Download pdf - Kontrollmechanismen der Glycolyse - Home - Springer · Kontrollmechanismen der Glycolyse BENNO HESS und KARL BRAND Max-Planck-Institut fi~r Erniihrungsphysiologie, Dortmund ABSTRACT:

Kontrollmechanismen der Glycolyse

BENNO HESS u n d K A R L BRAND

Max-Planck-Institut fi~r Erniihrungsphysiologie, Dortmund

ABSTRACT: Control mechanisms of glycolysis. Control mechanisms of enzymic reactions are generally based on interactions between activators, inhibitors, substrates and products with enzyme proteins or on induction and repression of enzyme synthesis. All main types of control can be recognized in glycolysis. They are the basis of the network which controls the over-all glycolytic function and operates according to the feed-back principle. - Enzyme profiles may not be used for a functional definition of the metabolic state. Enzyme activities are governed by a variety of control mechanisms, which can best be recognized by steady- state and transient state analysis of metabolites and by an analysis of the system's response in titration experiments with pure enzymes under conditions whereby the system displays oscillatory behaviour of its over-aII flux. The important parameter for the definition of the metabolic state is the net-flux through the system, since this parameter, along with the steady- state levels of the meabolites, gives the steady-state flux pattern, reveals the kinetic state of enzymic reactions and points to control points of metabolism. Continuous glycolytic oscillations in a cell-free extract of Saccharomyces carlsbergensis have been observed over a period of 22 hours with a constant frequency of 0.17 min -1 and a rate of 7.2 nMol ethanol per mg protein per min. Titration of such an extract by pure yeast enzymes reveals the gain (FDP, ADP) and damping components (ATP), which are fed ba& to the enzymes PFK and PK, respectively, PFK, PGK and PK operating as the control units. On the basis of the titration data as well as metabolite and enzyme activity phase relationship, the mechanism of this oscillation can be understood as a crossed feed-ha& interaction. Furthermore, it is discussed as the biochemical model of a physiological clo& mechanism.

E I N L E I T U N G

Mit der Kristallisation des letzten nicht kristallisierten G~irungsenzyms, der Phosphofruktokinase, durda KRE~s und seine Mitarbeiter (PARramGIANNI, LOVE & KI<EBS 1964) kann die klassis&e Periode der Erfors&ung der Glycolyse als abge- schlossen betrachtet werden. Unser heutiges Interesse richtet sich auf zwei verschiedene Gesi&tspunkte der Glycolyse, einmal auf die elementaren Reaktionsmechanismen der Katalyse am Enzym, einer neuen Chemic der I3bergangszust~inde (EIGEN & HAMMES 1963), zweitens auf die Kontrollme&anismen, die den Ablauf der einzelnen Reaktions- s&ritte der Gtycolyse bestimmen (HEss & CHarqc~ 1959, CHANCE & HESS 1959). Als Grundlage der Diskussion sollen zun~i&st formale Gesichtspunkte der Kontr011e enzy- matis&er Reaktionen er6rtert werden; dann will ida den station~iren Zustand sowie ein mathematisches Modell der Glycolyse und schlief~lida einen neuen oszillatorischen r3bergangszustand der Glycolyse besprechen.

130 B. HEss und K. BRAND

K O N T R O L L M E C H A N t S M E N E N Z Y M A T I S C H E R R E A K T I O N E N

In Tabelle 1 sind aligemeine Kontrollmechanismen enzymatischer Reaktionen mit Beispielen aus der glycolytischen Enzymsequenz zusammengestellt. Wi t unterscheiden zwei Typen der Kontrolle enzymatischer Wirksamkeiten, die sich aus der allgemeinen Umsatzglei&ung enzymatischer Reaktionen ergeben: (1) Kontrolle yon Enzymaktivi- t~iten und (2) Kontrolle yon Enzymkonzentrationen (HEss & BRAND 1965, HESS 1963).

Tabelle 1

Kontrollmechanismen gtykolytischer Enzyme. (Nach HEss 1963 und HEss & BRAND 1965)

Typ Mechanismus* Beispiele

A. Kontrolle der Enzymaktivitiit 1~ Energiekontrolle durch

Massenwirkung Aurokontrolle

Kompetitive Kontrolle

Substrataktivierung S + E -+ SE Substrathemmung S + E ~ SE' Produktaktivierung P + E --~ PE Produkthemmung P + E ~ PE' Aktivierung und Hemmung yon Enzymen durch gemeinsame Substrate und/oder Produkte S + E1 q- E2--~ SE1 + SE2

ENO, GAPDH, GAPDH PFK GAPDH PGK, PK GAPDH, LDH ADH, u. a.

2. Katalytische Kontrotle Aktivierung A + E --~ AE 2A + E ---~ A2E

e t c .

Hemmung I + E ~ IE 2 1 + E --~ I~E

etc.

PFK, PK

PFK

B. Kontrolle der Enzymkonzentration Induktion der Enzymsynthese SA-+ ,,GEN" -+ EA Repression der Enzymsynthese Pp -+ ,,GEN" ~ EA Katabotische Repression SA-+ ,,GEN" --~ Ex

PDC ?

MDH/LDH

* S = Substrat, E = Enzym, SE = Enzym-Substrat-Komplex, SE' = ,,modifizierter Enzym-Substrat-Komplex, P = Produkt, PE = Produkt-Enzym-Komplex, PE' = modifizierter Produkt-Enzym-Komplex, A = Aktivator, AE = Aktivator-Enzym-Komplex, I = Inhibitor, IE = Inhibitor-Enzym-Komplex, SA = spezifisches Substrat fiir Enzym EA, Pp = spezifis&es Produkt yon Enzym EA, EX = irgendeln Enzym in der Kette, deren erstes Substrat SA ist, ,,GEN" = aktives GEN-Element.

Die Kontrolle yon E n z y m a k t i v i t ~i t e n wird gewShntich mit Ubergangszeiten yon Sekunden realisiert und ist fiir die rasche Anpassung des Stoffwechsels an neue Bedingungen verantwortlich zu machen. Sie kann durch einfache Massenwirkung (Energiekontrolle), sei es durch Substrat beziehungsweise Produktwirkung, oder durch Competit ion mehrerer Enzyme um gemeinsame Metaboliten zustande kommen und bildet das Beispiel der ~ilteren Kontrolltheorien des Stoffwechsels auf der Grundlage

st6chiometrischer Wechselwirkungen. Weitaus wirksamer dt~rl°te der zweite Kontrollmechanismus durch katalyt is&e

Wechselwirkung mit Enzymen sein. Hier t r i t t die Kontrollsubstanz [ein Akt ivator (A)

Kontroltmechanismen der Glycolyse 131

oder ein Inhibitor (I)] im Sinne eines chemischen Signals zu informativer Koppelung mit dem Enzym unter Konformations~inderung in Reaktion. Entscheidend ist, daft die Substanz dabei nicht verbraucht wird. Die allosterische Aktivierung oder Hemmung sind ein Beispiel fiir diesen Mechanismus (MoNon, CHANG~UX & JACOB 1963).

Der I[Jber-alles-Mechanismus der Kontrolle yon E n z y m k o n z e n t r a t i o n wird dutch Induktion und Repressionsph~inomene beschrieben. Derartige Kontrollwirkun- gen nehmen den Apparat der Eiweiffsynthese in Anspruch und haben l[~bergangszeiten bis zu Stunden. Rir unsere Betrachtungen wollen wir diese Mechanismen vernach- l~issigen.

G_~RUNG

Tr~igt man die Wechseiwirkung glycolytischer Intermediate in ein qualitatives FluBdiagramm ein (Abb. 1), so tritt bei der engen inneren Vernetzung der gesamten Stoffwechselkette das Prinzip der R~ickkopplung oder auch Vorwiirtskopplung klar hervor, wenn auch zun~ichst zwischen energetischer und informativer KoppIung nicht

T G-I-P EtOH ~ATP

[ ATP

;+1 J AA

2 Io' DP PNH

Glu )AI ,

ADP P

Abb. 1 : Vereinfachtes Fiuffdlagramm der G~irung

unterschieden werden kann. Energetische R~ickkopplung ist starr wie ein Getriebe, informative Rtickkopplung ist integrativ. Durch Eingriff an mehreren Punkten der Kette (multiside control) kann der Flut~ durch das System nicht nut dur& schrittweise Massenwirkung, sondern durch Aktivierungs- und Ziigelungskontrolle jeweils um ein Vielfaches positiv oder negativ beeinflut~t werden (siehe unten). Durch die Wirkung mehrerer Kontrollmetaboliten an mehreren Stellen (concerted action) wird die Kon- trolle des glycolytischen Flusses iiber die ganze Kette koordiniert. Die Kontroltenzyme (insbesondere die Kinasen) werden durch einen Mechanismus aktiviert, der sie funk- tionell zu biochemischen ,,Schaltern" des Zellstoffwechsels macht. Von speziellem Interesse ist in manchen glycolytischen Systemen die mSgliche Flui~umkehr mit Hilfe yon Gegenreaktionen eigener ,,glycosynthetischer" Enzyme, die prinzipM1 in Symme-

132 B. H~ss und K. BRAND

trie zu den Kontrollenzymen der Glycolyse zur I]berbriickung thermodynamischer Gefiille angelegt sind (zum Beispiel FDPase).

JF G-I-P

I ADP ATP

\ ,o- , / ........ ~ G-6-P <1 - < . : . . . , , / G l u k o s ¢

27 180 Jr150

" ,- F-6-P - A T P

2 7 10-2

D p 0 ~ AD P

GAP "' DHA

DPNH ....... DPN- ' ' DPGA ~x.Gp /

AT P 3 - P GA

PEP

ADP 5 - ~ [ 10_3

ATP Pyruvat

/ /

1

/ /

t /

! l

DPNH DPN

\5 ~> kakta t

Abb. 2: Flugdiagramm der Glykolyse yon Ascites-Tumorzellen, die Ziffern geben den Umsatz in ,t~M • sec -1 (ha& H~ss, 1963) an

PROFILE GLYCOLYTISCHER FLIESSGLEICHGEWICHTE

PETTE (1965) hat dutch die Bestimmung glycolytischer Enzymverteilungsmuster in dner gro~en Anzahl yon Geweben gezeigt, wie man ein Bild der Ober-alles-Funktion der Glycolyse im Sinne einer biochemischen ,,Gestalt" gewinnen kann. Enzymvertel- lungsmuster geben qualitativ die Richtung der Flief~gleichgewi&te an. Da die Bezie-

Kontrollmechanismen der Gtycolyse 133

hungen der Muster zum station~iren Flui~ und den in vivo Aktivit~iten unter verschie- densten Bedingungen uniibersichtlich sind, haben wit zur Definition der Fliel~gleich- gewichte den Weg fiber die Metabolit- und Flugmuster gew~ihlt (HEss & BRAND 1965,

TabeUe 2

Glei&ungen fiir die Hin- und Rii&fliisse

Die R e a k t i o n k 1

[A] * [B] k_'¢"~ [C] + [D]

i s t im M c l s s e n w i r k u n g s g i e i c h g e w i c h t d e f i n i e r t d u r c h

v 1 = v _ 1 Vne t = 0

u n d

K a p p = [ g ]

im s t a t i o n i : i r e n Z u s t a n d d u t c h

u n d

Vne t : v 1 -- v - 1

[c] [ D] F =

[A] [8]

d a v - 1

is t

v 1 =

v - 1

Vnet

1 - /~ / Kap p

Vnet

K a p p / P - 1

a n d

HESS 1962, 1963). Die Metabolit-Spiegel k/Snnen unter station~iren Bedingungen und Verwendung des Nettoflusses zur Berechnung der Hin- und Riickfliisse jeder einzelnen glycolytischen Reaktion verwandt werden. Damit ist ein metabolischer Zustand quantitativ im Hinblick auf die Lage und Richtung der Fliei~gMchgewichte definiert.

Der Zusammenhang geht aus der Ableitung hervor, die in Tabelle 2 ausgefiihrt ist. Sie beruht auf der Reversibilit~t der Reaktionen und der Tatsache, dab die Akti- vit~iten alter an einem Umsatz beteiligten Enzyme im station~iren Zustand identisch


oder bei Verzweigungen einfach gebrochen beziehungsweise vervielfacht sind. Ein auf dieser Grundlage berechnetes Flut~profil ist auf Abbildung 2 dargestellt. Die Differenz der angegebenen Hin- und Riickfliisse ergeben jeweils den Nettofluf~ des Systems, der entsprechend der Mengenbilanz 27 beziehungsweise 54 Einheiten betr~igt.

Man erkennt zwei Gruppen von Reaktionen: (1) Enzyme, die nahe dem Massen- wirkungsgleichgewicht operieren (vJv_l und dementsprechend Kapp//' nahezu 1) und (2) Enzyme, die um GrS~enordnungen entfernt vom Gleichgewidlt laufen. Bei der ersten Gruppe yon enzymatischen Reaktionen handelt es sich um EnergiekontrolIe dutch Massenwirkung. Man kann sagen, daf3 die Enzymkapazitiiten ausreichen, urn den Substratanfall yon den entsprechenden Donor-Enzymen tiber das Flui~gef~ille zu bew~itigen und damit sich selbst der Uber-alies-Umsatzgeschwindigkeit anzupassen. Da die kinetischen Verhiiltnisse tibersichtlich sind, lassen sich aus den vorliegenden Daten bei Kenntnis der Michaelis-Konstanten einfach die MaximalaktivitS.ten der Enzyme berechnen (HEss & BRAND 1965, HESS 1963). Sie stimmen bei Enolase, Phosphoglyce- ratmutase und Adenylatkinase mit den extrahierbaren Enzymaktivit~iten tiberein.

Fiir die erhebliche Abweichung der zweiten Gruppe yon Enzymen (vor allem der Kinasen) yore Massenwirkungsglei&gewicht mtissen wir den Mechanismus der Ztige- lungskontrolle entweder durch Aktivierung oder Hemmung oder durch Kompartmen- tierung verantwortlich machen. Schon friiher (H~ss & CHANCe 1961) haben wir gezeigt, daI~ die Phosphofruktokinase der Asciteszellen bei station',iren Zust~inden und Ubergangszustiinden ihre Aktivit~it bei fallender ATP- und nahezu unver~inderter F6P-Konzentration urn ein Vielfaches erhSht. Damit und dutch die Ausbildung eines kinetischen Kreuzungspunktes (B/2cHSR 1961) war diese Reaktion als wichtiger Kon- trollpunkt der Glycolyse ausgewiesen. Auch die anderen Enzyme dieser Gruppe - bei der Here mu~ Pyruvatdecarboxyiase hinzugez~hlt werden - sind in diesem Sinne als Kontrollpunkte der glycolytischen Sequenz anzusehen. Auf die Beweisfiihrung kann im einzelnen an dieser Stelle nicht eingegangen werden. Die Tatsache einer urn, GrSgenordnungen vom Massenwirkungsgleichgewicht abweichenden Reaktion hat ftir die Identifizierung yon Kontrollpunkten des Stoffwechsels grSf~ten heuristischen Wert (siehe unten) (Hess & BRAND 1965).

Metabolit- und Fluf~profile kSnnen als Grundlage eines mathematischen Modells der Glycolyse benutzt werden (GAR~INKeL & Hess 1964). Unter Benutzung der Hin- und Rtickfliisse, der Michaelis-Konstanten und anderer bekannter kinetischer Kon- stanten lassen sich fiir jeden einzelnen enzymatischen Schritt die detaillierten Me&a- nismen ausarbeiten. Man bildet fiir jede einzelne Reaktion die entsprechenden Differentialgleichungen auf der Grundlage der Massenwirkungskinetik und simuliert katalytische Kontrollwirkungen durch Aktivatoren und Inhibitoren in Form yon zu- s~itzlichen ,,Konstanten". Ein derartiges Gleichungssystem kann durch Digital-Rechen- maschinen mit einem einfachen numerischen Integrationsverfahren modifiziert nach E~L~P, bearbeitet werden.

In Tabelle 3 ist eine Zusammenstellung der yon uns berechneten Metabolit-Ver- hgltnisse unter den Bedingungen einer station~iren Glycolyse yon EHRLICtt-Ascites- Tumor-Zellen wiedergegeben. Man sieht, dag die berechneten und gemessenen Werte gut tibereinstimmen (GARHNKeL & H~SS 1964).

Kontrollmechanismen der Glycolyse 135

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136 B. Hrss und K. BRANn

Abbildung 3 gibt schliet~lich eine graphische Darstellung einer Reihe yon glyco- lytis&en Intermediaten (Ordinate = Konzentration in Prozent, Abszisse = Realzeit) tiber einen station~iren Zustand sowie nach Entkopplung dur& Dibromplaenol (DBP) wieder. Die Darstellung wurde dutch den S&nelldru&er der Re&enmas&ine (UNI- VAC II) hergestellt. Man sieht, daf~ entspre&end dem beim PASTEUI~-Effekt bekannten Obergangszustand der Verbrauch an Glucose (GLU) nach Entkopplung rasch ansteigt, zugleich der Gehalt an Adenosintriphosphat im Cytoplasma (1 TP) zu- und in den

Tabelte 3

Verh~ilmisse der Konzentration yon Metaboliten in Ehrlich-Ascites-Tumor-Zellen und ihre Computer-Berechnung. (Aus GaRFi~Iizt & HEss 1964)

Verhglmis

"121 l 'a ¢) I ~.a

o ' ~ . o ~ o

~ ~ 0 0 ~ ~ ~

Comp. Zelle Comp. Comp. Zelle Comp. Zelle

Lactat/Pyruvat Fruktose 1,6-Diphosphat/ Dioxyacetonphosphat a-Glycerophosphat/Dihydroxy- aceton-Phosphat Glyceraldehydphosphat/ Dioxyacetonphosphat ATP (cytoplasmatisch)/ADP ATP (mitochondriaI)/ADP Gesamt-ATP/ADP Fruktose 6-phosphat/Fruktose 1,6-diphosphat DPNH (cytoplasmatlsch)/DPN DPNH (mitochondrial)/DPN Gesamt-DPNH/Gesamt-DPN

152 164 138 77 69,5 t79 135

•,23 1,25 3,64 9,25 11,6 9,44

8,62 9,1 7,15 6,31 7,8 6,29

1,52 1,42 1,52 1,35 1,57 1,32 3,64 ca. 5 0,962 0,4 1,18 0,41 0,3! 4,I 0,14 4,05 ca. 5,5 t~3 4,5 1,3

0,188 ca. 0,2 0,1 0,196 0,198 ca. 0,1 ca. 0,16 0,062 0,063 0,028 0,068

10,1 1,97 0,294 0,724 0,648 0,389 0,615 0,246

Mitochondrien (2 TP) abnimmt und weiterhin Glucose-6-phosphat (GLP) sowie Fruktose-l,6-Diphosphat (FPP), Dioxyacetonphosphat (DHA) und schliel~li& Adenosintriphosphat (ADP) entsprechend den experimentellen Erfahrungen einem hgheren station~iren Spiegel zustreben. Die Untersu&ung mathematischer Modelle durch Rechenmas&inen erlaubt, wie man sieht, nicht nur die Prlifung unserer Vor- stellungen tiber station~ire Zust~inde, sondern auch der l~berg~inge des Stoffwechsels, die auf komptexere Kontrollwirkungen zurli&zuftihren und ftir unser Verst~indnis der Kontroilmechanismen yon weitaus gr~5t~erer Bedeutung sind.

OBERGANGSZUSTANDE

In Tabelle 4 sind verschiedene Ubergangsformen der Gtycolyse seit der beriihmten Beobachtung yon PaSTeUR (1876) zusammengestellt. In allen F~illen handelt es sich um die Reaktionen des glycolytischen Systems auf Anderung kontrollierender Para-

Kontrollmechanismen der Gtycotyse 137

meter. Jede Anderung fiihrt zu einer Umstellung yon Fliissen und stationiiren Meta- bolitkonzentrationen innerhalb yon typischen l[lbergangszeiten zwischen 1 bis 30 sec, die fiir jedes glycolytische System charakteristisch sind. Die neu eingestellten statio- n~iren Zust~inde halten so iange an, wie die entsprechenden Parameter einwirken.

Tabelle 4

f3bergangszust~inde der Glykolyse

Zelle Met~zustand Wirkung Autoren

I.iefe station~ir Hemmung yon GS.rung durch Atmung

Htefe station~ir Aktivierung der G~irung durch Phosphat

Muskel station~ir Umkehr der Glykolyse

Ascites- stationer Hemmung yon Atmung durch Tumorzelle Glykolyse Here station~ir Kontrolle der G~-rung dutch

ADP und Phosphat Here transient Aktivierung der aeroben

Glykolyse durch Glucose Ascites- transient Aktivierung der Atmung durch Tumorzelle Glucose

Frosch- transient- Aktivierung der Atmung durch Sartorius- station~ir elektrische Erregung des Muskel Muskels Here transient Aktivierung der anaeroben

Glykolyse durch Glucose Here transient Oszillation der Pyridinnucle-

otide

Heuschrecken- station~ir Aktivierung der Atmung durch Flugmuskel Glykolyse Ascites- station~ir Umkehr der oxydativen Tumorzelle Phosphorylierung Herzmuskel statlon~ir Hemmung der Glykolyse durch

den Citratcyclus

Here transient- Kontinuierliche Oszillation stationer der Glykolyse

PASTEUR (1876)

I'IARDEN & YOUNG (1905)

MEYEgHOF (1920)

CRABTI<E~ (1929)

LYNEN (1941), JOHNSON (1941)

CHANCE (1954)

CHANCE • I'IESS (1956)

CHANCE ~x~ CONNELLY (1955)

I'IOLZER (1952)

DUYSENS ~i~ AMESZ (1957)

BOCHER (1961)

HESS (1962), CHANCE (1962)

GARLAND, t~ANDLE ~L NEWS- HOLME (1963), WILLIAMSON (1964)

HEss, PYE & BRAND (1966, 1965)

Die Untersuchung der fdbergangszust~nde liefert uns wesenttiche Informationen iiber Kontrollpunkte, an denen Substanzen eingreifen und den Umsatz beschleunigen oder hemmen. Dem Regeltechniker sind verschiedenste 17bergangsformen technischer Systeme seit langem bekannt. In den vergangenen 10 Jahren konnten vide Uber- gangsformen auch in biochemischen Systemen nachgewiesen werden" Asymptotische f3berg~inge im Cytochromsystem (CHANCE & HESS 1959), aperiodische Elberg~inge mit


und ohne Umkehr in der Glykolyse und in der Zellatmung (HEss 1963, CHANCE & Hess 1959, CHANCE 1961, HOLZER & FI~EYTAG-HII.~ 1959), schlief~lich oszillatorisch ged~/mpfke l[lberg~inge (DuYsENS & AMESZ 1957, CHANCe, ESTABROO~ & GOSH 1964, HOMMES 1964, HESS, CHANCE & BETz 1964, MATTHAI 1964, Be'rz & CHANCE 1965). In letzter Zeit wurden schlief~lich erzwungene Schwingungen, iiberlagerte Oszillationen (Amplituden-Modulation), oszillatorisches ,,Aufschaukeln" sowie kontinuierliche Oszillationen (HEss & BRAND 1965, H~SS, PYE & BRAND 1965) beoba&tet. Die Unter- suchung der stationgr oder voriibergehend osziIlierenden Glycoiyse, besonders im zellfreien Extrakt, hat neue Einbli&e in die Kontrollmechanismen der Glycolyse ergeben, die nun besprochen werden sollen.

OSZILLIERENDE GLYCOLYSE

Bei der oszillierenden Glycolyse handelt es si& um eine periodische Aktivierung und Hemmung der Gtycolyse, wobei maximale Aktivierung im oberen Bereich der Glycolyse mit maximaler Hemmung im unteren Bereich der Glycolyse in einer Halb- periode und umgekehrt in der nS.chsten Halbperiode bei station~irer Alkoholproduk- tion abwechseln. Es handett sich um eine Art yon automatisch repetierender PASTEUR- Reaktion, bei der die dur& Beschleunignng und Ziigelung der Glycolyse entstehenden kinetis&en Kreuzungspunkte periodis& dutch die endogenen Eigenschal°cen des glycolytischen Systems unabh~ingig vom Beobachter produziert werden. Dementsprechend kommt es zu oszillierenden ~nderungen der Konzentrationen der glycolytischen Inter- mediate tiber einen grol%n Bereich (80 °/0 des cytoplasmatischen PyridinnucIeotids), deren Bewegung durch Registrierung der Pyridinnncleotide erkannt werden kann. Der Nettoflut~ dur& das System ergibt si& aus dem Produkt yon Amplitude (ausgedrti&t in DPNH-Einheiten) und der Kreisfrequenz (Hess, CHANCE & BE'rz 1964), die kinetischen Kreuzungspunkte werden aus dem Phasendiagramm der Metabolite (BE'rz & CHANCE 1965) durch die entsprechende Phasenvers&iebung identifiziert uncl kSnnen im zellfreien Extrakt dutch Enzymtitrationen (HEss & BRAND 1966, HESS, CHANCE & Bm'z 1964, Hess, BRAND & CASSUTO 1965, HESS & BRAND 1965) bes6itigt werden. Der Vorgang l~/uR in der intakten Zelle mit einer Frequenz yon t,7 rain -1 bei 260 C, im Extrakt mit einer Frequenz yon 0,2 rain -1 bei 250 Cab.

Abbildung 4 gibt einen Ausschnitt aus der Registrierung der oszillierenden Glyco- lyse in einem zellfreien Extrakt aus Saccharomyces carlsbergensis wieder, der durch Ultraschallbehandlung und Ultrazentrifugation gewonnen war. Die Oszillation konnte 22 Stunden lang bei Zimmertemperatur mit konstanter Frequenz und einer Flug- geschwindigkeit yon 9 Nanomol X rain - i X mg-1 (Protein) unter Verwendung yon Trehalose als Substrat mit einer Endkonzentration yon 0,34 M Alkohol nach 22 Stun- den beobachtet werden (HESS & BRAND 1966, HESS, PYE & BRAND 1965). Der Q-Wert als Gtitemat~ der Oszillation (siehe HESS, CHANCe & BETZ t964) betr~gt 1000 und liegt damit im Bereich elektronischer Oszillatoren. Aus diesem Experiment geht die augerordentliche Stabili6it der Oszillationen und der daran beteiligten Enzyme hervor.

Die Analyse des zellfreien Extraktes ergibt alie bekannten Bestandteile des Enzymverteilungsmusters sowie des Metabolit-Musters yon Bierhefen (Hess & BRAND


I966, HESS, CHANCE & BETZ 1964). Da die Glucose-Konzentration im Extrakt zu vernachl~issigen ist (kleiner als 10 -6 mot) und der Extrakt zun~ichst tiber Stunden ohne Substratzusatz osziIliert, muf~ endogenes Substrat zur S~ittigung der Glycolyse vor- liegen. Die Untersuchung auf glycogenartige Substrate ergab (H~ss, CHANC~ & B~TZ 1964) Xquivalente in der Gr6t~enordnung yon 7 mM (in Glucoseeinheiten). Da

NADH

--~- ~ V V

Abb. 4: Kontinuierliche Oszillation der Glykolyse in einem Extrakt von Saccharomyces carlsbergensis (HEss, PY~ & BRAND 1965). Messung der reduzierten Pyridinnucleotlde in Fluori-

meter ,,Eppendorf" (366/400-3000 raft), d =~ I ram. Temperatur ,-, 220 C. Amplituden- eichung : 0,5 cm = 131 nMol NADH/200 #1

Trehalose (PYE 1965) ein gutes Substrat ftir die oszillierende Glycoiyse ist, nehmen wir an, dat~ es sich zum Tell bei unseren Analysen um Trehalose-Einheiten handeh. Bei der Papierchromatographie wird nach orientierenden Versuchen neben Mannose Glucose frei (HEss, PYE & BRAND 1965).

Zur Aufki~irung des Mechanismus der Oszillation haben wir das System mit rei- nen G~irungsenzymen titriert (HEss & BRAND 1965, HESS, BRAND & CASSUTO 1965) und gefunden, daf~ Wellenformen und Frequenz auf Zusatz der Phosphokinasen empfindlich reagieren, w~ihrend Zusatz yon GAPDH, MK unter anderem erst bei etwa 15- bis 20facher Steigerung der vorhandenen Aktivitiit den Ablauf beeinflussen. Abbit- dung 5 zeigt die Reaktion nach Zusatz einer PFK-Akfivitiit, die den vorhandenen Bestand etwa verdoppeh. Zun~ichst wurde eine nicht sinusf6rmige Wellenform beobachtet. PFK-Zusatz ffihrt nach einer kurzen Reduktion zu einer vorzeitigen Umkehr der Periode in Richtung auf eine Oxydation des Systems, das schliel31ich sinusf6rmig auf einem st~irker oxydierten mittleren Niveau weiterpendeh. Die Massenwirkung durch vermehrte ADP-Bildung drtickt das System zur st~irker oxydierten Seite. Die nun sinusfSrmige Wellenform ftihren wir auf die Aktivierung yon PK dutch phasen- verfri~hte Produktion von FDP zurtick (siehe unten). Wie man welter sieht, bleibt das Amplituden-Frequenz-Produkt konstant.

Ein Spiegelbildexperiment ist auf Abbildung 6 wiedergegeben. Hier ftihrte die Verdoppelung der PGK-Aktivifiit zu einer raschen Verschiebung des Systems zu einem mehr reduzierten Zustand, dessert stSchiometrischer Zusammenhang auf dem Block- diagramm veranschaulicht ist. Der nicht sinusfSrmige VerIauf ftihrt wieder zum sinus- fSrmigen Verlauf. Das Amplituden-Frequenz-Produkt bleibt ebenfalls konstant (die Experimente auf Abbildungen 5a und 6a sind absolut spiegelbildlich, da die Registrie- rung auf Abbildung 6a mit halber Empfindlichkeit vorgenommen wurde). Die rasche

140 B. HESS und K. BRAND

Reduktion des Systems fiihren wir auf eine Enthemmung von GAPDH durch Weg- nahme yon 1,3-DPGA zuriick, eine Folgerung, die nach Kontrollexperimenten dur& Titration mit ATP beziehungsweise 1,3-DPGA best~itigt werden konnte (HEss, BRAND

340-400 m~ DPN- Rcduktion?

- - - : : ~ - - 5 7, PFK

- , i _ _ . . . . . . . . . . . . I

- - I , . . . . _ _ _ . - ~

. . . . . I i

9,5 rain j<-- I:> I

t ?

Abb. 5a: Titration der oszillierenden Glykolyse dutch PFK. d = 1 mm, Temperatur ,~ 220 C. Ordinate in % Extinktionsdifferenz

F6P - = F

A TP DPN i '11111

ADP i i

-1 H~ ,', EthOH

Abb. 5b: Blockdiagramm der durch die Titration erzeugten st6chiometrischen Verschiebungen

& CASSUTO 1965). Das System reagiert ebenfalls empfindlich auf Zugabe yon PK durch Verkleinerung yon Amplitude und Erh~hung der Frequenz, jedoch tendiert das System zur stSrker oxydierten Seite, die vor allem dutch die ATP-Hemmung yon H K und PFK bestimmt wird (siehe unten).


Aus diesen Experimenten sowie aus Metabolit-Titrationen (CHANCe, SC~tOENrI~ & ELSAESSEP. 1964) geht die Bedeutung des ATP/ADP-Systems fiir die Kontrolle der Oszillation hervor. Auf Grund der Metabolit-Messungen und der Titrationsexperi- mente ergibt si& ein Zusammenhang, der ftir den sinusf6rmigen Verlauf dur& das Phasenwinkel-Diagramm auf Abbildung 7 demonstriert wird. Fiir den nicht sinus-

340-400 mat DPN-Oxydation t

2X PKG 2,4 JU

9, 5 min I< b. I

Abb. 6a: Titration der oszillierenden Glykolyse durch PGK. d = 1 mm, Temperatur ~ 22 o C. Ordinate in % Extinktionsdifferenz

ATP

Abb. 6b: Blo&diagramm der dutch die Titration erzeugten st6chiometrischen Verschiebungen

f6rmigen Vertauf ist die Stellung yon FDP urn etwa 900 verz6gert. Dem Phasendia- gramm der Metabolit-Konzentrationen entspricht das Phasendiagramm aller an der Glycolyse beteiligten Enzymaktivit,iten. Die Phasenlage der fiir die Kontrolle der Oszillation wesentlichen Enzymaktivit~iten ist schematisch dargestellt.

Wenn sich auch aus der Phasenlage die kinetischen Kreuzungspunkte des Systems kiar ergeben, so sind damit die ftir die Oszillation entscheidenden Diimpfungs- bezie-

142 B. Hess und K. BRAND

hungsweise Verst~irkungskomponenten noch nicht bezeichnet. Die Reaktion des Systems sowie der Konzentrationsbereich identifizieren ATP eindeutig als D~mpfungskompo- nente. Die Phosphokinasen werden wenigstens tiber 900 der Phase yon ATP gehemmt (HEss, Px~ & BRAND 1965). Die Reaktion der Kinasen auf ADP ist unabhiingig yon

I I I

A D P DAP GAP FDP ATP G-6-P DPNH D;N F~6-P

\ \ • / "'...

,. (;. •

° 9'0 ° l eo ° 270 ° 360"

PGK PK PFK

i • \ , / X \ ," /

o o i o o 1~o o 2~o o 360 =

Abb. 7: Phasenwinkeldiagramm der Konzentration yon glykolytis&en Zwischenstoffen sowie der Aktivit~iten yon PGK, PFK und PK

seiner Massenwirkung wenig eindeutig. Wir haben daher nach einer anderen Ver- st~rkungskomponente gesucht und gefunden, dai~ PK yon Here (nicht aus der Musku- latur) im physiologischen Bereich stark durch FDP aktiviert wird, wie aus Abbildung 8 (H~ss & B~ANI) i965) hervorgeht.

Damit k6nnen wir ein Kontrollnetz entwerfen (siehe Abbildung 9), das uns er- kl~rt, wie durch ATP-Riickkopplung und FDP-Vorw~rtskopplung die Glycolyse tiber einen grof~en Konzentrations- und Aktivit~its-Bereich hin- und herpendelt, wobei Energie und Aktivit~,itskontrolle nebeneinander wirksam sin& Das auf Abbildung 9 dargestellte Kontrollnetz entspricht formal, jedoch nicht spezifisch, dem von HIcGINS (1964), das auf einer gekreuzten Riickkopplung beruht und mit elnem Analog-Com- puter-System simutiert wurde. Unklar in diesem Netz sind die Aktivierungskompo- nenten yon PFK und HK, die bislang nicht eindeutig identifiziert werden konnten.


6,0

3,0

( PK II102 )

for ADP 2,5.10 "3M

-" . ' \ - ~ . . , . , 0 - ~ ~2;

2 . 1 0 -4 Q

tKONTROLLE

} I M 3,o 6,0 -g-

Abb. 8 : Aktivierung der Hefepyruvatkinase dutch FDP

Trehaiose

, l f J i 1

Abb. 9: Kontrollnetz der oszillierenden Glykolyse

,~ EthOH

AUSBLICK

Uberbli&t man die heutigen Vorstellungen der Kontrolle der Glycolyse, so erkennt man, dag der Umsatz dieses elementaren Prozesses des Zellstoffwechsels nicht allein dur& Massenwirkung, sondern und vor allem durch Aktivit~itskontrolle fest- gelegt wird. Die Rolle des klassischen Kontrollenzymes der Glycolyse GAPDH ist zurii&getreten. PFK, auf dessen Bedeutung L,~Dx" (1956) zuerst hingewiesen hat, und die anderen Kinasen haben weitaus gr6gere Bedeutung als Kontrollenzyme. Sie be-

144 B. Hrss und K. BRAND

stimmen den Ablauf der oszillierenden Glycolyse, die als das Modell eines allgemeinen bio&emis&en Uhrenmechanismus dienen kann. Erstaunli& ist die Wirkung yon ATP, deren Struktur LOHMANN vor fiber 30 Jahren entde&t hat und deren Funktion als Energieiibertr~iger und, wie man erst jetzt erkennt, als Kontrollmetabolit yon univer- seller Bedeutung ist.

ZUSAMMENFASSUNG

1. Die Mechanismen der Kontrolle enzymatischer Reaktionssequenzen lassen sich ali- gemein auf Wechseiwirkungen yon Aktivatoren, Inhibitoren, Substraten und Pro- dukten mit Enzymproteinen sowie au£ Induktion oder Repression der Enzym- synthesen zurii&£iihren. Alle Kontrolttypen werden im Verlaufe der Glycolyse beoba&tet. Sie sind die Grundlage des Kontrollnetzes, das den Ablauf der Glyco- Iyse bestimmt und ha& dem Rii&kopplungsprinzip operiert.

2. Das station~ire Verhalten der Fliet~gleichgewi&te der Glycolyse kann durch Bestim- mung yon Netto-Fluf~ und station~iren Intermediatkonzentrationen adequat in Form der Metabolit- und Flugprofile fiir den Hin- und Riickflu£ jeder enzymati- s&en Reaktion bes&rieben werden. Derartige Profile kennzei&nen den Kontrolltyp jeder enzymatischen Reaktion. Metabolit- und Flugprofile k/Snnen als Grundlage mathematis&er Modelle der Glycolyse benutzt werden. Das Verhalten dieser Mo- delle unter station~iren und transienten Bedingungen steht in ~bereinstimmung mit den experimentellen Beobachtungen.

3. Die Untersuchung yon l]bergangszust~inden erg~inzt die Analyse station~irer Zu- st~inde. Sie fiihrt unabhiingig zur Aufde&ung yon Kontrollpunkten der glycolyti- s&en Sequenz und erfagt allgemein den Betel& sowie die Giite biochemis&er Kontrollmechanismen.

4. Der Mechanismus der station~ir oder transient oszillierenden Glycolyse konnte im zellfreien Extrakt dur& Metabolitanalysen, durch Titrationen mit Intermediaten und EnZymen weitgehend aufgekl~irt werden. Er beruht auf der spezifischen Kon- trolle der Phosphotransferasen durch gekreuzte Rii&kopplung und stellt das bio- &emis&e Modell zellul~irer Uhrenme&anlsmen dar.

Ausgearbeitet nach den Vortr~igen auf dem II. Internationalen Symposion iiber quanti- tative Biologie des Stoffwe&sels der Biologischen Anstalt Helgoland sowie der II. Jahres- tagung der Arbeitsgemeins&aflc ,,Bio&emle" in der Gesellschat~ fiir experimentelle Medizin, Magdeburg 1965.

Wir danken der Deuts&en Forschungsgemeinschaflc Bad Godesberg bei Bonn, dem US Public Health Service Bethesda. MD. sowie der Research Corporation New York fiir die grogzfigige Unterstiitzung unserer Arbeiten.

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Diskussion irn Ans&Iufl an den Vortrag HESS 8¢ BRAND

AEI~I: Diese wichtigen Untersuchungen erhffnen verheigungsvolie Perspektiven. Wenn schon zellfreie und organellfreie Hefeextrakte zum Oszillieren gebracht und durch Substrat- beziehungsweise Enzymzusiitze gestartet oder phasenverschoben werden ktinnen, so erscheint prinzipielI auch die M~glichkeit gegeben, oszillierende Systeme durch geeignetes Mischen yon Substrat und Reinenzymen ,,synthetisch" darzustellen. Sind bereits Versuche in dieser Rich- tung unternommen worden? Lassen sich derartige Oszillationen auch an geeigneten Pr~iparaten aus Warmbltitergewebe (z. B. Muskelextrakt) erzeugen? Welches ist die Temperaturabh~.ngig- keit dieser Oszillation? Liege sich aus Experimenten, die ,,vorschriltsgemiig" bei 250 beziehungsweise 300 C ausgefiihrt worden sind, ohne weiteres auf die Situation in vivo schlieflen?

HEss: The frequency of the oscillation is temperature dependent with an activation energy of 19 kcaI X Mol _1 The frequency is 0,56 rain _i at 35 ° C. We are preparing all components which, to our knowledge, are necessary for the oscillation and hope to be able to synthesize an oscillating system by appropriate mixing of substrates and enzymes. Oscillation has recently been observed in extract of bovine heart muscle.

HEINMETS: I should like to mention that in addition to oscillatory phenomena in enzyme activ-

Kontrol lmechanismen der Gtycolyse 147

ity, theoretical analyses of certain genetic schemes (JAcoB & MoNoD 1961) also reveal oscillatory enzyme formation.

MAt~MASSE: It is of interest to note that other types of oscillations exist. For instance, oscillations of redox-potential can sometimes be recorded in suspensions of cell-free homogenates of rat hepatoma or in dilutions of human blood. It must be pointed out that such oscillations were not consistently observed; their frequency ranged from 10 to 30 per minute approxi- mately; they were obtained in a well buffered media with electrodes of polished pIatinum or of pure gold, in an inert atmosphere (nitrogen or argon).

HEss: I understand there are a number of systems which show oscillations. The problem is only how well can they biochemically be defined.

ROBERTS: You have mentioned the oscillatory mechanism in yeast cells, but in multicellular systems, how might the oscillatory activity between cells be linked?

Hess: At the present state it is very difficult to make any comments on the coupling of oscillatory activities between various cells.