CD-Spektroskopie

Seminar zur Vorlesung »Proteinchemie & Enzymologie«

Leipzig, 14.06.2019

Ferdinand Holzhausen

Gliederung des Vortrags

CD-SPEKTROSKOPIE

1. Polarisationen des Lichts

2. Aufbau eines Spektropolarimeters

3. Circulardichroismus von Proteinen

4. Physikalische Größen & Grundgleichung

5. Auswertung von CD-Spektren

6. Einsatz von CD-Spektren

Leipzig, 14.06.2019

Ferdinand Holzhausen

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CD-Spektroskopie | Ferdinand Holzhausen Institut für Biochemie, Brüderstraße 34, 04103 Leipzig

[1] www.chemgapedia.de (Ausbreitung elektromagnetischer Wellen, 2016)

POLARISATIONEN DES LICHTS

LICHT ALS ELEKTROMAGNETISCHE WELLE

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[2] www.spektrum.de/lexikon/optik/polarisation/2616 (Polarisation, Spektrum Akademischer Verlag, 1999, Heidelberg)

linear zirkulär elliptisch

AUFBAU EINES SPEKTROPOLARIMETERS

GERÄTEBAUTEILE & UMWANDLUNG DES LICHTS

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[3] G. Richter, Praktische Biochemie – Grundlagen und Techniken, Georg Thieme Verlag, 2004, Stuttgart, S. 122-124

Lichtquelle Monochro-

mator Polarisator

elektro-

optischer

Modulator

Probe Detektor

a) b) c) d)

a) monochromatisches Licht

b) linear polarisiertes Licht

c) alternierend rechts und links zirkular polarisiertes Licht

d) elliptisch polarisiertes Licht

CIRCULARDICHROISMUS VON PROTEINEN

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[4] F. Lottspeich, J. W. Engels, Bioanalytics – Analytical Methods and Concepts in Biochemistry and Molecular Biology, Wiley-VCH Verlag, 2018, Weinheim

[5] www.spektrum.de/lexikon/biologie/cotton-effekt/15551 (Cotton-Effekt, Spektrum Akademischer Verlag, 1999, Heidelberg)

Circulardichroismus: unterschiedliche Absorption von links und rechts

zirkulär polarisiertem Licht durch chirale Moleküle, z.B. Proteine, DNA

Cotton-Effekt: abrupte Änderung der optischen Aktivität in Abhängigkeit von

der Wellenlänge aufgrund eines elektronischen Übergangs (Absorption)

BEGRIFFSKLÄRUNG & FUNKTIONSWEISE

CIRCULARDICHROISMUS VON PROTEINEN

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[4] F. Lottspeich, J. W. Engels, Bioanalytics – Analytical Methods and Concepts in Biochemistry and Molecular Biology, Wiley-VCH

Verlag, 2018, Weinheim

PDB ID: 3RGK, Hubbard, S.R., Lambright, S.G., Boxer, S.G., Hendrickson, W.A. (1990) J. Mol. Biol. 20: 215-218.

A.S. Rose, A.R. Bradley, Y. Valasatava, J.D. Duarte, A. Prlić, P.W. Rose (2018) NGL viewer: web-based molecular graphics for large complexes.

Bioinformatics (doi:10.1093/bioinformatics/bty419)

RCSB PDB (rcsb.org): H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne (2000)

The Protein Data Bank Nucleic Acids Research, 28: 235-242.

BEGRIFFSKLÄRUNG & FUNKTIONSWEISE

CIRCULARDICHROISMUS VON PROTEINEN

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[4] F. Lottspeich, J. W. Engels, Bioanalytics – Analytical Methods and Concepts in Biochemistry and Molecular Biology, Wiley-VCH

Verlag, 2018, Weinheim

PDB ID: 3RGK, Hubbard, S.R., Lambright, S.G., Boxer, S.G., Hendrickson, W.A. (1990) J. Mol. Biol. 20: 215-218.

A.S. Rose, A.R. Bradley, Y. Valasatava, J.D. Duarte, A. Prlić, P.W. Rose (2018) NGL viewer: web-based molecular graphics for large complexes.

Bioinformatics (doi:10.1093/bioinformatics/bty419)

RCSB PDB (rcsb.org): H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne (2000)

The Protein Data Bank Nucleic Acids Research, 28: 235-242.

BEGRIFFSKLÄRUNG & FUNKTIONSWEISE

PHYSIKALISCHE GRÖSSEN & GRUNDGLEICHUNG

EXTINKTION & ELLIPTIZITÄT

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[6] M. Helm, S. Wölfl, Instrumentelle Bioanalytik – Eine Einführung für Biologen, Biochemiker, Biotechnologen und Pharmazeuten,

Wiley-VCH Verlag, 2007, Weinheim, S. 31-33

LAMBERT-BEER‘sches Gesetz:

Einführung der Elliptizität:

Ψ =ln(10)

4∙180°

𝜋∙ 𝑐 ∙ 𝑑 ∙ (𝜀𝐿 − 𝜀𝑅)

Δ𝐸 = 𝐸𝐿 − 𝐸𝑅 = (𝜀𝐿 − 𝜀𝑅) ∙ 𝑐 ∙ 𝑑

(E: Extinktion, Ψ: Elliptizität, 𝜀: Extinktionskoeffizient, c: Konzentration, d: Schichtdicke)

Ψ ER-EL

ER+EL

PHYSIKALISCHE GRÖSSEN & GRUNDGLEICHUNG

DEFINITIONEN DER ELLIPTIZITÄT

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[6] M. Helm, S. Wölfl, Instrumentelle Bioanalytik – Eine Einführung für Biologen, Biochemiker, Biotechnologen und Pharmazeuten,

Wiley-VCH Verlag, 2007, Weinheim, S. 31-33

spezifische Elliptizität: Einheit: grad ∙ cm2 ∙g-1

molare Elliptizität: Einheit: grad ∙ cm2 ∙ dmol-1

MRW Elliptizität: Einheit: grad ∙ cm2 ∙ dmol-1

Θ 𝜆𝑇 =

Ψ 𝜆𝑇 ∙ 𝑀

100

Ψ 𝜆𝑇 =

Ψ

𝑐 ∙ 𝑑

(M: molare Masse, 100: historische Gründe, MRW: mean residue weight, mittlere Aminosäuremasse)

Θ 𝑀𝑅𝑊 =Ψ 𝜆

𝑇 ∙ 𝑀𝑅𝑊

100

AUSWERTUNG VON CD-SPEKTREN

AM BEISPIEL VON POLY-L-LYSIN

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[7] www.chemgapedia.de (Circulardichroismus und Proteinstruktur, 2016)

ferner UV-Bereich (170-250 nm)

Absorption der Peptidbindungen

naher UV-Bereich (250-300 nm)

Absorption der aromatischen Seitenketten

und Disulfidbrücken

n→π* und π→π* Übergänge

Quenching-Effekte

AUSWERTUNG VON CD-SPEKTREN

AM BEISPIEL VON LYSOZYM AUS HÜHNEREIWEISS

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PDB ID: 1DPX , Weiss, M.S., Palm, G.J., Hilgenfeld, R. (2000) Acta Crystallogr., Sect. D 56: 952-958.

A.S. Rose, A.R. Bradley, Y. Valasatava, J.D. Duarte, A. Prlić, P.W. Rose (2018) NGL viewer: web-based molecular graphics for large complexes.

Bioinformatics (doi:10.1093/bioinformatics/bty419)

RCSB PDB (rcsb.org): H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne (2000)

The Protein Data Bank Nucleic Acids Research, 28: 235-242.

AUSWERTUNG VON CD-SPEKTREN

AM BEISPIEL VON LYSOZYM AUS HÜHNEREIWEISS

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[8] Arnaudov, L. N., & de Vries, R. (2005). Biophysical Journal, 88(1), 515-526.

pH = 3,0 pH = 2,0 pH = 4,0

(a) Molecular residue ellipticity of HEWL at pH 2.0 for a range of temperatures between 25ºC and 85ºC.

(b) Molecular residue ellipticity of HEWL at pH 3.0 for a range of temperatures between 25ºC and 85ºC.

(c) Molecular residue ellipticity of HEWL at pH 4.0 for a range of temperatures between 25ºC and 90ºC.

AUSWERTUNG VON CD-SPEKTREN

AM BEISPIEL VON LYSOZYM AUS HÜHNEREIWEISS

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[8] Arnaudov, L. N., & de Vries, R. (2005). Biophysical Journal, 88(1), 515-526.

pH = 3,0 pH = 2,0 pH = 4,0

Tapping mode AFM height images of 2.0 wt % HEWL heated for 13 days at 57ºC

(a) pH 2.0; (b) pH 3.0; (c) pH 4.0.

EINSATZ VON CD-SPEKTREN

ANWENDUNGSGEBIETE

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[7] www.chemgapedia.de (Circulardichroismus und Proteinstruktur, 2016)

Bestimmung der Anteile von Sekundärstrukturelementen

Beobachtung von Konformationsänderungen, z.B. durch pH, Temperatur

Überprüfung der Konformationen von Proteinen unterschiedlichen

Ursprungs, z.B. natives und rekombinantes Protein

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Vielen Dank für

Eure Aufmerksamkeit! Für Fragen und Anregungen stehe ich nun gerne zur Verfügung.

DISKUSSION

AUSBLICK

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[7] www.chemgapedia.de (Circulardichroismus und Proteinstruktur, 2016)

SRCD: synchrotron radiation circular dichroism

Hochvakuum-UV-Bereich (120-180 nm)

höhere Intensität der Synchrotron-Strahlung