Εισαγωγή στην Μοριακή
διαγνωστική για τον HPV
Ιωαννίδης Αναστάσιος BSc, MD, PhD
Επίκουρος Καθηγητής Μικροβιολογίας
Πανεπιστήμιο Πελοποννήσου
Επιστημονικός Υπεύθυνος Εργαστηρίου Medisyn
Κλασικ
ή έ
ναντι
μορια
κής
διά
γνω
σης
Η επανάσταση στη μοριακή βιολογία έχει επηρεάσει:
• Επιστήμες
• Ιατρική
• Κοινωνία
• Διάγνωση / Κλινική διαχείριση
Μοριακά Διαγνωστικά
Εξατομικευμένη ιατρική
Πρόκληση για τον 21ο αιώνα
DNA
➢ ΑΠΟΤΕΛΕΙΤΑΙ ΑΠΟ ΔΥΟ
ΠΟΛΥΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΕΣ ΑΛΥΣΙΔΕΣ
ΠΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΖΟΥΝ ΣΤΟ ΧΩΡΟ
ΜΙΑ ΔΕΞΙΟΣΤΡΟΦΗ ΕΛΙΚΑ
➢ Η ΚΑΘΕ ΑΛΥΣΙΔΑ ΑΠΟΤΕΛΕΙΤΑΙ
ΑΠΟ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΑ ΠΟΥ
ΛΕΓΟΝΤΑΙ
ΔΕΣΟΞΥΡΙΒΟΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΑ
Στις βάσεις του DNA βρίσκεται αποθηκευμένη η γενετική πληροφορία
RNA
➢ ΑΠΟΤΕΛΕΙΤΑΙ ΑΠΟ MIA
ΠΟΛΥΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚH ΑΛΥΣΙΔA
➢ Η ΑΛΥΣΙΔΑ AYTH ΑΠΟΤΕΛΕΙΤΑΙ ΑΠΟ
ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΑ ΠΟΥ ΛΕΓΟΝΤΑΙ
ΡΙΒΟΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΑ
Διαχείριση κλινικών δειγμάτων & μοριακή ανάλυση
Κλινικό Δείγμα
Λύση-Καθαρισμός
Απομόνωση Νουκλεϊκού Οξέος
mRNA
Ιϊκό RNA
rRNA
ΗλεκτροφόρησηΠροϊόντα
Κλωνοποίηση
RT-PCR
Αλληλούχηση
Γενωμικό DNA
cDNA
PCR
• Σπάσιμο των κυττάρων
• Απελευθέρωση των πυρηνικών οξέων σε διαλυτή μορφή
• Προστασία των πυρηνικών οξέων από την αποικοδόμηση
• Διαχωρισμός των πυρηνικών οξέων, από κυτταρικά
Υπολείμματα, πρωτεΐνες και ένζυμα
• Το DNA δεν διαλύεται στην αιθανόλη
• Συμπύκνωσή τους σε μικρό όγκο
• Συλλογή σε υδατικό περιβάλλον
Απομόνωση πυρηνικών οξέων
Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης
PCR
• DNA (0,01 – 0,1 μg)
• PRIMER 1-FORWARD (20 pmol)
• PRIMER 2-REVERSE (20 pmol)
• Tris – HCL (20mM, pH 8)
• MgCl2 (2 mM)
• 50μM dATP, dCTP, dGTP, dTTP.
• ΘΕΡΜΟΑΝΘΕΚΤΙΚΗ DNA ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗ (2 IU)
• dH2O ΕΩΣ 50-100 μl ΣΥΝΟΛΙΚΟΥ ΟΓΚΟΥ.
ΟΡΓΑΝΟ ΕΚΤΕΛΕΣΗΣ : ΘΕΡΜΟΚΥΚΛΟΠΟΙΗΤΗΣ (THERMOCYCLER)
1. DNA ΑΠΟΔΙΑΤΑΞΗ 94ο C. 30 sec
PCR
PCR
2. DNA ANNEALING (ΕΠΑΝΑΔΙΑΤΑΞΗ – ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ ΕΚΚΙΝΗΤΩΝ ΜΕ ΤΙΣ ΜΟΝΟΚΛΩΝΕΣ
ΑΛΥΣΙΔΕΣ DNA) 45ο - 60ο C (30 sec)
PCR
3. DNA EXTENSION (ΕΠΙΜΗΚΥΝΣΗ) 72Ο C (1 min)
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ 1ου ΚΥΚΛΟΥ
2 ΔΙΚΛΩΝΑ ΜΟΡΙΑ DNA
RT - PCR
RT – PCR
Το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση
χρησιμοποιεί ένα συμπληρωματικό
ολιγονουκλεοτίδιο για να ξεκινήσει
την σύνθεση DNA από ένα μόριο
RNA. Η μονόκλωνη αλυσίδα του DNA
που παράγεται, χρησιμοποιείται σαν
«μητρική» για τη σύνθεση και μιας
δεύτερης αλυσίδας DNΑ.
Τα προϊόντα PCR αναλύονται σε μια ξεχωριστή
διαδικασία που πραγματοποιείται μετά το τέλος της PCR
ή κατά την διάρκεια αυτής, ανάλογα με το είδος της
αντίδρασης
Πρόληψη επιμολύνσεων
Διαχωρισμός χώρων πραγματοποιήσεως PCRΚαλή εργαστηριακή πρακτικήΦυσικές μέθοδοι διαχωρισμούΠαρασκευή DNA/RNA σε BSC ή hood ή PCR-workstationΦίλτρα στα tips
Yπεριώδης ακτινοβολίαΑντιδραστήρια PCR σε μικρές ποσότητες Χρησιμοποίηση μαρτύρωνΑδρανοποίηση προϊόντων πολλαπλασιασμού μεχημικές/βιοχημικές μεθόδουςΚλειστά συστήματα
DNA του Ιου είναι~8 kbp
Πάνω από 200 HPV γονότυποι
Διαφέρουν μεταξύ τους κατά τουλάχιστον
κατά 10% στο επίπεδο ακολουθίας DNA
• WHITE, E. A. 2019. Manipulation of Epithelial Differentiation by HPV Oncoproteins.
Viruses, 11.
• ZHU, Y., WANG, Y., HIRSCHHORN, J., WELSH, K. J., ZHAO, Z., DAVIS, M. R. &
FELDMAN, S. 2017. Human Papillomavirus and Its Testing Assays, Cervical Cancer
Screening, and Vaccination. Adv Clin Chem, 81, 135-192.
ESCOBAR-ESCAMILLA, N., RAMIREZ-GONZALEZ, J. E., CASTRO-ESCARPULLI, G. & DIAZ-QUINONEZ, J. A. 2018. Utility of high-
throughput DNA sequencing in the study of the human papillomaviruses. Virus Genes, 54, 17-24.
http://cvc.dfci.harvard.edu/hpv/HTML/classification.html
** *
*
* HR Status not certain
HR-HPV
LR-HPV
Ασθένεια Τύπος του HPV
Απλά Κονδυλώματα 2, 7
Πελματικά Κονδυλώματα 1, 2, 4
Δερματικά Κονδυλώματα 3, 10
Γενετικά Κονδυλώματα 6,11,40,42,43,44,55,61,70,72,81,83,84,89
Δυσπλασίες (καρκίνος) γεννητικών οργάνων16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68,7
0,73,82,85
Στοματική Ενδοεπιθηλιακή Υπερπλασία 13, 32
Κονδυλώματα του στόματος 6, 7, 11, 16, 32
Τύπος 6
Τύπος 11
Τύπος 16
Συχνότεροι HPV τύποι
Τύπος 18
Οι τύποι 6,11 προκαλούν το
90% των κονδυλωµάτων
Οι τύποι 16,18 προκαλούν
το 70% των καρκίνων του
τραχήλου
Η μόλυνση με τον HPV μεταδίδεται σεξουαλικά
Ο ιός διεισδύει στον τράχηλο
Uterus
HPVinfection
Vagina
Cervix
Layers of epithelial cells
Papillomavirus
WHITE, E. A. 2019. Manipulation of Epithelial
Differentiation by HPV Oncoproteins. Viruses, 11.
Ο HPV ΚΑΙ Ο ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ ΤΗΣ ΜΗΤΡΑΣ
• Προκαλείται από στελέχη HPV υψηλού κινδύνου
• E6 και E7 είναι τα κύρια HPV ογκογονίδια
• E6 και E7 ογκογονίδια εκφράζονται από τα καρκινικά κύτταρα και η συνεχής έκφραση τους είναι απαραίτητη για τη συντήρηση του κακοήθους φαινοτύπου
KIM, K. Y., LEWIS, J. S., JR. & CHEN, Z. 2018. Current status of clinical testing for human papillomavirus in
oropharyngeal squamous cell carcinoma. J Pathol Clin Res, 4, 213-226.
Η μέχρι χθες κατάσταση
Απαρχή ΚλινικήΦυσιολογικές συνθήκες της νόσου
Υποκλινική νόσος νόσος
Προχωρημένη νόσος
Τεστ Παπανικολάου
Πρωτογενής πρόληψη Δευτερογενής πρόληψη
ΠΡΟΛΗΨΗ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ:
ΝΕΑ ΕΠΟΧΗ ΣΤΗΝ ΠΡΟΛΗΨΗ ΤΟΥ
ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ
Απαρχή ΚλινικήΦυσιολογικές
συνθήκες της νόσου
Υποκλινική
νόσος νόσος
Προχωρημένη
νόσος
HPV Εμβόλιο HPV DNA test Τεστ Παπανικολάου
Πρωτογενής πρόληψη Δευτερογενής πρόληψη
Ευαισθησία της κυτταρολογίας για τηνανίχνευση CIN2+
(όλες οι ηλικίες)
HART
Tuebingen
Hannover
Jena
French Public
French Private
Seattle
Canada
Combined
0% 100%10% 30% 50% 70% 90%
Cytology Positivity
CIN 2+
Ευαισθησία του HPV Test για τηνανίχνευση CIN2+
(όλες οι ηλικίες)
HART
Tuebingen
Hannover
Jena
French Public
French Private
Seattle
Canada
Combined
0% 100%10% 30% 50% 70% 90%
HPV Positivity
CIN 2+
Self-Collection Instruction Guide
TSAKOGIANNIS, D., GARTZONIKA, C., LEVIDIOTOU-STEFANOU, S. & MARKOULATOS, P. 2017. Molecular approaches for HPV genotyping and HPV-DNA physical status.
Expert Rev Mol Med, 19, e1.
• ΑΛΛΗΛΟΥΧΗΣΗ DNA
• ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΥΒΡΙΔΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΕΣ (Microarray Comparative Genomic Hybridization –MCGH)
• ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΟΛΟΚΛΗΡΟΥ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΟΣ (Whole-Genome Sequencing-WGS)
(Mahmoodi et al., 2019)
HPV testing
ως μέθοδος πληθυσμιακού ελέγχου
• Λιγότερο εκτεθειμένο σε ανθρώπινα λάθη
• Πιο ευαίσθητο στην ανίχνευση CIN2+
• Πιο ασφαλές για την γυναίκα
• Επιτρέπει την διεύρυνση των χρονικών μεσοδιαστημάτων μεταξύ δύο εξετάσεων
• Θα οδηγήσει σε ελάττωση του κόστους
• Συνολικά θα οδηγήσει στην βελτίωση της ποιότητας και της αποτελεσματικότητας του πληθυσμιακού ελέγχου (screening)
Nobel Price for Medicine 2008
to Harald zur Hausen…
…for the proof that cervical cancer is
induced by Human Papillomaviruses (HPV)
Success story of medicine