Aos meus pais....
MÓNICA PATRÍCIA SILVA GOMES
ESTUDO DA INFLUÊNCIA DE POLIMORFISMOS FUNCIONAIS
NOS GENES IL-4 E IL-8 NA SUSCEPTIBILIDADE PARA O
DESENVOLVIMENTO DE CANCRO DE PULMÃO
Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre
em Oncologia submetida ao Instituto de
Ciências Biomédicas de Abel Salazar da
Universidade do Porto
Orientador- Professor Doutor Rui Manuel de
Medeiros Melo Silva
Categoria- Professor Associado Convidado com
Agregação
Afiliação- Instituto de Ciências Biomédicas de
Abel Salazar
INFORMAÇÃO TÉCNICA TÍTULO: Estudo da Influência de Polimorfismos Funcionais nos genes IL-4 e IL-8 na
susceptibilidade para o desenvolvimento de Cancro de Pulmão
Dissertação de Candidatura ao Grau de Mestre em Oncologia, apresentada
ao Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar, Universidade do Porto
AUTOR:
Mónica Patrícia Silva Gomes
DATA:
Outubro de 2010
EDITOR: Mónica Patrícia Silva Gomes
MORADA: Rua Rainha Santa, 555
LOCALIDADE: Olival, Vila Nova de Gaia
CÓDIGO POSTAL: 4415-719 Olival
CORREIO ELECTRÓNICO: [email protected]
1ª EDIÇÃO: Setembro 2010
AGRADECIMENTOS Ao finalizar esta etapa do meu percurso académico, é importante salientar
algumas pessoas que de uma forma ou de outra contribuíram para o sucesso deste
trabalho,
Deste modo, gostaria de agradecer à comissão de Coordenação do Mestrado em
Oncologia, sob a pessoa do Professor Doutor Carlos Lopes, a oportunidade de ingressar
neste mestrado e de enriquecer os meus conhecimentos científicos na área da oncologia.
Ao coordenador do Grupo de Oncologia Molecular, Professor Doutor Rui Medeiros
e meu orientador, gostaria de agradecer a oportunidade de realizar este trabalho no seu
grupo, assim como todos as palavras de incentivo e de confiança que me foi transmitindo
e que foram muito importantes em alguns momentos....Obrigado “Chefe”.
À Liga Portuguesa Contra o Cancro- Núcleo Regional do Norte, na pessoa do Dr.
Vitor Veloso, gostaria de agradecer a Bolsa de Investigação que me foi concedida, a qual
foi indispensável para a realização deste trabalho.
Ao Dr António Araújo, por ter a amabilidade de enviar as amostras dos seus
doentes para o laboratório, e por ter feito com que fosse possível levar além fronteiras
este trabalho, obrigado por tudo.
À Drª Ana Coelho, pelo apoio incansável, pela paciência, pela dedicação, pela
amizade, pela disponibilidade, etc, etc, etc....Para ti só tenho duas palavras: Obrigado
“Bunny”.
Á Drª Raquel Catarino, pela boa disposição que a caracteriza e que transmite
quando chega ao laboratório, e por todo o apoio na elaboração desta tese. Obrigado.
Á Drª Ana Nogal, por tudo o que me ensinou neste laboratório, pela paciência que
teve para comigo e por tudo o resto que é dificíl de enumerar...Noguinha, Obrigado.
Aos restantes investigadores que fazem parte deste laboratório, obrigado pelas
conversas da hora de almoço, pelas pausas para café e por todas as restantes
actividades extra-laboratório que sabem tão bem em momentos mais complicados.
Á Drª Ana Luísa Teixeira, gostaria de agradecer pelo companheirismo e amizade
constantes ao longo dos últimos tempos, pelo tempo perdido a aturar os meus
problemas, pelas fantásticas viagens a congressos...pelos jantares maravilhosos...e por
todos os disparates que fazemos juntas...e por me ajudar a manter a minha sanidade
mental. Para a minha Lesbiana preferida...Um obrigado do tamanho do mundo.
Aos meus amigos de “Braga” que apesar de longe sempre estiveram por perto, e
sempre com uma palavra de apoio e conforto especialmente o Carlos, a Patrícia, o
Ricardo...a vocês um grande obrigado, vão estar sempre no meu coração.
Um obrigado muito especial a quem me ajudou na parte gráfica deste trabalho,
que tanto tempo gastou a fazer esquemas, formatações, capas, cd’s....e que tanta
paciência teve para me aturar...enfim....Obrigado.
À minha família, que sempre me deu todo o apoio e sempre confiou em mim... em
especial aos meus avós que apesar de já não estarem entre nós...tenho a certeza que
estão a olhar por mim... E que ficariam muito felizes com mais este passo na minha
formação. Obrigado....
Por fim, gostaria de deixar o último agradecimento para as pessoas mais
importantes da minha vida.... por todo o apoio, confiança, disponibilidade, entrega,
carinho e amor....por me terem ensinado a lutar e a acreditar nos meus sonhos, por
valorizarem as minha escolhas, por estarem sempre ao meu lado. Por serem os meus
pais... OBRIGADO!!!
AAbbrreevviiaattuurraass
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
XIII
Abreviaturas
A
A Adenina
APC Células apresentadoras de antigénio
ADN Ácido desoxirribonucleico
aOR Odds Ratio ajustado
C
C Citosina
CD Células Dendríticas
CPNPC Cancro de pulmão de não pequenas células
ºC Graus centígrados
COX-2 Cicloxigenase-2
D
dNTP Desoxirribonucleosídeo trifosfato
E
ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
G
G Guanina
I
IC Intervalo de confiança
Ig Imunoglobulina
IL-4 Interleucina-4
IL-8 Interleucina-8
IFN-γ Interferão- γ
AAbbrreevviiaattuurraass
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
XIV
M
M Concentração molar
mg/mL Miligrama por mililitro
MHC Complexo Maior de Histocompatibidade
mL Mililitro
mM Concentração milimolar
MMP Metaloproteases da Matriz
N
ng Nanograma
ng/mL Nanograma por mililitro
NK Natural Killer
NO Óxido Nítrico
O
OR Odds Ratio
P
P Probabilidade
p/v Peso por volume
PAH’s Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
Pb Pares de bases
PCR Polymerase Chain Reaction
R
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
RPM Rotação por minuto
S
SNP Single Nucleotide Polymorphism
AAbbrreevviiaattuurraass
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
XV
T
T Timina
TAM Tumour- associated macrophages
TAF Tumour- associated fibroblasts
TBE Tris-borate EDTA buffer
Tc Linfócitos T citotóxicos
TCR Receptor de células T
Th Linfócitos T helper
TNF-α Tumour-Necrosis Factor- alfa
TGF-β Transforming growth factor -beta
U
U Unidade
μg/μL Microgramas por microlitro
μL Microlitro
μM Concentração Micromolar
V
VEGF Vascular endothelial growth factor
X
χ2 Qui-Quadrado
ÍÍnnddiiccee
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
XVII
AGRADECIMENTOS ........................................................................................ IX
Abreviaturas .................................................................................................... XI
Resumo ........................................................................................................ XVII
Abstract ......................................................................................................... XXI
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... -1-
1.1. Cancro: Conceitos Gerais .................................................................... - 3 -
1.2 Oncobiologia Molecular ........................................................................ - 4 -
1.2.1 Carcinogénese............................................................................ - 4 -
1.2.2. Variabilidade Genética Individual: Influência no Microambiente
Tumoral ................................................................................................... - 7 -
1.3. Imunologia e Cancro ........................................................................... - 8 -
1.4. Inflamação e Cancro .......................................................................... - 10 -
1.5. Citocinas ............................................................................................. - 12 -
1.6 Interleucina-4 (IL-4) ............................................................................ - 14 -
1.6.1. Polimorfismo -590 C/T no gene da IL-4 ....................................... - 15 -
1.7 Quimiocinas ............................................................................................ - 15 -
1.8 Interleucina -8 (IL-8) .............................................................................. - 17 -
1.8.1. Polimorfismo -251T/A no gene da IL-8 ....................................... - 18 -
1.9. Cancro de Pulmão ................................................................................. - 19 -
1.9.1 Epidemiologia e Mecanismos Moleculares ............................... - 19 -
2. OBJECTIVOS ......................................................................................... -23-
2.1. Objectivo Geral ..................................................................................... - 25 -
2.2. Objectivos Específicos ......................................................................... - 25 -
3. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................... -27-
3.1. Caracterização das Amostras ............................................................... - 29 -
ÍÍnnddiiccee
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
XVIII
3.1.1. Doentes com Cancro de Pulmão ...................................................... - 29 -
3.1.2. Indivíduos do Grupo Controlo ............................................................ - 29 -
3.2. Processamento das amostras ...................................................................... - 31 -
3.3. Genotipagem dos Polimorfismos dos genes da IL-4 e IL-8 ..................... - 31 -
3.3.1. Polimorfismo -590 C/T no gene IL-4 ................................................ - 32 -
3.3.2. Polimorfismo -251 A/T no gene IL-8 ................................................. - 34 -
3.4. Análise estatística ........................................................................................... - 36 -
4.RESULTADOS .......................................................................................... - 37 -
4.1. Associação do Polimorfismo -590 C/T no gene IL-4 na susceptibilidade de
Cancro de Pulmão (CPNPC) ................................................................................. - 39 -
4.2. Associação do Polimorfismo -251 A/T no gene IL-8 na susceptibiliade de
Cancro de Pulmão (CPNPC) ................................................................................. - 43 -
5. DISCUSSÃO ........................................................................................... -47-
5.1. Influência do polimorfismo -590 C/T de IL-4 na susceptibilidade para o
desenvolvimento de CPNPC ................................................................................. - 51 -
5.2. Influência do polimorfismo -251 A/T de IL-8 na susceptibilidade para o
desenvolvimento de CPNPC ................................................................................ - 56 -
6. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS FUTURAS ....................................... -59-
7. REFERÊNCIAS ................................................................................ ......-63-
8. ANEXOS ................................................................................................. -73-
R E S U M
O
RReessuummoo
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
XXI
O cancro é um importante problema de saúde pública, sendo a segunda causa de
morte por doença em todo o mundo: cerca de 13 milhões de pessoas são diagnosticadas
com cancro todos os anos e cerca de 8 milhões morrem anualmente devido a esta
doença.
A carcinogénese é um processo multifactorial e multifásico, que culmina no
desenvolvimento de neoplasias malignas, pela acumulação de alterações genéticas e/ou
epigenéticas que poderão conduzir a mudanças na actividade génica e a fenótipos
alterados sobre os quais actua a selecção ambiental e microambiental. Este processo
passa por vários estadios até que se constitua um carcinoma in situ, podendo ser dividido
em três fases consecutivas: iniciação, promoção e progressão.
As variações no ADN existentes nos indivíduos de uma população cuja variante
menos frequente está presente em pelo menos 1% dessa população designam-se de
polimorfismos. A maioria dos polimorfismos ocorre em genes envolvidos no controlo da
proliferação e diferenciação celulares, na reparação de ADN e na manutenção da
integridade do genoma, bem como em genes que codificam proteínas envolvidas na
metabolização de diferentes xenobióticos, e em genes importantes na regulação do
sistema imunológico.
O sistema imunológico dos mamíferos é composto por vários tipos de células que
interagem entre si e com outras células que não pertencem ao sistema imunológico,
numa rede complexa e dinâmica, que assegura a protecção contra agentes patogénios
estranhos, mantendo em simultâneo a tolerância para antigénios do próprio.
As células tumorais produzem várias citocinas e quimiocinas que atraem os
leucócitos. A componente inflamatória da neoplasia em desenvolvimento inclui uma
população leucocitária muito diversificada, da qual se destacam macrófagos (abundantes
em vários tipos de tumores), linfócitos, células NK, neutrófilos e células dendríticas.
A forma como as células inflamatórias se comprometem com a via da
carcinogénese não está esclarecida. A hipótese mais plausível é a de que vários tumores
têm origem em locais de infecção, como parte da resposta normal do hospedeiro.
As citocinas desempenham um papel fulcral na indução de diferenciação de células
do sistema imunológico, destacando-se entre outros, a diferenciação de células T
imaturas (Th0) em linfócitos T helper (Th) do tipo Th1 ou Th2.
A IL-4 é uma citocina que desempenha um papel importante no processo de
inflamação, quer pela sua capacidade de induzir diferenciação de linfócitos Th2, quer por
conferir às células sobre as quais actua um efeito anti-proliferativo. Esta interleucina tem
RReessuummoo
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
XXII
funções muito diversificadas e pode actuar ao nível dos tecidos hematopoiéticos, tecidos
de adesão e nos processos de inflamação.
As quimiocinas compreendem uma grande família de proteínas pró-inflamatórias
de baixo peso molecular, que são potentes activadores e quimioatractores para diferentes
sub-populações de leucócitos e algumas células não hematopoiéticas.
A IL-8 é secretada por diversas células como monócitos, macrófagos, fibroblastos e
queratinócitos. As funções principais são a quimiotaxia de células do sistema imune,
desempenhando também um papel importante como factor angiogénico.
O cancro de pulmão é a neoplasia mais comum no mundo desde 1985, sendo que
em 2008 cerca de 1,6 milhões de novos casos foram diagnosticados e a taxa de
mortalidade foi de 18,2% (1,4 milhões de mortes). Este tipo de cancro apresenta
diferentes tipos histológicos, sendo que o cancro de pulmão de não-pequenas células
(CPNPC) representa cerca de 75% da totalidade dos cancros de pulmão.
O objectivo deste trabalho consistiu na avaliação da influência dos polimorfismos
genéticos -590 C/T do gene da IL-4 e -251 A/T do gene da IL-8 na susceptibilidade para o
desenvolvimento de CPNPC.
Neste estudo foram incluídos 669 indivíduos sem doença oncológica conhecida,
que constituíram o grupo controlo e 391 indivíduos com diagnóstico histológico de cancro
de pulmão, designado por grupo de casos. Os indivíduos de ambos os grupos foram
genotipados por PCR-RFLP, relativamente aos polimorfismos em estudo. A análise
estatística dos resultados foi realizada com o auxílio do programa estatístico SPSS.
Os resultados obtidos indicam a existência de uma associação entre o
polimorfismo -590 C/T do gene da IL-4 e o desenvolvimento de CPNPC do tipo
histológico epidermóide. Indivíduos portadores do genótipo de alta expressão, TT,
apresentam uma protecção de cerca de 78% para o desenvolvimento da neoplasia,
quando comparados com os portadores CC (OR=0,221; IC95%=0,544-1,900;P=0,958).
Estes resultados vêm de encontro ao que se conhece sobre o papel desempenhado pela
IL-4 na progressão tumoral: maior expressão desta interleucina pode influenciar
negativamente a neoangiogénese, condicionando desta forma o crescimento do tumor.
Relativamente ao polimorfismo -251 A/T do gene IL-8, não foram observadas
associações estatisticamente significativas entre este e a susceptibilidade para o
desenvolvimento do cancro de pulmão.
Estudos futuros deveriam ser realizados noutros modelos tumorais, uma vez que
a inflamação e as suas vias relacionadas podem condicionar o desenvolvimento de várias
neoplasias.
RReessuummoo
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
XXIII
A B S T R A C T
AAbbssttrraacctt
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
XXV
Cancer is currently a major public health problem, being the second leading cause
of death by disease in the world: about 13 million people are diagnosed with cancer each
year and about 8 million people die annually due to this disease.
The carcinogenesis is a multifactorial and multi-phase process culminating in the
development of malignancies, the accumulation of genetic mutations and / or epigenetic
alterations that could lead to changes in gene activity and altered phenotypes on which
selection acts on environmental and microenvironmental level. This process goes through
several stages pending the establishment of a carcinoma in situ, and can be divided into
three consecutive phases: initiation, promotion and progression.
Single base pair positions in genomic DNA, at which different sequence alternatives
(or alleles) exist in normal individuals, wherein the least frequent allele has an abundance
of 1% or greater are called polymorphisms.
The majority of polymorphisms occur in genes involved in controlling cell
proliferation and differentiation, in DNA repair and maintaining genome integrity as well as
genes that encode proteins involved in metabolism of different xenobiotics, and genes
important in regulating the immune system.
The immune system of mammals is composed of several cell types that interact
among themselves and with other cells outside the immune system, in a complex and
dynamic network, providing for the protection against foreign pathogens, while maintaining
tolerance to self antigens.
Tumor cells produce various cytokines and chemokines which attract leukocytes.
The inflammatory component of the neoplasm includes developing a diverse leukocyte
population, such as macrophages (abundant in various types of tumors), lymphocytes, NK
cells, neutrophils and dendritic cells.
The way in which inflammatory cells are committed to the pathway of
carcinogenesis is unclear. The most plausible hypothesis is that multiple tumors arise
from sites of infection as part of the normal response of the host.
Cytokines play an important role in inducing differentiation of cells of the immune system,
including the differentiation of immature T cells (Th0) lymphocytes into T helper (Th) type
Th1 or Th2.
IL-4 is a cytokine that plays an important role in the inflammation process, either by
its ability to induce differentiation of Th2 lymphocytes, or by giving the cells on which it
acts an anti-proliferative effect. This interleukin has very diverse functions and may act at
the level of hematopoietic tissue, tissue adhesion and inflammation processes.
AAbbssttrraacctt
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
XXVI
Chemokines comprise a large family of pro-inflammatory proteins of low molecular
weight, which are potent activators and chemoattractants for different sub-populations of
leukocytes and some non-hematopoietic cells.
The IL-8 is secreted by various cells such as monocytes, macrophages, fibroblasts
and keratinocytes. Its main functions are chemotaxis of immune cells, also play an
important role as an angiogenic factor.
Lung cancer is the most common cancer in the world since 1985, and in 2008 some
1.6 million new cases were diagnosed and the mortality rate was 18.2% (1.4 million
deaths). This type of cancer has different histological types, with non-small cell lung
cancer (NSCLC) representing about 75% of all lung cancers.
The purpose of this study was to understand the relevance of genetic
polymorphisms -590 C / T in IL-4 gene and -251 A / T in gene IL-8 in the susceptibility to
the development of NSCLC.
This study included 669 individuals without known malignant disease, which
constituted the control group and 391 subjects who were diagnosed with lung cancer (the
case group). The subjects from both groups were genotyped by PCR-RFLP for the
polymorphisms studied. The statistical analysis was performed with the aid of SPSS.
The results indicate the existence of an association between the TT genotype of -
590 C / T IL-4 polymorphism and the development of epidermoid NSCLC.
Individuals carrying the high-expression TT genotype showed a protection of about
78% for the development of epidermoid NSCLC when compared to those with CC
genotype (OR=0,221; CI95%=0,544-1,900; P=0,958). These findings are in agreement
with the role of IL-4 in tumor progression: increased expression of this interleukin may
negatively affect neoangiogenesis, conditioning thus tumor growth.
For the -251 A / T IL-8 polymorphism, no statistically significant associations were
found between its genotypes and NSCLC development.
Future studies should be conducted not only in lung cancer but also in other tumor
models, since the inflammation and its related pathways may influence the development
of several tumors.
1.
I N T R O D U Ç Ã O
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 3 -
1.1. Cancro: Conceitos Gerais
As últimas décadas têm sido acompanhadas de grandes mudanças e enormes
evoluções, que permitiram ao Homem adquirir um maior conhecimento de si mesmo e do
que o rodeia, proporcionando-lhe melhor qualidade de vida, melhores hábitos
alimentares e de higiene, melhores cuidados de saúde e também uma maior esperança
média de vida.
Acredita-se ter sido Hipócrates, médico da Grécia antiga, o primeiro a reconhecer a
existência de tumores malignos. A invasão tumoral lembrava-lhe as garras do
caranguejo, pelo que chamou a esta doença karkino, designação grega para caranguejo,
de onde deriva a palavra carcinoma. O cancro constitui um desafio clínico e molecular
para todos os envolvidos na elucidação dos fenómenos que conduzem ao
desenvolvimento tumoral.
O cancro é actualmente um importante problema de saúde pública [1,2] sendo a
segunda causa de morte por doença em todo o mundo: cerca de 13 milhões de pessoas
são diagnosticadas com cancro todos os anos e cerca de 8 milhões morrem anualmente
devido a esta doença [3]. Atendendo à relação entre a esperança média de vida e o risco
para cancro e usando como referência a população mundial do ano 2000, estima-se que
em 2015 haja um aumento significativo da taxa de incidência de cancro, uma vez que o
número de indivíduos de 65 e 80 anos de idade será 22 e 50% superior, respectivamente
[1]. Desta forma, admite-se que as taxas de incidência de cancro poderão acompanhar o
aumento da esperança média de vida [1].
O cancro é uma doença heterogénea, com diferentes etiologias e história natural,
que se desenvolve através da interacção entre factores ambientais e genéticos. Trata-se
de uma doença multifactorial complexa, cujo processo de desenvolvimento é lento e
envolve a ocorrência de múltiplos eventos sequenciais.
O termo cancro refere-se a um vasto grupo de patologias que se caracterizam pela
auto-suficiência, capacidade de proliferação e deinvasão do tecido adjacente e
capacidade de metastização [4].
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 4 -
Geralmente, o balanço entre a proliferação e a morte celular programada é
altamente regulado, garantindo a integridade dos órgãos e tecidos [5]. Nas neoplasias, a
ocorrência de uma alteração no equilíbrio crescimento/morte celular pode dever-se a
danos provocados no genoma humano, especialmente em genes envolvidos na
regulação do ciclo celular [4,5].
Em relação ao cancro, muitas questões carecem de elucidação, sendo este o
desafio que encaram quer os que estão envolvidos no seu tratamento clínico, quer os que
se dedicam a estudar e caracterizar os mecanismos moleculares subjacentes ao seu
desenvolvimento.
1.2. Oncobiologia Molecular
1.2.1. Carcinogénese
Os indivíduos adaptam-se ao meio onde estão inseridos por processos de
reparação de danos causados por diferentes tipos de agressões que vão ocorrendo ao
longo da vida. Diversos factores podem originar diferentes danos ao nível celular, mais
especificamente ao nível do ácido desoxirribonucléico (ADN).
As bases moleculares da susceptibilidade para cancro foram colocadas a
descoberto aquando do desenvolvimento das técnicas de análise de ADN [6]. As
agressões que causam danos no ADN podem ser herdadas ou adquiridas ao longo da
vida de um indivíduo, por acção de compostos químicos, agentes biológicos ou agentes
físicos [6]. Para além disso, mutações espontâneas que ocorrem com elevada frequência
durante a replicação do ADN podem exceder a capacidade de reparação por parte das
polimerases de ADN, constituindo um risco potencial para o desenvolvimento de uma
neoplasia [6,7].
A carcinogénese é um processo multifactorial e multifásico, que culmina no
desenvolvimento de neoplasias malignas, pela acumulação de alterações genéticas e/ou
epigenéticas que poderão conduzir a mudanças na actividade génica e a fenótipos
alterados sobre os quais actua a selecção ambiental e microambiental [8]. Este processo
passa por vários estadios até que se constitua um carcinoma in situ (CIS), podendo ser
dividido em três fases consecutivas: iniciação, promoção e progressão [9].
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 5 -
A iniciação é uma fase que se caracteriza por uma alteração no material genético
de uma célula normal, por acção de um agente carcinogénio, de uma mutação
espontânea ou hereditária, ou outro factor que resulte num dano celular. Caso a célula
não tenha capacidade de reparar o dano sofrido, vai ocorrer uma acumulação sucessiva
de alterações genéticas que conferem vantagem selectiva à célula “iniciada”- fase de
promoção. A acumulação sequencial de alterações genéticas em genes responsáveis
pelo controlo da proliferação celular, da morte celular programada e da manutenção da
integridade do genoma, culmina na expansão clonal da célula “iniciada”. A fase de
progressão é uma fase irreversível, em que o processo evolui até ao aparecimento das
primeiras manifestações clínicas da doença. A progressão do cancro caracteriza-se pela
inactivação de determinados genes e sobrexpressão de outros, dando origem a células
independentes da regulação local e central do organismo, que proliferam sem inibição [9].
Alguns dos genes mais frequentemente alterados no cancro são os proto-
oncogenes, cujo ganho de função promove a proliferação celular e a carcinogénese, os
genes supressores tumorais, que por perda de função promovem a proliferação celular e
a carcinogénese e os genes envolvidos na reparação do ADN [10].
As células tumorais apresentam características distintas das células normais,
sabendo-se que, durante a carcinogénese, adquirem fenótipos essenciais e
discriminativos como: potencial proliferativo ilimitado, capacidade de evasão à apoptose,
auto-suficiência em factores de crescimento, insensibilidade a sinais de inibidores de
crescimento, capacidade de promover a angiogénese, capacidade de invasão tecidular e
metastização à distância (figura 1) [8].
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 6 -
Figura 1. Alterações adquiridas pela célula maligna ao longo do processo de carcinogénese [8].
Contudo, o número de alterações necessárias para adquirir estas capacidades e a
ordem pela qual elas surgem, variam de acordo com as características da neoplasia [11].
Algumas alterações podem ser transmitidas de geração em geração, através da linhagem
germinativa do indivíduo, originando os cancros familiares, que são raros (entre 5 e 10%),
ao passo que a maioria das neoplasias surgem de um modo esporádico, na linhagem
somática de tipos específicos de células, originado os cancros esporádicos [11].
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 7 -
1.2.2. Variabilidade Genética Individual: Influência no Microambiente
Tumoral
Devido ao carácter multifactorial das neoplasias malignas, o seu desenvolvimento é
condicionado pela interacção entre o meio ambiente em que o hospedeiro se encontra e
a variabilidade genética individual deste.
A descodificação do genoma humano permitiu constatar que diferenças nas
sequências de ADN podem explicar diferentes susceptibilidades e diferentes padrões de
desenvolvimento tumoral, tendo esta variabilidade implicações ao nível do tratamento e
prognóstico do cancro [12].
As variações no ADN existentes nos indivíduos de uma população cuja variante
menos frequente está presente em pelo menos 1% dessa população designam-se de
polimorfismos [13]. A maioria dos polimorfismos ocorre em genes envolvidos no controlo
da proliferação e diferenciação celulares, na reparação de ADN e na manutenção da
integridade do genoma, bem como em genes que codificam proteínas envolvidas na
metabolização de diferentes xenobióticos e em genes importantes na regulação do
sistema imunológico [14].
Os polimorfismos mais comuns são caracterizados pela alteração de apenas um
nucleotídeo na sequência de ADN e designam-se por Single Nucleotide Polymorphisms
(SNPs) [15]. Os SNPs são a principal fonte de variabilidade individual, pelo que cada
indivíduo é portador de um vasto grupo de polimorfismos, o que lhe confere um
património genético único. No entanto, a distribuição da frequência dos SNPs apresenta
variações dentro da mesma população, para além de variações inter-populacionais. Dado
que o risco para cancro parece ser influenciado pelos padrões de SNPs que cada
indivíduo possui em determinados genes chave de susceptibilidade [14], o estudo de
polimorfismos em genes alvo poderá ajudar a definir grupos de risco para o
desenvolvimento neoplásico e onde estes possam constituir factores de prognóstico.
Cada indivíduo, como portador de um conjunto de polimorfismos, apresentará um
perfil de carcinogénese singular. Alguns desses polimorfismos podem ser caracterizados
como variantes genéticas funcionais, sendo a sua ocorrência responsável por padrões de
expressão/função genética alteradas. Estes, por originarem diferenças na expressão
génica e/ou diferenças na produção adequada da respectiva proteína, terão a capacidade
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 8 -
de determinar o microambiente tumoral que, por sua vez, exercerá influência no processo
de desenvolvimento tumoral [9].
Entende-se por microambiente tumoral o conjunto de todos os elementos não-
epiteliais adjacentes às células tumorais incluindo fibroblastos, células do sistema imune,
matriz extracelular e vasos sanguíneos [16]. Actualmente, admite-se que o mesmo não
desempenhe apenas funções de suporte, tendo também a capacidade de contribuir para
o desenvolvimento e progressão tumorais, por interacções mediadas entre moléculas
secretadas por células do sistema imunitário [16]
1.3. Imunologia e Cancro
Bactérias, vírus, ou outros agentes patogénicos uni e pluricelulares e células
cancerígenas representam ameaças para o organismo, contra as quais este desenvolveu
defesas activas, que constituem o sistema imunológico [17]. A associação entre células
do sistema imunológico e o cancro foi estabelecida há mais de um século, acreditando-se
inicialmente que os infiltrados de leucócitos encontrados no estroma e rodeando o tumor
representavam uma tentativa de erradicação do tumor por parte do hospedeiro [16]. O
conceito de vigilância imunológica, que foi delineado no inicio do século XX, foi definido
por Macfarlane Burnet nos anos 50, baseado no pressuposto de que uma das funções
fisiológicas do sistema imunológico é a do reconhecimento e destruição de clones de
células transformadas antes que estas originem um tumor e, após a formação do mesmo,
a morte das células tumorais [17]. A importância desta vigilância imunológica tem sido
questionada pelos resultados de diversos estudos e o seu papel pode variar em
diferentes tipos de tumores [17].
O sistema imunitário dos mamíferos é composto por vários tipos de células que
interagem entre si e com outras células que não pertencem ao sistema imunológico,
numa rede complexa e dinâmica, que assegura a protecção contra agentes patogénios
estranhos, mantendo em simultâneo a tolerância para antigénios do próprio. Baseado na
especificidade para o antigénio e na altura em que é activado, podem distinguir-se dois
compartimentos no sistema imune – o inato e o adquirido. Ainda que a composição
celular e a especificidade antigénica de ambos sejam distintas, cada um deles
desenvolveu um sofisticado sistema de comunicação que permite respostas rápidas a
danos tecidulares [16].
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 9 -
As células da imunidade inata, incluindo as células dendríticas (CD), as células
natural killer (NK), os macrófagos, os neutrófilos, os basófilos, os eosinófilos e os
mastócitos constituem a primeira linha de defesa contra agentes patogénicos estranhos
[16].
Quanto à sua acção as CD, os macrófagos e os mastócitos, alojados nos tecidos,
funicionam como células sentinela e monitorizam constantemente o seu microambiente,
detectando sinais irregulares [16]. Quando a homeostasia do tecido é perturbada, os
macrófagos e mastócitos libertam mediadores soluvéis, como citocinas, quimiocinas,
proteases remodeladoras da matriz, espécies reactivas de oxigénio e mediadores
bioactivos, como histamina, que induzem a mobilização e infiltração de leucócitos no
tecido danificado. Podem também induzir respostas vasculares e activar fibroblastos, de
forma a orquestrar a eliminação de microorganismos invasores e iniciar a reparação do
tecido danificado [16]. A característica que melhor distingue a imunidade inata da
imunidade adquirida é a capacidade intrínseca da primeira responder rapidamente a
danos no tecido sem especificidade antigénica ou necessidade de encontro prévio com o
antigénio [16]. A activação aguda da imunidade inata desencadeia a activação do sistema
de imunidade adquirida. A indução de uma resposta imune adquirida eficiente requer a
interacção directa com células apresentadoras de antigénio (APC) e um ambiente pró-
inflamatório. As células responsáveis pela resposta imune adquirida são os linfócitos T
helper (Th) e linfócitos T citotóxicos (Tc), que pertencem ao ramo celular da imunidade
adquirida e os linfócitos B, que compõem o ramo humoral. A componente humoral da
resposta imune adquirida está envolvida na produção de anticorpos capazes de
neutralizar ou destruir agentes que causem dano ao organismo. A componente celular é
particularmente relevante para a imunologia tumoral [9].
As células da imunidade inata, em particular macrófagos associados a tumores
(TAM), mastócitos e granulócitos, contribuem de forma directa para a formação de
tumores através da indução de danos no ADN pela geração de radicais livres, e através
da regulação parácrina de factores de transcrição que controlam vias de sinalização
intracelulares, (como o NF-Kβ, factor nuclear κβ). Estas células contribuem também de
forma indirecta para a progressão tumoral, através da promoção da angiogénese, e de
remodelação de tecidos, pela produção de factores de crescimento, citocinas,
quimiocinas e metaloproteases da matriz (MMPs), regulação positiva da ciclooxigenase-2
(COX-2) e pela supressão da resposta imune adquirida anti-tumoral [16]. A imunidade
adquirida pode modular a carcinogénese, quer directamente, pela inibição do crescimento
tumoral mediada pelos linfócitos T citotóxicos, ou pela lise das células tumorais mediada
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 10 -
por citocinas, quer indirectamente, pela promoção do crescimento tumoral por acção da
resposta imune humoral que promove a inflamação crónica no microambiente tumoral
[16].
Embora o sistema imunológico seja capaz de responder à presença das células
tumorais, o número anual de mortes por cancro sugere que a resposta imune às células
tumorais é pouco eficiente. O que se verifica é que a resposta imune falha
frequentemente na prevenção do crescimento tumoral. Esta incapacidade de erradicação
de células transformadas prende-se com diversos factores. As células tumorais derivam
de células do hospedeiro, assemelhando-se a células normais. A maior parte das células
tumorais expressam poucos antigénios passíveis de serem reconhecidos pelo sistema
imune como estranhos, pelo que a maior parte dos tumores é pouco imunogénica,
originando apenas respostas imunes fracas ou indetectáveis [16].
Por outro lado, o rápido crescimento e disseminação dos tumores podem sobrepor-
se à capacidade do sistema imune para erradicar as células tumorais, e muitos dos
tumores conhecidos possuem mecanismos especializados que lhes permitem a evasão à
resposta imune desencadeada pelo hospedeiro. Outra explicação plausível para o
escape das células tumorais aos mecanismos de vigilância imunológica prende-se com o
facto de o microambiente tumoral favorecer estados inflamatórios pró-tumorigénicos, ao
invés de promover respostas imunes anti-tumorais agudas [16].
1.4. Inflamação e Cancro
O conhecimento da relação funcional entre a inflamação e o cancro não é recente.
Em 1863, Virchow propõe que o cancro possa ter origem em locais de inflamação
crónica, baseando-se na hipótese de que alguns tipos de agentes que provocam irritação,
associados a danos nos tecidos e a inflamação subsequente, promoveriam a proliferação
celular e consequente neoplasia [4,18]. Embora esteja claro que a proliferação celular por
si só não é a causa do aparecimento do cancro, a proliferação celular sustentada num
ambiente rico em células inflamatórias, factores de crescimento, estroma activado e
agentes promotores de danos no ADN certamente potenciam e/ou promovem o risco
para o surgimento de neoplasias. O microambiente tumoral é composto não apenas por
células do tecido residente, como fibroblastos e células endoteliais, mas também por
infiltrados de leucócitos do hospedeiro [19].
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 11 -
As células tumorais produzem várias citocinas e quimiocinas que atraem os
leucócitos. A componente inflamatória do neoplasma em desenvolvimento inclui uma
população leucocitária muito diversificada, da qual se destacam macrófagos (abundantes
em vários tipos de tumores), linfócitos, células NK, neutrófilos e células dendríticas.
Estes componentes inflamatórios do tumor são considerados factores chave na
promoção da progressão tumoral devido à sua capacidade para libertar uma grande
variedade de citocinas, quimiocinas, mediadores citotóxicos, como espécies reactivas de
oxigénio, metaloproteases (MMPs) e agentes perforantes de membrana e mediadores
solúveis de morte celular, como o TNF-α (Tumour Necrosis Factor-α), interleucinas e
interferões [4].
Muitos dos mediadores libertados durante o processo de inflamação crónica
desregulada promovem a proliferação celular e invasão, induzem a mutagénese e
aumentam a angiogénese. Devido a estas características, os mediadores inflamatórios
promovem a transformação e a iniciação de um fenótipo maligno e se a sua expressão
for sustentada, promovem também a progressão tumoral. Para além disto, muitos dos
factores libertados pelas células inflamatórias conduzem, directa ou indirectamente, a
uma supressão marcada da resposta imune, que de outra forma poderia ter um papel
importante na erradicação do tumor [19].
A forma como as células inflamatórias se comprometem com a via da
carcinogénese não está esclarecida. A hipótese mais plausível é a de que vários tumores
têm origem em locais de infecção e inflamação, como parte da resposta normal do
hospedeiro [20].
Sabe-se que os macrófagos podem ser activados como resposta a agentes
microbianos e citocinas em particular o interferão-γ (IFN-γ) (activação clássica de
macrófagos). No entanto, descobriu-se recentemente que moléculas anti-inflamatórias,
como as hormonas glucocorticóides e as citocinas IL-4, IL-13 e IL-10 induzem um
programa diferente de activação de macrófagos (activação alternativa de macrófagos).
[21-23].
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 12 -
1.5. Citocinas
As citocinas são polipéptidos ou glicoproteínas de baixo peso molecular, igual ou
inferior a 30 Kda, secretadas por leucócitos e outros tipos de células. Estas moléculas
apresentam acções pleiotrópicas, dada a sua capacidade para actuar sobre diferentes
tipos celulares conduzindo a diferentes respostas. As citocinas podem actuar em sinergia
ou antagonicamente, apresentando algumas delas acções redundantes [24]. Estas
proteínas actuam através de uma rede intrincada de sinalização, que envolve a
interacção com receptores de superfície celular específicos, os quais apresentam alta
afinidade para o seu ligando. Devido a esta interacção, as citocinas são capazes de
exercer os seus efeitos biológicos de estímulo ou de repressão, quer no local da sua
secrecção quer à distância. A sua actividade pode desencadear um efeito em cascata,
activando genes que induzem processos de divisão celular, proliferação, diferenciação,
migração ou apoptose das células envolvidas [24].
As citocinas desempenham um papel fulcral na indução de diferenciação de células
do sistema imunológico, destacando-se entre outros, a diferenciação de células T
imaturas (Th0) em linfócitos T helper (Th) de tipo Th1 ou Th2 (figura 2) [22]. A IL-4 é uma
importante citocina que actua na diferenciação de Th0 para Th2, podendo bloquear o
desenvolvimento de Th0 para Th1 [25].
Figura 2. Diferenciação dos linfócitos Th0 e respectivas citocinas secretadas.
Efeito imunológico
pró-inflamátório
Efeito imunológico
anti-inflamátório
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 13 -
A diferenciação de uma célula Th0 em Th1 ou Th2 depende dos diferentes
estímulos a que estão sujeitos os linfócitos T naϊve (Tho). Entre estes incluem-se o tipo
de células apresentadoras de antigénio (APC) presentes no local, a quantidade do
antigénio, a afinidade química da molécula do complexo maior de histocompatibilidade
(MHC) para com o antigénio, a interacção entre o receptor de células T (TCR) e o
complexo MHC peptídeo e a afinidade das ligações entre as moléculas co- estimuladoras
[26,27].
As células Th1 apresentam um efeito imunológico pró-inflamatório, produzindo
citocinas como o interferão-γ (IFN-γ), a interleucina-2 (IL-2), o factor de necrose tumoral-α
(TNFα), que induzem a secrecção de anticorpos opsonizantes e fixadores de
complemento pelas células B, activam macrófagos e promovem a citotoxicidade celular e
a imunidade mediada por células [24].
Por outro lado, as células Th2, que segregam IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13,
promovem uma resposta humoral, induzindo a produção de imunoglobulinas da classe E
(IgE), favorecendo a diferenciação e activação de eosinófilos e supressão da imunidade
mediada por células [28]. A figura 3 ilustra como diferentes microambientes induzem
respostas inflamatórias também distintas.
O equilíbrio entre uma resposta Th1 e Th2 é fundamental para uma resposta
imunológica adequada. No entanto, em situações de inflamação, ou outras que exijam
uma resposta imune, é necessário que uma das respostas seja mais eficaz. Este parece
ser o caso do ambiente tumoral, em que o tumor induz uma activação de resposta Th2,
conduzindo esta à expressão de mediadores que são caracterizados como anti-
inflamatórios, sendo estes favoráveis ao desenvolvimento tumoral [24].
Figura 3. Balanço na resposta imunológica numa situção normal e no microambiente tumoral.
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 14 -
1.6. Interleucina-4 (IL-4)
A interleucina-4 (IL-4), é uma citocina que desempenha um papel importante no
processo de inflamação, quer pela sua capacidade de induzir diferenciação de linfócitos
Th2, quer por conferir às células sobre as quais actua, um efeito anti-proliferativo [29].
O gene que codifica a IL-4 localiza-se no braço longo do cromossoma 5, 5q23-31,
próximo de outros genes que codificam citocinas de diferenciação Th2 (IL-5, IL-13) (figura
4) [30-32].
Figura 4. Localização cromossómica do gene da IL-4. (adaptado de:www.ncbi.nlm.nih.gov)
A IL-4 é uma citocina pleiotrópica, sendo produzida por células T, mastócitos e
basófilos [33,34]. Esta citocina apresenta múltiplas funções imunomoduladoras. Tem
características anti-inflamatórias, estimulando a produção de citocinas com propriedades
semelhantes (IL-10, antagonista IL-1R) e inibe a expressão de citocinas pró-inflamatórias,
como IL-1, IL-6, IL-12, contribuindo desta forma para a redução da inflamação [35,36].
A IL-4 é um potente inibidor do processo de inflamação e angiogénese, bem como
do crescimento tumoral, tendo um efeito directo anti-proliferativo em alguns carcinomas
(mama, gástrico, renal, cólon, pulmão e mieloma múltiplo) [37-40].
A IL-4 é capaz de actuar quer localmente, quer sistemicamente de forma a bloquear
a neovascularização [41], modulando a activação de fibroblastos associados a tumores
(TAF). Esta capacidade da IL-4 permite a supressão do crescimento de novos vasos
sanguíneos, processo que é fundamental para o desenvolvimento tumoral [42]. Esta
interleucina tem funções muito diversificadas e pode actuar ao nível dos tecidos
hematopoiéticos, tecidos de adesão e nos processos de inflamação [33,34]. É de
destacar a sua influência nos tecidos de adesão, onde tem a capacidade de regular
moléculas de adesão (ICAM-1, intercellular adhesion molecule-1), fundamentais no
processo de metastização [43].
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 15 -
1.6.1. Polimorfismo -590 C/T no gene IL-4
O polimorfismo funcional -590 C/T do gene IL-4 é um dos vários que este gene
apresenta. Este polimorfismo representa uma substituição de uma citosina (C) por uma
timina (T) na posição -590 (rs 2243250) na região promotora, afectando a actividade
transcriptional do gene [30,32,38,44,45]. Este polimorfismo induz um aumento na
expressão de IL-4 na presença do alelo T, verificando-se um aumento dos níveis desta
citocina no soro. Por outro lado, o alelo C está associado a uma menor expressão do
gene [37,38,44,45].
A frequência do alelo T dito de “alta expressão” varia entre os 70% e 85% na
população Asiática e 15% a 25% na população Europeia [38,45,46]. Este alelo tem sido
relacionado com o desenvolvimento de vários tipos de cancro, como mama, cólon e
cabeça e pescoço [37].
1.7. Quimiocinas
Quimiocinas são citocinas com características quimioatractoras. Foram
inicialmente definidas como factores solúveis que regulam a migração de leucócitos
durante os vários estadios da inflamação. Contudo, a biologia das quimiocinas estende-
se a todos os tipos de células, incluindo células tumorais [4], desempenhando um papel
crucial nas reacções imunológicas e inflamatórias [21].
As quimiocinas compreendem uma grande família de proteínas pró-inflamatórias de
baixo peso molecular [47], que são potentes activadores e quimioatractores para
diferentes sub-populações de leucócitos e algumas células não hematopoiéticas [48].
Quase todos os membros da super-família das quimiocinas possuem quatro resíduos
conservados do aminoácido cisteína no N-terminal, sendo as quimiocinas agrupadas em
quatro grupos, de acordo com a separação dos dois primeiros resíduos [49].
O maior grupo de quimiocinas é caracterizado por possuir 2 resíduos adjacentes de
cisteína no N-terminal, donde lhe advém a designação CC. As quimiocinas CC exercem a
sua acção em linfócitos, monócitos e macrófagos, basófilos, eosinófilos, células NK e
células dendríticas. O segundo maior grupo, o grupo CXC, é caracterizado por possuir
um resíduo de aminoácido variável que se encontra entre os dois resíduos de cisteína N-
terminais. As quimiocinas CXC actuam sobretudo sobre linfócitos e neutrófilos [50].
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 16 -
Os dois outros grupos de quimiocinas são o grupo XC, onde apenas um resíduo de
cisteína está presente no N-terminal e o grupo CX3C, que tem três resíduos de
aminoácidos entre os dois primeiros resíduos de cisteínas [50].
As quimiocinas exercem os seus efeitos biológicos ligando-se a receptores
acoplados à proteína G (GPCRs) presentes na membrana citoplasmática da célula alvo.
Todos estes receptores são constituídos por aproximadamente 350 aminoácidos, com um
peso molecular que ronda os 40 kDa. O domínio extracelular consiste no N-terminal e
três loops extracelulares, que actuam de forma conjunta para a ligação do ligando
quimiocina. A região intracelular é composta por três loops e pelo C-terminal, que
colaboram para a transdução do sinal induzido pela ligação da quimiocina [51] .A rede de
quimiocinas e seus receptores que se encontra em tumores epiteliais pode contribuir para
vários aspectos do desenvolvimento e invasão tumoral. As quimiocinas são os principais
determinantes dos infiltrados de leucócitos nos tumores e podem contribuir para um
ambiente de imuno-supressão [50].
Devido ao envolvimento das quimiocinas numa tão vasta gama de actividades no
hospedeiro, torna-se natural assumir que estas terão um grande impacto na patobiologia
do cancro [52].
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 17 -
1.8. Interleucina -8 (IL-8)
A interleucina-8 (IL-8 ou CXCL8 de acordo com a nova nomenclatura das
quimiocinas), foi originalmente identificada como neutrophils chemotactic factor no
sobrenadante de monócitos humanos activados e foi caracterizada como um membro da
familia de quimiocinas CXC [53-56]. As quimiocinas CXC actuam sobretudo sobre
linfócitos e neutrófilos sendo que a IL-8 tem um papel importante como citocina
quimioatractora de neutrófilos [53-56].
Os primeiros estudos que permitiram associar a expressão de IL-8 a tumores foram
realizados em melanócitos humanos e linhas celulares de melanoma [57]. Estes estudos
demonstraram que a IL-8 era importante na regulação do crescimento de melanoma e
das suas metástases. A expressão de IL-8 foi observada em vários tumores, incluindo
leucemias, cancro de mama, tumores cerebrais, cancro gástrico e cancro de pulmão [57].
O gene IL-8 codifica uma proteina de 99 aminoácidos que são subsequentemente
processados por proteínas competentes, dando origem a 77 aminoácidos nas células não
imunológicas e 72 aminoácidos em monócitos e macrófagos [55]. Os efeitos biológicos
desta citocina são mediados pela ligação da IL-8 a 2 receptores acoplados à proteína G,
CXCR1 e CXCR2. Estes receptores são considerados estruturalmente semelhantes, o
que sugere que tenha havido uma duplicação de genes [55].
A IL-8 é secretada por diversas células como monócitos, macrófagos, fibroblastos e
queratinócitos [54]. As suas funções principais são a quimiotaxia de células do sistema
imune (neutrófilos e macrófagos), desempenhando também um papel importante como
factor angiogénico [58]. Esta citocina está relacionada com a produção de outras
citocinas como o TNF-α e IL-6 [58].
O gene que codifica a IL-8 localiza-se no braço longo do cromossoma 4, 4q13-q21
[59] (Figura 5) e contém quatro exões e três intrões, estando descritos vários
polimorfismos em diferentes locais do gene [59].
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
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Figura 5: Localização cromossómica do gene da IL-8. (adaptado de: www.ncbi.nlm.nih.gov)
1.8.1. Polimorfismo -251T/A no gene IL-8
De entre os polimorfismos descritos no gene que codifica a IL-8, é de destacar o
SNP -251T/A na região promotora, caracterizado pela substituição de uma timina (T) por
uma adenina (A) (rs4073) [54]. Este polimorfismo funcional correlaciona-se com a
expressão de IL-8, estando descrito que o alelo A está associado à diminuição dos níveis
de proteína [57-60]. A frequência do alelo A deste polimorfismo está descrito que na
população normal das várias etnias varia entre 30% a 50% [60].
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
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1.9. Cancro de Pulmão
1.9.1. Epidemiologia e Mecanismos Moleculares
O cancro de pulmão é a neoplasia mais comum no mundo desde 1985, sendo que
em 2008 foram diagnosticados cerca de 1,6 milhões de novos casos e a taxa de
mortalidade foi de 18,2%, o que corresponde a 1,4 milhões de mortes [3]. Na Europa, em
2008 foram registados cerca de 391 000 novos casos, originando no mesmo período
cerca de 19,9% do total de mortes por cancro (342 000 mortes) [1]. Em Portugal o
cenário é bastante semelhante, sendo que a taxa de mortaliadade foi de 28,5% o que
corresponde a 2666 mortes por cancro de pulmão, no ano de 2008 [3]. A incidência do
cancro do pulmão é maior nos homens e nos indivíduos mais velhos, sendo
aproximadamente o dobro da taxa de incidência deste tipo de cancro na mulher [1-3]. A
taxa de incidência desta neoplasia na mulher tem vindo a aumentar durante a última
década, devido sobretudo à alteração dos hábitos tabágicos das mulheres [1-3].
A maioria dos países desenvolvidos apresenta um decréscimo nas taxas de
mortalidade devidas a cancro, com excepção para o cancro de pulmão que continua a
aumentar [2]. Tais alterações parecem estar directamente relacionadas com o estilo de
vida dos habitantes dos países desenvolvidos, nomeadamente devido ao consumo de
tabaco [2].
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 20 -
Figura 6. Taxas de incidência anuais do cancro de pulmão por 100 000 individuos, em
ambos os sexos em 2008 [3].
Desde 1954 que está estabelecida a relação directa entre o fumo do tabaco e o
cancro do pulmão [61], e as evidências desta associação são claras: o risco para o
cancro do pulmão aumenta com o número de cigarros fumados, anos de tabagismo, grau
de inalação, a tara e o conteúdo de nicotina e o uso de cigarros sem filtro [61-63].
Os indivíduos fumadores apresentam um risco 10 vezes superior de desenvolver esta
neoplasia do que individuos não fumadores. O fumo do tabaco contém numerosos
agentes procarcinogéneos, como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH) e
benzeno, que após a sua activação, são altamente nocivos para o epitélio respiratório.
Outros factores que poderão contribuir para o aparecimento desta neoplasia
incluem doenças pulmonares anteriores e exposição a agentes carcinogéneos ambientais
[64,65]. No entanto, nem todos os fumadores desenvolvem cancro de pulmão, o que
indica que outros condicionantes podem estar envolvidos no desenvolvimento tumoral.
Diferenças genéticas na capacidade de reparação de ADN e no metabolismo de
0 3.3 10.4 26.8 47.8 80
1. Introdução
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 21 -
carcinogéneos têm sido apontadas como factores importantes na definição de subgrupos
com maior ou menor risco de desenvolver cancro de pulmão [64-67].
O cancro de pulmão apresenta diferentes tipos histológicos, sendo que o cancro de
pulmão de não-pequenas células (CPNPC) representa cerca de 75% da totalidade dos
casos de cancro de pulmão. Dependendo do tipo de célula que lhe dá origem, o
carcinoma do pulmão pode ser classificado como epidermóide, adenocarcinoma,
carcinoma de grandes células, CPNPC misto ou indiferenciado [64]. A avaliação do tipo
histológico do tumor, juntamente com o estadio, aquando do diagnóstico do cancro do
pulmão, é determinante na escolha do tratamento e no prognóstico do doente [68]. O
estadiamento do tumor é feito com base no sistema TNM, proposto pelo American Joint
Committee on Cancer (AJCC) em 1973, que classifica o tumor de acordo com o seu
tamanho e potencial invasivo (T), com o envolvimento de gânglios linfáticos na região (N)
e com a presença ou não de metástases à distância (M) [68-71].
O tratamento do cancro de pulmão é bastante individualizado, variando com o tipo
histológico, localização e extensão do tumor e também com a idade e estado geral do
doente. As opções terapêuticas disponíveis são a cirurgia, a radioterapia e a
quimioterapia, podendo ser aplicadas isoladamente ou como terapia combinada, visando
controlar o desenvolvimento tumoral e a metastização [72].
Numerosas evidências sugerem que a progressão tumoral é condicionada não
apenas por alterações genéticas intrínsecas ao cancro, mas também por factores
epigenéticos e ambientais sendo a inflamação crónica representativa de ambos [73].
Nas últimas décadas, tem sido sugerido que a inflamação e vias relacionadas têm
um papel importante na patogénese do cancro do pulmão [74,75], em particular no
epitélio dos fumadores, embora os mecanismos que conduzem a tal não estejam ainda
esclarecidos [73].
A inflamação envolve um conjunto de respostas do hospedeiro, que incluem o
recrutamento de células específicas do sistema imunológico, a libertação de mediadores
solúveis e interacções entre sistemas de citocinas e os seus receptores. O cancro do
pulmão é um modelo tumoral em que a inflamação crónica associada ao tabagismo se
reveste de especial importância, pelo que a modulação de mediadores imunológicos
pode ser encarada como alvo molecular de estratégias terapêuticas inovadoras contra a
progressão tumoral.
O B J E C T I V O S
2.
2. OObbjjeeccttiivvooss
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 25 -
2.1. Objectivo Geral
Compreender a relevância dos polimorfismos genéticos -590 C/T do gene IL-4 e -
251 A/T do gene IL-8 na susceptibilidade para o desenvolvimento de cancro de pulmão
de não-pequenas células (CPNPC).
2.2. Objectivos Específicos
- Analisar a frequência dos polimorfismos genéticos - IL-4 590C/T e IL-8 -251 A/T
em indivíduos com CPNPC e indivíduos sem doença oncológica conhecida;
- Avaliar a existência de associações entre a frequência dos polimorfismos
estudados e a susceptibilidade para cancro de pulmão;
- Avaliar a associação dos polimorfismos estudados com características clínico-
patológicas dos doentes com CPNPC.
3.
M A T E R I A L
E
M É T O D O
S
3. Material e Métodos
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 29 -
3.1. Caracterização das Amostras
Para a realização deste trabalho experimental, foi realizado um estudo de base
hospitalar do tipo caso-controlo, para o qual foram recrutados 391 doentes do Instituto
Português de Oncologia – Porto (IPO-Porto), caucasianos, com diagnóstico
histopatológico de Cancro de Pulmão (grupo de casos) e 669 indivíduos sem doença
oncológica conhecida, caucasianos, dadores de sangue do IPO-Porto (grupo controlo),
perfazendo um total de 1060 individuos.
Os indivíduos participantes neste estudo (controlos e casos) são residentes na
região Norte de Portugal. Os casos são acompanhados no Instituto Português de
Oncologia Francisco Gentil – Centro Regional de Oncologia do Porto, E.P.E.. As
amostras foram recolhidas após prévio consentimento de todos os indivíduos, de acordo
com a Declaração de Helsínquia.
3.1.1. Doentes com Cancro de Pulmão
Foram analisadas amostras referentes a 391 indivíduos diagnosticados com cancro
de pulmão no Instituto Português de Oncologia Francisco Gentil – Centro Regional de
Oncologia do Porto, E.P.E. com uma idade média de 62,7 anos (desvio padrão de 10,0
anos). Foram avaliados vários parâmetros clínico-patológicos, tais como: estádio e tipo
histológico do tumor, como descrito na tabela 1.
3.1.2. Indivíduos do Grupo Controlo
O grupo de controlo incluiu 669 indivíduos sem qualquer patologia oncológica
conhecida, sendo estes dadores de sangue do Instituto Português de Oncologia
Francisco Gentil – Centro Regional de Oncologia do Porto, E.P.E., com uma idade média
de 48,2 anos (desvio padrão de 9,79 anos), descrito na tabela 1.
3. Material e Métodos
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 30 -
Tabela 1. Características clínico-patológicas do grupo de casos com CPNPC e carcterísticas
gerais do grupo controlo.
Casos
(n=391)
Controlos
(n=669)
n % n % Género
Masculino 311 79,5 269 40.2
Feminino 79 20,2 400 59.8
Sem informação 1 0,3
Total 391 100,0 669 100.0
Idade
Média ± SD 62,7± 10,0 48,2 ± 9,79
Histologia
Epidermóide 149 38,1
Não epidermóide 238 60,9
Sem informação 4 1,00
Total 391 100,0
Estadio
I 41 10,5
II 30 7,7
III 174 44,5
IV 143 36,6
Sem informação 3 0,8
Total 391 100,0
Fumadores
Fumadores e Ex-Fumadores 288 73,7 266 39,8
Não fumadores 101 25,8 351 52,5
Sem informação 2 0,5 52 7,8
Total 391 100,0 669 100,0
3. Material e Métodos
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 31 -
3.2. Processamento das amostras
O ADN genómico utilizado no decorrer do trabalho experimental foi isolado a partir
de células nucleadas de sangue periférico. O isolamento de ADN genómico foi efectuado
segundo o Kit de extracção da Qiagen ®, QIAmp® DNA Blood Mini Kit, (Qiagen® 51106)
executando o procedimento laboratorial fornecido pelo fabricante.
3.3. Genotipagem dos Polimorfismos dos genes IL-4 e IL-8
A caracterização dos polimorfismos em estudo foi realizada recorrendo às técnicas
de PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragment Lenght Polymorphism),
tendo sido utilizadas diferentes condições, para a análise dos diferentes polimorfismos,
as quais estão descritas na tabela 2.
Tabela 2. Descrição dos protocolos de PCR-RFLP dos polimorfismos estudados
Gene Método Sequência de Primers Enzima de
Restrição
Tempo de
incubação ºC Ref.
IL-4
- 590 C/T PCR-RFLP F- 5’- ACT AGG CCT CAC CTG ATA CG– 3’
R- 5’GTT GTA ATG CAG TCC TCC TG – 3’ BsmFI 4 H 65 [30]
IL-8
-251 A/T PCR-RFLP F- 5’- CCA TCA TGA TAG CAT CTG TA– 3’
R- 5’– CCA CAA TTT GGT GAA TTA TTA A- 3’ Ase I 3H 37 [76]
3. Material e Métodos
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 32 -
3.3.1. Polimorfismo -590 C/T no gene IL-4
Para análise do polimorfismo -590 C/T do gene IL-4, amplificou-se um fragmento de
ADN por PCR (Polymerase Chain Reaction) com base no protocolo descrito por Gyan et
al [30].
Submeteram-se a PCR cerca de 20 ng de ADN de cada caso, o que corresponde a
aproximadamente 2 µl de cada amostra.
O volume de reacção foi de 50 µl, e a mistura de reacção incluiu: 5µl de tampão de
reacção de PCR (1x), 1U de Taq ADN Polimerase, 2,5mM de MgCl2 (Go Taq®Flexi DNA
Polymerase #M8305), 0,2mM de dNTPs (dinucleosídeos trifosfato) (Fermentas, #R0192)
e 0,3µM de cada um dos primers.
As condições de amplificação utilizadas foram: pré-desnaturação a 95ºC durante 10
minutos, seguida de 30 ciclos de 50 segundos a 95ºC (desnaturação), 50 segundos a
62ºC (emparelhamento) e 50 segundos a 72ºC (extensão) aos quais se seguiu um passo
final de extensão a 72ºC durante 5 minutos. A reacção foi efectuada num termociclador
programável BioRad®.
Para confirmar a correcta amplificação dos fragmentos de ADN obtidos e o seu
respectivo peso molecular (252 pb), analisaram-se 15 µl do produto de PCR por
electroforese em gel de agarose a 1.5% (p/v), corado com brometo de etídeo (10µg/ml).
Os géis foram preparados em tampão TBE (Anexo I), sendo este também utilizado como
tampão de electroforese. As amostras foram aplicadas no gel e foi utilizado um marcador
molecular de 100pb (Fermentas #SM0243). A visualização dos géis foi efectuada
recorrendo a um transiluminador Gel DocXR, Biorad® (figura 7).
Figura 7. Gel de agarose a 1,5 % (p/v), mostrando a banda de 252 pb que corresponde à
região de IL-4 -590 C/T amplificada por PCR (M- marcador de 100 pb).
252 pb
252 pb
3. Material e Métodos
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 33 -
Para a análise dos genótipos do polimorfismo foram utilizados 10 μl de produto de
PCR de cada amostra para a restrição com 1 unidade da endonuclease BsmFI (New
England Biolabs®, R0572L) num volume final de reacção de 15 μL. As amostras foram
incubadas a 65 ºC, durante 4 horas. O resultado da digestão do fragmento amplificado do
gene IL-4 contendo o locus de interesse foi observado por electroforese em gel de
agarose a 2 % (p/v), corado com brometo de etídeo (10μg/mL).
A digestão do fragmento do gene IL-4 resulta em 3 padrões de bandas, permitindo
identificar os diferentes genótipos do polimorfismo -590 C/T: 192pb e 60pb (não é
possível visualizar) corresponde ao genótipo CC, uma banda de 252 pb corresponde ao
genótipo TT, e um padrão de bandas de 252pb, 192pb e 60pb (não é possível visualizar)
corresponde a um genótipo CT (Figura 8).
Figura 8. Gel de agarose a 2 % (p/v), após PCR- RFLP, observando-se os 3 genótipos
possíveis do polimorfismo IL-4 -590 C/T (M- marcador 100 pb).
252 pb
192 pb
3. Material e Métodos
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 34 -
3.3.2. Polimorfismo -251 A/T no gene IL-8
Para análise do polimorfismo -251 A/T do gene IL-8, amplificou-se um fragmento de
ADN por PCR com base no protocolo descrito por Heinzmann et al. [76].
Submeteram-se a PCR cerca de 20 ng de ADN de cada caso, o que corresponde a
aproximadamente 2 µl de cada amostra.
O volume de reacção foi de 50 µl, e a mistura de reacção incluiu: 5µl de tampão de
reacção de PCR(1x), 1U de Taq ADN Polimerase, 2,5mM de MgCl2 (Go Taq®Flexi DNA
Polymerase #M8305), 0,2 mM de dNTPs (dinucleosídeos trifosfato) (Fermentas, #R0192)
e 0,3µM de cada um dos primers .
As condições de amplificação utilizadas foram: pré-desnaturação a 94ºC durante 5
minutos, seguida de 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC (desnaturação), 55 segundos a
57ºC (emparelhamento) e 60 segundos a 72ºC (extensão) aos quais se seguiu um passo
final de extensão a 72ºC durante 8 minutos. A reacção foi efectuada num termociclador
programável BioRad®. Para confirmar a correcta amplificação dos fragmentos de ADN
obtidos e o seu respectivo peso molecular (173 pb), analisaram-se 15 µl do produto de
PCR por electroforese em gel de agarose a 1.5% (p/v), corado com brometo de etídeo
(10µg/ml). Os géis foram preparados em tampão TBE (Anexo I), sendo este também
utilizado como tampão de electroforese. As amostras foram aplicadas no gel e foi
utilizado um marcador molecular de 100pb (Fermentas #SM0243). A visualização dos
géis foi efectuada recorrendo a um transiluminador Gel DocXR, BioRad.® (figura 9).
Figura 9. Gel de agarose a 1,5 % (p/v), mostrando a banda de 173 pb que corresponde à
região de IL-8 -251 A/T amplificada por PCR (M- marcador de 50 pb).
M
173 pb
3. Material e Métodos
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 35 -
Para a análise do polimorfismo no gene IL-8 foram utilizados 10 μL de produto de
PCR de cada amostra para a restrição com a endonuclease AseI (New England Biolabs®,
R0526S) num volume final de reacção de 15 μL. As amostras foram incubadas a 37 ºC,
durante 3 horas. O resultado da digestão do fragmento amplificado do gene IL-8
contendo o locus de interesse foi observado por electroforese em gel de agarose a 2%
(p/v), corado com brometo de etídeo (10μg/mL).
A digestão do fragmento do gene IL-8 resulta em 3 padrões de bandas, permitindo
identificar os diferentes genótipos do polimorfismo -251A/T: 152pb e 21pb (não é possível
visualizar) corresponde ao genótipo AA, uma banda de 173 pb corresponde ao genótipo
TT, e um padrão de duas bandas de pesos moleculares de 173pb, 152pb e 21pb (não é
possível visualizar) corresponde ao genótipo AT (figura 10).
Figura 10. Gel de agarose a 2 % (p/v), após PCR- RFLP, observando-se os 3 genótipos
possíveis do polimorfismo IL-8 -251 A/T (M- marcador 100 pb).
AA
173 pb
152 pb
3. Material e Métodos
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 36 -
3.4. Análise estatística
A análise estatística dos resultados foi realizada com o auxílio do programa
estatístico SPSS (versão 15.0, SPSS Inc, 2004).
A análise pelo teste Qui-Quadrado (χ2) foi utilizada para comparação das diferentes
variáveis categóricas. O valor de p foi obtido pelo teste de χ2 e considerado
estatísticamente significativo quando inferior a 0,05.
O valor de Odds Ratio (OR) indica o risco relativo para determinado acontecimento
num estudo do tipo caso-controlo, e foi calculado juntamente com o intervalo de
confiança de 95% (IC 95%) para medir a associação entre os genótipos de IL-4, IL-8 e o
risco para cancro da pulmão.
Foi realizada uma análise de regressão logística multivariada para calcular o Odds
Ratio ajustado (aOR) e respectivo IC95% para a influência das variantes genéticas no
risco para o desenvolvimento de CPNPC, ajustado para possíveis variáveis de
confundimento.
.
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 37 -
4.
R E S U L T A D O
S
4. RReessuullttaaddooss
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 39 -
4.1. Associação do Polimorfismo -590 C/T no gene IL-4 na susceptibilidade
de Cancro de Pulmão (CPNPC)
A distribuição das frequências dos vários genótipos do polimorfismo -590 C/T do
gene da IL-4 (CC, CT e TT) no grupo controlo e no grupo de casos com CPNPC está
descrita na tabela 3.
Relativamente ao grupo controlo, dos 669 indivíduos incluídos neste estudo, 67,9%
apresenta genótipo CC, 24,7% genótipo CT e 7,5% genótipo TT. Estas frequências estão
de acordo com outros estudos em populações saudáveis [38,45,46].
No grupo dos casos com CPNPC, foram incluídos no estudo 321 indivíduos e
obtiveram-se frequências de 65,4% para o genótipo CC, 29,6% para o genótipo CT e
5,0% para o genótipo TT.
Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre o grupo de casos e
o grupo controlo, tendo em conta os vários genótipos do polimorfismo.
Tabela 3: Frequências genotípicas do polimorfismo -590 C/T IL-4 nos grupos controlo e CPNPC.
p- valor de p obtido pelo teste de χ2; OR- odds ratio; IC 95%- intervalo de confiança a 95%
IL-4 590 C/T
n (%)
Controlos (n=669)
CPNPC (n=321)
OR IC 95% P
Genótipo
CC 454 (67,9) 210 (65,4) 1,00 referência -
CT 165 (24,7) 95 (29,6) 1,245 0,921-1,682 0,153
TT 50 (7,5) 16 (5,0) 0,692 0,385-1,243 0,216
4. RReessuullttaaddooss
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 40 -
As frequências genotípicas do polimorfismo -590 C/T do gene IL-4 no grupo
controlo, nos grupos de pacientes com CPNPC e resultados da análise estatística
atendendo ao genótipo de alta e baixa expressão, TT e CC, respectivamente, estão
descritos na tabela 4.
Através da análise dos resultados observou-se que os indivíduos portadores do
genótipo TT apresentam uma protecção de aproximadamente 78% para o
desenvolvimento de CPNPC do tipo histológico epidermóide (OR=0,221; IC95%= 0,053-
0,928; P=0,024), quando comparados com os indíviduos do grupo controlo.
Considerando os tipos histológicos não-epidermoides, não foram verificadas diferenças
estatisticamente significativas na distribuição dos genótipos do polimorfismo entre o
grupo controlo e os grupos de pacientes com CPNPC (OR= 1,017; IC95%= 0,544-1,900;
P=0,958).
Tabela 4: Distribuição das frequências de alta e baixa expressão, TT e CC, respectivamente, do
polimorfismo -590 C/T IL-4 no grupo controlo e em doentes com CPNPC de acordo com o tipo
histológico.
p- valor de p obtido pelo teste de χ2; OR- odds ratio; IC 95%- intervalo de confiança a 95%
IL-4 -590C/T
n (%) OR 95% IC P
CC TT
Controlos (n=504)
454 (90,1)
50 (9,9)
1,00
referência
-
Epidermóides (n=84) 82 (97,6) 2 (2,4) 0,221 0,053-0,928 0,024
Não epidermóides (n=139) 125 (89,9) 14 (10,1) 1,017 0,544-1,900 0,958
4. RReessuullttaaddooss
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 41 -
Dada a relevância do fumo de tabaco na carcinogénese do pulmão, foi realizada
uma análise ajustada para o tabaco e também para o género.
Esta análise foi dividida por tipo histológico, visto ter sido encontrada uma forte
associação estatística no tipo histológico epidermóide.
Para os casos do tipo histológico epidermóide, esta análise mostra que o
polimorfismo -590 C/T IL-4 genótipo de “alta expressão” TT, continua a ter uma grande
relevância, uma vez que este polimorfismo ajustado às variaveis referidas mantém uma
significativa associação estatística, sendo ainda reforçada (aOR= 0,184; IC 95%= 0,042-
0,804; P*= 0,024) (tabela 5). A análise multivariada demonstra que indivíduos portadores
do genótipo de “alta expressão” de gene da IL-4 (TT), sendo fumadores e do género
masculino, apresentam uma protecção para o desenvolvimento de CPNPC do tipo
epidermóide.
Tabela 5: Análise multivariada ajustada para o tabaco e género, nos casos do tipo histológico
epidermóide
P*, aOR e 95%IC é calculado usando regressão logística
P* aOR IC 95%
IL-4 “alta expressão” TT 0,024 0,184 0,042-0,804
Tabaco <0,0001 9,680 4,673-20,052
Género <0,0001 6,080 2,532- 14,602
4. RReessuullttaaddooss
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
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Na tabela 6 estão descritos os resultados da análise multivariada ajustada para o
tabaco e género nos casos com tipo histológico não epidermóide. Estes resultados
mostram que somente a variável tabaco tem importância no desenvolvimento desta
neoplasia (OR= 2,354; IC95%=1,563-3,544; P<0,0001) e que as restantes váriaveis,
nomeadamente o genótipo de “alta expressão” TT não apresenta associação
estatisticamente significativa (OR= 0,940; IC95%= 0,495-1,787; P=0,851).
Tabela 6: Análise multivariada ajustada para o tabaco e género, nos casos do tipo histológico não
epidermóide.
P*, aOR e 95%IC é calculado usando regressão logística
P* aOR IC 95%
IL-4 “alta expressão” TT 0,851 0,940 0,495-1,787
Tabaco <0,0001 2,354 1,563-3,544
Género 0,267 1,279 0,828-1,976
4. RReessuullttaaddooss
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 43 -
4.2. Associação do Polimorfismo -251 A/T no gene IL-8 na susceptibiliade
de Cancro de Pulmão (CPNPC)
A distribuição dos genótipos do polimorfismo -251 A/T do gene IL-8 (AA, AT e TT),
no grupo controlo e no grupo de casos com CPNPC encontram-se descritos na tabela 7.
As frequências dos genótipos AA, AT e TT observadas no grupo controlo
constituído por 476 indivíduos, foram 6,3%, 49,3% e 22,9% respectivamente. Nos 346
casos analisados, obtiveram-se frequências de 8,7% para o genótipo AA, 53,7% para o
genótipo AT e 26,1% para o genótipo TT.
Não se observaram diferenças estatisticamente significativas na distribuição dos
genótipos entre o grupo controlo e o grupo de casos.
As frequências genotípicas do polimorfismo em estudo no grupo controlo e no
grupo de doentes com CPNPC, tendo em conta os genótipos (AT+AA e TT), modelo
recessivo, encontram-se descritas na tabela 7. Os resultados mostram que no grupo
controlo, 29,0% apresenta um genótipo TT e que 71,0% têm genótipos portadores do
alelo A. No grupo de casos, são portadores do genótipo TT 29,5 % e portadores do alelo
A, 70,5% dos indivíduos. No entanto, não se verificaram associações estatisticamente
significativas entre os grupos tendo em conta os genótipos do polimorfismo no gene da
IL-8 (OR=0,977; IC95%= 0,720-1,340; P= 0,879)
4. RReessuullttaaddooss
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
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Tabela 7: Frequências genotípicas do polimorfismo -251A/T IL-8 nos grupos controlo e CPNPC.
p- valor de p obtido pelo teste de χ2; OR- odds ratio; IC 95%- intervalo de confiança a 95%
De forma a avaliar a influência deste polimorfismo nos diferentes tipos histológicos,
foi realizada uma análise estratificada por tipo histológico. Os resultados encontram-se
descritos na tabela 8.
No grupo controlo foram analisados 476 indivíduos, dos quais 29,0% apresentavam
genótipo TT e 71,0% tinham genótipos portadores do alelo A. No grupo dos casos com
CPNPC, foram incluídos nesta análise 342 casos, dos quais 132 eram do tipo histológico
epidermóide e 210 eram não-epidermóide. Relativamente ao tipo histológico
epidermóide, 29,5% apresentam genótipo TT e 70,5% eram portadores do alelo A. Não
foram encontradas associações estatísticamente significativas para estes casos, em
comparação com os controlos, atendendo aos genótipos do polimorfismo (OR= 0,974;
IC95%=0,638-1,486; P=0,901).
Em relação ao indivíduos do tipo histológico não epidermóide, 29,5% apresentavam
genótipo TT, e 70,5% eram portadores de genótipos como o alelo A. Também neste
subgrupo não foram encontradas associações estatisticamente significativas nas
frequências dos genótipos do polimorfismo entre o grupo de casos e o grupo controlo.
(OR=0,975; IC95%=0,682-1,392; P=0,888).
IL-8-251 A/T
n (%) OR IC 95% P
Controlos
(n=476)
CPNPC
(n=346)
Genótipos
TT 138 (29,0) 102 (29,5) 1,00 referência -
AT 300 (63,0) 210 (60,7) 0,95 0,69-1,31 0,73
AA 38 (7,9) 34 (9,8) 1,21 0,69-2,12 0,48
Modelo Recessivo
TT 138 (29,0) 102 (29,5) 1,00 referência -
Portador A 338 (71,0) 244 (70,5) 0,977 0,720-1,340 0,879
4. RReessuullttaaddooss
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
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Tabela 8: Distribuição das frequências do genótipo TT e portador A, respectivamente do
polimorfismo -251 A/T IL-8 no grupo controlo e no grupo de casos com CPNPC, de acordo com o
tipo histológico.
p- valor de p obtido pelo teste de χ2; OR- odds ratio; IC 95%- intervalo de confiança a 95%
IL-8 -251 A/T
n (%) OR 95% IC P
TT Portador A
Controlos (n=476)
138 (29,0)
338 (71,0)
1,00
referência
-
Epidermóides (n=132) 39 (29,5) 93(70,5) 0,974 0,638-1,486 0,901
Não epidermóides (n=210) 62 (29,5) 148 (70,5) 0,975 0,682-1,392 0,888
5.
D I S C U S S Ã
O
- 48 -
5. DDiissccuussssããoo
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 49 -
No decorrer dos últimos anos, os avanços alcançados pela investigação na área da
oncologia permitiram definir o cancro como uma doença complexa, que envolve
alterações dinâmicas do genoma, destacando a importância da componente genética na
sua etiologia.
Os tumores sólidos compreendem, para além de células malignas, vários tipos de
células não malignas, o que lhes confere um microambiente que pode modificar as
propriedades neoplásicas das células tumorais [77]. Grande parte da investigação em
oncologia tem-se centrado nas células malignas que constituem o tumor. A explicação
para este facto prende-se, provavelmente, com o sucesso dos estudos que definiram a
necessidade de vários eventos mutagénicos nas células epiteliais para a formação de
tumores malignos, no isolamento de oncogenes cuja expressão restrita ao epitélio
provoca cancro, e na concordância entre os resultados experimentais e estudos
epidemiológicos que indicam que múltiplos eventos são necessários para a aquisição, por
parte das células, de um fenótipo de malignidade [78]. Apesar dos progressos
alcançados no sentido da definição molecular das alterações genéticas intrínsecas que
ocorrem nas células malignas, tornou-se claro que os tumores são uma rede intrincada
de diferentes tipos de células e que a manifestação plena do potencial maligno das
células epiteliais transformadas requer um suporte estrutural apropriado por parte do
estroma do tumor [79]. Este é complexo, sofre alterações constantes e depende do local
onde o tumor tem origem [80]. Pode consistir em fibroblastos residentes, adipócitos,
vasos sanguíneos e linfáticos e pode conter infiltrados de diversos leucócitos
[21,77,79,80]. Estudos recentes demonstram que todos estes tipos de células podem
influenciar a progressão tumoral a vários níveis, dependendo do tipo de tumor [77,79].
Durante o desenvolvimento tumoral ocorrem alterações em importantes processos
celulares. A resposta imunológica é um desses processos, que poderá estar afectado
quando se inicia o processo de carcinógenese, podendo existir uma sobre ou sub
expressão das células que regulam este sistema [77]. Paralelamente às alterações
genéticas somáticas que as células adquirem durante a transformação neoplásica, a
variabilidade genética do hospedeiro, nomeadamente em genes-alvo especificos,
também contribui e influencia todo o desenvolvimento tumoral [15].
5. DDiissccuussssããoo
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 50 -
A IL-4 e a IL-8 são citocinas importantes na resposta inflamátoria. Em situações
fisiológicas estas duas interleucinas encontram-se em equilíbrio, existindo um balanço
entre uma resposta Th1 e uma resposta Th2. Em situações em que exista algum tipo de
stress, a expressão destas moléculas pode sofrer alterações de forma a manter a
homeostasia entre as respostas imunológicas [81]. Neste sentido, polimorfismos
funcionais como o -590 C/T e -251 A/T nos genes IL-4 e IL-8, que induzem alterações no
perfil de expressão de IL-4 e IL-8, respectivamente, podem ser considerados importantes
na definição de um perfil de susceptibilidade associado ao desenvolvimento tumoral, de
CPNPC.
O objectivo deste trabalho consistiu na avaliação da frequência genotípica dos
polimorfismos -590 C/T do gene da IL-4 e -251 A/T do gene da IL-8 na população
controlo e em indivíduos com cancro do pulmão e avaliar a existência de associações
entre a frequência dos polimorfismos estudados e a susceptibilidade para o
desenvolvimento de CPNPC.
5. DDiissccuussssããoo
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 51 -
5.1. Influência do polimorfismo -590 C/T da IL-4 na susceptibilidade para
o desenvolvimento de CPNPC
Durante décadas, o objectivo da investigação na área da oncologia era tentar
explicar alterações genéticas e fenotípicas nas células tumorais, numa tentativa de
compreender a essência desta doença [77]. Actualmente, tornou-se claro que é
imprescindível a análise do estroma tumoral, como uma parte crucial no esclarecimento
dos mecanismos neoplásicos [77]. Durante a progressão de uma neoplasia ocorrem
eventos em que as células tumorais apresentam a capacidade de modular as células do
tecido residente, de forma a induzirem uma resposta inflamatória para permitir o
recrutamento de células do estroma que são essenciais para a progressão neoplásica
[77]. O estroma tumoral é constituído por uma mistura de vários tipos celulares e diversos
factores de crescimento bem como matriz extracelular, que são essenciais para a
sustentação e manutenção dos tecidos [77].
As citocinas têm a capacidade de influenciar o crescimento, a sobrevivência e a
eliminação das células neoplásicas e esta pode ser uma influência negativa ou positiva,
dependendo da interacção entre a resposta imunológica inata e a adquirida [42].
A IL-4 é uma citocina pleitrópica que exerce a sua actividade biológica em diversas
células [82]. Esta citocina apresenta a capacidade de modular a diferenciação de células
T naíve em células Th2 [42].
Recentemente, foi demonstrado quer in vivo, quer in vitro, que a IL-4 apresenta
uma importante actividade anti-tumoral em vários modelos tumorais [82]. Esta citocina é
expressa no microambiente de alguns tumores, local onde existem também [42]. Os
leucócitos que se encontram no estroma tumoral têm a capacidade de produzir leucócitos
infiltrados altos níveis de IL-4 e baixos níveis de IFN-γ, o que conduz a uma diferenciação
em células Th1 menos eficaz, favorecendo a diferenciação Th2 [42,83].
A IL-4 desempenha um papel fulcral na inibição da diferenciação de macrófagos
induzida por citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1 e IL-8) [84], pelo que é considerada
um mediador chave, juntamente com a IL-10, na inibição de respostas mediadas por
células Th1, promovendo a resposta Th2. Assim, tumores que expressam IL-4 e IL-10,
incluindo os do pulmão, apresentam um favorecimento da resposta Th2 em relação a Th1
[84,85].
5. DDiissccuussssããoo
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 52 -
Sendo a IL-4 é uma citocina multifuncional, desempenha um papel ambíguo na
carcinogénese, comportando-se em algumas situações como citoquina inibitória do
desenvolvimento tumoral, efeito verificado em linhas celulares de cancro da mama,
gástrico, rim e colo-rectal. No entanto, noutras situações pode ser considerada um
estímulo para o desenvolvimento tumoral como se verifica nos tumores da cabeça e
pescoço [37,38]. Atendendo a este papel paradoxal da IL-4 no desenvolvimento tumoral,
Li e colaboradores [86], propuseram uma distinção, atendendo ao tipo de expressão
desta proteína, em dois grupos: exógena e endógena, sendo que a IL-4 endógena se
refere à molécula de IL-4 que é gerada sem a intervenção humana, quer em processos
fisiológicos, quer patológicos. A IL-4 endógena é usualmente produzida por células T,
basófilos, mastócitos e a sua produção é estritamente regulada por interação de sinais,
de forma a regular a homeostasia do sistema imune [86]. Em contraste, a IL-4 exógena
pode ser distribuída de forma sistémica como proteína recombinante no hospedeiro, ou
localmente pelo gene modificado por células tumorais [86]. Contudo, as condições
fisiológicas do microambiente tumoral podem condicionar a forma de actuação da IL-4
[42] (Figura 11).
Figura 11. Efeito paradoxal da IL-4 no controlo da progressão tumoral atendendo ao micro-
ambiente do tumor [42].
5. DDiissccuussssããoo
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 53 -
A progressão tumoral é estritamente dependente da angiogénese, observando-se
uma elevada contribuição das células que compõem o sistema imunológico para este
processo, facilitando o crescimento da neoplasia [80]. O tumor, para conseguir evoluir,
tem que ser capaz de induzir modificações no estroma do tecido residente, sendo o
aumento do número de fibroblastos do tecido uma modificação essencial ao
desenvolvimento tumoral [80].
Os fibroblastos são as principais células constituintes de um tecido, e as suas
principais funções incluem a deposição da matriz extracelular, regulação da diferenciação
do epitélio, regulação de alguns mecanismos associados à inflamação e encontram-se
também envolvidos no processo de cicatrização [80]. Além destas funções, os
fibroblastos são responsáveis pela síntese da maioria dos constituintes da matriz
extracelular, como o colagénio do tipo I, II, III e IV e a fibronectina. Os fibroblastos são
também uma importante fonte de proteases responsáveis pela degradação da matriz
extracelular, as MMP’s, enzimas essas importantes na manutenção da homeostasia dos
tecidos [80].
No início do crescimento tumoral, as células que formam a lesão neoplásica estão
envolvidas por um microambiente que é facultado pelo tecido residente. Com o decorrer
do desenvolvimento tumoral, as células do sistema imunológico, vasos sanguíneos,
fibroblastos e matriz extracelular constituem o estroma tumoral [80].
O estroma normal da maioria dos orgãos contém um número mínimo de
fibroblastos associados com a fisiologia da matriz extracelular. No entanto, no caso de
um estroma reactivo, este é associado ao aumento do número de fibroblastos, ao reforço
da densidade de vasos sanguíneos e ao aumento do depósito de colagénio do tipo I e de
fibrina [80].
Os fibroblastos associados ao estroma tumoral adquirem um fenótipo modificado,
que se torna semelhante ao do processo de cicatrização. Os fibroblastos “activados”,
incluídos no estroma tumoral, são designados de fibroblastos reactivos ou fibroblastos
associados a tumores [80]. Este tipo de fibroblastos apresenta a capacidade de promover
a progressão tumoral, uma vez que são capazes que recrutar factores essenciais ao
desenvolvimento do tumor (VEGF, TGF-β) [80]. Os fibroblastos associados a tumores são
pró-angiogénicos, quer actuando via promoção da expressão de VEGF quer pela
produção de fibrina e colagénio, permitindo o desenvolvimento de novos vasos [80].
5. DDiissccuussssããoo
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 54 -
A IL-4 é considerada uma citocina pleiotrópica e crucial como modulador do sistema
imune, tendo sido associada ao processo de angiogénese [87]. Os fibroblastos
associados a tumores são constantemente descritos como indutores da progressão e
crescimento tumorais. Contudo, um estudo de Blankestein e colaboradores, mostrou que
este tipo de fibroblastos pode condicionar a eliminação do tumor [88]. Este autor
demonstrou que a IL-4 é capaz de modular a activação dos fibroblastos e desta forma
este tipo de células não consegue auxiliar a formação de novos vasos sanguíneos, uma
vez que perde a sua capacidade reactiva [88]. O processo de angiogénese é fundamental
para o desenvolvimento tumoral, e uma vez condicionado, poderá limitar o
desenvolvimento de uma determinada neoplasia. Atendendo ao facto da IL-4 apresentar
a capacidade de modular a activação dos fibroblastos associados a tumores e de estes
serem fundamentais para o desenvolvimento da neoangiogénese, pode presumir-se que
a IL-4 condiciona a neovascularização. Desta forma, a relação da IL-4 com a
angiogénese pode constituir um mecanismo indirecto de eliminação do tumor, uma vez
que a estrutura do estroma tumoral será danificada, em consequência da perda de
capacidade de proliferação e disseminação que as células neoplásicas sofrem [42].
O microambiente de alguns tumores, incluindo cancro de pulmão, apresenta uma
sobrexpressão de algumas enzimas essenciais para o seu desenvolvimento, sendo a
COX-2 uma dessas enzimas. Esta enzima é descrita em inúmeros estudos
farmacológicos, biológicos e genéticos como uma enzima relacionada com a
tumorigénese [85].
Nas células não neoplásicas, como monócitos e neutrófilos, a IL-4 e IL-10 têm a
capacidade de inibir a expressão de COX-2. Nas células neoplásicas esta inibição por
parte da IL-10 é suprimida. Contudo, foi descrito que nas células de CPNPC a IL-4
continua a manter a capacidade de inibir a produção de COX-2 [85]. Este facto contribui
para a diminuição da progressão tumoral condicionando uma possível redução e/ou
eliminação do tumor [85].
Em virtude da relevância da IL-4 no desenvolvimento tumoral, o estudo desta
molécula reveste-se de especial importância na compreensão dos mecanismos
imunológicos subjacentes ao desenvolvimento tumoral. Desta forma, um dos objectivos
em que se centrava este trabalho era a análise da frequência do polimorfismo -590C/T do
gene IL-4 em indivíduos sem qualquer patologia oncológica conhecida e em doentes com
CPNPC e na avaliação de possíveis associações entre as frequências observadas do
polimorfismo em estudo e a susceptilidade para o desenvolvimento de CPNPC.
5. DDiissccuussssããoo
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 55 -
As frequências encontradas para o polimorfismo -590 C/T IL-4 foram 67,9%, 24,7%
e 7,5% para os genótipos CC, CT e TT, respectivamente, no grupo controlo e 65,4%,
29,6% e 5,0% para os genótipos CC, CT e TT respectivamente, no grupo de casos com
CPNPC. Estas frequências encontram-se em concordância com outros estudos em
populações caucasianas [37,44]. Uma vez que o alelo T deste polimorfismo promove uma
maior expressão da proteína, foi realizada a análise estatistica atendendo ao nível de
expressão, ou seja, considerando o genótipo TT como “alta expressão” e de “baixa
expressão” o genótipo CC. Atendendo a esta estratificação, foi possível verificar que os
indivíduos portadores do genótipo de “alta expressão” apresentam uma protecção para o
desenvolvimento de CPNPC do tipo histológico epidermóide (OR=0,221; IC95%=0,053-
0,928; P=0,024), quando comparados com indivíduos portadores do genótipo de “baixa
expressão” CC.
Os resultados obtidos indicam a existência de uma associação entre o genótipo TT
e o desenvolvimento de CPNPC epidermóide. Indivíduos portadores do genótipo de alta
expressão apresentam uma protecção de cerca de 78% para o desenvolvimento da
neoplasia, quando comparados com os portadores do genótipo CC. Deste modo,
indivíduos portadores de um fenótipo de alta expressão de IL-4 apresentarão uma maior
expressão desta citocina, o que poderá contribuir para uma diminuição da
neoangiogénese e consequentemente um menor risco para o desenvolvimento de
CPNPC. Estes resultados vêm de encontro ao que se conhece sobre o papel
desempenhado pela IL-4 na progressão tumoral: maior expressão desta interleucina pode
influenciar negativamente a neoangiogénese e inibir a expressão de COX-2,
condicionando desta forma o crescimento do tumor.
.
5. DDiissccuussssããoo
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 56 -
5.2. Influência do polimorfismo -251 A/T da IL-8 na susceptibilidade para
o desenvolvimento de CPNPC
Nos últimos anos a evolução do conhecimento na área da investigação oncológica
tem demonstrado que a inflamação apresenta um papel importante e complexo na
iniciação e promoção tumorais [89]. A interação entre o sistema imunológico e a
inflamação pode ser uma condicionante para o desenvolvimento tumoral, uma vez que
quando o sistema imunológico apresenta uma resposta inflamatória aguda, a inflamação
é auto-limitada [89]. Neste caso a produção de citocinas pro-inflamatórias, ou citocinas
Th1, é seguida pelas citocinas anti-inflamatórias, ou citocinas Th2 e o equilibrio entre os
dois tipos de respostas é mantido e a inflamação é controlada [89]. Por outro lado,
quando existe uma situação de inflamação crónica o balanço entre citocinas Th1 e Th2
não é conseguido, prolongando-se a inflamação, o que pode conduzir a uma elevada
produção de radicais de oxigénio ou de azoto [89].
Na literatura está descrito que a IL-8 é produzida por várias populações celulares
(células não neoplásicas e/ou células neoplásicas) [56,90]. A produção desta citocina
pode ser induzida por diversos estímulos, como IL-1, TNF-α e algumas células tumorais
que expressam constitutivamente IL-8 [55,56].
Ao nível das células tumorais, a expressão de IL-8 pode ser condicionada
significativamente por diversos factores como a hipóxia, acidose, óxido nítrico (NO) e
densidade celular [55,56].
Relativamente ao NO, este é um potente agente mediador de actividades
biológicas, incluindo vasodilatação, neurotransmissão e outras actividades mediadas pelo
sistema imune [56].
Estudos recentes indicam que o NO é um importante modulador da expressão da
IL-8, provocando um aumento da produção desta citocina por um aumento da actividade
do respectivo promotor [56]. Alguns estudos indicam que a IL-8 é predominantemente
expressa em locais onde as células tumorais se encontram rodeadas de áreas
necróticas, que surgem em locais de hipóxia do tumor, sugerindo que o estado de hipóxia
condiciona a expressão de IL-8 levando a uma sobrexpressão desta citocina [56], tal
como se verifica com o aumento de NO.
5. DDiissccuussssããoo
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 57 -
A IL-8 tem como função fisiológica primária a quimiotaxia de leucócitos (neutrófilos
e macrófagos) [56]. A sobrexpressão de IL-8 pelas células tumorais pode condicionar o
aumento do infiltrado leucocitário tumoral facilitando a produção de vários tipos de
factores de crescimento (EGF) e factores angiogénicos (VEGF), que em larga escala
promovem a rápida expansão da massa tumoral [56].
Atendendo às funções da IL-8 num ambiente inflamatório e à sua importância no
processo de carcinogénese, esta citocina torna-se uma molécula relevante na elucidação
dos processos imunológicos relacionados com a carcinogénese [56].
Um dos objectivos deste estudo consistia na análise da frequência do polimorfismo
-251 A/T do gene IL-8 em indivíduos sem qualquer patologia e em doentes com cancro
de pulmão de não-pequenas células e na avaliação da existência de associações entre a
frequência do polimorfismo estudado e a susceptibilidade para o desenvolvimento de
CPNPC.Este é o primeiro estudo que associa este polimorfismo ao desenvolvimento de
cancro de pulmão.
O polimorfismo -251 A/T promove a sobrexpressão da citocina IL-8 em indivíduos
portadores do alelo A [58,91]. Este aumento traduz-se num aumento do recrutamento de
leucócitos, nomeadamento neutrófilos e macrófagos, o que permitirá uma rápida
dissiminação de factores de crescimento[56].
Relativamente às frequências genotípicas do polimorfismo - 251 A/T do gene IL-8,
no nosso estudo as frequências encontradas foram 22,9%, 49,8% e 6,3 %
respectivamente para os genótipos TT, CT, AA no grupo dos individuos controlo. No
grupo de doentes com CPNPC as frequências observadas foram 26,1 %, 53,7% e 8,7%
respectivamente para os genótipos TT, AT e AA. Na análise estatística segundo o
modelo recessivo TT vs portador A, no presente estudo não se observam diferenças
estatísticamente significativas entre os dois grupos, casos e controlos (OR=0,997;
IC95%=0,720-1,340;P=0,879).
6.
P E R S P E C T I V A S
F U T U R A
S
C O N C L U S Ã
O
E
6. CCoonncclluussããoo ee PPeerrssppeeccttiivvaass FFuuttuurraass
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 61 -
As citocinas, intermediários cruciais do sistema imunológico, têm sido relacionadas
com aspectos fundamentais do desenvolvimento tumoral, ao nível do tumor, do seu
microambiente e ao nível do hospedeiro. Assim, as citocinas IL-4 e IL-8, importantes
mediadores da inflamação, tornam-se alvos de estudo bastante aliciantes na investigação
oncológica. A actuação destas citocinas, que condicionam processos inflamatórios,
parece estar envolvida no desenvolvimento de cancro de pulmão de não pequenas
células.
A análise de polimorfismos funcionais poderá contribuir para a caracterização da
susceptibilidade individual para o desenvolvimento de cancro. Desta forma, variantes
genéticas funcionais nos genes das interleucinas IL-4 e IL-8 poderão influenciar o
processo de carcinogénese e o desenvolvimento de cancro de pulmão. A definição de
grupos de indivíduos com maior susceptibilidade para o desenvolvimento desta neoplasia
poderá contribuir para um diagnóstico mais precoce.
Os polimorfismos -590 C/T IL-4 e -251 A/T IL-8 surgem na literatura associados a
uma maior expressão destas duas moléculas, o que condicionará uma maior
biodisponibilidade das respectivas proteínas. De acordo com os resultados obtidos, o
polimorfismo funcional -590 C/T IL-4 parece influenciar a susceptibilidade para o
desenvolvimento de CPNPC. Este polimorfismo, segundo os resultados do presente
estudo, confere uma protecção aos indivíduos portadores do genótipo de “alta expressão”
para o desenvolvimento de CPNPC do tipo histológico epidermóide. No entanto, o
polimorfismo -251 A/T IL-8, de acordo com os resultados deste estudo, não parece estar
associado ao desenvolvimento de cancro de pulmão na população alvo do estudo.
Estudos posteriores passarão pela replicação do presente estudo numa
amostragem maior de casos e controlos, de forma a confirmar estes resultados, devendo
incluir uma variante funcional, como a realização de ensaios de ELISA, para
quantificação da expressão de IL-4 e IL-8 no soro dos doentes com CPNPC e em
indivíduos saudáveis, relacionando-os com os diversos genótipos dos polimorfismos em
estudo.
Atendendo ao papel central que as moléculas em estudo desempenham no
microambiente tumoral, a quantificação dos seus níveis de expressão no tecido tumoral
reveste-se de especial importância para a elucidação dos mecanismos envolvidos na
progressão do tumor. Assim, estudos futuros passarão pela realização da quantificação
da expressão de IL-4 e IL-8 por imunocitoquímica em amostras de tecido tumoral de
doentes com CPNPC.
6. CCoonncclluussããoo ee PPeerrssppeeccttiivvaass FFuuttuurraass
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 62 -
Dado que a inflamação e vias relacionadas podem condicionar o desenvolvimento
de várias neoplasias, é importante relacionar estas variantes genéticas funcionais com o
desenvolvimento de outras neoplasias malignas, bem como envolver no estudo outras
citocinas e moléculas chave dos processos inflamatórios com capacidade de modular a
expressão das proteínas em estudo.
A imunoterapia é uma abordagem promissora para o desenvolvimento de terapias
integradas contra o cancro. Em combinação com estratégias como a cirurgia,
quimioterapia ou a radioterapia, a imunoterapia pode constituir um ataque eficiente à
sobrevivência residual do tumor. Literatura recente indica que as citocinas, quimiocinas e
os seus receptores, possam ser alvos terapêuticos aliciantes em terapias adjuvantes,
como é o caso da imunoterapia [92]. Neste sentido, o conhecimento aprofundado sobre
mecanismos e vias de actuação de mediadores da inflamação como IL-4 e IL-8 reveste-
se de particular interesse no contexto da definição de potenciais candidatos a inclusão
em novas estratégias de imunoterapia.
Um dos objectivos futuros passa pelo alargamento do presente trabalho a uma
perspectiva farmacogenómica, com o intuito de avaliar o papel dos polimorfismos que
foram alvos deste estudo na resposta à terapia.
Um melhor conhecimento da interacção das moléculas do sistema imune com o
tumor permitirá uma melhor avaliação do comportamento do tumor, podendo contribuir
para a definição de grupos de indivíduos com maior susceptibilidade para o
desenvolvimento de determinada neoplasia. A continuação deste trabalho será
fundamental para a elucidação do papel desempenhado pelos genes IL-4 e IL-8 não
apenas no cancro do pulmão, como também em outras neoplasias malignas.
R E F E R Ê N C I A
S
7.
77.. RReeffeerrêênncciiaass
Polimorfismos nos genes IL-4 e I-8 e Cancro de Pulmão
- 65 -
1. Ferlay, J., Parkin, D.M. and Steliarova-Foucher, E. Estimates of cancer incidence
and mortality in Europe in 2008. Eur J Cancer, 46, 765-781.
2. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Murray, T. and Thun, M.J. (2008)
Cancer statistics, 2008. CA Cancer J Clin, 58, 71-96.
3. Ferlay, J., Shin, H.R., Bray, F., Forman, D., Mathers, C. and Parkin, D.M.
Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J
Cancer.
4. Coussens, L.M. and Werb, Z. (2002) Inflammation and cancer. Nature, 420, 860-
867.
5. Herbst, R.S., Bajorin, D.F., Bleiberg, H., Blum, D., Hao, D., Johnson, B.E., Ozols,
R.F., Demetri, G.D., Ganz, P.A., Kris, M.G. et al. (2006) Clinical Cancer Advances
2005: major research advances in cancer treatment, prevention, and screening--a
report from the American Society of Clinical Oncology. J Clin Oncol, 24, 190-205.
6. Loeb, L.A. (1989) Endogenous carcinogenesis: molecular oncology into the
twenty-first century--presidential address. Cancer Res, 49, 5489-5496.
7. Ames, B.N. and Gold, L.S. (2000) Paracelsus to parascience: the environmental
cancer distraction. Mutat Res, 447, 3-13.
8. Hanahan, D. and Weinberg, R.A. (2000) The hallmarks of cancer. Cell, 100, 57-70.
9. Vicent, T., De Vita, J., Hellman, S., Rosenberg, S.A.,. (2001) Cancer: Principles
and Practice of Oncology. 6 th edition ed. Lippincott Willians & Willians.
10. Brennan, P. (2002) Gene-environment interaction and aetiology of cancer: what
does it mean and how can we measure it? Carcinogenesis, 23, 381-387.
11. Weber, B.L. (2002) Cancer genomics. Cancer Cell, 1, 37-47.
12. Chakravarti, A. (2001) To a future of genetic medicine. Nature, 409, 822-823.
13. Knudsen, L.E., Loft, S.H. and Autrup, H. (2001) Risk assessment: the importance
of genetic polymorphisms in man. Mutat Res, 482, 83-88.
14. Brookes, A.J. (1999) The essence of SNPs. Gene, 234, 177-186.
15. Erichsen, H.C. and Chanock, S.J. (2004) SNPs in cancer research and treatment. Br
J Cancer, 90, 747-751.
77.. RReeffeerrêênncciiaass
Polimorfismos nos genes IL-4 e I-8 e Cancro de Pulmão
- 66 -
16. de Visser, K.E. and Coussens, L.M. (2006) The inflammatory tumor
microenvironment and its impact on cancer development. Contrib Microbiol, 13,
118-137.
17. Abbas, A.K., Lichtman, A. H., Pober, J. S. (2000) Cellular and Molecular
Immunology. 4 th edition ed. Saunders Company, Philadelphia.
18. Balkwill, F. and Mantovani, A. (2001) Inflammation and cancer: back to Virchow?
Lancet, 357, 539-545.
19. Ben-Baruch, A. (2006) Inflammation-associated immune suppression in cancer: the
roles played by cytokines, chemokines and additional mediators. Semin Cancer
Biol, 16, 38-52.
20. Kuper, H., Adami, H.O. and Trichopoulos, D. (2000) Infections as a major
preventable cause of human cancer. J Intern Med, 248, 171-183.
21. Mantovani, A., Sica, A., Sozzani, S., Allavena, P., Vecchi, A. and Locati, M.
(2004) The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and
polarization. Trends Immunol, 25, 677-686.
22. Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P. and Sica, A. (2002)
Macrophage polarization: tumor-associated macrophages as a paradigm for
polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends Immunol, 23, 549-555.
23. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A. and Allavena, P. (2006) Tumour-associated
macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression:
potential targets of anti-cancer therapy. Eur J Cancer, 42, 717-727.
24. Vilcek, J. (2003) The cytokines: an overview. 4 ed. Angus W. Thomson & Michael
T. Avon: Lotze editors.
25. Seder, R.A., Gazzinelli, R., Sher, A. and Paul, W.E. (1993) Interleukin 12 acts
directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and
diminishes interleukin 4 inhibition of such priming. Proc Natl Acad Sci U S A, 90,
10188-10192.
26. Hsieh, C.S., Macatonia, S.E., Tripp, C.S., Wolf, S.F., O'Garra, A. and Murphy,
K.M. (1993) Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by
Listeria-induced macrophages. Science, 260, 547-549.
77.. RReeffeerrêênncciiaass
Polimorfismos nos genes IL-4 e I-8 e Cancro de Pulmão
- 67 -
27. Murphy, K.M., Ouyang, W., Farrar, J.D., Yang, J., Ranganath, S., Asnagli, H.,
Afkarian, M. and Murphy, T.L. (2000) Signaling and transcription in T helper
development. Annu Rev Immunol, 18, 451-494.
28. Paul, W.E. and Seder, R.A. (1994) Lymphocyte responses and cytokines. Cell, 76,
241-251.
29. Paul, W.E. (1991) Interleukin-4: a prototypic immunoregulatory lymphokine.
Blood, 77, 1859-1870.
30. Gyan, B.A., Goka, B., Cvetkovic, J.T., Kurtzhals, J.L., Adabayeri, V., Perlmann,
H., Lefvert, A.K., Akanmori, B.D. and Troye-Blomberg, M. (2004) Allelic
polymorphisms in the repeat and promoter regions of the interleukin-4 gene and
malaria severity in Ghanaian children. Clin Exp Immunol, 138, 145-150.
31. Nakashima, H., Miyake, K., Inoue, Y., Shimizu, S., Akahoshi, M., Tanaka, Y.,
Otsuka, T. and Harada, M. (2002) Association between IL-4 genotype and IL-4
production in the Japanese population. Genes Immun, 3, 107-109.
32. Nunez, C., Santiago, J.L., Varade, J., de la Calle, H., Figueredo, M.A., Fernandez-
Gutierrez, B., de la Concha, E.G., Urcelay, E. and Martinez, A. (2008) IL4 in the
5q31 context: association studies of type 1 diabetes and rheumatoid arthritis in the
Spanish population. Immunogenetics, 60, 19-23.
33. Lee, S.O., Lou, W., Hou, M., Onate, S.A. and Gao, A.C. (2003) Interleukin-4
enhances prostate-specific antigen expression by activation of the androgen
receptor and Akt pathway. Oncogene, 22, 7981-7988.
34. Lee, S.O., Pinder, E., Chun, J.Y., Lou, W., Sun, M. and Gao, A.C. (2008)
Interleukin-4 stimulates androgen-independent growth in LNCaP human prostate
cancer cells. Prostate, 68, 85-91.
35. Buchs, N., Silvestri, T., di Giovine, F.S., Chabaud, M., Vannier, E., Duff, G.W. and
Miossec, P. (2000) IL-4 VNTR gene polymorphism in chronic polyarthritis. The
rare allele is associated with protection against destruction. Rheumatology
(Oxford), 39, 1126-1131.
36. Varin, A. and Gordon, S. (2009) Alternative activation of macrophages: Immune
function and cellular biology. Immunobiology.
77.. RReeffeerrêênncciiaass
Polimorfismos nos genes IL-4 e I-8 e Cancro de Pulmão
- 68 -
37. Yannopoulos, A., Nikiteas, N., Chatzitheofylaktou, A. and Tsigris, C. (2007) The (-
590 C/T) polymorphism in the interleukin-4 gene is associated with increased risk
for early stages of corolectal adenocarcinoma. In Vivo, 21, 1031-1035.
38. Vairaktaris, E., Yannopoulos, A., Vassiliou, S., Serefoglou, Z., Vylliotis, A.,
Nkenke, E., Critselis, E., Avgoustidis, D., Yapijakis, C., Neukam, F.W. et al.
(2007) Strong association of interleukin-4 (-590 C/T) polymorphism with increased
risk for oral squamous cell carcinoma in Europeans. Oral Surg Oral Med Oral
Pathol Oral Radiol Endod, 104, 796-802.
39. Konwar, R., Gara, R., Singh, M., Singh, V., Chattopadhyay, N. and Bid, H.K.
(2008) Association of interleukin-4 and interleukin-1 receptor antagonist gene
polymorphisms and risk of benign prostatic hyperplasia. Urology, 71, 868-872.
40. Gooch, J.L., Lee, A.V. and Yee, D. (1998) Interleukin 4 inhibits growth and
induces apoptosis in human breast cancer cells. Cancer Res, 58, 4199-4205.
41. Volpert, O.V., Fong, T., Koch, A.E., Peterson, J.D., Waltenbaugh, C., Tepper, R.I.
and Bouck, N.P. (1998) Inhibition of angiogenesis by interleukin 4. J Exp Med,
188, 1039-1046.
42. Olver, S., Apte, S., Baz, A. and Kienzle, N. (2007) The duplicitous effects of
interleukin 4 on tumour immunity: how can the same cytokine improve or impair
control of tumour growth? Tissue Antigens, 69, 293-298.
43. Kawakami, M., Kawakami, K., Stepensky, V.A., Maki, R.A., Robin, H., Muller,
W., Husain, S.R. and Puri, R.K. (2002) Interleukin 4 receptor on human lung
cancer: a molecular target for cytotoxin therapy. Clin Cancer Res, 8, 3503-3511.
44. Li, Y., Guo, B., Zhang, L., Han, J., Wu, B. and Xiong, H. (2008) Association
between C-589T polymorphisms of interleukin-4 gene promoter and asthma: a
meta-analysis. Respir Med, 102, 984-992.
45. Rosenwasser, L.J., Klemm, D.J., Dresback, J.K., Inamura, H., Mascali, J.J.,
Klinnert, M. and Borish, L. (1995) Promoter polymorphisms in the chromosome 5
gene cluster in asthma and atopy. Clin Exp Allergy, 25 Suppl 2, 74-78; discussion
95-76.
46. Elliott, K., Fitzpatrick, E., Hill, D., Brown, J., Adams, S., Chee, P., Stewart, G.,
Fulcher, D., Tang, M., Kemp, A. et al. (2001) The -590C/T and -34C/T interleukin-
77.. RReeffeerrêênncciiaass
Polimorfismos nos genes IL-4 e I-8 e Cancro de Pulmão
- 69 -
4 promoter polymorphisms are not associated with atopic eczema in childhood. J Allergy
Clin Immunol, 108, 285-287.
47. Kleine-Lowinski, K., Rheinwald, J.G., Fichorova, R.N., Anderson, D.J., Basile, J.,
Munger, K., Daly, C.M., Rosl, F. and Rollins, B.J. (2003) Selective suppression of
monocyte chemoattractant protein-1 expression by human papillomavirus E6 and
E7 oncoproteins in human cervical epithelial and epidermal cells. Int J Cancer,
107, 407-415.
48. Murdoch, C. and Finn, A. (2000) Chemokine receptors and their role in
inflammation and infectious diseases. Blood, 95, 3032-3043.
49. Frederick, M.J. and Clayman, G.L. (2001) Chemokines in cancer. Expert Rev Mol
Med, 3, 1-18.
50. Davidson, B., Dong, H.P., Holth, A., Berner, A. and Risberg, B. (2007) Chemokine
receptors are infrequently expressed in malignant and benign mesothelial cells. Am
J Clin Pathol, 127, 752-759.
51. Mellado, M., Vila-Coro, A.J., Martinez, C. and Rodriguez-Frade, J.M. (2001)
Receptor dimerization: a key step in chemokine signaling. Cell Mol Biol (Noisy-le-
grand), 47, 575-582.
52. Conti, I., Dube, C. and Rollins, B.J. (2004) Chemokine-based pathogenetic
mechanisms in cancer. Novartis Found Symp, 256, 29-41; discussion 41-52, 266-
269.
53. Mukaida, N. (2003) Pathophysiological roles of interleukin-8/CXCL8 in pulmonary
diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 284, L566-577.
54. Puthothu, B., Krueger, M., Heinze, J., Forster, J. and Heinzmann, A. (2006) Impact
of IL8 and IL8-receptor alpha polymorphisms on the genetics of bronchial asthma
and severe RSV infections. Clin Mol Allergy, 4, 2.
55. Waugh, D.J. and Wilson, C. (2008) The interleukin-8 pathway in cancer. Clin
Cancer Res, 14, 6735-6741.
56. Xie, K. (2001) Interleukin-8 and human cancer biology. Cytokine Growth Factor
Rev, 12, 375-391.
57. Wei, Y.S., Lan, Y., Tang, R.G., Xu, Q.Q., Huang, Y., Nong, H.B. and Huang, W.T.
(2007) Single nucleotide polymorphism and haplotype association of the
interleukin-8 gene with nasopharyngeal carcinoma. Clin Immunol, 125, 309-317.
77.. RReeffeerrêênncciiaass
Polimorfismos nos genes IL-4 e I-8 e Cancro de Pulmão
- 70 -
58. Reyes-Gibby, C.C., Spitz, M., Wu, X., Merriman, K., Etzel, C., Bruera, E.,
Kurzrock, R. and Shete, S. (2007) Cytokine genes and pain severity in lung cancer:
exploring the influence of TNF-alpha-308 G/A IL6-174G/C and IL8-251T/A.
Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 16, 2745-2751.
59. Savage, S.A., Abnet, C.C., Mark, S.D., Qiao, Y.L., Dong, Z.W., Dawsey, S.M.,
Taylor, P.R. and Chanock, S.J. (2004) Variants of the IL8 and IL8RB genes and
risk for gastric cardia adenocarcinoma and esophageal squamous cell carcinoma.
Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 13, 2251-2257.
60. Kang, J.M., Kim, N., Lee, D.H., Park, J.H., Lee, M.K., Kim, J.S., Jung, H.C. and
Song, I.S. (2009) The effects of genetic polymorphisms of IL-6, IL-8, and IL-10 on
Helicobacter pylori-induced gastroduodenal diseases in Korea. J Clin
Gastroenterol, 43, 420-428.
61. Doll, R. and Hill, A.B. (2004) The mortality of doctors in relation to their smoking
habits: a preliminary report. 1954. BMJ, 328, 1529-1533; discussion 1533.
62. Ezzati, M. and Lopez, A.D. (2003) Estimates of global mortality attributable to
smoking in 2000. Lancet, 362, 847-852.
63. Kamangar, F., Dores, G.M. and Anderson, W.F. (2006) Patterns of cancer
incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to
reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol,
24, 2137-2150.
64. Alberg, A.J., Brock, M.V. and Samet, J.M. (2005) Epidemiology of lung cancer:
looking to the future. J Clin Oncol, 23, 3175-3185.
65. Stavrides, J.C. (2006) Lung carcinogenesis: pivotal role of metals in tobacco
smoke. Free Radic Biol Med, 41, 1017-1030.
66. Araujo, A., Ribeiro, R., Azevedo, I., Coelho, A., Soares, M., Sousa, B., Pinto, D.,
Lopes, C., Medeiros, R. and Scagliotti, G.V. (2007) Genetic polymorphisms of the
epidermal growth factor and related receptor in non-small cell lung cancer--a
review of the literature. Oncologist, 12, 201-210.
67. Mitsudomi, T. (2007) [Molecular biology in diagnosis and treatment of lung
cancer]. Kyobu Geka, 60, 349-354.
68. Mountain, C.F. (1997) Revisions in the International System for Staging Lung
Cancer. Chest, 111, 1710-1717.
77.. RReeffeerrêênncciiaass
Polimorfismos nos genes IL-4 e I-8 e Cancro de Pulmão
- 71 -
69. Brambilla, E., Travis, W.D., Colby, T.V., Corrin, B. and Shimosato, Y. (2001) The
new World Health Organization classification of lung tumours. Eur Respir J, 18,
1059-1068.
70. Mountain, C.F. (1986) A new international staging system for lung cancer. Chest,
89, 225S-233S.
71. Serke, M. and Schonfeld, N. (2007) [Diagnosis and staging of lung cancer]. Dtsch
Med Wochenschr, 132, 1165-1169.
72. Serke, M. (2007) [Lung cancer: targeted therapy]. Pneumologie, 61, 162-170.
73. Wistuba, II. (2007) Genetics of preneoplasia: lessons from lung cancer. Curr Mol
Med, 7, 3-14.
74. Anderson, G.P. and Bozinovski, S. (2003) Acquired somatic mutations in the
molecular pathogenesis of COPD. Trends Pharmacol Sci, 24, 71-76.
75. Bauer, A.K., Malkinson, A.M. and Kleeberger, S.R. (2004) Susceptibility to
neoplastic and non-neoplastic pulmonary diseases in mice: genetic similarities. Am
J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 287, L685-703.
76. Heinzmann, A., Ahlert, I., Kurz, T., Berner, R. and Deichmann, K.A. (2004)
Association study suggests opposite effects of polymorphisms within IL8 on
bronchial asthma and respiratory syncytial virus bronchiolitis. J Allergy Clin
Immunol, 114, 671-676.
77. Blankenstein, T. (2005) The role of tumor stroma in the interaction between tumor
and immune system. Curr Opin Immunol, 17, 180-186.
78. Pollard, J.W. (2004) Tumour-educated macrophages promote tumour progression
and metastasis. Nat Rev Cancer, 4, 71-78.
79. Condeelis, J. and Pollard, J.W. (2006) Macrophages: obligate partners for tumor
cell migration, invasion, and metastasis. Cell, 124, 263-266.
80. Kalluri, R. and Zeisberg, M. (2006) Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer, 6, 392-
401.
81. Keibel, A., Singh, V. and Sharma, M.C. (2009) Inflammation, microenvironment,
and the immune system in cancer progression. Curr Pharm Des, 15, 1949-1955.
82. Nagai, S. and Toi, M. (2000) Interleukin-4 and breast cancer. Breast Cancer, 7,
181-186.
77.. RReeffeerrêênncciiaass
Polimorfismos nos genes IL-4 e I-8 e Cancro de Pulmão
- 72 -
83. Sparano, A., Lathers, D.M., Achille, N., Petruzzelli, G.J. and Young, M.R. (2004)
Modulation of Th1 and Th2 cytokine profiles and their association with advanced
head and neck squamous cell carcinoma. Otolaryngol Head Neck Surg, 131, 573-
576.
84. Huang, M., Wang, J., Lee, P., Sharma, S., Mao, J.T., Meissner, H., Uyemura, K.,
Modlin, R., Wollman, J. and Dubinett, S.M. (1995) Human non-small cell lung
cancer cells express a type 2 cytokine pattern. Cancer Res, 55, 3847-3853.
85. Cui, X., Yang, S.C., Sharma, S., Heuze-Vourc'h, N. and Dubinett, S.M. (2006) IL-4
regulates COX-2 and PGE2 production in human non-small cell lung cancer.
Biochem Biophys Res Commun, 343, 995-1001.
86. Li, Z., Chen, L. and Qin, Z. (2009) Paradoxical roles of IL-4 in tumor immunity.
Cell Mol Immunol, 6, 415-422.
87. Haas, C.S., Amin, M.A., Allen, B.B., Ruth, J.H., Haines, G.K., 3rd, Woods, J.M.
and Koch, A.E. (2006) Inhibition of angiogenesis by interleukin-4 gene therapy in
rat adjuvant-induced arthritis. Arthritis Rheum, 54, 2402-2414.
88. Schuler, T., Kornig, S. and Blankenstein, T. (2003) Tumor rejection by modulation
of tumor stromal fibroblasts. J Exp Med, 198, 1487-1493.
89. Enewold, L., Mechanic, L.E., Bowman, E.D., Zheng, Y.L., Yu, Z., Trivers, G.,
Alberg, A.J. and Harris, C.C. (2009) Serum concentrations of cytokines and lung
cancer survival in African Americans and Caucasians. Cancer Epidemiol
Biomarkers Prev, 18, 215-222.
90. Shi, Q., Abbruzzese, J.L., Huang, S., Fidler, I.J., Xiong, Q. and Xie, K. (1999)
Constitutive and inducible interleukin 8 expression by hypoxia and acidosis renders
human pancreatic cancer cells more tumorigenic and metastatic. Clin Cancer Res,
5, 3711-3721.
91. Serefoglou, Z., Yapijakis, C., Nkenke, E. and Vairaktaris, E. (2008) Genetic
association of cytokine DNA polymorphisms with head and neck cancer. Oral
Oncol, 44, 1093-1099.
92. Coelho, A., Calcada, C., Catarino, R., Pinto, D., Fonseca, G. and Medeiros, R.
(2006) CXCL12-3' A polymorphism and lung cancer metastases protection: new
perspectives in immunotherapy? Cancer Immunol Immunother, 55, 639-643.
8.
A N E X O
S
88.. AAnneexxooss
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 75 -
Anexo I
TBE 10X
Tris Base 108 g/L (Merck 1083821000)
Ácido Bórico 55 g/L (Merck 1001651000)
EDTA 6,72 g/L (Sigma E-1644)
88.. AAnneexxooss
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 76 -
Anexo II
Abstract apresentado sob a forma de poster na 15th European Cancer Organisation and
34th Congress of the European Society for Medical Oncology, em Berlim (Setembro
2009)
Influence of IL-4 -590C/T polymorphism in Non-Small Cell Lung
Cancer (NSCLC) susceptibility
Mónica Gomes1,2, Ana Coelho1,4, António Araújo2,3, Raquel Catarino1,4, Ana Nogal1, Rui Medeiros1,2
1 Molecular Oncology Group - CI, Portuguese Institute of Oncology, Porto, Portugal
2 ICBAS, Abel Salazar Institute for the Biomedical Sciences, University of Porto, Porto, Portugal
3 Oncology Department, Portuguese Institute of Oncology, Porto, Portugal
4 Faculty of Medicine of University of Porto, Portugal
Background:
Lung cancer is the leading cause of death by cancer in the world, originating about 17.5% of
total deaths from cancer (1.18 million). Inflammation and related pathways play an important role
in the pathogenesis of lung cancer. IL-4 is an anti-inflammatory cytokine, which reduces the
production of proinflammatory cytokines by monocytes and with direct antiproliferative effects in
some tumors. The polymorphism -590 C/T SNP is a C to T transition in the -590 position of the
promoter region of the IL-4 gene, and the T variant is associated with increased expression of IL-4.
The aim of this study was to evaluate the influence of this polymorphism in the susceptibility to
non-small cell lung cancer development (NSCLC).
Methods:
DNA was extracted from peripheral blood of 696 individuals (277 patients diagnosed with
NSCLC and a control group of 419 individuals without cancer). The characterization IL-4 -590C/T
genotypes was performed by PCR-RFLP (BsmFI).
88.. AAnneexxooss
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 77 -
Results:
The -590 C/T polymorphism genotypes were classified as low (CC) and high expression (TT).
The frequencies obtained for the CC and TT genotypes were 86.3% and 13.7%, respectively, in the
control group and 92.3% and 7.7%, respectively, in the case group. The analysis of the TT and CC
genotype frequencies in the two groups under study showed a statistically significant difference in
its distribution, indicating a protection of 48% for the development of NSCLC in individuals with
the TT genotype when compared with individuals with CC genotype (P=0.036, OR=0.522: 95%
CI=0.282-0.965).This result is more pronounced when considering only the NSCLC epidermoid
histological type (P=0.003, OR=0.086: 95% CI=0.012-0.636). Stratifying according to smoking
status, the results also show that smokers with the TT genotype have a protection for the
development of NSCLC (P=0.007, OR=0.100: 95% CI=0.013-0.772), when compared with the non-
smoking group with TT genotype.
Conclusion:
The results of this study point to the involvement of CC and TT genetic variants of the IL-4 -
590 C/T polymorphism in the development of NSCLC. Increased expression of IL-4 associated with
the TT genotype may contribute to the promotion of immune surveillance during NSCLC
development, which could explain the results obtained in this work. However, further functional
studies regarding IL-4 expression according to IL-4 -590 C/T polymorphism genotypes should be
conducted in order to validate this hypothesis.
88.. AAnneexxooss
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 78 -
Anexo III
Resumo apresentado sob a forma de poster no 3º Congresso Nacional de Cancro de
Pulmão, em Albufeira (Outubro 2008)
Influência do polimorfismo -590C/T do gene da IL-4 na
susceptibilidade para o desenvolvimento de CPNPC
Mónica Gomes1, Ana Coelho1, António Araújo2, Raquel Catarino1, Ana Nogal1, Rui Medeiros1
1- Departamento de Oncologia Molecular/Virologia- Instituto Português de Oncologia- Porto 2- Servico de Oncologia Médica- Instituto Português de Oncologia- Porto
Introdução: O cancro do pulmão é a principal causa de morte por cancro em todo o mundo, originando cerca
de 17.6% do total de mortes por cancro (1.18 milhões).
A interleuquina-4 é um modulador da resposta inflamatória contra infecções e células
tumorais, mediada por células B, T e macrófagos. Esta citoquina apresenta também efeitos anti-
proliferativos durante o desenvolvimento tumoral, estando descrita a sua associação à
patogénese do cancro do pulmão, em particular no epitélio respiratório dos fumadores.
O polimorfismo -590 C/T é um SNP que consiste na susbstituição de citosina (C) por timina
(T) na região -590 do promotor do gene da IL-4, estando a variante T associada à expressão
aumentada de IL-4. O objectivo deste estudo consistiu na avaliação da influência do polimorfismo
-590C/T na susceptibilidade para o desenvolvimento de cancro de pulmão de não pequenas
células (CPNPC).
Métodos:
Foram extraídas amostras de ADN do sangue periférico de 696 indivíduos divididos num
grupo de 277 pacientes diagnosticados com CPNPC no IPO do Porto e num grupo controlo de 419
indivíduos sem qualquer patologia conhecida.
A caracterização genótipica do polimorfismo -590C/T do gene da IL-4, foi realizada por
PCR/RFLP (BsmFI).
88.. AAnneexxooss
Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão
- 79 -
Resultados:
Os genótipos do polimorfismo -590 C/T foram classificados como de baixa (CC) e elevada
expressão (TT). As frequências obtidas para os genótipos CC e TT foram de 86.3% e 13.7%,
respectivamente, no grupo controlo e de 92.3% e 7.7%, respectivamente, no grupo de casos.
Quando se comparam as frequências destes dois genótipos nos dois grupos em estudo, observa-
se uma diferença estatísticamente significativa na sua distribuição, que indica numa protecção de
48% para o desenvolvimento de CPNPC em indivíduos com o genótipo TT relativamente aos
indivíduos com o genótipo CC (P= 0,036; OR= 0,522: IC 95%= 0,282-0,965).
Conclusão:
Os resultados obtidos neste estudo apontam para o envolvimento das variantes
genéticas CC e TT do polimorfismo -590 C/T no desenvolvimento de CPNPC. O aumento da
expressão da IL-4 associado ao genótipo TT pode contribuír para a promoção da vigilância
imunológica no decurso da transformação celular subjacente ao aparecimento de CPNPC, o que
permitiria explicar o efeito deste genótipo no desenvolvimento de CPNPC, observado neste
trabalho. No entanto, esta hipótese terá que ser validada por estudos funcionais que permitam
avaliar a expressão da interleuquina associada aos diferentes genótipos do polimorfismo em
estudo.