije i biološka fiksacija) putem.
Asimilacija azota
• Više biljke dobijaju azot isključivo iz zemljišta na kome žive.
• Blizu 90% azota u zemljištu se nalazi u obliku organskih azotnih jedinjenja.
• Različite bakterije i gljivice razlažu organska jedinjenja u procesu mineralizacije ili amonifikacije, pri čemu se obrazuje amonijak.
• Amonijumovi joni su podložni hemosintetičkoj oksidaciji koju obavljaju bakterije:
Nitrosomonas oksiduje NH4+ u NO2
-
Nitrobacter oksiduje NO2- u NO3
-
• Nitrat koji na taj način nastaje, sa nitratom koji potiče iz drugih izvora (veštačka đubriva i dr.), predstavlja najvažniji oblik azota koji biljke primaju .
• Količina nitrata u zemljištu nije stabilna - gravitaciona voda spira nitrate u dublje slojeve zemljišta, zbog čega oni postaju nedostupni za biljku (u okeanima se to takođe dešava povremeno, ali, naravno, na drugi način)
• Denitrifikacija (Micrococcus denitrificans - prevodi nitrate u molekulski N2 i vraća azot u atmosferu).
• Kad se azot fiksira u amonijum i nitrat,
on ulazi u ciklus azota i može da
pređe kroz više organskih i
neorganskih formi pre nego što se
ponovo vrati u oblik molekularnog
azota.
• Biljkama i životinjama je dostupan
azot u obliku nitrata i amonijuma.
• Ukoliko količina usvojenih (korenom)
nitrata prevazilazi kapacitet biljke da
ih asimiluje, nitrati se akumuliraju u
biljci i ona može i da ih skladišti i da
ih transportuje iz tkiva u tkivo bez
štetnih posledica. Međutim, prevelike
količine nitrata u biljkama imaju
štetne efekte na biljojede.
• Akumulacija amonijum jona u biljkama je toksična i za biljke i za
biljojede. Oni su dekuplujući agensi u fotosintezi i disanju (rasipaju
gradijent protona na tilakoidnim membranama i unutrašnjim
membranama mitohondrija). Zbog toga ih biljke ili asimiluju blizu mesta
usvajanja ili deponuju u vakuolama.
Biološka redukcija nitrata i nitrita
• Biljke usvajaju nitrate iz zemljišta,
korenom, aktivnim transportom
kroz ćelijske membrane.
Transport pripada sekundarnom
aktivnom transportu –
kotransporteri obavljaju simport
protona i nitrata iz apoplasta u
citoplazmu.
• NO3- mora da se redukuje da bi
se asimilovao, a redukcija se
odvija u dva stupnja: 1) nitrat se
najpre redukuje u nitrit, a zatim
se 2) nitrit redukuje u
amonijumov jon.
• Ove procese, koji pretstavljaju
prvi korak u asimilaciji azota,
katalizuju dva enzima, nitratna
i nitritna reduktaza.
Gde se u biljci odigrava biološka redukcija nitrata i nitrita?
• Redukcija nitrata može da se obavi u korenu, gde
se izgrađuju aminokiseline i amidi, koji se u stablo
transportuju putem ksilema.
• Nitratni jon može i da bude transportovan u listove,
u kojima se onda obavljaju redukcija nitrata i
sinteza organskih jedinjenja.
• Dva ekstremna primera su biljke Lupinus albus i
Xanthium strumarium. Kod prve se više od 90%
usvojenih nitrata redukuje u korenu, a korenovi
druge vrste gotovo uopšte ne redukuju nitrat, nego
se ovaj jon transportuje u listove.
• Kod jedne iste biljke raspodela asimilacije azota
između korena i lista može da varira, zavisno od
stadijuma razvića ili nekih spoljašnjih činilaca .
• Pri niskoj koncentraciji nitrata (oko 1 mol m-3),
kakva se obično nalazi u prirodi, asimilacija u
korenu je znatna u odnosu na list. Pri većoj
koncentraciji nitrata (oko 20 mol m-3), koja se
postiže primenom đubriva, asimilacija u listovima se
značajno povećava i može da prevaziđe onu u
korenu.
U korenu se deo
aminokiselina koristi za
sinteze proteina, a deo se transportuje ksilemom u
nadzemne delove biljke.
Razlikuju se dve grupe
biljaka po tome u kom
organskom obliku
pretežno transportuju azot
ksilemom: 1) biljke kod
kojih su glavni transportni
oblik azota amidi (asparagin i glutamin) i 2)
biljke koje transportuju
azot u obliku ureida
(alantoin, alantoinska
kiselina i citrulin).
1) Redukcija nitrata u nitrite
• Redukcija nitrata u nitrite dešava se uvek u citoplazmi (bez obzira na to da
li se odvija u ćelijama korena ili ćelijama lista).
• Reakciju katalizuje enzim nitratna reduktaza (NR).
• Donor elektrona za redukciju nitrata može biti redukovani NADPH ili NADH.
Izoforme NR se razlikuju po tome da li elektrone primaju samo od NADH ili
i od NADH i od NADPH (ove druge su zastupljene u tkivima koja nisu
zelena, tkivima korena napr.)
• NR je dimer, sastavljen iz dve identične subjedinice, od kojih svaka nosi
po 3 prostetične grupe: FAD (flavin adenin dinukleotid), hem (u sastavu
citohroma b557) i molibdenski kofaktor (MoCo; molibden vezan za pterin).
• Domeni polipeptida za koje se vezuju prostetične grupe razdvojeni su
domenima koji ih spajaju (spojnice I i II), koji su veoma varijabilni po
primarnoj strukturi.
• Na enzimu postoje dva aktivna mesta – za jedno (na C-terminusu) vezuje
se NAD(P)H, a za drugo (na N-terminusu) nitrat.
• NR funkcioniše kao elektron-transportni lanac – prenosi 2 elektrona sa
NAD(P)H, na FAD, zatim na gvožđe hema, pa na molibden MoCo, koji
prima ta dva elektrona i redukuje nitrat do nitrita.
• Redukciju nitrata inhibiraju cijanid i azid (inhibitori disanja).
• NR je inducibilan enzim (supstratna indukcija enzima).
• Nitrati, svetlost, citokinini (grupa biljnih hormona) i ugljeni hidrati
učestvuju u regulaciji aktivnosti nitratne reduktaze na transkripcionom i
translacionom nivou. Nitrati stimulišu ekspresiju gena za NR (supstratna
indukcija enzima), a svetlost i nivoi šećera u ćeliji utiču na aktivnost
ovog enzima posredstvom fosforilacije i defosforilacije.
Dnevni (cirkadijalni) ritam asimilacije azota
2) Redukcija nitrita u amonijum
• NO2- je veoma reaktivan i potencijalno toksičan jon, pa se iz citoplazme
odmah transportuje u plastide, gde se redukuje do amonijum jona.
• Redukciju nitrita obavlja enzim nitritna reduktaza (NiR). Ovaj enzim se
nalazi isključivo u plastidima, i to u hloroplastima ćelija lista i u
proplastidima ćelija korena.
• Nitritna reduktaza obavlja prenos 6 elektrona na nitrit, pri čemu se ne
pojavljuju međuprodukti, nego se odmah dobija amonijumov jon.
• NiR je monomerni protein sa dve prostetične grupe: 4Fe-4S centar i
sirohem (specijalizovani hem).
• Donor elektrona je redukovani feredoksin (Fdred) koji elektrone dobija ili
od P700, u fotosintezi, ili od NADPH koji nastaje u oksidativnom
pentoznom ciklusu. U ćelijama korena, gde nema hloroplasta i
redukovanog feredoksina, ulogu donora ima protein sličan feredoksinu
koji elektrone prima od NAD(P)H koji nastaje u procesu disanja.
• Geni za NiR nalaze se u jedru, a enzim se sintetiše u citoplazmi.
• Nitrati i svetlost indukuju ekspresiju gena za NiR, a aspasagin i glutamin
utiču na represiju tih gena.
sirohem
Asimilacija amonijumovih jona • Azot se ugrađuje u organska jedinjenja samo u obliku amonijumovih
jona, koje biljka ili usvaja iz zemljišta ili dobija redukcijom nitrata i nitrita.
• Značajan izvor amonijum jona kod C-3 biljaka je fotorespiracija.
• Amonijum joni mogu biti i proizvod katabolizma azotnih jedinjenja.
• Akumulirani amonijum joni su toksični za fotosintezu, pa se onda odmah
asimiluju ili se deponuju u vakuoli.
• Asimilacija amonijum jona u azotna organska jedinjenja uvek ide preko
amonokiselina.
• Za sintezu aminokiselina potrebni su: amonijum joni, ketokiseline, ATP i
reduktanti.
• Biosinteza aminokiselina zavisi od fotosinteze i disanja.
• Primarna sinteza aminokiselina podrazumeva cikličan proces u kojem se
amonijum grupa vezuje za glutaminsku kiselinu pri čemu nastaje
glutamin, koji opet transaminacijom (uz prisustvo α keto glutarne
kiseline) može da da dve glutaminske kiseline. Za proces su potrebni ATP
i dva enzima – glutamin sintetaza (GS) i glutamat sintaza (GOGAT) – koji
čine sistem GS/GOGAT.
• Pošto je glutaminska kiselina prva aminokiselina koja nastaje
asimilacijom amonijum jona, ona se naziva primarnom aminokiselinom.
Ona i glutamin su davaoci NH2 grupe za sve ostale aminokiseline, kao i
izvor organskog azota za sintezu složenijih organskih azotnih jedinjenja.
• GOGAT elektrone prima od NAD(P)H u plastidima tkiva koja ne
fotosintetišu (u korenu) ili od redukovanog feredoksina u
hloroplastima tkiva koja fotosintetišu (u listu).
• Postoje najmanje dva sistema GS/GOGAT u biljnim ćelijama. Jedan
ima izoenzim GS2, koji se nalazi u plastidima ćelija listova i korena.
Taj enzim koristi ATP iz fotosinteze (ili glikolize u korenovima) i
amonijum jone koji nastaju redukcijom nitrita ili u fotorespiraciji. GS2
ima visok afinitet ka amonijum jonima, vezuje ih i sprečava njihovo
štetno dejstvo na fotosintezu. Drugi GS/GOGAT sistem ima izoenzim
GS1 koji se nalazi u citoplazmi, koristi ATP iz glikolize i amonijum jone
koji se usvajaju iz zemljišta ili nastaju u katabolizmu azotnih organskih
jedinjenja.
• GS se nalazi i u citoplazmi i u plastidima, ali je kontrola ekspresije
gena za te različito locirane enzime različita. Svetlost i nivoi ugljenih
hidrata utiču na ekspresiju GS koje su aktivne u plastidima, dok ne
utiču značajno na citosolnu GS.
• Kad se jednom asimiluje u glutamat i glutamin, azot se ugrađuje u
druge aminokiseline u reakcijama transaminacije koje katalizuju
enzimi aminotransferaze (prenose amino grupe).
• Aminotransferaze imaju kao kofaktor piridoksal fosfat (vitamin B6) i
nalaze se u: citoplazmi, mitohondrijama, hloroplastima,
peroksizomima i glioksizomima.
• Sve aminokiseline nastaju transaminacijom iz 3 ketokiseline
(piruvat, oksaloacetat i α – ketoglutarat) ili od intermedijera u
metabolizmu ugljenih hidrata.
Piruvat → alanin, valin, leucin i izoleucin → cijanogeni glukozidi
Oksaloacetat → asparaginska kiselina, lizin, treonin i metionin → purin, alkaloidi, etilen, poliamini
α–ketoglutarat → glutaminska kiselina, arginin, prolin,
hidroksiprolin, ornitin, citrulin → 5-ALA, pirimidin, alkaloidi,
osmoprotektanti, strukturni proteini ćelijskog zida
Glikolat → glicin, serin, cistein (fotorespiracija) → purin
Eritrozo-4-fosfat i PEP → fenilalanin, tirozin, triptofan (put
šikiminske kiseline) → indolna jedinjenja, auksini, sekundarni
metaboliti, fenolna jedinjenja, flavonoidi, alkaloidi, lignin
Asimilacija sumpora • U prirodi postoji i kruženje sumpora (ciklus sumpora).
• Sumpor se u zemljištu nalazi u obliku različitih mineralnih soli i
organskih jedinjenja. Sumporni gasovi se nalaze u atmosferi.
Industrijalizacija i sagorevanje fosilnih goriva dovode do
aerozagađenja sumpornim jedinjenjima kao što su SO2 i H2S , koji u
dodiru sa vodom grade sumpornu kiselinu i dospevaju u zemljište
preko kisele kiše. Svi ovi oblici sumpora su dostupni biljkama (čak i
SO2 koji ulazi kroz stome, može se iskoristiti, ali u velikim dozama
dovodi do propadanja tkiva jer se konvertuje u sumpornu kiselinu) i one ih mogu koristiti.
• Sumpor ulazi u sastav većeg broja organskih jedinjenja koja su od
vitalnog značaja za biljke: aminokiseline cistein i metionin, CoA,
vitamini tiamin i biotin, sulfolipidi, proteini koji sadrže fero-sumporni
centar i učestvuju u prenošenju elektrona, glutation itd.
• Za funkcionisanje proteina od naročitog su značaja disulfidne
veze.
• Sulfatni jon je najčešći oblik sumpora koji biljka usvaja iz zemljišta.
Biološka redukcija sulfata i sulfita
• Usvajanje sulfata (SO42-
) iz zemljišta u ćelije korena je aktivan proces,
pripada sekundarnom aktivnom transportu i u njemu učestvuje
kotransporter koji obavlja simport protona (niz gradijent koncentracije) i
sulfata (uz gradijent koncentracije).
• Sulfati se akumuliraju u vakuolama ili podležu procesu redukcije, koja
prethodi asimilaciji u organska jedinjenja.
• Biološka redukcija sulfata je analogna redukciji nitrata i samo su biljke u
stanju da je obave. Iako je samo 0,2% redukcije CO2 i 20 puta manja od
redukcije nitrata, ona je isto toliko važna kao i druge dve biološke
redukcije i pripada procesima koji su bitni za autortofiju biljaka.
• Sulfatni jon je inertan i njegovoj redukciji
prethodi aktivacija (vezivanje za ATP), a
zatim sledi njegova redukcija prvo do
sulfita (2 elektrona), pa potom redukcija
sulfita do sulfida (6 elektrona).
• Dva ključna jedinjenja u procesu
redukcije sulfata do sulfida su APS i PAPS.
• Veliki značaj ima i tripeptid (Glu-Cys-Gly)
glutation, koji je i transportni oblik
asimilovanog, organskog sumpora.
• Asimilacija sulfida podrazumeva
vezivanje za serin (zamenu acetil grupe
SH grupom), pri čemu nastaje
aminokiselina cistein. Cistein se
konvertuje u metionin.
• Cistein je toksičan u većim količinama i
odmah se ugrađuje u organska jedinjenja,
pre svih u glutation.
• Redukcija sulfata i sulfita
dešava se u hloroplastima
ćelija lista (mezofilnih kod C-3
biljaka, a ćelija sare
provodnih snopića kod C-4
biljaka) i plastidima ćelija
korena.
• Listovi su aktivniji u asimilaciji
sumpora od korenova, zato
što fotosinteza obezbeđuje
velike količine redukovanog
feredoksina (donor elektrona),
a fotorespiracija znatne
količine serina (iz kojeg
nastaje cistein).
• Asimilovani sumpor se iz
listova transportuje floemom
do mesta u biljci gde je
intenzivna sinteza proteina
(vrhovi stabla i korena,
plodovi itd), uglavnom u
obliku glutationa.
Asimilacija fosfora
• Kao i u slučaju azota i sumpora, u prirodi postoji ciklus fosfora.
• Fosfor se usvaja iz zemljišta u obliku fosfata (HPO42-
), sekundarnim aktivnim
transportom (kotransporteri obavljaju simport fosfata i protona).
• Za razliku od azota i sumpora, fosfor se asimiluje u organska jedinjenja kao fosfat, bez
prethodne redukcije.
• Prvi stupanj usvajanja fosfora je vezivanje fosfata za inozitol (estarske veze sa svih 6
OH grupa inozitola), pri čemu nastaje fitinska kiselina. Soli fitinske kiseline sa
kalcijumom i magnezijumom su fitini. Fitini se nalaze u većim količinama u semenima
i plodovima biljaka i predstavljaju rezervu neorganskog fosfata i dvovalentnih
katjona.
• Prvo organsko jedinjenje koje sadrži fosfate i ima metaboličku funkciju je ATP. Sinteza
ATP-a obavlja se kod biljaka: u hloroplastima (fotosintetička fosforilacija),
mitohondrijama (oksidativna fosforilacija i Krebsov ciklus) i citoplazmi (glikoliza).
• Fosfati učestvuju u estarskim i anhidridnim vezema, koje pri hidrolizi oslobađaju veliku
energiju, zbog čega se smatraju najvažnijim načinom transformacije i prenosa
energije u ćeliji.
• Fosfor ulazi u sastav mnogih važnih organskih jedinjenja: nukleotida i nukleinskih
kiselina, fosfolipida, fosforilisanih šećera, koenzima (NAD, NADP i FAD).
• Fosfati mogu imati i regulatornu funkciju u nekim metaboličkim procesima (kao što je
sinteza skroba, na primer).
BIOLOŠKA FIKSACIJA AZOTA • Ima značajno mesto u ciklusu azota.
• Podrazumeva redukciju atmosferskog azota (N2) do amonijum jona (NH4+).
• Sposobnost biološke fiksacije azota ograničena je isključivo na
prokariotske organizme, ali neke više biljke, zahvaljujući simbiozi sa njima,
mogu da koriste proizvode fiksacije N2. U ovakvoj simbiozi mikroorganizmi
obavljaju redukciju atmosferskog azota, a biljka-domaćin prihvata
amonijum jon, asimiluje ga i mikroorganizme snabdeva organskim
jedinjenjima.
• Organizmi koji fiksiraju atmosferski azot nazivaju se diazotrofima.
• Diazotrofi pripadaju različitim taksonima i, osim fiksacije azota, nemaju
mnogo zajedničkih osobina. Među njima se nalaze cijanobakterije,
aktinomicete i bakterije različitih rodova, autotrofne i heterotrofne,
anaerobne i aerobne. Dele se u dve osnovne grupe:
slobodni diazotrofi (obligatni aerobi, aerobi, fakultativni anaerobi, obligatni
anaerobi)
simbiotički diazotrofi - Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium – simbioza
sa biljkama iz reda Fabales (leguminoze: grašak, pasulj, bob, soja, kikiriki,
naut, detelina, lucerka); Frankia (aktinomiceta) – simbioza sa drvećem i
žbunjem (aktinoriza); Nostoc, Anabaena (cijanobakterije) - simbioza sa
biljkama iz rodova Cycas i Ceratozamia, Azolla (paprat), Anthoceros
(mahovina) i mnogim lišajima.
Frankia alni - Alnus glutinosa (Betulaceae) aktinoriza
• Slobodni diazotrofi koji ne žive u anaerobnim uslovima moraju za fiksaciju N2 da
obezbede takve uslove kako bi proces fiksacije mogao da se odvija.
• Cijanobakterije (Nostoc, Anabaena, Calothrix) mogu da fiksiraju azot i kao slobodni
oblici. Kod njih se anaerobni uslovi obezbeđuju prostornim razdvajanjem fiksacije
N2. U njihovim specijalizovanim ćelijama, heterocistama, se odvija fiksacija azota.
• Heterociste imaju zadebljale ćelijske zidove, nepropustljive za O2. U njihovim
membranskim sistemima nema PSII, pa pri transportu elektrona ne proizvode
kiseonik i obavljaju samo ciklični transport elektrona, sintetišući samo ATP.
Heterociste nemaju enzime reduktivnog pentoznog ciklusa, ali je oksidativni
pentozni ciklus vrlo aktivan – u njemu nastaje NADPH koji predaje elektrone
feredoksinu, neposrednom donoru elektrona za fiksaciju azota. N2 ulazi u
heterociste kroz plazmodezme, a O2 koji tako uđe, odmah se troši u veoma
intenzivnom procesu disanja.
• Kod ovih diazotrofa svetlost je uslov za fiksaciju azota, kao i za fotosintezu u drugim
ćelijama.
Simbiotički diazotrofi
• Simbioza između leguminoza i rizobija nije obavezna.
• Bakterije (tri roda - Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium) koje
fiksiraju azot, a ulaze u simbiozu sa biljkama, žive inače (u odsustvu
biljaka-domaćina i pri dobroj snabdevenosti zemljišta azotom) kao
heterotrofni, slobodni oblici u zemljištu i tada ne fiksiraju azot.
• Biljke-domaćini mogu da rastu i bez simbioze sa diazotrofima i njihovo
klijanje nije pod kontrolom simbionata.
• Ako na zemljištu raste biljka koja je njihov potencijalni domaćin i ako je
količina azota u zemljištu mala, onda dolazi do specifičnog oblika
simbioze, koja podrazumeva infekciju biljke bakterijama i formiranje
posebnih organa na korenovima biljke (kvržice, nodule).
• Fiksacija azota kod leguminoza dešava se, prema tome, samo u
nodulama na korenovima biljaka.
• Infekcija bakterijama i formiranje nodula su nezavisni procesi koji se
dešavaju paralelno, a diazotrofi indukuju biljke da formiraju nodule na
korenovima.
• Većina vrsta navedena tri roda diazotrofa ima svoje specifične
domaćine po kojima dobijaju i ime.
• Uspostavljanje simbioze zahteva razmenu signala između potencijalnih
simbionata.
• U razmeni signala ulogu imaju specifični biljni i bakterijski geni – biljni
nodulin (Nod) geni koji se eksprimiraju samo u nodulama i bakterijski
nodulacioni (nod) geni koji učestvuju u formiranju nodula. Svi nod geni
osim jednog su inducibilni.
• Proces formiranja simbioze počinje hemotaksijom rizobija ka korenovima
biljke domaćina. Ovaj lokomotorni pokret bakterija izazvan je hemijskim
supstancama koje korenovi u određenoj fazi razvića biljke oslobađaju u
zemljište (flavonoidi i betaini). Te supstance aktiviraju prvo nodD gen, a on
dalje aktivira sve ostale nod gene.
• Proizvodi aktivnosti nod gena su proteini koji učestvuju u biosintezi Nod
faktora. Nod faktori su derivati ugljeno-hidratnih komponenti bakterijskog
ćelijskog zida, lipo-oligosaharidi, i oni su specifični za biljku-domaćina.
• Nod faktori deluju kao povratni signali na korenske dlačice i ćelije kore
korena.
• Nod faktori aktiviraju lektine (strukturne proteine ćelijskog zida biljaka koji
imaju funkciju u prepoznavanju ćelija) u ćelijskim zidovima korenskih
dlačica leguminoza, a ovi prepoznaju i olakšavaju vezivanje specifičnih
rizobija koje mogu da uđu u simbiozu sa tom vrstom leguminoza.
• Slede dva procesa koji se dešavaju paralelno: formiranje infekcione niti i
formiranje nodula. U formiranje nodula umešano je nekoliko grupa biljnih
hormona – citokinini, auksini i giberelini – koje sintetišu rizobije, kao
sekundarne metabolite.
Kada infekciona nit dođe do
primordije nodule, bakterije
izlaze iz niti, povećavaju
svoju veličinu, prestaju da se
dele i opstaju u ćelijama
nodule kao endosimbiotske
organele, bakteroidi,
obavijene peribakteroidnom
membranom.
Leghemoglobin se sintetiše
istovremeno sa formiranjem
bakteroida.
• Biljni hormoni, čiju sintezu određuju
bakterijski geni, regulišu procese
dediferencijacije, deobe i
rediferencijacije ćelija korena, koje
rezultiraju formiranjem prvo
primordija nodula, a zatim i nodula.
• U morfološkim (vaskularni elementi i
meristemski centar) i biohemijskim
promenama koje se dešavaju
tokom formiranja nodula imaju
ulogu i proteini nodulini (enzimi i
transporteri), koji su kodirani biljnim
Nod genima (ne eksprimiraju se kad
nema infekcije rizobijama).
• Nodule mogu biti izdužene
(indeterminantne) ili loptaste
(determinantne) u zavisnosti od toga
da li u njima postoji aktivan
meristemski centar ili ne.
Indeterminantne nodule su sastavljene
iz 3 tkiva: meristemskog, provodnog i
parenhimskog. Meristemsko tkivo nalazi
se na vrhu izdužene nodule. Provodno i
parenhimsko tkiva su organizovana u
periferno postavljene kortikalne slojeve
i centralno postavljeno tkivo koje sadrži
bakteroide. U diferenciranim nodulama,
u centralnom delu, razlikuje se 5
razvojnih zona, koje su rezultat
produžene aktivnosti nodule:
I. meristemsko tkivo
II. zona infekcije
III. zona rane simbioze
IV. zona kasne simbioze
V. senescentna zona
Fiksacija azota odvija se samo u zoni
kasne simbioze.
Determinantne nodule gube
meristemsko tkivo ubrzo posle infekcije
i dalje rastu samo na osnovu
povećanja volumena ćelija. One su
loptaste i sve ćelije u nodulama su u
istoj fazi razvića. Karakteristične su za
biljne simbionte poreklom iz tropskih
krajeva.
• Leghemoglobin je produkt kasnih
Nod gena. Nalazi se u citoplazmi
inficiranih ćelija nodule, a
funkcija mu je da veže O2,
transportuje ga do bakteroida
(kojima je kiseonik potreban za
disanje) i obezbedi anaerobne
uslove unutar nodula (ima
veoma visok afinitet za vezivanje
kiseonika).
Redukcija N2
Biološka redukcija N2 odigrava se na isti način kod svih diazotrofa.
• U reakciji iz jednog molekula azota nastaju dva molekula NH3, a
redukuju se i 2 protona do molekulskog vodonika.
• Enzim koji učestvuje u katalizi reakcije je nitrogenaza.
• Nitrogenaza je zapravo enzimski kompleks koji se sastoji iz dva enzima:
Protein I = molibdo-fero protein (MoFe-protein) – sastoji se iz 4
subjedinice, od kojih svaka sadrži 2 atoma molibdena i različit broj
Fe-S kompleksa.
Protein II = fero-protein (Fe-protein) – sastoji se iz 2 subjedinice i
sadrži 4 Fe-S kompleksa.
• Nitrogenaza je osetljiva na kiseonik. U aerobnoj sredini oba proteina u
sastavu nitrogenaze se ireverzibilno inaktiviraju. Zbog toga je uslov za
fiksaciju N2 da se reakcija odvija u anaerobnoj sredini ili u sredini u kojoj
je nivo kiseonika veoma nizak.
Uslovi za funkcionisanje
nitrogenaze:
1. Adekvatni donori
elektrona
2. Velika količina ATP
3. Anaerobna sredina
• Donor elektrona za redukciju azota je redukovani feredoksin.
• Fdred redukuje prvo Fe-protein, za šta je potreban utrošak ATP i
prisustvo Mg2+
, a zatim on redukuje MoFe-protein. Akceptor elektrona
su N2 i protoni, a proizvod reakcije su amonijak i molekulski vodonik.
• Redukcija protona se neizbežno dešava uporedo sa redukcijom
azota, pa se reakcija može predstaviti dvema jednačinama:
N2 + 6e- + 12ATP + 6H
+ 2NH3 +12ADP + 12Pi
2H+ + 2e
- + 4ATP H2 + 4ADP + 4Pi
• Nitrogenaza može da prenese elektrone na različite supstrate, ali u
prirodnim uslovima akceptori elektrona su N2 i H+. Redukcija acetilena
u etilen, koju takođe može da katalizuje ovaj enzim, koristi se kao
kriterijum za dokazivanje nitrogenazne funkcije kod potencijalnih
diazotrofa.
• Smisao redukcije protona do molekulskog vodonika još nije
razjašnjen.
• Proces redukcije azota do amonijaka je energetski skup proces – za
prenos svakog elektrona troše se 2 molekula ATP.
• U nodulama biljke-domaćina energija potrebna za disanje bakteroida i
za fiksaciju azota potiče iz metaboličkih procesa biljke.
• Amonijak koji nastaje u nodulama kao proizvod redukcije azota, pošto
je toksičan, mora odmah da se asimiluje u organska jedinjenja, a ta
organska jedinjenja se transportuju ksilemom u listove. Postoje dva tipa
leguminoza (na osnovu toga koja azotna jedinjenja sintetišu u
nodulama i transportuju ksilemom):
leguminoze koje u kvržicama asimiluju amonijak u amide
(uglavnom glutamin i asparagin) koristeći sistem GS/GOGAT
leguminoze koje u kvržicama asimiluju amonijak u ureide
(alontoinska kiselina, alantoin i citrulin) – ova jedinjenja se u
listovima katabolizuju u amonijak, a zatim opet asimiluju u glutamin
(sistem GS/GOGAT).
• S obzirom na to da energiju i za fiksaciju azota i asimilate za rastenje
bakterija obezbeđuje biljka-domaćin, postoji povezanost procesa
biološke redukcije azota sa fotosintezom. Korenovi sa nodulama
predstavljaju jedan od uvira sa najvećom snagom privlačnog centra.
Nodule, sa druge strane, obezbeđuju veliki deo redukovanog azota za
biljku i tako je čine nezavisnom od količine azota u zemljištu.
• Značaj fiksacije azota i simbioze leguminoza i diazotrofa je u tome da se
zahvaljujući njima zemljište obogaćuje azotom, što je od velikog
značaja za poljoprivredu.