Étude de la qualité des ovocytes de la perche commune :
utilisation de critères morphométriques et de nouvelles
approches protéomiques
Encadrants: Pascal Fontaine, Jean-Noël Gardeur, Bérénice Schaerlinger
Castets Marie-Dorothée
1
Géniteurs
Œufs
Ovocytes Spermatozoïdes Larves
Domestication de nouvelles espèces
Maîtrise du cycle de vie
Besoin d’indicateurs de qualité – Besoin d’indicateurs de qualité – morphométriquesmorphométriques//moléculairesmoléculaires
Approche générique
Perca fluviatilis
Modification des Modification des performances de performances de
reproductionreproduction
Collecte d’ovocytes
Ovocytes non fécondés
Congélation
Analyse protéomique
Protéines d’intérêt ?
Mise au point du protocole
F. Silvestre, Namur
Ovocytes fécondés
Incubation (laboratoire)
Suivi : mesure des caractéristiques
Base de données œufs/paramètres
Classification des œufs / qualité (ACP-CAH)
1. Protocole expérimental
2
Site expérimental de La Bouzule
-Géniteurs poids, date de ponte
-Ovocytes diamètre et poids ovocytaire, fragmentation des pontes
-Œufs fécondés Taux de fécondation à 3 jours, Durée d’incubation, Durée d’éclosion, Taux d’éclosion
-Larves Taux de malformation larvaire, Taille des larves à l’éclosion, Taux de survie à 7 jours, Taux de résistance au jeûne
OD
jc
l
2. Détermination morphométrique de la qualité des ovocytes
3
Starvation tolerance
0.80.40-0.4- 0.8Axis 1
Female weight
Egg weight
Fragmentation rate
Oocyte diameter
Fertilization rate Hatching
rate
Incubation duration
Hatching duration
Malformation rate
Larval size at hatching
Survival rate after 7 days
0.8
0.4
0
-0.4
-0.8
Axis
2
Spawning date
Résultats : Analyse en Composantes Principales – Cercle des corrélations
Axe 1
Axe 2
Axe 3
Variables non impliquées dans des axes
Variables actives
Variables illustratives
Taux de survie larvaire à 7 joursTaux de résistance au jeûne
Taux de fécondationTaux d’éclosion
Taux de malformation larvaire
2. Détermination morphométrique de la qualité des ovocytes
4
2.25
0.75
0
-0.75
-1.50
15-3
1.50
15-2
15-1
28-1
34-1
37-2
34-3
36-234-2
36-1
36-3
39-1
39-2
37-335-3
35-2
35-1
28-3
22-3
22-16-3
21-2
16-3
16-2
21-3
16-1
27-1
28-2
37-1
21-122-2 6-1
6-2
42-2
42-3
25-125-227-3
27-2
42-1
Mr
HrFer
Lz
Sm
s7d
Ew
Hd
SfOd
FrrId
Sw
Classe A
Classe B
-3 -2 -1 0 1 2
Axis 1
Axi
s 2
2. Détermination morphométrique de la qualité des ovocytes
Résultats : ACP + CAH – Classification des pontes
5
Classe A
Bonne qualitéClasse B
Qualité moyenneTaux de survie à 7jours
(%) 93 39
Taux de résistance au jeûne
(dl50; jour) 12 6
Taille des larves à l'éclosion (mm) 5 5
Taux de malformation larvaire (%) 1 4
Mise en évidence de 2 catégories de pontes selon l’ACPMise en évidence de 2 catégories de pontes selon l’ACP
5 à 6 pontes de chaque classe sélectionnée pour une étude protéomique
2. Détermination morphométrique de la qualité des ovocytes
Résultats : Caractéristiques des classes
Ajout d’1 catégorie de pontes sans aucune fécondationAjout d’1 catégorie de pontes sans aucune fécondation
6
Classe C
Non Fécondées
Std. interne
Ech. 1 Ech. 2
Std. interne
Ech. 3 Ech. 4
Ele
ctr
op
horè
se 2
DEle
ctr
op
horè
se 2
D
Std. interne Ech. 1 Ech. 2
Std. interne Ech. 3 Ech. 4
25µg 25µg
25µg 25µg
3. Etude protéomique des ovocytes
Technologie 2D-DIGE : Principe
27.5µg
27.5µg
7
367
701 715
482
10291032
707
1469 14631406 1334
16811717
1660
1742 16831792
16101472
1953
1969
2399
2325
24742454
270827822835
2875
2252
2137
2447
20
30
50
40
60
70
80
90
Mr (kD
al)
4 7pI (pH units)5 6
3. Etude protéomique des ovocytes
Résultats : spots d’intérêt (variation d’abondance intergroupe – p<0.05)
34 spots dont 34 spots dont l’expression varie l’expression varie selon les groupes de selon les groupes de pontespontes
8
34 36 28 37 39 41 35 40 20 33 26 6 22 21 25 38-0.2 0 0.2
BQMQNF
11-2
1-1
16601717247424541742232517922270270827822835287521373672399707482168170171514061610
1469
146314411683
1029
19531472
2447
13341969
1032
2252
AA
BB
CC
DD
Bonne QualitéNon FécondésQualité Moyenne
3. Etude protéomique des ovocytes
Résultats : Classification spots/oocytes
9
2
Groupe C
Groupe A
Groupe D
Groupe B
Qualité Moyenne
Non Fécondés
Bonne Qualité
+
4 groupes :QM NF BQ
0
2
4
6
8
10
12
1 2 3 4
Prot
ein
Num
ber
Stress
Oxydative stress
Proteins degradation(proteasome)Energetic metabolism
Biosynthèse AA, AN
Cytoskeleton, celldivision Other
I mplied in severalfonctionsNot defi nite
Groupe A
Groupe D
Groupe B Groupe C
QM NF BQ
Inhibition de l’expression
Activation de l’expression
- Classification des fonctions biologiques- Classification des fonctions biologiques
10QM NF BQ NF
3. Etude protéomique des ovocytes
Résultats : Identification des spots par spectrométrie de masse MS/MS
- 19 spots identifiés / 34- 19 spots identifiés / 34
Protéines du Stress oxydatifGroupe
AProtection cellulaire contre les espèces réactives de l’oxygène
Protéines du StressGroupe B
Protéines chaperonnes + protection des protéines lors d’un stress
3. Etude protéomique des ovocytes
Perspectives : Protéines/fonctions potentiellement intéressantes
Biomarqueurs potentiels de qualité Biomarqueurs potentiels de qualité 11
Ovocytes Ovocytes Non Non
FécondésFécondés
Ovocytes Ovocytes Qualité Qualité
MoyenneMoyenne
Merci de votre attention.
12
Remerciements :
Equipes de l’Université de Notre Dame de la Paix (Namur) : -Frédéric Silvestre, Patric Kestemont, URBO -Edouard Delaive, Marc Dieu, URBC
Equipe de l’UR.AFPA :-Yannick Ledoré, Alain Iuretig, Awatef Trabelsi, Kevin Debes