Cours M1 - 2011
Introduction aux
techniques de biologie
moléculaire
ADN
ARNm Protéine
Expression des gènes
Analyse des ARNm
Analyse des protéines
Expression des protéines
Western-blot
Immunoprécipitation
Immunocytochimie
Gel retard
Western-blot
Principe:
Séparation des protéines selon leur poids moléculaire
Immunodétection de la protéine d’intérêt
Étapes:
Extraction et préparation des protéines des échantillons
biologiques
Migration et transfert sur membrane
Immunodétection
Expression des protéines
Western-blot
Extraction des protéines
Echantillon d’origine:
Tissu (foie, cœur, etc…)
Cellules (cultures primaires, lignées cellulaires)
Extraction des protéines:
Tampon - PBS/EDTA + Inhibiteurs de protéases
- Tris-HCl
Séparation fraction/extraits totaux
- Centrifugation
- Ultracentrifugation
Débris
cellulaires
Surnageant
= Protéines
Dosage des protéines: pourquoi ?
- Échantillons différents: foie, cœur, poumon, rein, etc…
- Conditions différentes: - témoin,
- traitement inducteur ou inhibiteur
Expression différente de la protéine d’intérêt
Uniformisation des échantillons
Même quantité de protéines analysée quelque soit l’origine de
l’échantillon ou le traitement reçu
Dosage des protéines
Western-blot
Dosage des protéines
- Méthode du Biuret: - Méthode de Lowry:
Réduction du Cu2+ en Cu+ Réduction du Cu2+ en Cu+
Réaction avec Trp, Tyr, Cys Réduction du réactif de Folin
Couleur bleue, pic abs 550 nm (phénolique: jaune en bleue), pic abs 750 nm
Peu sensible 2-100 µg, zone de linéarité étroite
- Méthode de Bradford:
Bleu de Coomassie (se lie à Arg, Tyr, Trp, His, Phe)
Rouge (abs 470 nm) et bleu lorsque lié aux protéines (abs 595 nm)
Très sensible (0,2 – 20 µg), très rapide, interférence avec certains détergents
- Méthode BCA
Acide bicinchonique
Formation complexe coloré avec Cu+
Couleur violette, pic abs à 562 nm
Très sensible, rapide, compatible avec les détergents
Western-blot
Dosage des protéines: exemple
Solution d’Albumine
bovine à 1 mg/mL
Dilution en séries
Mesure au spectrophotomètre
Concentration
DO
Droite étalonnage
DO échantillon
Conc échantillon
Echantillon à
doser Distribution
Préparation des échantillons Protéines: grande hétérogénéité de poids, charges et formes
Contrecarrer ces effets Différenciation sur 1 seul paramètre
Glycérol augmente densité échantillon
-
H2N COOH
+
+
+
+
-
- Ebullition dénaturation
H2N COOH -
- -
+
+
+
Détergent anionique lipophile (SDS)
charges négatives solvatation
+ empêche précipitation
Solution tampon (Laemmli)
Composant sulfhydryl
(β-mercaptoéthanol, DTT) empêche
régénération des ponts disulfures
H2N COOH -
- -
+
+ + - -
- -
- - - - - - -
H2N COOH - - - -
- - -
Protéines dépliées et uniformément chargées (Fct masse)
Migration en fonction du poids moléculaire (+ petite, + vite)
Western-blot
Dépôt et migration des échantillons
Gel SDS-page Sodium Dodecyl Sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis
Gel de séparation (pH 8,8)
5-15% acrylamide
Gel de concentration (pH 6,8)
5% acrylamide)
Sens de
migration
+ pourcentage est élevé
+ densité réseau est élevée
+ mailles sont serrées
Dépôt et migration des échantillons
Solution de dépôt:
- Tampon HCl pH 6,8 Idem gel de concentration
- Bleu de bromophénol Suivi de la migration
- Glycérol Densifier l’échantillon
Western-blot
Séparation selon le poids moléculaire des protéines
Western-blot
Coloration du gel
Contrôle de l’homogénéité de la migration
Vérification de la présence de protéines
Bleu de Coomassie (coloration homogène)
Nitrate d’Argent (plus sensible, parfois moins homogène)
Western-blot
Transfert sur membrane
- Pression, application d’un courant
- Fixation des protéines de façon non-spécifique:
- Interactions ioniques
- Interaction hydrophobes
- Membranes nitrocellulose / PVDF
Western-blot
Coloration de la membrane
Contrôle de l’efficacité du transfert
Contrôle de l’homogénéité des dépôts
Coloration réversible
Western-blot
Immunodétection
Blocage des sites aspécifiques
Incubation avec Anticorps primaires
Incubation avec Anticorps secondaires
Révélation
Western-blot
Blocage de la membrane
Blocage des sites aspécifiques:
- Protéines de lait (solution de lait à 5% dans tampon TBS-Tween)
- BSA (Bovine Serum Albumin – 3-5% dans tampon TBS-Tween)
Membrane X X X X
Blocage avec des protéines inertes
Membrane
Western-blot
Incubation avec Anticorps primaires
Anticorps primaires = dirigé contre un épitope de la protéine X
Dilués dans la solution de blocage (lait ou BSA)
X X X X
Membrane X X X X
Lavage = supprime l’excès d’Ac 1aires
Western-blot
Incubation avec Anticorps secondaires Anticorps secondaire = dirigé contre l’espèce à laquelle
appartient l’anticorps primaire (ex: souris, chèvre, lapin)
Couplés à une enzyme (peroxydase ou phosphatase alcaline)
Membrane X X X X
Perox Perox Perox Perox
X X X X
Perox Perox Perox Perox
Lavage = supprime l’excès d’Ac 2aires
Western-blot
Révélation par chemiluminescence Ajout du substrat de l’enzyme
Clivage avec relargage d’un produit émettant de la lumière
Impression d’un film photographique
Révélation photo
X X X X
Perox Perox Perox Perox
Ex: Stabilisation du facteur de
transcription HIF-1α par l’hypoxie
Western-blot
Western-blot: Résumé
Extraction et préparation des échantillons
- Protection vis-à-vis des protéases
- Dosage
- Dénaturation
Electrophorèse
- Dépôt et migration des échantillons sur gel (selon leur poids
moléculaire)
- Transfert sur membrane
Immunodétection
- Blocage des sites aspécifiques
- Incubations avec Ac 1aire puis 2aire
- Révélation
Immunoprécipitation Isoler une protéine d’intérêt à partir d’un lysat cellulaire
Utiliser un Ac spécifique de la protéine d’intérêt
Précipiter le complexe Protéine-Ac avec une forme insoluble de protéines se liant à
des anticorps (ex: Protein G)
Centrifuger la suspension: la protéine d’intérêt est séparée
Interactions protéines-protéines, protéine-médicament
Concentration d’une protéines présente en faible quantité
Western-blot
Western-blot
Méthode d’analyse des cellules in situ par une technique
d’immunofluorescence
Révéler et cibler une molécule biologique à l’échelle cellulaire avec des
anticorps spécifiques
Utilisation d’un fluorochrome couplé à:
- anticorps primaire = immunofluorecence directe
- anticorps secondaire = immunofluorecence indirecte
Ex: Mise en évidence du cytosquelette
Anticorps 1aire anti-tubuline
Anticorps 2aire couplé à la fluorescéine
Immunocytochimie
Immunocytochimie
Immunocytochimie: Méthode
Immunocytochimie
Cellules en culture
Fixation (PFA 4%) Lavages au PBS
Perméabilisation au
Triton X-100 (0,05%)
Blocage des sites
aspécifiques (BSA 3%)
Anticorps 1aire
(une nuit – 4°C)
Anticorps 2aire
couplé au
fluorochrome
Lavages
au PBS
Analyse au
microscope
Anti-actine
Immunocytochimie: exemple
Immunocytochimie
Facteur de transcription HIF-1α (Hypoxia Inducible Factor)
- Présence O2 cytoplasmique
- Absence O2 nucléaire transcription de gènes nécessaires à la survie
cellulaire
Fibroblastes de membrane synoviale humains
+ mimétique (CoCl2 150 µM) pendant 24 h
Témoin CoCl2
Les fluorochromes
Immunocytochimie
Substance chimique capable d'émettre de la lumière de fluorescence
après excitation
Sont caractérisés par: - un spectre d’absorption
- un spectre d’émission
Ex: Fluorescéine
Absorption des radiations bleues
(max 490 nm)
Émission d’une fluorescence
verte (max 520 nm)
Les fluorochromes Diagramme de Jablonski
Immunocytochimie
S0
État fondamental
S1 État excité
Niveau
d’énergie des
électrons
d’une
molécule
fluorescente
Laser Absorption
Fluorescence
Emission
Les fluorochromes Exemples
Immunocytochimie
DAPI
- Excitation à 365 nm; émission à 420 nm
- Contre-coloration de fond des noyaux
- Fluorescence bleue
FITC: Isothiocyanate de Fluorescéine
- Excitation à 490 nm ; émission à 520 nm
- Fluorescence verte
TRITC: Tetra methyl Rhodamine Iso Thio Cyanate
- Excitation à 541 nm ; émission à 572 nm
- Fluorescence rouge
Le microscope à fluorescence
Immunocytochimie
Filtre correspondant au fluorochrome utilisé
Filtre d’excitation (2): permet de sélectionner les
radiations absorbées par le fluorochrome (fluorescéine:
490 nm)
Miroir dichroïque (3): ne réfléchit que les radiations
absorbables vers l’échantillon et ne laisse passer par
transmission que les radiations vertes
(fluorescéine: > 500 nm)
Filtre d’émission (6): ne laisse passer par
transmission que les radiations vertes
(fluorescéine: > 500 nm)
1-lampe à arc
2-filtre d'excitation
3-miroir dichroïque
4-objectif
5-préparation
6-filtre d'émission
7-oculaire
Le microscope à fluorescence
Ex: Fluorescéine
Immunocytochimie
Le filtre d'excitation
sélectionne les
radiations spécifiques
du fluorochrome...
...qui sont réfléchies
par le miroir et
éclairent
l'échantillon...
...celui-ci émet les
radiations de fluorescence
qui seules atteignent
l'oculaire.
Étude des facteurs de transcription Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)
Gel retard
Facteur de
transcription
activé
Recrutement du
complexe d’activation de
la transcription
ADN Séquence de
fixation
spécifique
Gène TATA box
Étude de la fixation d’un facteur de transcription sur sa séquence cible
Principe (1)
Gel retard
Retard de migration dans un gel natif de polyacrylamide de duplexes
d'oligonucléotides de séquences courtes (15 à 30 nucléotides) en
présence de protéines (ou de complexes protéiques) ayant la propriété de
reconnaître spécifiquement la séquence d'intérêt.
Marquage radioactif au P32 des sondes nucléotidiques.
Spécificité de reconnaissance des sondes marquées testée par l'ajout en
excès du même duplexe non radioactif qui entrent en compétition avec la
forme radioactive.
Présence de protéines spécifiques dans le complexe retardé peut être
mise en évidence par l'ajout d'anticorps spécifiques qui permettent un retard
plus important sur le gel appelé " supershift ".
* *
Sonde libre
Principe (2)
Gel retard
* *
* *
* *
Sondes spécifiques
marquées au P32
+
Protéines nucléaires extraites
- Fixation de la protéine sur sa
séquence cible
- Élimination des autres
Dépôt sur un gel natif
* * *
* *
*
* *
Sonde + protéine
* *
Sonde + protéine + Ac
= « Super-Shift »
Résultats
Gel retard
Extraits nucléaires de cellules Hela
Inconvénients: - Extraction de protéines nucléaires
- Manipulation de la radioactivité
Expression des gènes
Étude de l’expression
Extraction des ARNs
Reverse Transcriptase
PCR semi quantitative et quantitative
Blocage de l’expression
siRNA
Extraction d’ARN
Molécules très fragiles
- Matériels stérile, RNAses et DNAses free
- Travail sur glace
- Port de gants
- Pointes avec filtre
Extraction Phénol/Chloroforme
Utilisation du Trizol® : - Phénol = isole les ADN et ARN
- Isothiocyanate de guanidium = dénaturation protéines
- Anti-RNases
Extraction d’ARN
Extraction d’ARN
Extraction d’ARN
Cellules en culture - Enlever le milieu de culture
- Ajouter le Trizol
- Gratter avec une spatule
- Récupérer dans un tube
Ajout Chloroforme
Vortex
Incubation sur glace
Protéines
Culot d’ARN
Resuspension dans l’eau UP
Lavage à l’Ethanol 70°C
Conservation à -80°C
Dosage à 260 nm
Centrifugation
Phénol + Chloroforme
= Débris cellulaires
Phase aqueuse
= ARN totaux Ajout Isopropanol
= Précipitation
ARN à -20°C
Centrifugation
Transcription inverse (1)
Transcription inverse
ARN ADN complémentaire
Molécule moins fragile
Conservation à -20°C
Sélection des ARNm
Matrice pour la réaction d’amplification
Enzyme Transcriptase inverse isolée de rétrovirus à ARN
Transcription inverse (2)
Transcription inverse
Kits commerciaux avec:
- Enzyme + tampon d’activité
- dNTPs en quantité suffisante
- DTT élimination des structures 2aires des ARNs
- Amorces polydT sélection des ARNm
AAAAA
10 min à 70°C
DTT AAAAAAAA
TTTTTTTTT
Amorce oligo dT 1h – 37°C
15 min – 70°C ARNm
TTTTTTTTT
ADNc
Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR
Méthode d’amplification génique in vitro
Permet de copier en grand nombre (facteur de multiplication de l'ordre du
milliard), une séquence d'ADN ou d'ARN connue, à partir d'une faible quantité
(pg) d'acide nucléique
Utilisation d’amorces spécifiques constituées d'oligonucléotides de synthèse
(20 à 25 nucléotides) obtention d’un amplicon de taille connue
Basée sur:
L’utilisation d’enzymes ADN polymérase ADN dépendantes thermostables
Les propriétés d’hybridation et de déshybridation des brins complémentaires
d’ADN en fonction de la température
PCR: étapes d’un cycle
PCR
PCR: en pratique
PCR
Animation Flash
Au final, on obtient un très grand nombre de copies du
gène d’intérêt, visualisables sur gel
PCR: dépôt sur gel
PCR
Gel d’agarose = maillage
Plus solide et moins toxique que l’acrylamide
ADN chargé négativement, migre selon sa taille (ADN linéaire)
Plus % agarose est élevé, plus on sépare les petits fragments
Visualisation avec du Bromure d’Ethidium (agent intercalant)
- Ajouté lors de la préparation du gel
- En solution dans laquelle le gel est plongé après migration
M échantillons
PCR quantitative ou en temps réel
PCR
A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN total ou d’amplicon est
mesurée grâce à un marqueur fluorescent.
Suivi de la cinétique complète = quantification absolue de la quantité initiale
d’ADN cible
2 techniques:
- agents se liant à l’ADN (ex: SYBR Green)
- sondes fluorescentes (ex: Taqman)
2 conditions:
- Fluorescence augmentée lorsque lié à l’ADN double brin
- Pas d’inhibition de la réaction de PCR
PCRq: SYBR Green
PCR
Étape de dénaturation: le colorant libre émet
peu de fluorescence
Étape de dénaturation: extinction de la
fluorescence
Mesure à la fin de l’étape d’élongation
Étape d’hybridation et d’élongation:
fluorescence associée à la quantité de colorant se
fixant à l’ADN double brin
Lorsque suivi en temps réel, l’augmentation du
signal de fluorescence est observée pendant l’étape
de polymérisation et l’émission fluorescente décroît
complètement lorsque l’ADN est dénaturé à l’étape
suivante
PCRq: SYBR Green
PCR
Avantages:
Utilisation simple
Pas de sonde
Nécessité d’amorces spécifiques
Pas affectée par la présence de mutations sur l’ADN cible
Inconvénient
Se fixe à n’importe quelle molécule d’ADN double brin
Visualisation des produits aspécifiques
PCRq: Technologie Taqman Hydrolyse de sonde
PCR
Basée sur l’activité 5’-exonucléasique de la Taq polymérase pour hydrolyser
une sonde hybridée à sa séquence cible sur l’amplicon durant l’étape
d’hybridation/extension de la PCR.
Lorsque stimulé, le fluorochrome émetteur transfère son énergie au
fluorochrome suppresseur voisin par le principe FRET (fluorescence resonance
energy transfer) qui dissipe cette énergie sous forme de chaleur plutôt que
d’émettre de la fluorescence.
Un fluorochrome émetteur (reporter) (ex. FAM : 6-carboxyfluorocein) est fixé
à l’extrémité 5’ de la sonde d’hybridation et son émission est inhibée par un
second fluorochrome suppresseur (quencher) présent à l’extrémité 3’ (ex.
TAMRA : 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine).
PCRq: Technologie Taqman Hydrolyse de sonde
PCR
Hybridation de la sonde
Fixation de l’amorce et
élongation
Hydrolyse de la sonde
Émission de fluorescence
L’émission de fluorescence augmente à chaque cycle
proportionnellement au taux d’hydrolyse de la sonde
PCRq: Technologie Taqman Hydrolyse de sonde
PCR
Précautions:
Nécessité d’un A, un C ou un T à l’extrémité 5’ parce qu’un G supprime
la fluorescence de l’émetteur même après clivage
Tm de 5 à 10 °C plus élevé que les amorces afin de s’assurer qu’elles
s’hybrideront avant les amorces et qu’elles demeureront hybridées
pendant l’étape combinée d’hybridation et de polymérisation
Avantage:
Plus spécifique
Inconvénient:
Pas idéale pour la détection des mutations
PCRq: Cycle seuil (Ct)
PCR
Base de la quantification précise et reproductible de l’ADN par fluorescence
Valeurs de fluorescence enregistrées à chaque cycle représentent la quantité
d’amplicons produits à un instant précis
Plus il y a de matrices à amplifier au
départ de la réaction de PCR, moins élevé
sera le nombre de cycles requis pour
atteindre un point où le signal d’émission
de fluorescence sera statistiquement et
significativement plus élevé que le bruit de
fond)
Ce point est défini comme étant le cycle seuil (Ct) et apparaîtra toujours au cours de
la phase exponentielle d’amplification.
PCRq: Courbe de fusion « Melting curve »
PCR
Chaque produit d'ADN double brin synthétisé a une température de
fusion (Tm) spécifique, définie comme étant la température à partir de
laquelle 50% de l'ADN est sous forme double brin et 50% sous forme
simple brin.
Étape supplémentaire programmée en fin des cycles d’amplification
45°C à 75°C par palier de 0.1°C avec acquisition de la fluorescence en
continu
PCRq: Courbe de fusion « Melting curve »
PCR
Dérivée première de la fluorescence en fonction de la température
Vérification de la spécificité des sondes
PCRq vs PCR classique
PCR
Quelques ng d’ADN suffisent
Rapidité du run (~ 1 h vs 2h30)
Sensibilité
Quantification précise (si droite d’étalonnage avec une quantité connue)
Logiciels d’analyse = exportation des résultats et gain de temps
small interfering RNA (siRNA)
siRNA
ARN simple ou double brin, qui interfère avec un ARNm spécifique
conduisant à sa dégradation et à la diminution de sa traduction en
protéine
Mécanisme très spécifique
Permet l’étude des gènes
RNA interférence
siRNA
ARN double brin
introduit dans la
cellule (siRNA)
DICER
Complexe RISC
(RNA-Induced Silencer
Complex)
Elimination d’un des brins
du siSNA, dit « passager »
Ciblage des ARNm de la
cellule possédant une
séquence complémentaire
DICER Ribonucléase qui clive l’ARN
double brin toutes les 21 à 25 pb
Clivage de l’ARNm
cible par RISC
- Nécessité d’une complémentarité parfaite entre le siRNA et sa cible
Mécanisme très spécifique
- Possibilité de choisir un siRNA capable de cibler un ARNm porteur
d’une mutation ponctuelle sans affecter l’ARNm sauvage
RNA interférence
siRNA
- Introduction du siRNA 24h avant le début de la manip
- Vérification par western-blot de l’extinction de la protéine
Frede et al., 2005 Anand et al., 2007
Conclusions Importance des outils de la biologie moléculaire
Etude de l’expression génique
- Transcriptionnel (ARNm)
- Traductionnel (Protéines)
Etudes de localisation
- Localisation fonctionnelle
- Physiologique vs pathologique
ne correspondent pas toujours
Limites: - Disposer d’un matériel en quantité suffisante
- Spécificité (anticorps, amorces, etc…)