GLICOSIDOS CARDIOTONICOS
DEFINICION
Los glicósidos cardiotónicos son sustancias amargas
constituidas de una porción esteroide, una
porción glicosídica y un anillo de gama-lactona ,
alfa,ß-insaturada o delta-lactona-alfa,ß-
insaturada, que actúan sobre el músculo
cardiaco y por tanto se utilizan como
medicamentos contra la insuficiencia cardiaca.
Se conocen entonces según el anillo lactónico dos
grandes clases de cardiotónicos: Los
CARDENOLIDOS, con anillo de gama-lactona,a
y los BUFANOLIDOS O ESCILANOLIDOS,
con anillo de delta-lactona.
Los glicósidos cardiotónicos son sustancias constituidas de una porción esteroide,
una porción glicosídica y un anillo de ¡-lactona a,ß-insaturada o d-lactona-a,ß-
insaturada, que actúan sobre el músculo cardiaco y por tanto se utilizan como
medicamentos contra la insuficiencia cardiaca. Se conocen entonces según el
anillo lactónico dos grandes clases de cardiotónicos: Los CARDENOLIDOS, con
anillo de ¡-lactona, y los BUFANOLIDOS O ESCILANOLIDOS, con anillo de d-
lactona. La figura 24 muestra la estructura estereoquímica general de ambas
clases de sustancias.
glicósidos cardiotónicos: incrementan la fuerza de contracción del corazón
actúan sobre el corazón fortaleciendo el trabajo cardiaco. La fracción de hidratos de carbono que constituyen los glicosidos, contienete de 3 a 5 monosacaridos , por lo general desoxiazucares o azucares especiales. Para que el compuesto resulte activo, deben estar presentes al menos un OH en el C3 en ß (que constituye el glicosido) y otro en el C14 en ß, metilos en ß, en C10 y C13; una lactona unida al C17 correspondiente a una g-lactona a –insaturada (cardenolido), o una d-lactona a, ß-insaturada ( bufadienolido), y los anillos A/B y C/D deben estar en cisBIOSINTESIS
La progesterona formada se condensa con una unidad C2 para dar origen a una cadena lateral de 4 carbonos típica de los cardenólidos.La posterior oxidación y deshidratación origina el anillo γ-lactonaα,ß-insaturada.Posteriormente ocurre la glicosilación.
DISTRIBUCION NATURAL
Principalmente en las hojas de plantas de las familias Scrofulariaceae, Apocynaceae, Liliaceae, Ranunculaceae y Moraceae.Los bufanólidos se han encontrado también en ranas del género Bufus, y en las alas de mariposas monarca, han sido considerados de interés por su potencial anticancerígeno.
DISTRIBUCION NATURAL
• Cardenólidos: familias
Scrofulariaceae, Apocynaceae,
Liliaceae, Ranunculaceae y
Moraceae
• Bufanólidos: en ranas del género
Bufus, y en las alas de mariposas
monarca
ENSAYOS DE RECONOCIMIENTO
Los cardenólidos se pueden reconocer en muestras biológicas mediante los ensayos de coloración con varios reactivos nitro, tal como se anotó para las sesquiterpenlactonas; específicamente con los reactivos de Kedde, Legal y Raymond. Al igual que las saponinas esteroides, dan resultados positivos con el reactivo de Liebermann-Burchard, lo que permite diferenciarlos de las terpenlactonasy las cumarinas.
Kedde
Legal
Raymond
Liebermann-Burchard
Ensayosparacarbohidratos
(Molisch, antrona, etc.)
• Keller-Kiliani:
Para 2-deoxiazúcares
A.- ENSAYO DE KEDDE (PARA CARDIOTONICOS)Precaución: La
formación del color violáceo no dura sino algunos pocos
segundos.Ensayo: Tomar 1 ml de la fase orgánica. Llevar a sequedad.
Redisolver en 1 ml dealcohol. Añadir 0.5 ml de reactivo de Kedde recién
prepa rado (Mezcla de partes igualesde las soluciones A y B). Se
considera positiva la prueba si aparece una coloraciónpúrpura o
violácea. Como referencia se puede compa rar con el color producido
con 1ml de KOH al 5% en alcohol.
B.- HIDROLISIS
Los glicósidos cardiotónicos se hidrolizan fácilmente en soluciones
ácidas liberando la sapogenina y los carbohidratos ligados. En medio
alcalino, además de liberarse la sapogenina ocurre la apertura del anillo
lactónico.
10. HECHOS ESTRUCTURALESLos cardiotónicos naturales en su
gran mayoría, poseen:Un anillo lactónicoa,ß-insaturado en posición
17ßUn grupo hidroxilo o glicosilo en posición 3ßUn grupo hidroxilo
en posición 14ßConfiguración cis entre los anillos A/B y C/DOtros
grupos hidroxilo en 1, 5, 12, 16, etc.El grupo metilo 19 algunas veces
oxidado hasta alcohol o aldehído1 a 4 unidades de carbohidrato
ligadas al oxígeno del carbono 3Los carbohidratos ligados son
principalmente glucosa y desoxiazúcarescomo digitoxosa, cimarosa,
etc.Los desoxiazúcares son una característica importante de los
glicósidos cardiotónicos, ya que esta clase de carbohidratos se
encuentra prácticamente restringida a estas sustanciasnaturales.
HECHOS
ESTRUCTURALES
Un anillo lactónico alfa,ß-insaturado en posición 17ß.
Un grupo hidroxilo o glicosilo en posición 3ß.
Un grupo hidroxilo en posición 14ß.
Configuración cis entre los anillos A/B y C/D
Otros grupos hidroxilo en 1, 5, 12, 16, etc.
El grupo metilo 19 algunas veces oxidado hasta
alcohol o aldehído.
1 a 4 unidades de carbohidrato ligadas al oxígeno del
carbono 3.
Los carbohidratos ligados son principalmente glucosa
y desoxiazúcares como digitoxosa, cimarosa, etc.
Los desoxiazúcares son una característica importante
de los glicósidos cardiotónicos, ya que esta clase de
carbohidratos se encuentra prácticamente restringida
a estas sustancias naturales.
11. EXTRACCION Y AISLAMIENTOAl igual que las saponinas
esteroides y otros glicósidosterpenoides, los cardiotónicos pueden
aislarse en forma glicosídica o como sapogeninas.En el primer caso
se utiliza el método ya descrito para las saponinas esteroides
(desengrase, extracto polar, resina de intercambio iónico,
Sephadexy cromatografía), mientras que en el segundo caso se
realiza una hidrólisis ácida seguida de partición con un solvente
orgánico (generalmente cloroformo) y cromatografía en sus
diferentes formas, especialmente con sílica gel.Para el
fraccionamiento por cromatografía en columna con sílica gel pueden
utilizarse mezclas de solventes comDiclorometano/Metanol/Agua
91:22:683.Luego de este fraccionamiento e hidrólisis ácida, las
geninas pueden analizarse y separarse por HPLC-fase
reversa4,5,6,7; mientras que los carbohidratos ligados pueden
analizarse por cromatografía en papel eluyendo con la mezcla
Butanol/Acido Acético/Agua 4:1:58.Recientemente y gracias al
avance de las denominadas técnicas "on-line" y el desarrollo de
interfaces HPLC-Espectrometría de masas se pueden analizar
extractos crudos que contienen glicósidos cardiotónicos o saponinas,
mediante técnicas combinadas como LC-TMS (HPLC combinada
con Espectrometría de masas con interfasetermospray) y
LC-CF/FAB (HPLC combinada con Espectrometría de masas FAB
de flujo continuo)9.
12. VALORACION EN PRODUCTOS FARMACEUTICOSLa mejor
técnica para valorar los glicósido cardiotónicos en extractos
vegetales y productos farmacéuticos es HPLC.Otros métodos de
valoración de los cardiotónicos son la colorimetría con el Reactivo de
Kedde y métodos biológicos en los que se determina la Dosis Letal
Mínima (DL-50), el volumen de vómito en palomas, el paro cardíaco
en gatos y con el corazón aislado de ranas, y los métodos
enzimáticos.
13. ACCION FARMACOLOGICA Y RELACION ESTRUCTURA-
ACTIVIDADTienen acción inotrópica positiva, es decir, incrementan
las fuerzas de contracción del músculo cardíaco. Por otro lado, las
hojas de digital tienen un efecto diurético. Por estas razones se les
utiliza en tratamientos de nefritis, edemas y algunas enfermedades
infecciosas. Se ha establecido que para que los cardiotónicos
manifiesten su actividad requieren además del ciclo lactónicoa,ß-
insaturado, que:La configuración sea 14ß,3ß,17ßconfiguración A/B
cisAdemás, se ha observado que la presencia de azúcares ligados y
el número de hidroxilos tienen capacidad en aumentar la actividad
farmacológica.
Extracción y aislamiento
Glicósidos: Extracción ídem a lo descrito para las
saponinas esteroides (desengrase, extracto polar, resina
de intercambio iónico, Sephadex y cromatografía)
Sapogeninas: Extracción con hidrólisis ácida seguida de
partición con un solvente orgánico (generalmente
cloroformo) y cromatografía en sus diferentes formas,
especialmente con sílica gel.
Cromatografía en columna (Sílica gel, Diclorometano-
Metanol/Agua 91:22:68)
Extracción con hidrólisis ácida, las geninas pueden
analizarse y separarse por HPLC-fase reversa; mientras
que los carbohidratos ligados pueden analizarse por
cromatografía en papel eluyendo con la mezcla
Butanol/Acido Acético/Agua 4:1:5.
HPLC-Espectrometría de masas
LC-TMS (HPLC combinada con Espectrometría de
masas con interface termospray)
LC-CF/FAB (HPLC combinada con Espectrometría de
masas FAB de flujo continuo).
CARACTERISTICAS
ESPECTRALES
• Espectroscopia Infrarrojo: Los
cardiotónicos además de las bandas
características de la funcionalidad
esteroide, presentan bandas de
absorción características del grupo
carbonilo lactónico alfa,ß-insaturado
alrededor de 1715-1725 cm-1.
• b. Espectroscopia UV: El
cromóforo gama-lactona-alfa ,ß-
insaturada muestra un máximo de
absorción alrededor de 215-220 nm.
• c. Espectrometría de masas 70 eV:
Agliconas m/z 111, M-44.
Glicósidos: Espectrometría de masas
FAB en modo positivo o negativo.
PRINCIPALES DROGAS VEGETALES QUE CONTIENEN CARDIOTONICOS
Hojas de digital
La droga la constituyen las hojas desecadas de Digitalis purpurea (Fam.
escrofulariácea). Esta planta es cultivada en Europa, pero en nuestro país es más
bien escasa y se utiliza con fines ornamentales. Se la conoce con el nombre
vulgar de "campanitas" o "dedalera" y crece silvestre en localidades como a orillas
de la autopista Medellín-Bogotá en el sector de Sasaima. Los principios activos
son una mezcla de glicósidos cardiotónicos denominados purpureaglicósidos, en
los cuales la sapogenina es la digitoxigenina. Uno de estos es el
purpureaglicósido A:
La especie relacionada Digitalis lanata, también contiene glicósidos cardiotónicos
pero con la característica particular de que uno de los carbohidratos ligados posee
un grupo hidroxilo acetilado. Esta especie contiene los denominados lanatósidos
como por ejemplo:
La especie D. lanata, aunque es originaria de Europa, también se encuentra en
nuestro país, específicamente en la sabana de Bogotá.
Estas drogas vegetales se comercian en Europa bajo nombres comerciales como
DigitalinaÔ, CardinatinaÔ, CristalloxinaÔ, DigoxinaÔ, etc.
Para el análisis HPLC de esta droga puede consultarse el trabajo de Ikeda y
col.26, y este autor también ha reportado el análisis cuantitativo mediante
Cromatografía en Capa Fina de Fase Reversa 27.
El género Isoplexis fam. Escrofulariáceas contiene cardenólidos similares a los de
Digitalis28.
Estrofanto
Esta droga la constituyen las semillas desecadas de varias especies de plantas
del género Strophantus, y es usada como veneno de flechas por los nativos de
algunas tribus de Africa. Esta droga contiene el glicósido estrofantina:
Azuceno de la habana
Corresponde al Nerium oleander (Fam. Apocináceas). Esta planta es cultivada
para fines ornamentales, y es común verla en diferentes sitios de la ciudad de
Medellín, con flores rosadas o blancas. La variedad de flores blancas tiene
reportados usos como antídoto, antibacterial, antiepiléptico, anticancerígeno,
cardiotónico y como depresor del Sistema Nervioso Central (SNC). De las raíces, Huq y col., aislaron un cardenólido que además de cardiotónico es antibacterial29.
Las hojas contienen varios cardenólidos con acción depresora sobre el SNC 30.
Thevetia peruviana
Las semillas de esta planta contienen cardiotónicos como el peruvósido:
Lirio de los valles
La droga la constituyen las partes aéreas de Convallaria majalis (Fam. liliáceas).
Esta contiene varios cardiotónicos, entre ellos la convalatoxina:
Bulbo de escila
La droga la constituyen los bulbos de Drimia maritima (Fam. liliáceas). Contiene
bufanólidos como el escilareno-A el cual produce irritación gástrica la que a su vez
induce la secreción de los bronquiolos, por lo cual se usa como expectorante.
Heléboro negro
Corresponde al Helleborus niger (Fam. Ranunculáceas).
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
INTRODUCCIÓN
La insuficiencia cardiaca congestiva (ICC) aparece cuando el corazón es incapaz
de atender las necesidades del organismo mediante un funcionamiento normal. El
corazón aumenta de tamaño, pierde fuerza de contracción y por tanto, la
capacidad de bombear sangre con la eficacia requerida.
El tratamiento clásico de la ICC va dirigido a reducir los factores que la provocan y
a mejorar la función del miocardio, lo cual se puede alcanzar incrementando la
eficacia por aumento de la fuerza contráctil y el vaciado del corazón con agentes
inotrópicos positivos (cardiotónicos).
La especie vegetal
Thevetia peruviana, originaria de la América tropical y naturalizada en la región del
Valle de Aburrá sintetiza metabolitos secundarios tipo glicósidos cardiotónicos, los
cuales almacena en hojas y semillas. Esta premisa fue la motivación para llevar a
cabo la extracción, purificación, identificación y cuantificación de este tipo de
glicósidos presentes en la planta mencionada.
Los glicósidos cardiotónicos son de estructura esteroidal y se caracterizan por
llevar en el C-17 del núcleo esteroideo un anillo de lactona insaturado. Las
diferentes sustituciones del C-17 dan lugar a diversas actividades o funciones, que
son aprovechadas para la elucidación estructural.
Entre los glicósidos cardiotónicos se encuentran los cardenólidos, productos
naturales que aparecen en diversas plantas, estos compuestos poseen un anillo
pentagonal con un doble enlace conjugado con el carbonilo en C-17. Además,
ellos presentan azúcares como sustituyentes, entre los más importantes se puede
mencionar la glucosa y 6-desoxiazúcares (ramnosa, mucosa, digitalosa), así
como 2,6-desoxiazúcares (digitoxosa, cimanosa).
El presente trabajo incluye el proceso de extracción sólido-líquido de los glicósidos
cardiotónicos de las hojas de Thevetia peruviana a través de una metodología
optimizada de separación y purificación, así como su respectiva identificación
estructural y cuantificación.
La cromatografía de columna fue la técnica implementada para la separación de
los componentes de la mezcla, en tanto que la elucidación estructural fue
alcanzada con la ayuda de la espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear
(1H- y 13C-RMN) y
su cuantificación se logró mediante cromatografía de alta resolución acoplada a
masas, (HPLC-MS), permitiendo determinar por primera vez la cantidad de
principios activos presentes en estos compuestos.
Para las mediciones espectroscópicas y de cuantificación contamos con el apoyo
del Laboratorio de Resonancia Magnética Nuclear de la Universidad Nacional de
Colombia – Sede Bogotá y del Laboratorio de de Cromatografía Líquida de la
Sede de Investigaciones Universitarias, SIU, de la Universidad de Antioquia.
Thevetia peruviana
Seguidamente se detallan algunas características específicas de la especie
vegetal de estudio.
Familia: Apocynáceae
Sinónimos: Cerbera peruviana , Thevetia neriifolia
Nombre común: Catape, cascabel, azuceno
Lugar de origen: México y América tropical
Etimología: Thevetia, en honor a André Thévet (1502-1590), misionero francés
que colectó plantas en Suramérica. Peruviana, del latín peruvianus-a-um,
procedente de Perú.
Cultivo y usos: Se multiplica por semillas, es una planta de rápido crecimiento y
muy resistente a condiciones adversas. Se suele cultivar más como arbusto que
como árbol. Su látex y semillas son venenosas. Las hojas y semillas contienen
glucósidos que actúan como estimulantes cardíacos; aunque es utilizada en
medicina
popular su empleo inadecuado es muy peligroso.
Los criterios para la selección de la Thevetia peruviana que se utilizará en el
presente trabajo de grado se basaron en su disponibilidad geográfica y en el alto
contenido de glicósidos cardiotónicos reportado para esta familia.
Figura 6. Thevetia peruviana
3.5. Propiedades químicas
Las propiedades fisicoquímicas de estos compuestos corresponden a las
esperadas de su estructura y considerable tamaño, así, ellos son sólidos
cristalizables, insolubles ó poco solubles en agua, solubles en alcoholes y en
cloroformo. La solubilidad depende de la naturaleza de la aglucona y de la cadena
de azúcares, entre mayor sea el número de residuos de azúcar, mayor será la
solubilidad.
HIPÓTESIS
Dado que muchas reacciones y compuestos que intervienen en el metabolismo en
los diferentes grupos de organismos vivos son casi idénticos, se les denomina
reacciones y productos metabólicos primarios. Sin embargo, una amplia variedad
de rutas bioquímicas son exclusivas de unas pocas especies de organismos y se
conocen colectivamente como “metabolismo secundario”, y a los compuestos
generados como metabolitos secundarios, los cuales usualmente son señalados
por los químicos como “productos naturales”.
La formación de productos naturales es una característica común de células
especializadas, originada por la acción de enzimas específicas que juegan un
papel decisivo en el desarrollo y función del organismo productor como un
conjunto. Actualmente se reconoce que muchos de estos compuestos
desempeñan un papel vital como mediadores de interacción biológica, asegurando
la supervivencia de un organismo en un medio hostil y competitivo. Tales
interacciones incrementan el interés por el estudio de los productos naturales,
imprimiendo a este campo un carácter interdisciplinario, que abarca la química, la
biología y la botánica, entre otras áreas. La razón principal de estos estudios
radica en la utilización de los productos naturales en medicina, conduciendo a la
búsqueda de nuevas plantas potencialmente útiles por parte de químicos y
biólogos, así como de compañías farmacéuticas que enfocan sus investigaciones
en las propiedades de plantas muy reconocidas en la medicina popular.
Con relación a las enfermedades
cardíacas, la frecuencia de cardiopatías congénitas constituye un problema de
salud que va en aumento en la medida que la población es más longeva; para su
tratamiento se utilizan glicósidos cardiotónicos, especialmente cardenólidos,
causando un efecto que se manifiesta en el sistema cardiovascular ocasionando el
aumento de la contracción sistólica, lo que se denomina acción inotrópica positiva.
Los glicósidos cardiotónicos están presentes en especies vegetales de las familias
de las Apocynáceas y Asclepydáceas, donde la especie vegetal más importante e
investigada para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el corazón es
la Digitallis purpurea2, conocida como Digital, de la cual se extraen compuestos
como la digitoxina que posee una gran cantidad de estos cardenólidos
encaminados a producir el efecto inotrópico positivo mencionado.
Kyeremematen y Hagos3, de la Facultad de Farmacia del Centro Biomédico
Uppsala en Suecia, realizaron un estudio de los compuestos presentes en las
especies Thevetia ovata y Thevetia nereifolia, encontrando tres glicósidos
cardiotónicos tipo cardenólido, para los cuales se caracterizó una estructura
formada por un anillo esteroidal y residuos de glucosa en la posición del C-3 y un
compuesto lactonizado en la posición del C-17.
En este marco de referencia y señalando que pese al gran interés práctico de las
plantas de Thevetia peruviana, el estudio de su química ha sido muy limitado, el
presente trabajo de investigación centra su interés en el estudio de los
compuestos químicos presentes en las hojas de la especie vegetal Thevetia
peruviana, perteneciente a la familia
de las Apocynáceas, originaria de la América tropical y naturalizada en el Valle de
Aburrá. Se espera que los metabolitos secundarios aislados puedan ser
aprovechados a futuro en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.
Acorde con estas expectativas se han fijado los siguientes objetivos:
3.1 OBJETIVO GENERAL
Extraer, purificar, identificar y cuantificar los glicósidos cardiotónicos presentes en
las hojas de la especie vegetal Thevetia peruviana, naturalizada en la región del
Valle de Aburrá.
3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
* Seleccionar y adecuar un método eficiente para la extracción y purificación de
los glicósidos cardiactivos existentes en las hojas de Thevetia peruviana.
* Utilizar ensayos conocidos para la identificación cualitativa de las partes
componentes de los glicósidos cardiotónicos.
* Llevar a cabo la identificación estructural de los compuestos de interés con la
ayuda de técnicas espectroscópicas convencionales.
* Cuantificar mediante cromatografía HPLC-Masas la cantidad de metabolitos
cardiotónicos presentes en las hojas de Thevetia peruviana con el fin de disponer
de estándares puros de glicósidos cardiotónicos de esta especie, aún no
disponibles y que serán de gran ayuda como indicadores en la identificación de
cultivos provenientes de esta planta.
4. EQUIPOS
Figura 10. Rotaevaporador
Figura 11. Muestras extraidas y purificadas listas a analizar
Figura 12. Cromatografía de columna
Figura 13. Esquema de la cromatografía de columna
Figura 14. TLC (Thin Layer Chromatography)
5. METODOLOGIA
5. METODOLOGIA
La secuencia
de etapas que permitieron extraer, separar, purificar y cuantificar los glicósidos
cardiotónicos presentes en las hojas de Thevetia peruviana, se esquematizan en
el diagrama 1 (ver final del capítulo).
Después de un tratamiento preliminar de la muestra se efectuó un tamizaje
fitoquímico, etapa inicial de toda investigación fitoquímica que permite determinar
cualitativamente los principales grupos de constituyentes químicos
(fundamentalmente metabolitos secundarios) presentes en una planta, y a partir
de esta información, orientar la extracción y/o fraccionamiento de los extractos
para el aislamiento de los grupos de mayor interés. Específicamente, el tamizaje
fitoquímico consiste en la extracción de los componentes químicos de la planta
con disolventes apropiados y la aplicación de reacciones de coloración que
permitan la evaluación rápida, sensible, reproducible y de bajo costo de los
mismos.
El desarrollo de la secuencia de etapas específicas de la metodología
implementada se describe a continuación.
5.1. Recolección y tratamiento preliminar de la muestra
La recolección del material vegetal se llevó a cabo en las riberas de la quebrada
La Iguana, localizada en el sector urbano de la ciudad, en cercanías de la
Universidad Nacional de Colombia – Sede Medellín.
La Thevetia peruviana es un arbusto de 3 a 5 m de altura, con la corteza grisácea,
lenticelada, algo rugosa con los años. Hojas de linear-lanceoladas a lanceoladas,
de 10-15 x 0,5-1,2 cm, con la base atenuada, el margen entero y el ápice corta o
largamente acuminado; son glabras, algo coriáceas, de color verde lustroso en el
haz, algo
más claras en el envés, con el nervio central destacado y la nerviación secundaria
poco visible.
Después de su respectivo lavado, se procedió a su secado durante dos días a
temperatura ambiente, luego se trituró de tal forma que el material vegetal tuviera
un tamaño promedio de 0.5 cm.
5.2. Preparación de la muestra
En esta etapa se incluyeron los procesos de licuado, filtración desgrasado, lavado,
cromatografía de capa delgada y rotaevaporación, que se detallan seguidamente.
Licuado: 250 g de hojas de Thevetia peruviana (TP) previamente seca y triturada
se someten a un licuado con 400 mL de éter de petróleo durante 10 minutos para
aumentar el área superficial y así poder extraer la mayor cantidad de
cardenólidos.
5.3. Extracción
Una vez que la TP se ha licuado, se procede a realizar una filtración al vacío para
recolectar el extracto etéreo y eliminar los residuos de las hojas.
Dicho concentrado se lavó tres veces con metanol en una relación de volumen
(metanol / éter de petróleo) 3:1 para retirar las grasas en suspensión que se
forman durante este proceso y que son retenidas en un embudo de separación
buchner.
Después se concentran las muestras por medio de rotaevaporación y se realiza un
seguimiento de los compuestos por medio de cromatografía de capa fina para
verificar la presencia de los cardenólidos en la muestra.
5.4. ANALISIS CUALITATIVO
Después del lavado y una filtración al vacío se debe comprobar la existencia de
cardenólidos en el compuesto extraído, para ello se realizó un análisis cualitativo.
Para comprobar de forma cualitativa la presencia de cardenólidos en
el extracto obtenido, se realizaron los siguientes ensayos con reacciones
coloreadas:
* Presencia de azúcares (desoxiazúcares).
* Presencia del núcleo esteroideal.
* Reacciones del anillo de lactona.
5.4.1. Desoxiazúcares
Para comprobar la presencia de azúcares utilizamos la reacción de Keller Killiani:
En un tubo de ensayo se disuelve un poco del extracto metanólico (1 mL) en ácido
acético con algo de tricloruro de hierro. Sobre esta disolución se deja caer por las
paredes ácido sulfúrico y tricloruro de hierro. En la superficie de contacto aparece
un anillo pardo y una capa acética azul verdosa, que muestra la presencia de los
desoxiazúcares. Este ensayo resultó positivo para la muestra analizada.
Reacción de Keller-Killiani
CH3COOH + FeCl3 + H2SO4 TP Color verde azul (Fase acética)
5.4.2. Anillo esteroidal
Para comprobar la presencia del anillo esteroidal se llevó a cabo la reacción
Liebermann-Burchnard.
A 1 mL de muestra disuelta en etanol, se le adiciona anhídrido acético (5 mL) y
ácido sulfúrico concentrado (5 mL), recién preparados, se agita con acido acético y
se deja reposar en un baño de hielo. La aparición de un color violeta verde es
indicativo de la presencia del anillo esteroidal.
La reacción de Liebermann-Burchard se realiza en un medio ácido fuerte
constituido por ácido sulfúrico, ácido acético y anhídrido acético. En la reacción, el
esteroide sufre una oxidación gradual, formándose en cada etapa una molécula de
colestapolieno, que posee un doble enlace adicional con respecto al compuesto
del cual deriva. La etapa inicial de esta reacción consiste en la
protonación del grupo OH del colesterol con la consiguiente pérdida de agua,
obteniéndose el ión carbonio 3,5-colestadieno que constituye el primer paso de la
reacción del color. La oxidación secuencial de este ión carbonio alílico por el SO2-
produce un ácido colesta-hexano-sulfónico con características cromofóricas.
Al igual que en los pruebas anteriores, este ensayo arrojó un resultado positivo
sobre la muestra de estudio.
5.4.3. Anillo pentagonal de lactona
Reactivo de Raymond-Marthoud.
Este reactivo se prepara a partir de 1 g de m-dinitrobenceno en 100 mL de etanol
y la adición de hidróxido de potasio. La presencia de un color violeta confirma la
estructura del anillo lactónico.
Reactivo de Kedde
Para preparar este reactivo se requiere ácido 3,5-dinitrobenzoico (al 3% en
metanol) y la adición de hidróxido de potasio (al 6% en H2O). Un color rojo violeta
señala la presencia del anillo lactónico.
Estos dos ensayos también dieron resultados positivos, confirmando la presencia
del anillo lactónico.
5.5. Cromatografía de columna
5.5.1. Separación a través de cromatografía de columna
Con el extracto vegetal concentrado se realizaron placas cromatográficas con
diferentes combinaciones de solventes para poder determinar la mejor separación
de los compuestos de interés, el mejor resultado fue obtenido para la relación
tolueno/acetato de etilo (3:1).
Con esta combinación de solventes y con el fin de separar los compuestos del
extracto vegetal, ese efectuó el montaje de columnas cromatográficas con silica
gel 60, en tanto que la cromatografía de capa fina fue utilizada para
controlar la pureza de las fracciones obtenidas.
Al realizar la columna cromatográfica se observan dos franjas bien diferenciadas
por su color, de la primera franja de color verde oscuro se recolectaron las
fracciones 3-11, las cuales dieron lugar a un compuesto puro. Las placas
cromatográficas de las fracciones 12-23, no presentaron ningún compuesto.
La segunda franja de color pardo, correspondiente a las fracciones 24-30 presentó
impurezas en las placas cromatográficas tomadas en tolueno/acetato de etilo
(3:1), por lo que se procedió a realizar una nueva columna cromatográfica
modificando la proporción de disolventes (tolueno/acetilo de etilo en relación de
volumen 5:1) dando un compuesto puro, pero en cantidad mínima.
Las dos muestras fueron rotuladas y enviadas al laboratorio de Resonancia
Magnética Nuclear de la Universidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá para
su identificación espectroscópica.
Resultados
La caracterización espectroscópica de los cardenólidos se apoya principalmente en la resonancia magnética nuclear de protones y carbono (1H- y 13C-RMN), en la espectrometría de masas y en los espectros simulados; es de resaltar que todas las señales experimentales concuerdan con las predichas. Dado que el glicósido Thevetin A solo puedo aislarse en una cantidad mínima, que permitió la comprobación de su estructura por medio de masas, la discusión de resultados está referida a la molécula de Thevetin B.
Conclusiones
1. Se comprobó la presencia de metabolitos secundarios tipo glicósidos
cardiotónicos en la planta de Thevetia peruviana naturalizada
en nuestra región.
2. Mediante técnicas tradicionales de separación y purificación como son, la
extracción, filtración y cromatografía en columna, se logró aislar y purificar dos
metabolitos secundarios tipo glicósidos cardiotónicos en las hojas de la planta
Thevetia peruviana, naturalizada la región de Antioquia. Su elucidación estructural
se efectuó con espectroscopia de RMN y cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC-MS) acoplado a masas.
3. Además, mediciones de UV-VIS permitieron la cuantificación del cardenólido
Thevetin B en la especie vegetal de estudio.
4. El método desarrollado para extraer y caracterizar los glicósidos cardioactivos
fue eficiente y condujo a resultado satisfactorios, por tanto puede implementarse
para el análisis de glicósidos cardiotónicos de otras especies vegetales.
Bibliografía
http://es.geocities.com/qo_10_rmn/
Litter, M., Farmacologia experimental y clinica, Ed. El Ateneo, Sexta Edición.
Medarde, M., Caballero, E., San Feliciano, A., Cardiopatías, Investigación y Ciencia, Febrero (1997), 36-37.