Ordre de passage pour les présentations
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Ou
12 avril19 avril
Techniques d’étude des interactions protéine-
protéine à grande échelle
Hervé PHILIPPE
BIN1002 – hiver 2013
Pourquoi étudier les interactions protéine-protéine ?
• beaucoup de matériel à disposition
• focus sur l’étude des fonctions cellulaires
• capacité des protéines à former des complexes• ≈5 partenaires pour chaque protéine
• importance des complexes protéiques dans l’aspect fonctionnel
interactome
De nombreuses techniques d’étude
Piehler J. Curr.Op.Struct.Biol. 2005; 15:4-14
in vivo
• maintien du contexte cellulaire
in vitro
• caractérisation détaillée des interactions(cinétique, stochiométrie …)
• validation des résultats in vivo
Co-immunoprécipitation
http://www.piercenet.com/Proteomics/browse.cfm?fldID=9C471132-0F72-4F39-8DF0-455FB515718F
Double hybride
• utilisation de facteurs de transcription modulaires chez la levure • domaine d’activation• domaine de liaison à l’ADN
• fusion des protéines à tester chacune avec un module du facteur de transcription
• expression du produit de transcription si les protéines testées interagissent
Principe :
Double hybride
DA
DL
mARN
DA : domaine d’activation
DL : domaine de liaison à l’ADN
TF
Système rapporteur
Fusion protéines et modules du facteur de transcription
Expression du système
DA
DLprot 1
prot 2
DL
prot 3
pas d’expression
expression du gène
colonies de levures
mARN
Double hybride
• expérience facile à mettre en placeAvantages :
• analyse qualitative• faux positifs si les interactions préexistent chez la
levure• faux négatifs : problème d’expression des protéines
cibles chez la levure• non applicable aux protéines membranaires (30%
du protéome)
Inconvénients :
• identification des interactions• criblage de banque de protéines
Application :
Fields S. & Song O. Nature. 1989; 340:245-246.
Interactome chez Caenorhabditis elegans
Li S. et al.; Science 2004; 303:540–543
PCA : protein fragment complementation assay
a) rapporteur (enzyme ou protéine fluorescente)
b) fractionnement du rapporteur + fusion aux protéines à tester
c) mesure de la reconstitution du rapporteur si les protéines testées interagissent
Principe :
Michnick SW. Curr Opin Biotechnol. 2003;14(6):610-7
Johnsson N & Varshavsky A. PNAS. 1994; 91:10340-10344
PCA : protein fragment complementation assay
Application :
• applicable pour les protéines membranaires• réponse très rapide• niveau d’expression naturel
Avantages :
• décalage temporel de la réponse au signal d’expression
• création de protéines chimériques qui peuvent modifier les interactions
• nombreux faux positifs : accumulation du substrat et du produit de la réaction enzymatique
Inconvénients :
• identification des interactions• étude des réseaux d’interaction
FRET (fluorescence resonance energy transfer)
525
accepteur
donneur
excitation
475 nm 525 nm
• excitation d’un fluorophore donneur par un photon• émission fluorescence par le donneur• excitation du fluorophore accepteur s’il est suffisamment proche• mesure du rapport de fluorescence
Principe :
R0
10-70 Å
475nm
émission
L. Stryer; Annu Rev Biochem 1978; 47: 819–846
FRET (fluorescence resonance energy transfer)
• étude dynamique en temps réel • applicable in vivo dans le système cellulaire originel• peut être couplé à un signal biologique• applicable dans tous les compartiments cellulaires
Avantages :
• création de protéines chimériques qui peuvent modifier les interactions
• nécessite la surexpression des protéines testées
Inconvénients :
• signification biologique des interactions• localisation cellulaire par couplage avec des techniques
de microscopie
Application :
TAP-Tag : Tandem Affinity Purification
1.
2.
3.
4.
5.Puig O. et al.; Methods 2001; 24:218–229
Principe :tag
1. constitution du complexe protéique in vivo puis lyse des cellules
2. fixation du complexe via la ProtA sur la colonne d’affinité et élution douce des contaminants
3. clivage du tag par la protéase
4. fixation du complexe via le peptide de fixation à la calmoduline et élution douce des contaminants résiduels et de la protéase
5. élution du complexe et analyses subséquentes
peptide de fixation à la calmoduline
domaines de fixation de la ProtA aux IgG
site de clivage à la TEV protéase
Spectrométrie de masse
• nécessite la purification des complexes• méthode compliquée et relativement coûteuse
Inconvénients :
Application : • identification des protéines présentes dans un complexe
Gingras et al. (2005) J Physiol 563:11-21
TAP-Tag : Tandem Affinity Purification
• seules les interactions très stables peuvent être détectées
• nombreux faux positifs (protéines « colle »)
Inconvénients :
• seul l’appât est modifié, pas les autres protéines du complexe
• taux d’expression biologique des protéines• identification de complexes avec plus de 2 protéines
Avantages :
Application : • identification des complexes protéiques
Quelques définitions
Arbre = réseau connexe non cyclique
Réseau non connexe non
cyclique
Réseau connexe cyclique
Réseau connexe non cyclique
branche
noeud
Jeong et al, Nature 2001
Qualité du réseau d’interactions
Nécessité de valider les résultats
Très nombreuses interactions protéine/protéine détectées par différentes
méthodes
Pourquoi ?
1. Les méthodes sont prévues pour détecter des interactions différentes (binaire pour le double hybride, interactions fortes pour la protéomique, etc.)
2. Les méthodes se trompent (faux positifs, faux négatifs)
Qualité du réseau d’interactions
Construction d’un ensemble d’interactions validées manuellement
10 907 interactions impliquant 1308 protéines de la levure Saccharomyces cerevisiae (http://mips.gsf.de/proj/yeast/catalogues/complexes/index.html)
1. Coverage (couverture) : fraction des interactions de référence analysées par une méthode donnée
2. Accuracy (précision) : fraction des interactions de référence retrouvées par une méthode donnée
Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403
Qualité du réseau d’interactions
Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403
Qualité du réseau d’interactions
Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403
Qualité du réseau d’interactions
Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403
Qualité du réseau d’interactions
Von Mering et al, Nature (2002) 417:399-403
Filtrage : interactions détectées trois fois pour le double-hybride, par exemple
Von Mering et al. (2005) Nucleic Acids Research, 33:D433–D437http://string.embl.de/
Distance et Distance caractéristique d’un réseau
http://mathworld.wolfram.com/GraphDistance.html
la distance d(u,v) est la longueur du plus court chemin connectant deux noeuds, c-à-d le nombre minimal de noeuds qu’il faut traverser pour se rendre d’un noeud u à un noeud v
la distance caractéristique L = meanu,v d(u,v) d’un graphe est la longueur moyenne du plus court chemin connectant deux noeuds
Diamètre d’un réseau
http://mathworld.wolfram.com/GraphDiameter.html
le diamètre D = maxu,v d(u,v) d’un graphe est la longueur du plus long des plus courts chemins connectant deux noeuds, c’est-à-dire le nombre maximal de noeuds qu’il faut traverser pour se rendre d’un noeud u à un noeud v lorsque les retours, détours et boucles sont interdits
3 4 5 7
Réseaux « Small-World »
dans un réseau Small-World, la plupart des noeuds sont voisins les uns des autres, c-à-d qu’il faut traverser un petit nombre de noeuds pour se rendre d’un noeud u à un noeud vex : WWW ; liens sociaux entre les êtres humains formellement, on dit que son diamètre est petit (D ≤ 6)
ces réseaux ont des distances caractéristiques faibles
http://en.wikipedia.org/wiki/Small-world_network
Connectivité d’un réseau
http://web.hamline.edu/~lcopes/SciMathMN/concepts/cevcon.html
la connectivité K d’un réseau est le nombre minimal de liens connectant deux noeuds u et v
formellement, c’est le nombre minimal de noeuds qu’il faut supprimer pour déconnecter le réseau
Connectivité d’un noeud
Jeong et al, Nature 2000
ExponentialExponential Scale-freeScale-free
la connectivité K d’un noeud (protéine i) est le nombre de liens émanant du noeud i
HUBHUB
Une autre représentation du réseau
1
9
2
3
4
6
7
8
5
1 2 3 4 5 6 7 8 91 X X2 X X3 X4 X X X5 X X X6 X7 X X8 X X X X9 X X
3 6 7 4 8 2 5 1 93 X6 X7 X X4 X X X8 X X X X2 X X5 X X X1 X X9 X X
Après un algorithme de clustering
1
9
2
3
4
6
7
8
5
PP - polarity - polarityRR - Ras related pathway - Ras related pathwayHH - Highly osmotic conditions - Highly osmotic conditionsMM - Mating/filamentation - Mating/filamentation
Modular organization of cellular networksModular organization of cellular networks
Rives AW et al. PNAS, 2003
DD00 11
Modular organization of cellular networksModular organization of cellular networks
Rives AW et al. PNAS, 2003
- - ModulesModules
-- Intermodular connections Intermodular connections
Recherche de modules
Gavin et al. (2006) Nature, doi:10.1038/nature04532
Recherche de modules
Gavin et al. (2006) Nature, doi:10.1038/nature04532
A(i,j) : indice de socio-affinité
ni;j|i=bait : nombre of fois où protéines i et j sont retrouvées quand I est étiquettée
: nombre of proies récupérées quand i est un appât
: nombre de fois où protéines i and j sont copurifiées avec d’autres appâts.
preybaitin =preyjin ,
Recherche de modules
Gavin et al. (2006) Nature, doi:10.1038/nature04532
Recherche de modules
Gavin et al. (2006) Nature, doi:10.1038/nature04532
Essentialité des gènes
Yu et al (2004) Trends in Genetics 20:227-231
Essentialité des gènes
Yu et al (2004) Trends in Genetics 20:227-231
Hubs : 1061 protéines qui ont le plus grand nombre d’interactions
Robustesse du réseau aux mutations
Jeong et al, Nature 2000
Robustesse du réseau aux mutations
Freeland et al. (2000) Mol. Biol. Evol. 17:511–518
Kelley & Iteker (2005) Nature Biotechnology 23:561-566
Perspectives : combiner les réseaux