GENERACIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS
CLAUDIA MACHICADO RIVERO, Ph.D.
Asesora científica de F. Hoffmann-La Roche
RESUMEN
• Introducción
• Herramientas y métodos bioinformáticos
• Diseño de cavidades en el interior de proteínas
• Acoplamiento molecular proteína-ligando
• Screening masivo y automático de librerías de fármacos
RESUMEN
Creación de sitios de unión
+
-Estabilizar proteínas-Modular la actividad (interruptor)-Albergar y vehiculizar fármacos
INTRODUCCIÓN
Estrategia para el diseño de sitios de unión y vehiculización de ligandos in vivo
1) Construcción del sitio de unión de ligando
¿COMO METER UN LIGANDO EN UNA PROTEINA DETERMINADA?
• Elegimos una proteína modelo y creamos agujeros virtuales.• Seleccionamos los que no colapsan.• Hacemos acoplamiento masivo de bases de datos de ligandos a los agujeros.• Comprobamos que el ligando seleccionado se une al mutante con agujero.
2) Vehiculización
Diseño de proteínas terapéuticas
1. Elegir residuos grandes e hidrófobos enterrados en la proteína.
Diseño de proteínas terapéuticas
2. Mutaciones truncantes
Diseño de proteínas terapéuticas
3. Creación de una cavidad
Diseño de proteínas terapéuticas
4. Estudio de la unión de pequeñas moléculas
Proteína
Elegir residuos
Mutación in silico
Minimización/ Análisisde cavidades
Acoplamiento automático
Proteínas concavidad
Acoplamiento interactivo
Energíasinteracción Análisis de
dG de unión
Buscar residuosvoluminosos
Acoplamiento P-L
EnergéticaEnergías de
desolvatación
Proteínas huecudas
Creación de cavidades
Ligandos
Esquema general del trabajo
Flavodoxina de Anabæna como modelo de estudio
Dominio de unión a FMN
Estabilidad y plegamiento
Clonada
Cristalizada
FMN
Trp 57
Tyr 94
+
Holoproteína
FMNApoproteína
Ligando
Cavidad
2. Docking Flexible+Screening masivo y automático
Complejo modelado
3. Evaluación energética
Software Affinity + Catalyst (Accelrys Inc.)
Proteína
1. Diseño in silico de
cavidad
Herramientas y métodos bioinformáticos
Software InsightII (Accelrys Inc.)
Programas varios: Linux
Objetivos
• Diseñar proteínas con cavidad: analizar su estructura y estabilidad y evaluar su capacidad de unir moléculas específicas.
• Determinar teóricamente la afinidad y complementariedad de las cavidades creadas por pequeñas moléculas orgánicas.
• Seleccionar y evaluar automáticamente la energética de los ligandos más prometedores de unirse en una cavidad, partiendo de una librería de miles de compuestos.
• Comprobar experimentalmente la fiabilidad de los métodos bioinformáticos desarrollados.
Desarrollar un procedimiento teórico de diseño de proteínas portadoras que
eventualmente puedan emplearse en el campo de la Medicina.
PREDICCIÓN DE CAVIDADES EN EL INTERIOR DE PROTEÍNAS: DISEÑO Y OBTENCIÓN DE MUTANTES DE FLAVODOXINA CON CAVIDAD
PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA Y ENERGÍA DE UNIÓN DE COMPLEJOS PROTEÍNA-LIGANDO
CRIBADO MASIVO DE LIGANDOS EN CAVIDADES DE PROTEÍNAS Y DETECCIÓN EXPERIMENTAL DE LA FORMACIÓN DE COMPLEJOS
Diseño de un método para predecir la formación de cavidades en proteínas
Modelos de estudio: Mutantes truncadas
Mutaciones truncantes in silico
Minimización de energía
Análisis de los modelos: dimensiones de la cavidad y estructura global
Lisozima T4 Barnasa Citocromo c peroxidasa
Modelización de proteínas con cavidad
Identificación dela mutante
Volúmenes y reducción de lacavidad teórica y cristal
Modelo deSteepest descents
Proteína Mutante Volumencavidadteórica
(Å3)
Volumencavidadcristal
(Å3)
Reducciónvolumencavidadcristal
(%)
Volumencavidadmodelo
(Å3)
Reducciónvolumencavidadmodelo
(%)
RMScadenaslaterales
superficiecavidad
T4L M102AM106A 0 0 Na 0 Na 0,48I29A 40 42 -5 31 23 0,23I17A 34 0 100 0 100 0,16L99A 155 174 -12 162 -5 0,24
M102A 121 94 22 105 13 0,44L133G 191 182 5 177 7 0,31L133A 171 150 12 147 14 0,34F153A 161 110 32 149 7 0,28
L99A/F153A 275 265 4 268 3 0,29L46A 51 32 37 43 16 0,23I100A 19 36 -89 31 -63 0,38V87A 32 45 -41 40 -25 0,22V111A 57 46 19 50 12 0,22V149A 40 47 -18 0 100 0,23M6A 74 58 22 52 30 0,23
V103A 14 14 0 0 100 0,23F67A 40 40 0 83 -108 0,39I58A 92 67 27 40 57 0,32
L121A 172 50 71 148 14 1,46Barnasa I76A 32 0 100 0 100 0,19
I88A 23 21 9 15 35 0,30I96A 39 40 -3 48 -23 0,32
Cit. c R48A 0 0 Na 0 Na 0,31perox. W191G 164 184 -12 204 -24 0,19
19 mutantes de lisozima T4
3 mutantes barnasa
2 mutantes cit. c perox.
Ampliación
Reducción
Predicción del porcentaje de reducción de la cavidad
Steepest descents reprodujo con mayor precisión el porcentaje de
reducción de las cavidades: ligeros cambios en la estructura
Steepest descents Conjugate gradients
Predicción de la estructura de las proteínas con cavidad
Bajos valores de rmsd entre la estructura cristalizada y modelada
Reducción
Teórico CristalModelo
Alta precisión en la predicción de la forma y tamaño de las cavidades y de la estructura
global de la proteína
ExpansiónTeórico Cristal
Modelo
Diseño de cavidades en el núcleo hidrófobo de la flavodoxina de Anabæna
Trp66
Leu44Ile52Ile109
Leu105
Mutaciones in silico truncantes a Ala (Phe)
Método de modelización
Análisis de los modelos de flavodoxina con
cavidad
Mutante* Estructurasecundaria
Accesibilidadsolvente
cadena lateral(%)
Volumencavidadteórica
Volumencavidadmodelo
Reduciónvolumencavidad
(%)
W66F/L44A Hélice 0 251 232 8
W66F/L105A Hélice 0 255 217 15
W66F/I109A Hélice 0 205 210 -2
W66F Hélice 0 173 140 19
L44A Hélice 0 151 137 9
L105A/L44A Hélice 0 151 137 9
I109A Hélice 0 111 116 -5
I52A Lámina 0 97 91 6
L105A Hélice 0 52 61 -17
* modelos sobre la holoflavodoxina
Mutantes modeladas de flavodoxina de Anabæna con cavidad
• Muy ligeros rearreglos en la estructura de la proteína
• Ningún colapso fue observado
Flexibilidad reducida del núcleo hidrófobo
Machicado C., Bueno M. & Sancho J. 2002. Predicting the structure of protein cavities created by mutation. Protein Engineering. 2002 Aug;15(8):669-75.
W66F/L44AW66F/L105A
Cavidad: 185 Å3 Cavidad: 204 Å3
Mutantes modeladas de flavodoxina de Anabæna con cavidad
Estudio experimental del plegamiento de las mutantes de flavodoxina con cavidad
Dicroísmo circular en el UV-lejano
Dicroísmo circular en el UV-cercano
La creación de cavidades fue crítica para 2 mutantes (I109A y
W66F/I109A): parcialmente desplegadas
Estudio experimental de la estabilidad térmica de las mutantes de flavodoxina con cavidad
La creación de cavidades generó una importante desestabilización térmica
en todas las mutantes:-Pérdida de contactos de vdw-Pérdida de la fuerza hidrófoba
Proteína Tm (K EE) Tm (K)
Silvestre W66F -3.7 W66F/L105A -10.6 W66F/L44A -9.3
I109A -15.3 W66F/I109A -21.3
FLUORESCENCIA
322.9 0.2319.2 0.3312.3 0.3313.6 0.1307.6 0.4301.6 0.8
329.1 0.1327.3 0.1318.9 0.1318.2 0.2306.8 0.6303.9 1.4
Tm (K EE) Tm (K)
CD EN EL UV-LEJANO
-1.8-10.2-10.9-22.3-25.2
Método de modelización de cavidades aplicadoa otras proteínas: anti-HBsAg scFv fragment
Pedroso I, Irun MP, Machicado C, Sancho J. Biochemistry. 2002 Aug 6;41(31):9873-84.
Método de modelización de cavidades aplicadoa otras proteínas: COX-I
Rebeca Acın-Perez, Marıa Pilar Bayona-Bafaluy{, Marta Bueno, Claudia Machicado, Patricio Fernandez-Silva, Acisclo Pe´rez-Martos, Julio Montoya, M.J. Lo´pez-Perez, Javier Sancho and Jose´ Antonio Enrıquez* Hum Mol Genet. 2003 Feb 1;12(3):329-39.
C. Machicado, S. Castillo, M. Bueno, M. Pocoví y J. Sancho. Clin Invest Arterioscl 2003;15(2):59-65
Método de modelización de cavidades aplicadoa otras proteínas: receptor de LDL
PREDICCIÓN DE CAVIDADES EN EL INTERIOR DE PROTEÍNAS: DISEÑO Y OBTENCIÓN DE MUTANTES DE FLAVODOXINA CON CAVIDAD
PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA Y ENERGÍA DE UNIÓN DE COMPLEJOS PROTEÍNA-LIGANDO
CRIBADO MASIVO DE LIGANDOS A CAVIDADES DE PROTEÍNAS Y DETECCIÓN EXPERIMENTAL DE LA FORMACIÓN DE COMPLEJOS
Implementación de un método para modelar complejos proteína-ligando
Lisozima L99A
• Estructuras cristalizadas (9)
• Gunión experimentales (15)
+ 17 ligandos 23 moléculas no unidoras
Unión Proteína-Proteína Unión Proteína-Ligando
Efecto hidrofóbico
EntalpíaEntropía
Desolvatación
El método de docking moleculardebe reproducir la unión proteína-ligando
Simulaciones computacionales de la unión proteína-ligando
Proteína Ligando
3. Ordena conformaciones de acuerdo a la energía obtenida.
1. Explora conformaciones que favorezcan la interacción proteína-ligando
2. Minimiza la energía potencial de los complejos.
Algoritmo de acoplamiento
Etapas del acoplamiento molecular proteína-ligando
∆Gunión= ∆GPL + ∆GP + ∆GL + ∆Gdesol
2. Evaluación de la energía potencial de los complejos y elección del más estable
3. Energía libre de unión teórica de los ligandos
1. Acoplamiento flexible• Monte Carlo y minimización
de energía, en un campo de fuerza CVFF
• 30 conformaciones distintas
• Selección de complejos: Metropolis
Variables definidas
FLEXIBILIDAD DEL SITIOFLEXIBILIDAD DEL SITIO • Átomos flexibles: Sitio de unión (cavidad) y ligando
• Átomos rígidos: Resto de proteína
• Campo de fuerza: CVFF
• Dimensiones de la cuadrícula
CÁLCULOS ENERGÉTICOSCÁLCULOS ENERGÉTICOS
• Método de minimización y número de pasos
• Prueba de selección
• Temperatura de Metrópolis
Sitio de unión: residuos en la superficie de la cavidadSitio de unión: residuos en la superficie de la cavidad
CUADRÍCULAS DE DOCKING CUADRÍCULAS DE DOCKING
SIMULACIÓN (5-6 HORAS) SIMULACIÓN (5-6 HORAS)
30 CONFÓRMEROS PARA CADA LIGANDO
30 CONFÓRMEROS PARA CADA LIGANDO
ELECCIÓN DEL MEJOR CONFÓRMERO
ELECCIÓN DEL MEJOR CONFÓRMERO
Predicción de la estructura de complejos Lisozima L99A-ligandos
Complejos modelados son casi idénticos a los cristalizados Método de acoplamiento reproduce con alta precisión la estructura de los complejos proteína-ligando
CristalModelo
DESVIACIÓN CUADRÁTICA MEDIA
(RMSD) DE LOS COMPLEJOS
MODELADOS Y CRISTALIZADOS
PDB Ligando RMSD (Å)
181L benceno 0.22
182L benzofurano 0.34
183L indeno 0.35
184L iso-butilbenceno 0.45
185L indol 0.35
186L n-butilbenceno 0.31
187L p-xileno 0.29
188L o-xileno 0.39
1NHB etilbenceno 0.25
DISCRIMINACIÓN DE LIGANDOS QUE NO SE UNEN
Ácido benzoico (NO UNIÓN)
Benzofurano (UNIÓN)
Claudia Machicado, Jon López-Llano, Santiago Cuesta-Bueno & Javier Sancho. Journal of Computer-Aided Molecular Design (2005) 19 (6):
Predicción de la unión moléculas a la Lisozima L99A
2. Unión del 100% de los ligandos verdaderos de la cavidad: NO HUBIERON FALSOS NEGATIVOS
1. Éxito en el 74 % de casos de moléculas no afines a la cavidad: POCOS CASOS DE FALSOS POSITIVOS
• Las moléculas de agua aumentan su entropía (efecto hidrófobo)
• Aparecen interacciones entre la proteína y el ligando
• Proteína y ligando pierden grados de libertad
G = H -TSG = H -TS
Cambio de la energía libre durante la unión de una proteína y un ligando
Proteína
Ligando
Gu = Hsu + HI + HI:p - TSI - TSw - TSp - TSpl - Hl:w
GGuu = = HH -- TTSS
PARAMETRIZACIÓN DE LA ENERGÉTICA
∆Gunión = ∆Htotal - T∆Sconf - T∆SW
Implementación de una ecuación para calcular el cambio de energía libre de
unión de un complejo proteína-ligando
∆Gunión = ∆GP +∆GL+ ∆GPL+ ∆Gdesol
CAMBIO DE ENTROPÍA CONFORMACIONAL DEL LIGANDO (Sl) Y LA PROTEÍNA (dSp)
Novotny et al., 1987
Krystek et al., 1993
-TS = 0,52N * 298 kcal mol-1
CAMBIO DE ENTROPÍA DEL
AGUA (Sw)
-TSw = 0,45(ASAnp) * ln(T/384.15) - 0.26(ASAp) * ln(T/335.15) * 298
cal K-1 mol-1
Luque & Freire, 2000
ENTROPÍA TRASLACIONAL Y
ROTACIONAL (Spl)
-TSPL = 11 kcal mol-1
Krystek et al., 1993
Predicción del cambio de energía libre de unión de los complejos proteína-ligando
Ecuación 1
∆Gu = 0.18∆Htotal - 0.02T∆Sconf - 0.8T∆Sw
∆Gu = 0.07∆GP + 0.28∆GL + 0.19∆GPL + 1.64∆Gdesol
Ecuación 2
Parametrización del Gu experimental (15)
con datos teóricos
Grupo de entrenamientoOtros complejos
Grupo de entrenamientoOtros complejos
Grupo de entrenamiento: 6 complejos
RESULTADOS: CÁLCULO DE Gu EN LOS CONTROLES NEGATIVOS
RESULTADOS: CÁLCULO DE Gu EN LOS CONTROLES NEGATIVOS
LIGANDOS dHsu dHl Hl:p (-)TdSl (-)TdSw (-)TdSp (-)TdSpl Hl:w Predicted dG Actual dGp-cresol -16,56 2,00 -20,48 0 6,8576 - 2,08 11 -31,69 -3,827 N.d.
benzylalcohol -19,63 1,52 -21,20 0 6,6000 - 2,08 11 -34,83 -3,600 N.d.octanol -10,45 5,39 -11,38 3,12 9,9427 - 2,08 11 -28,34 -3,056 N.d.azulene -13,64 10,78 -19,89 0 10,8000 - 2,08 11 -30,64 -3,754 N.d.
t-buthylbenzene -7,61 5,17 0,80 0,52 10,1230 - 2,08 11 -24,82 -0,202 N.d.cyclohexane -15,39 -3,11 -6,54 0 7,7626 - 2,08 11 -15,17 -2,446 N.d.
1-phenylheptane -14 11,82 3,57 3,12 -13,8718 2,08 11 -37,34 1,151 N.d.fenol N.d.
metanol N.d.etanol N.d.
propanol N.d.heptanol N.d.quinolina N.d.aniline N.d.
benzaldehido N.d.acido benzoico N.d.
mesitileno N.d.camfeno N.d.camfor N.d.piridina N.d.
trans-cinmaldehido N.d.
LIGANDOS QUE QUEDAN FUERA DE LA PROTEÍNA DESPUÉS DEL
DOCKING MOLECULAR
PREDICCIÓN DE CAVIDADES EN EL INTERIOR DE PROTEÍNAS: DISEÑO Y OBTENCIÓN DE MUTANTES DE FLAVODOXINA CON CAVIDAD
PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA Y ENERGÍA DE UNIÓN DE COMPLEJOS PROTEÍNA-LIGANDO
CRIBADO MASIVO DE LIGANDOS EN CAVIDADES DE PROTEÍNAS Y DETECCIÓN EXPERIMENTAL DE LA FORMACIÓN DE COMPLEJOS PREDICHOS
Método de cribado virtual de bibliotecas de ligandos en cavidades de proteínas
ACOPLAMIENTO INICIAL
Puntuación y lista de candidatos
Filtro de volumen
Ligandos potenciales
NCI-DB250251 moléculas
Filtros de polaridad
ACOPLAMIENTO FINO
(II) CERIUS2
(I) CATALYST y VEGA (Awk)
(III) AFFINITY
Evaluación del Gu
Cribado masivo de la NCI-DB frente a la lisozima L99A: Enriquecimiento de la lista de candidatos
1. Filtros iniciales• Volumen• SASp
• Lipolo
0
100
200
300
400
500
600
Vol/Polar ConsScore SumScore
Vol/PolarConsScoreSumScore
2. Consensus Score Ligandos que puntuan bien considerando 5 funciones de energía
3. Puntuación global Sumatoria de 8 funciones de energía (SumScore)
CRITERIO DE % DE LA NCI-DB Nº LIGANDOS TASA DE SELECCIÓN ENRIQUECIMIENTO*
1. Volumen/polaridad 2.0 4913 51
3. SumScore 0.17 469 534
-20
-10
0
10
20
30
40
50
Ligandos
Su
mS
core
SumScore = 0.1(vdW + LS2 + 0.3*BuryPol2 + 1.5*Cpol)
+ 0.2(PLP1 + PLP2 + Jain + PMF)
NO UNIDORES U NIDORES
2. Consensus score 1.5 3824 65
NºLigEnc*NºBD
NºLigTot*NºCandidatos*TE=
Búsqueda de ligandos de la flavodoxina mutante con cavidad W66F/L44A
Holoflavodoxina mutante W66F/L44A
Acoplamiento masivo y puntutación
Acoplamiento fino
y cálculo del Gu
2% de NCI-DB
9 ligandos con gran afinidad por la cavidad
3 moléculas poco afinesa la cavidad
CRITERIO DE % DE LA NCI-DB Nº LIGANDOS TASA DE SELECCIÓN ENRIQUECIMIENTO
1. Volumen/polaridad 2.0 4913 51 2. Consensus score 1.4 3690 68 3. SumScore 0.2 585 428
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Vol/Polar ConsScore SumScore
Vol/PolarConsScoreSumScore
Complejos modelados flavodoxina W66F/L44A-ligando y energía de unión del complejo
LIGANDO PUESTO EN Gu (Kcal mol-1)
LA LISTA
UNIDORES
Bencilamina 66 -7.4
Piridina 324 -7.6
Benceno 355 -8.4
Furano 435 -6.6
Tolueno 585 -8.3
NO UNIDORES
Butanol 2312 -3.0
Colina 2803 N.a.ii
2-fenil-propanol N.a.i -3.5
N.a.i Fue excluido con el Consensus Scoring
N.a.ii Salió expelida de la cavidad luego del docking
Detección experimental de la unión flavodoxina-ligando: Medición de la Tm
UNIDORES PREDICHOS
NO UNIDORES PREDICHOS
COMPUESTOS Tm ± EE
Bencilamina 2,20 ± 0,82Benceno 2,20 ± 0,56Furano 1,90 ± 0,66Piridina 1,60 ± 0,47Tolueno 1,05 ± 0,60
COMPUESTOS Tm ± EE
Butanol 0,60 ± 0,48Colina -0,75 ± 0,422-fenilpropanol 0,60 ± 0,61
Detección experimental de la unión flavodoxina W66F/L44A-ligando: Titulaciones del ligando
BencilaminaG = -2.8 kcal mol-1
FuranoG = -1.8 kcal mol-1
BencenoG = -2.0 kcal mol-1
FUTUROS ESTUDIOS
GENÓMICA
• Identificación del blanco
• Validación del blanco
COLECCIONES DE COMPUESTOS
• Bibliotecas de compuestos existentes
• Química combinatorial
• Productos naturales
Cribado experimental a gran escala (HTS)
Selección y optimización de compuestos cabecera
Diseño del fármaco
Ensayos celulares
Candidato a pruebas clínicas
APLICACIÓN BIOMÉDICA: VEHICULIZACIÓN DE FÁRMACOS
Cribado virtual a gran escalaSelección compuestos candidatos
APLICACIÓN BIOMÉDICA: ENSAYOS CELULARES CON PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS
DE LIGANDOS
Especifidad
?
Liberación?
Ingreso?
Acción intracelular
?
Transporte plasmático?