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ENZYMOLOGIE
INHIBITIONS ENZYMATIQUES
Notes de cours
Casimir BLONSKI
Institut de Chimie Molculaire et des Matriaux dOrsay - UMR 8182
Groupe de Chimie Bioorganique et Bioinorganique
LabEx LERMIT
Universit Paris-Sud 11
Orsay
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Inhibition enzymatique
inactivation dune enzyme (ralentissement de la raction enzymatique) par la liaison dune petite molcule
diffrente que la dnaturation
Types dinhibition
rversible
comptitive
incomptitive
noncomptitive
irrversible
par marqueur daffinit
par inhibition suicide
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Leonor Michaelis (1875-1940) and Maud Leonora Menten (1879-1960) The kinetics of invertase activity
Biochemische Zeitschrift 49, 333 (1913)
Saturation curve for an enzyme showing the relation between the
concentration of substrate and rate.
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Inhibition comptitive la liaison de linhibiteur, lenzyme libre, empche la
liaison du substrat
Exemple de linhibition competitive lacide malonique ressemble lacide succinique et inhibe la dhydrognase de succinate lors de sa liaison :
S
Enz
SEnz
IEnz
I
E ES E + P k1, S k2
EI
ki, Ik
-1
k-i
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quations pour linhibition comp.
Graphique dinhibition comptitive
[S]
Vite
sse
, v
V ma
x / 2
KM
v = Vmax = kcat [E]0
KMapp
[I] = 2 Ki
[I] = Ki
[I] = 0
KMapp'
Graphique Michaelis-Menten d'inhibition comptitive
++
=
iM
max
]I[1]S[
]S[
KK
Vv
6
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Graphique dinhibition comptitive
1/[S]
1/v
0
pente = KM / Vmax
1
/ Vmax
-1
/ KM
Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition comptitive
-1
/ KMapp'
-1
/ KMapp
[I] = 0
[I] = Ki
[I] = 2 Ki
Dtermination de Ki (comptitive)
maxmax
M 1S][1
]I[11
VVK
K
v
i +
+
=
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quation pour IC50 (comptitive) quations de vitesse lorsque [Icomp] = IC50 :
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Inhibition incomptitive linhibiteur est li par le complexe ES
Exemple de linhibition incomptitive inhibition de la phosphatase alkaline par la L-
phnylalanine:
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quations pour linhibition incomp.
Graphique dinhibition incomptitive
[S]
Vite
sse
, v
V ma
x / 2
KM
v = Vmax = kcat [E]0
KMapp
[I] = 2 Ki
[I] = Ki
[I] = 0
KMapp'
Graphique Michaelis-Menten d'inhibition incomptitive
V ma
xapp
/ 2
V ma
xapp
' / 2
+
+
+
=
i
M
i
max
]I[1]S[
]I[1]S[
K
KK
V
v
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Graphique dinhibition incomptitive
Dtermination de Ki (incomptitive)
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quation pour IC50 (incomptitive) quations de vitesse lorsque [Iincomp] = IC50 :
Inhibition non-comptitive linhibiteur est li par lenzyme libre et par le complexe
ES
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Exemple de linhibition non-comp. inhibition de la bisphosphatase de fructose par le AMP :
quations pour linhibition noncomp.
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Inhibition non-comptitive simple laffinit de linhibiteur est indpendante de la
prsence de substrat (i.e. Ki = Ki') KM nest pas affect
Vmax est diminu par le facteur de
+
'
i
]I[1K
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Graphique dinhibition non-comptitive simple
[S]
Vite
sse
, v
V ma
x / 2
KM
v = Vmax = kcat [E]0
[I] = 2 Ki
[I] = Ki
[I] = 0
Graphique Michaelis-Menten d'inhibition noncomptitive simple
V ma
xapp
' / 2
V ma
xapp
/ 2
M
i
max
]S[
]I[1]S[
KK
V
v+
+
=
Graphique dinhibition non-comptitive simple
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Dtermination de Ki (non-comptitive simple) quation pour la diminution de Vmax :
Inhibition non-comptitive mixte
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laffinit de linhibiteur dpend de la prsence de substrat (i.e. Ki Ki')
Vmax est toujours diminu par le facteur de KM est affect selon Ki et Ki'
Inhibition non-comptitive mixte lorsque Ki < Ki', KM augmente et linhibition ressemble
linhibition comptitive :
+
'
i
]I[1K
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Inhibition non-comptitive mixte lorsque Ki > Ki', KM diminue et linhibition ressemble
linhibition incomptitive :
Dtermination de Ki' (non-comptitive mixte) quation pour la diminution de Vmax :
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Dtermination de Ki (non-comptitive mixte) quation pour la variation de KM :
quation pour IC50 (non-comp. simple) quations de vitesse lorsque [Inoncomp] = IC50 :
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Inhibition irreversible pour des inhibiteurs rversibles, on utilise le Ki comme
un indice de lefficacit de linhibition
pour les inhibiteurs irrversibles, on utilise le kinact et le KI
il y a deux types dinhibiteurs irrversibles :
ractifs du site actif (marquage par affinit) inhibiteurs bass sur le mcanisme (substrats
suicide ) Marqueurs par affinit
dmontrent la spcificit envers un groupement fonctionnel des acides amins du site actif
analogues de substrat pour favoriser sa liaison dans les site actif
comprennent aussi un groupement ractif (pharmacophore) typiquement un lectrophile qui ragit avec un nuclophile dans le site actif
possdent un seul site saturable et ragissent de manire stchiomtrique (1 mol de I/mol de E)
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Marquage par affinit lenzyme est protge contre cette inhibition par le
substrat (ou co-facteur) la perte dactivit suit une cintique de premier ordre,
parce que lenzyme est consomme comme un ractif pendant la raction
linhibition est accompagne de la modification covalente de lenzyme :
lenzyme demeure inactive aprs la sparation de lexcs de linhibiteur
linhibiteur reste li la protine aprs dialyse ou filtration sur gel (ou sur membrane) mme aprs la dnaturation de lenzyme
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Exemples de marquage par affinit TPCK (Tosyl phenylalanine chloromethyl ketone)
ressemble un amide de la phnylalanine, mais le groupement chloromthyle ctone effectue lalkylation de la His57 de la chymotrypsine :
DIFP (diisopropyl phosphofluoridate) ragit avec le groupement hydroxyle des rsidus de
srine :
O
CH2Cl
NH
S OO
CH3
N NH
Enz
N N
O
CH2NH
S OO
CH3
Enz
Cl
H
EnzHO
P
O
F
OO
EnzO
P
O
OO
F
H
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PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)
utilis pour inhiber des protases et ragit aussi avec des rsidus de srine :
Exemples de marquage par affinit
EnzHO
F
H
CH2 S
O
F
O
EnzO
CH2 S
O
O
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Analyse cintique liaison rapide lquilibre de linhibiteur suivie de la
formation lente et irrversible dun complexe inactif :
la proportion denzyme sous forme EI augmente avec la concentration de I
EI sinactive suivant une cintique du premier ordre
k1 k
-1KI =
E I EI E I+k1k
-1
kinact
complexe covalentinactif
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Mesure de kinact kinact peut tre dtermine en mesurant la perte dactivit
en fonction du temps (kobs) diffrentes concentrations dinhibiteur :
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% ac
tivit
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Temps (min)
[I] = 0
[I] = 0.2 KI
[I] = 0.5 KI
[I] = 2 KI
[I] = KI
constante de vitesse = kobs
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