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Aula 2 – Introduçã o ão conceito de enzimã. Breves notãs histo ricãs
Aspectos Históricos
Enzimas
Os enzimas são catalisadores – aceleram a velocidade das reações
sem que eles próprios sofram qualquer alteração permanente. Cada reacção
que tem lugar na célula é catalisada pelo seu próprio enzima, logo, numa dada
célula, existe um grande número de enzimas.
Na ausência de enzimas a maior parte das reacções do
metabolismo celular não ocorreriam, nem mesmo num período
de vários anos e a vida como nós a conhecemos, poderia nem
existir.
Pode-se por a questão:
Quantos enzimas existem numa célula?
1878 in Yeast – Kuhne
1897 Filtrados de extractos cell free – Buchner
1894 Hipótese chave-fechadura – Emil Fischer
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1926 Primeiro enzima (urease) a ser cristalizado – Summer
1920’s Desenvolvimento da ultracentrífuga – Svedberg
1960 Sequência do ribonuclease – enzima que catalisa a hidrólise do
ácido ribonucleico
1965 Estrutura tridimensional (cristalografia de Raio-X) do lisosima –
enzima de clivagem
50’s-60’s Flexibilidade estrutural
1958 “induced-fit” (Teoria do encaixe induzido) – Koshland
1961 Modelo alostéreo (actividade modulada por modificações
fisiológicas) – Monod
1968 (Kempner e Miller) – O meio celular é heterogéneo com elevado
conteúdo em proteínas (100-300mg/ml em eucariotas), abundância de
superfícies membranares e citoesqueleto
1969 síntese química do ribonuclease – Merrifield
1973/74 Kacser e Burns/Heinrich e Rapoport – O estado estacionário
de fluxos metabólicos e de concentrações de metabolitos na célula são
propriedades do sistema
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Aula 3 – Outrãs mole culãs com ãctividãde cãtãlí ticã. Propriedãdes
dos enzimãs.
Moléculas com actividade catalítica
Ribozimas
Molécula de RNA com capacidade autocatalítica. Tal como os enzimas
proteicos, possuem um centro activo que se une especificamente a um
substrato e que facilita a sua conversão num produto. Os ribozimas são menos
versáteis que os enzimas proteicos.
Exemplos:
Ribozimas “cabeças de martelo”
Anticorpos Catalíticos
Anticorpos que podem catalisar uma ampla variedade de reacções
químicas. São caracterizados pela elevada especificidade para os substratos,
compartilhando muitos aspectos mecanísticos com os os enzimas.
Exploram a capacidade de ligação (reconhecimento molecular)
– modulação do substrato (tipo de relação antigénio-anticorpo)
Construção de um análogo do estado de
transição
São bons em reacções simples mas são
limitados por: precisão e separação.
Aplicações: destoxificação por cocaína
Potencial terapêutico
Biossensores
Genómica funcional
Descoberta de genes
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“Enzimas Artificiais”
Servem para reproduzir a função do enzima, mimetizar uma reacção
química:
1. Transformação química – ligação covalente;
2. Reconhecimento molecular – Mimic binding (H, hidrófoba,
iónica)
3. Recriação do centro activo de um enzima.
A ter em conta:
Tem de ser um passo inicial de ligação
Dimensão: importante para a ligação e libertação do produto
Exemplos:
Ciclodextrinas
Criptandos – ligandos multi-dentados que ligam catiões
Anticorpos catalíticos
Propriedades dos Enzimas
Elevado poder catalítico
Grande aumento da velocidade da reacção.
Velocidades na ordem de 1017 em relação à reacção não catalisada.
Especificidade
A maioria dos enzimas são bastante específicos tanto para a natureza
do substrato que utilizam, tanto para a reacção que catalisam.
As reacções catalisadas enzimaticamente raramente dão origem
a produtos alternativos.
A especificidade varia de enzima para enzima. Uma especificidade
mais baixa, por exemplo, é comumente observada em enzimas de degração.
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Existem vários tipos de especificidade:
Especificidade de ligação – baixa (peptidases, fosfatases)
Especificidade de molécula – intermédia (hexocinase)
Especificidade de grupo – absoluta (urease)
Regulação
A actividade catalítica de muitos enzimas pode variar em resposta às
concentrações de outras substâncias que não os seus substratos. Estes
processos regulatórios incluem o controle alostéreo, modificação covalente e
variação da quantidade de enzima utilizado.
Aula 4 – Nomenclãturã e clãssificãçã o de enzimãs. Exemplos.
Nomenclatura
Em geral, adiciona-se o sufixo –ase ao substrato sobre o qual actua (ex:
urease – catalisa a decomposição da ureia), ou ao nome da reacção que o
enzima catalisa (ex: álcool desidrogenase – catalisa a desidrogenação do
álcool).
No entanto existem excepções. Por exemplo pepsina e tripsina –
enzimas digestivos.
Classificação
Os nomes dos enzimas são dados seguindo certas regras bem
definidas.
Os seis tipos principais de reacções catalisadas por enzimas são:
EC 1 – Reacções de oxidação-redução, catalisadas por
oxidoreductases;
EC 2 – Reacções de transferência de grupo, catalisadas por
transferases;
EC 3 – Reacções hidrolíticas, catalisadas por hidrolases;
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EC 4 – Reacções de eliminação nas quais é formada uma dupla
ligação, catalisadas por liases;
EC 5 – Reacções de isomerização, catalisadas por isomerases;
EC 6 – Reacções nas quais duas moléculas se juntam à custa de
energia (normalmente ATP), catalisadas por ligases.
O nome sistemático completo de um enzima não só mostra o tipo de
reacção catalisada, mas descreve se o substrato(s) “adicionou” qualquer outra
informação importante.
Exemplos:
EC 2.3.1.17 (Aspartato N-acetiltransferase)
2 – transferase
2.3. – acetiltransferase
2.3.1. transferência de grupo sem ser aminoacetil
2.3.1.17 – 17º enzima com estas características
EC 1.1.1.1 (Álcool desidrogenase)
1 – Oxidoreductase
1.1 – dador (álcool)
1.1.1 – aceitador (NAD+)
Nome sistemático: Álcool: NAD+ oxidoreductases (dador:aceitador)
Nome trivial (a usar): Álcool desidrogenase
ATP + Glu 6-P-Glucose
Classificação dos enzimas é do tipo EC a.b.c.d. onde:
a) O primeiro número indica o tipo de reacção catalisada e
pode tomar valores entre 1 e 6, de acordo com a classificação feita
anteriormente.
b) O segundo número indica a subclasse, que normalmente
especifica o tipo de substrato ou, mais precisamente, a ligação clivada.
Enzima
ATP: Glucose 6-fosfato transferase
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c) O terceiro número indica a sub-subclasse, permitindo uma
definição ainda mais precisa da reacção catalisada em termos do tipo de
aceitador de electrões (no caso dos oxidoreductases, por exemplo) ou do tipo
de grupo removido (nas liases, por exemplo).
d) O quarto número indica o “serial number” do enzima na
sua sub-subclasse.
Sistemas multienzimáticos
“Multienzimas” são proteínas que exibem mais do que uma actividade
catalítica. Para efeitos de nomenclatura, a recomendação é que, quando está a
ser atribuída mais do que uma única actividade catalítica, deve-se referir a um
sistema multienzimático.
Assim, enzimas multifuncionais terão mais de um número de EC e
posição no esquema de classificação.
Aulas 5 a 8 – Estruturã dos enzimãs.
Estrutura dos enzimas
O principal objectivo de uma investigação é estabelecer a estrutura
tridimensional completa de um enzima a nível atómico (ou quase atómico).
Esta informação fornece as bases necessárias não só para perceber as
propriedades detalhadas do enzima, especialmente a sua actividade catalítica,
mas também para várias aplicações: testar modelos de estruturas
macromoleculares, para propor um mecanismo de catálise, para explorar
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semelhanças entre enzimas, para o desenho racional de drogas e para a
exploração do enzima para fins industriais.
Supondo que está disponível uma fonte de enzima, as principais
etapas de trabalho são:
1. Determinação da massa molecular relativa, Mr;
2. Determinação da estrutura primária e composição em
aminoácidos;
3. Determinação das estruturas secundária e terciária;
4. Determinação da estrutura quaternária.
O termo estrutura primária refere-se à sequência de aminoácidos numa
cadeia polipeptídica. Este tipo de estrutura contém apenas informação
unidimensional e diz-nos pouca coisa acerca da estrutura tridimensional.
Os termos estrutura secundária e terciária referem-se a diferentes
aspectos da estrutura tridimensional: a estrutura secundária refere-se a
elementos regulares da estrutura, tais como a hélice-α e a folha-β, nas quais
estão envolvidas interacções entre regiões próximas. A estrutura terciária
refere-se ao folding de uma cadeia, no qual porções da molécula bem
separadas na sequência são trazidas para mais próximo uma da outra.
O termo estrutura quaternária refere-se ao arranjo de subunidades
individuais num enzima que contém mais do que uma subunidade.
Determinação de Mr
Enzimas são macromoléculas com valores de Mr que estão num
intervalo de cerca de 10 000 até alguns milhões. As determinações dos valores
de Mr dos enzimas nos dias são feitas, hoje em dia, recorrendo a uma destas
técnicas:
1. Ultracentrifugação;
2. Filtração em gel;
3. Electroforese SDS Page;
4. Espectrometria de massa.
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Destes métodos, (2) e (3) são “semi-empíricos” e possíveis
comparações são feitas com moléculas “standard” de massa molecular
conhecidas. No entanto, no método (1), Mr pode ser calculada usando
equações derivadas de princípios prévios. As técnicas recentes da
espectrometria de massa (4) podem fornecer valores de Mr extremamente
precisos.
A massa molecular relativa de um enzima é uma peça de informação
fundamental uma vez que nos permite converter a concentração de uma
solução de unidades de massa por volume (mg.cm-3 por exemplo) para
unidades de molaridade. Esta informação pode então ser utilizada de várias
maneiras, tais como: considerações de composição (quantos aminoácidos de
um dado tipo estão presentes por molécula de enzima?), actividade catalítica
(quantas moléculas de substrato são formadas por uma molécula de enzima
por segundo?), e ligação do ligando (quantas moléculas de ligando estão
ligadas por molécula de enzima?).
Medições de Mr feitas na ausência e presença de agentes
desnaturantes irão mostrar se o enzima é ou não composto por subunidades e
pode indicar o número de subunidades. Por exemplo, o lactato desidrogenase
da levedura tem uma Mr de 140 000 numa filtração em gel, mas numa
electroforese em SDS-Page a Mr é perto de 35 000, indicando que este enzima
é um tetrâmero (4 subunidades).
Determinação da estrutura primária
A estrutura primária é caracterizada pelo número de aminoácidos
componentes da sua cadeia e a ordem em que eles se encontram. A estrutura
primária é responsável pelas estruturas de ordem superior que a proteína exibe
na sua forma celular ou nativa.
Duas estratégias distintas são empregues para determinar a estrutura
primária de uma proteína ou enzima. O método “directo” opera a nível da
proteína. O método “indirecto” opera ao nível do gene (DNA) e usa o código
genético para traduzir a sequência do ácido nucleico no seu produto
correspondente.
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Determinação da estrutura secundária e terciária
O conhecimento da estrutura primária de um enzima não nos permite
explicar propriedades como poder catalítica e especificidade. Temos também
de considerar como é que a cadeia polipeptídica se “dobra”. A cristalografia de
raio-X tem sido, de longe, a técnica mais utilizada para a determinação da
estrutura tridimensional dos enzimas. No entanto, a técnica de ressonância
magnética nuclear de alta resolução (RMN) tem sido desenvolvida ao longo
dos anos e é agora capaz de fornecer informações acerca da dinâmica das
proteínas, especialmente aquelas com Mr superior a 25 000.
A estrutura secundária é caracterizada por estruturas específicas:
Hélice-α
Consiste num hélice direita formada e estabilizada por
ligações de hidrogénio.
Método “directo” Método “indirecto”
Hélice-α
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Folha-β
Estrutura também mantida por ligações de hidrogénio entre as
unidades peptídicas. Neste caso, as ligações
são estabelecidas entre cadeias
polipeptídicas diferentes, distendidas e
paralelas, ou entre segmentos distantes e
distendidos de uma mesma cadeia.
A estrutura terciária descreve a
conformação tridimensional que a molécula assume
em solução, explicando o dobramento da cadeia
peptídica com os enrolamentos, dobras e voltas que
a compõem e que a levam a uma forma geral
globular.
As interacções responsáveis pela estrutura tridimensional dos enzimas
são todas as forças fracas: ligações de hidrogénio, forças electrostáticas,
forças de Van der Waals e ligações hidrófobas.
Determinação da estrutura quaternária
A estrutura quaternária diz respeito à
organização presente nas proteínas e descreve quantos
e quais monómeros compõem a molécula e como estão
associados.
A maior parte dos enzimas consistem num
número de subunidades mantidas juntas por forças
não covalentes – são oligómeros.
Podem-se fazer várias questões acerca dos enzimas oligoméricos:
1. Quantas subunidades existem? E de que tipo?
2. Como estão as subunidades organizadas?
3. Que forças estão envolvidas?
4. Qual o significado, para o enzima, de ter múltiplas subunidades?
Folha-β
Estrutura terciária
Estrutura quaternária
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1. Quantas subunidades existem? E de que tipo?
a. Estudos de Massa Molecular
Uma indicação de que um enzima consiste em múltiplas
subunidades é fornecido por resultados de massa molecular realizados na
ausência e presença de agentes desnaturantes (exemplo: cloreto de
guanidina). O álcool desidrogenase de levedura, por exemplo, por
ultracentrifugação apresenta um Mr de 145 000. No entanto, sob condições
desnaturantes, é obtido um valor de Mr de 36 000, sugerindo que este enzima
consiste em 4 subunidades (145/36 ~ 4) provavelmente idênticas.
b. Estudos de Cross-Linking
Outro dos métodos é utilizar um agente de cross-linking,
como o dimetilsuberimidato. Este composto reage com os pares de cadeias
laterais de Lisina, que praticamente se encontram à superfície do enzima, para
criar ligações cruzadas que são estáveis na presença de agentes
desnaturantes.
Digamos que
fazemos reagir um enzima com 4
subunidades com um agente de
cross-linking: será formada uma
mistura de espécies que podem
ser separadas por electroforese
em gel de poliacrilamida, dando um
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total de 4 bandas. O número de bandas corresponde ao número de
subunidades.
c. Estudos de ligação de ligandos
O número de sítios de ligação num enzima para um
substrato ou outro ligando pode ser utilizado para indicar o número de
subunidades. Por exemplo, o álcool desidrogenase de levedura liga 4 mol
de NADH, enquanto o de fígado liga 2 mol de NADH, o que indica que o
primeiro é um tetrâmero (4 subunidades) e o segundo um dímero (2
subunidades).
d. Estudos de Simetria
O tipo de simetria de um dado enzima, deduzida por
cristalografia de raio-X pode, por vezes, ser usada para determinar o número
de subunidades num enzima, ou pelo menos, usada para excluir várias
estruturas de subunidade propostas.
2. Como estão as subunidades organizadas?
A disposição das subunidades num enzima oligomérico podem
ser usualmente deduzidas pelo tipo de simetria que as moléculas possuem
(através da cristalografia de raio-X). No geral, o arranjo das subunidades é tal
que permite o máximo de contacto entre subunidades. Assim, para um enzima
tetramérico, como o lactato desidrogenase, o arranjo geométrico preferencial é
o tetraédrico. Para um enzima hexamérico, o arranjo preferido será o
octaédrico.
3. Que forças estão envolvidas?
As forças envolvidas na associação de subunidades são as
fracas (não-covalentes) – ligações de hidrogénio, forças electroestáticas,
forças de van der Waals e forças hidrófobas. As superfícies envolvidas na
associação de subunidades são, na sua grande maioria (+ de 67%) não-
polares.
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"Economia genética" Porque são os enzimas
tão grandes?
Necessidade de múltiplas interações fracas para
dirigir a catálise
O enzima tem de ter área superficial suficiente para se ligar a múltiplos locais
na célula e para se integrar nas suas funões
metabólicas
4. Qual o significado, para o enzima, de ter múltiplas
subunidades?
Há, pelo menos, 4 possíveis razões que explicam que é vantajoso
para um organismo possuir enzimas com múltiplas subunidades:
a) A presença de múltiplas subunidades confere
possibilidades adicionais ao enzima de regulação da actividade catalítica;
b) A combinação de diferentes tipos de subunidades num
largo complexo permite uma variação nas propriedades catalíticas;
c) Aumento da estabilidade;
d) Associações geram grandes estruturas com determinada
simetria que podem dar origem a funções biológicas específicas com
“economia genética” (menos probabilidade de erro).
Flexibilidade estrutural (Enzima em solução)
Fenómeno crucial para função (alosteria e cooperatividade). Esta
mudança conformacional pode ser monitorizada por RMN e outras técnicas,
tais como: CD, Raios-X e fluorescência.
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As rotações ocorrem em torno de ligações simples, levando a
alterações conformacionais que se tornam no “passo limitante”.
Características Estruturais dos Enzimas
Estruturas globulares “empacotadas”;
Poucas cavidades preenchidas com H2O;
Alguns Asp no interior e Leu no exterior;
Múltilplos domínios;
Mr = 30 000 – enzima com uma cadeia polipeptídica ou subunidade
Mr > 50 000 – enzimas com várias cadeias polipeptídicas ou
subunidades
Classificação de Estruturas
Entre os vários sistemas de classificação para os elementos estruturais
em proteínas inteiras ou em domínios individuais, o mais utilizado tem sido o
sistema de quatro classes introduzido por Levitt e Chothia.
As quatro classes de estrutura da proteína são os seguintes:
1. Enzimas α – só têm estrutura em hélice-α (Exemplos: região
variável das imunoglobulinas);
2. Enzimas β – têm, maioritariamente, estrutura em folha-β
(Exemplos: região fixa e variável das imunoglobulinas);
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3. Enzimas α/β – têm segmentos mistos ou alternados de hélice-α
e folha-β (Exemplos: cinases e desidrogenases);
4. Enzimas α+β – têm estruturas em hélice-α e folha-β que estão
separadas ao longo da cadeia polipeptídica (Exemplos:
termolisina, lisozima e ribonuclease).
Famílias de folds Existem 9 superfolds (30% das proteínas)
Dependendo da função, os cinases têm um arranjo de folds
característicos.
Folding e Unfolding
Unfolding de Enzimas
A forma enrolada compacta de um enzima é geralmente
termodinamicamente mais estável que um enzima modificado (diferença de 20-
60 kJmol-1).
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Assim, a maioria dos enzimas podem ser facilmente desenrolados
(“unfolded”) e dissociados (no caso de enzimas com múltiplas subunidades)
por uma variedade de condições: valores de pH extremos, calor, adição de
solventes orgânicos, agentes caotrópicos e altas concentrações de ureia
e cloreto de guanidina.
A perda da estrutura tridimensional de um enzima enrolado é
conhecida como desnaturação. A desnaturação de um enzima pode ser
seguida pela perda de actividade, ou alteração de parâmetros-CD e
fluorimetria.
Folding de Enzimas
Em 1960, Anfinsen realizou uma experiência importante que mostrou
que um enzima desnaturado podia ganhar de volta a sua estrutura “folded”
quando o agentes desnaturante era removido – experiência com β-
mercaptoetanol (para quebrar ligações persulfureto) e ureia (enzima reduzido).
Esta experiência levou à conclusão de que a estrutura primária de um
enzima contém toda a informação necessária para o “levar” à estrutura
tridimensional.
Dogma de Anfinsen – nas condições ambiente (temperatura,
concentração de solvente…) às quais ocorre o folding, a estrutura nativa é
estável e cineticamente acessível com um mínimo de energia livre.
O folding de enzimas explica a especificidade de ligandos.
Deficiência de folding leva ao estudo da 2ª metade do código
genético
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Mr = 50 000 massa elevada interações adicionais
estarão ligadas à
regulação
Canalisação ("channeling") de substratos
Cofactores
Orgânicos
derivados de vitaminas
flavina
heme
Inorgânicos Iões metálicos Mg2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+
Enzimas em Sequência (e Regulação)
Aula 9 – Cofãctores. Mecãnismos de Cãtã lise Enzimã ticã.
Cofactores
Muitos enzimas requerem um componente não-proteico para
apresentarem actividade – esse componente denomina-se cofactor.
Channeling – processo de transferência
directa de um intermediário metabólico entre os
centros activos dos enzimas que catalisam duas
reacções sequenciais numa via biossintética: o
produto de uma reacção serve de substrato para a
reacção seguinte.
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Cofactores
Orgânicos
Grupos prostéticos
Coenzimas
Um enzima contendo um cofactor ou grupo prostético é denominado
holoenzima. Quando o cofactor é removido, passa a denominar-se
apoenzima.
Metalo-enzima – enzima que inclui na sua estrutura proteica, iões
metálicos. Neste caso o metal, com funções catalíticas e/ou estruturais, está
geralmente no centro catalítico.
Mecanismos de Catálise Enzimática
O que é?
É uma sequência de complexos com enzima durante a conversão de
substratos a produtos.
Grupo prostético – componente de origem
não proteica essencial para a actividade do enzima.
É parte integrante do enzima (não saem: ligam-se
permanentemente).
Coenzimas – complexos orgânicos ou
metalo-orgânicos que participam realmente na
catálise. Podem ser dadores ou aceitadores de
protões ou agentes nucleófilos que participam em
reacções de transferência de grupo. Ligam-se fraca
e não permanentemente aos enzimas.
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Estratégias de Catálise
Efeito de proximidade
Permite interações entre os substratos e
grupos funcionais para a reacção
Há um aumento de velocidade
cerca de 5 vezes
Efeito de orientação
Permite sobreposição de
orbitais electrónicas
Há um aumento de velocidade cerca de 100
vezes
Uma cinética de conversão entre esses produtos.
Tem de se ter em conta a estrutura de cada um dos complexos.
Catálise:
Ácido-base: resíduos de aminoácidos intervenientes dependem
do pKa da cadeia lateral. Este pKa no microambiente do centro activo pode ser
diferente do aminoácido isolado.
Covalente: há um complexo intermediário com ligação covalente
entre o enzima e o substrato. As cadeias laterais funcionam como nucleófilos.
Por estabilização do Estado de Transição: interacções
electroestáticas, ligações de hidrogénio e organização geométrica do centro
activo podem favorecer associação com estado de transição (mais forte do que
com substratos). Exemplo: anticorpos catalíticos.
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Aula 10 e 11 – Purificãçã o de Enzimãs. Exemplo
Porquê purificar enzimas?
A compreensão detalhada do comportamento de um enzima num
sistema complexo (num organelo subcelular ou na célula) passa pelo estudo
das suas propriedades num sistema mais simples.
A purificação de enzimas pode ter desvantagens em alguns enzimas,
como por exemplo os que se encontram ligados à membrana e que na
ausência de fosfolípidos ou detergente ficam inativos.
Os estudos com enzimas purificados permitem estudar:
A especificidade para o substrato;
Os parâmetros cinéticos da reação;
Modos de regulação da atividade enzimática;
E determinar a estrutura;
O mecanismo de catálise;
Aplicações em medicina, indústria e investigação (por ex.
desenho de drogas).
Objectivos da purificação de Enzimas
Máximo rendimento (baseado na percentagem de atividade do enzima
purificado comparada com a atividade total do extrato inicial)
Máximo de atividade catalítica (o enzima não deverá estar inativo ou
degradado)
Máximo de pureza (não deve conter outros enzimas ou
macromoléculas)
Antigamente pensava-se que a cristalização era uma prova da pureza do enzima. Hoje sabe-se que alguns enzimas, mesmo na forma cristalina, não se encontram puros. Na maior parte dos processos de purificação, a cristalização não é incluída, a não ser que se pretenda determinar a estrutura tridimensional do enzima.
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Estratégia
O procedimento a ser adotado para um dado enzima envolve escolhas como:
i) A fonte do enzima
ii) Métodos de homogeneização
iii) Métodos de separação
O progresso de purificação deve ser registado numa tabela.
i) Fonte do enzima
(Tecidos animais; Plantas; Microrganismos – bactérias, leveduras; Células em
cultura; Frações subcelulares – mitocôndrios, membranas, entre outros)
a. Abundância do enzima
A fonte deve possuir o enzima em grandes quantidades. Se não for
possível obter grandes quantidades pode-se manipular as condições de uma
dada cultura de forma que a produção do enzima seja aumentada. Apesar de
em alguns casos ser necessário utilizar a espécie WT, também se pode utilizar
tecnologias de DNA recombinante e produzir o enzima pretendido,
independentemente da fonte.
A produção de enzimas de células eucariotas em células procariotas
pode apresentar problemas, uma vez que as células procariotas não têm a
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maquinaria necessária para que ocorra transformações pos-traducionais.
Assim, o ideal será produzir o enzima numa célula eucariota mais simples,
como as leveduras, que apresentam crescimento rápido e não precisam de
muitos nutrientes.
b. Disponibilidade
Uma fonte com abundancia razoável de enzima pode não existir e
portanto, nestes casos é necessário haver um compromisso entre a
disponibilidade e a abundância do enzima.
c. Estudos comparativos
Pode-se estudar o enzima numa espécie diferente da pretendida. Para
tal é necessário o conhecimento das propriedades dos isoenzimas.
d. Localização subcelular
Se a reação catalisada por um dado enzima apenas ocorrer numa dada
localização da célula é necessário haver, na purificação desse enzima, um
passo de homogeneização ou de extração. Quando o enzima existe em mais
do que um lugar na célula é necessário proceder a um fracionamento celular. O
fracionamento celular é normalmente conseguido através de centrifugações
sucessivas (velocidade de rotação cada vez maiores), em que os organitos
maiores (núcleo, mitocôndrio,…) sedimentam primeiro
ii) Métodos de homogeneização
Existem diversos métodos para homogeneizar células e libertar o
seu conteúdo;
Dependem do tipo de tecido ou organismo utilizado como fonte de
enzima;
A utilização de uma solução tampão é de extrema importância.
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a. Tecidos de mamíferos
A falta de uma parede celular rígida permite uma fácil
homogeneização do tecido que é utilizado como fonte do enzima.
A extração tem de ser efetuada com uma solução isotónica
(quando é importante evitar a rotura de organelos, como os vacúolos) ou com
uma solução hipotónica.
Em alguns casos pode ser necessário adicionar inibidores de
proteases ou agentes redutores como o ditiotreitol.
b. Plantas, fungos e bactérias
As células têm uma parece celular rígida e portanto são
necessários métodos mais abrasivos como areia, congelação/ descongelação,
pressão mecânica prolongada (com ou sem esferas de vidro). Também podem
ser utilizados enzimas hidrolíticos
Nas plantas a homogeneização pode criar alguns problemas
pois, durante este processo, pode ocorrer a libertação do conteúdo dos
vacúolos (que são acídicos e contêm proteases), que poderá danificar o
enzima pretendido. A adição de um tampão apropriado e de inibidores de
proteases pode evitar tal danificação.
iii) Métodos de separação
As principais propriedades dos enzimas que podem ser exploradas
nos métodos de separação são:
Tamanho ou massa
Polaridade (carga ou hidrofobicidade)
Solubilidade (pH, força iónica)
Locais de ligação específica a outras moléculas
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Como avaliar o processo de purificação?
Análise da pureza do enzima
Avalia-se o processo de separação através de métodos de separação,
mas numa escala analítica. Exemplos: eletroforese, cromatografia (HPLC),
espectrometria de massa, cristalografia,…
Análise da atividade catalítica
o Testar a atividade do enzima nas diferentes frações;
o Testas cofatores e inibidores
o Construir uma tabela de purificação: em cada passo da
purificação, medir o volume da solução de enzima, a concentração de
proteínas e a atividade do enzima (velocidade de conversão do substrato em
produto em condições ótimas de temperatura e pH, com concentrações
saturantes de substrato e cofatores necessários). Exemplo:
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A bioinformática no planeamento da purificação de um
enzima
i) A informação na sequência de aminoácidos
a. Massa molecular do enzima
b. Carga versus pH, ponto isoelétrico (Importante na escolha do
tampão, da resina numa cromatografia de troca iónica ou numa precipitação no
ponto isoelétrico)
c. Coeficiente de absorção molar (a 280 nm, a absorvência de uma
proteína é devida à absorção dos seus resíduos de Trp, Tyr e Cys; método
utilizado na determinação da concentração de uma proteína purificada (ɛ(280nm)
= (Trp x 5500) +(Tyr x 1490) +(Cys x 125))
d. Conteúdo em cisteínas (enzima com muitas Cys adição de DTT
nos tampões previne a formação de ligações persulfureto, intra- e
intermoleculares
e. Estabilidade (é possível estimar o tempo de semivida de uma
proteína in vivo e o índice de instabilidade in vitro: se um enzima é
previsivelmente instável in vitro necessário baixas temperaturas e inibidores
na sua purificação
f. Hidrofobicidade e regiões membranares (a previsão de regiões
membranares num enzima afeta a estratégia de purificação do mesmo)
g. Semelhança na sequência sugere homologia e possível afinidade
para cofatores (a semelhança do enzima em estudo com outros já
caracterizados permite inferir a homologia com membros da mesma família e a
dependência de determinados substratos e cofatores)
h. Potenciais locais de modificações pós-traducionais (PTM) - Há
motivos conhecidos de PTM: glicosilação (NXS ou NXT); biotinilação (AMKM);
zinc finger (lig. metais) (F/YXCX2-4CX3 FX5 LX2HX3-4HX5)... Se um enzima é
glicosilado (ex. invertase) pode ser purificado por afinidade com uma coluna de
lectina
i. Solubilidade na sobre-expressão em E. coli (Alguns estudos
propõem a previsão da solubilidade de um enzima após sobre-expressão em E.
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coli; no entanto, manipulação das condições de crescimento permitem alterar
esta solubilidade)
ii) O que (ainda) não se pode prever a partir da sequência de
aminoácidos
a. Multi-subunidades; homomultímeros, heteromultímeros? Mesmo
com previsão da estrutura do enzima é impossível prever se o mesmo existe
em solução como monómero ou como um multímero (ex. hexâmero). Muitos
enzimas existem na célula como multi-complexos e a sua purificação depende
em muito da ligação aos seus interatuantes
b. Propriedades de precipitação (Ainda não é possível prever que
concentração de sulfato de amónio deve ser utilizada na precipitação de
determinada proteína)
iii) Recursos bioinformáticos. Exemplo: ProtParam, do ExPASy
(Expert Protein Analysis Software)
Como selecionar o método de purificação?
Cada enzima necessita de uma estratégia específica de purificação. O
método a utilizar depende da escala de preparação, do rendimento exigido, do
tempo disponível (e custos associados) e do equipamento e recursos
disponíveis.
Desenhar uma estratégia de purificação
i) Definir objetivos (pureza, atividade, quantidade – rendimento);
ii) desenvolver ensaios de atividade (para rápida deteção do enzima
recuperado em cada passo);
iii) Minimizar o uso de aditivos (podem requerer um passo adicional de
remoção ou interferir com a atividade);
iv) Remover (atempadamente) contaminantes que possam degradar ou
inativar os enzimas, por exemplo, proteases;
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v) Utilizar técnicas diferentes em cada passo (tirar partido das
características da proteína para a purificação (tamanho, carga,
hidrofobicidade, especificidade para ligandos...)
vi) Minimizar o nº de passos (evitar perda de rendimento)
vii) Combinar passos de maneira lógica (reduz o tempo de purificação, sem
comprometer a qualidade do produto final)
Exemplo
A purificação de enzimas é um processo dispendioso e nem todos os
enzimas podem ser purificados. É necessário, portanto, uma investigação
básica sobre a biologia celular e as vias metabólicas em que os enzimas
participam, a identificação do gene (e da sua sequência) que codifica para o
enzima.
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Aula 12 – Cine ticã Enzimã ticã. Introduçã o.
Classificação de uma Reacção
Molecularidade: define o número de moléculas que são alteradas na
reação, ou seja, o número de moléculas que reagem.
o Reação unimolecular AP
o Reação biomolecular A+ B P
o Reação trimolecular (raro) A+ B +C P
Ordem: descrição cinética da reação que define o número de termos de
concentração que devem ser multiplicados para obter a velocidade da
reação
o Reação de 1ªordem: a velocidade é apenas proporcional a uma
concentração (V α [A]);
o Reação de 2ª ordem: a velocidade é proporcional à multiplicação
de duas concentrações ou ao quadrado de uma concentração (V
α [A][B] ou V α [A]2);
o Reação de 3ª ordem: (…) V α [A][B][C].
Para uma reação que ocorre num único passo, a ordem, geralmente, é
igual à molecularidade. Numa reação que ocorre em vários passos, a ordem é
igual à molecularidade em cada passo.
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Cinética de Reações de 1ª ordem
A velocidade, , de uma reação de 1ª ordem ( → ) pode ser
expressa por:
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]
Integrando:
∫
[ ] [ ]
∫
Obtém-se:
[ ] [ ] ou [ ]
[ ]
Como [A]0 = constante ⇨ [ ]
Representando [ ] em função de :
[ ] [ ]
o Vida média, ⁄: tempo necessário para reduzir a concentração de
reagente a 50%
[ ]
[ ]
Cinética de Reações de 2ª ordem
A velocidade, , de uma reação de 2ª ordem ( → ) pode ser
expressa por:
[ ]
[ ]
[ ]
[ ][ ]
Se [ ] [ ] esta reação é complicada.
Assim, considera-se [ ] , logo [ ] [ ] e [ ] [ ]
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A velocidade é dada, então, por:
[ ]
[ ][ ] [ ] [ ]
[ ] [ ]
Integrando:
[ ] [ ]
[ ] [ ]
[ ] [ ]
[ ]
[ ] em função do tempo é uma reta com coeficiente angular [ ]
[ ]
Casos especiais
o [ ] [ ] cinética de pseudo – 1ªordem
o [ ] [ ] →
[ ]
[ ]
[ ][ ] [ ]
Integrando:
[ ]
[ ]
[ ]
[ ] em função do tempo é uma reta com coeficiente
angular
Reações reversiveis
Por exemplo:
No inicio, t=0, [ ] [ ] e [ ]
Quando t=t, [ ] [ ] e [ ]
[ ] [ ] [ ]
[ ]
Integrando:
[ ]
[ ]
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No equilíbrio, a velocidade global é nula, logo [P]t é constante, ou seja:
[ ] [ ]
A constante de equilíbrio (“global”) é:
[ ] [ ]
[ ] [ ] (
)
Combinando as equações anteriores, obtém-se:
Velocidade para uma reação de 1ª ordem
Pode determinar-se :
representando
em função do tempo;
e atraves de [ ] (
)
Pré-equilibrio
Trata-se de uma cinética complexa, a menos que se admita que [A·B] é constante
durante um período suficientemente longo da reacção (aproximação de estado-estacionário)
[ ]
⇨ [ ][ ] [ ] [ ] [ ]
A velocidade de reação é dada por:
[ ] [ ][ ]
Existem duas possibilidades:
Quebra rápida de , e [ ][ ]
Obtém-se duas
equações com duas
incógnitas
Sistema possível e
determinado!
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Quebra lenta de , e [ ][ ]
[ ][ ] [ ][ ]
Influência da Temperatura na velocidade de reação
A temperatura deve ser sempre controlada em ensaios cinéticos, no
entanto a sua variação pode ser informativa.
Equação de Arrhenius
Cada reação deverá ultrapassar uma barreira de eneria: o estado de transição (TS, X‡). Quando a temperatura é elevada, o
número de moléculas que ultrapassam essa barreira é maior. Resolvendo a equação em ordem a k:
Para determinar Ea, basta medir a duas temperaturas
(
(
))
(
)
Teoria da Colisão
(
)
Onde P é o factor de probabilidade (uma vez que nem todas as
colisões são eficazes) e Z o número de colisões por segundo.
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Teoria do estado de transição
Para determinar os parâmetros de ativação:
Determinar k a diferentes temperaturas;
Através do gráfico ln(k/T) em função de 1/T obtém-se ΔH‡;
Através da expressão:
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Obtém-se ;
Sabendo e , calcula-se .
Interpretação dos parâmetros de ativação
, Energia livre de ativação de Gibbs: determina a que velocidade uma certa
reacção ocorrerá a uma dada temperatura;
Medida da quantidade de energia de ligação que é perdida no estado de transição em relação ao estado fundamental (incluindo efeitos de solvente)
Medida da diferença na (des) ordem entre o estado de transição e o estado fundamental
o Para reações monomoleculares:
o Para uma reação bimolecular (duas partículas tem de encontrar-se no estado de transição para formar uma partícula, o que exige muito maior grau de ordem)
Cinética enzimática
A cinética enzimática não prova nada em termos de mecanismos. No
entanto, não precisa de enzima puro. Estes estudos fornecem informações
sobre grupos ativos e tipos de intermediários envolvidos na reação.
Os estudos cinéticos devem ser anteriores a quaisquer outros no estudo
do mecanismo.
Mecanismos de catálise enzimática – representações
Ex. Transferência de grupos
Wong e Hanes (1962)
A espécie que entra para a reação
encontra-se por cima da seta, a espécie
que sai encontra-se por baixo da seta.
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Cleland (1963) – mais utilizada
A linha horizontal representa o enzima; as espécies que entram para a
reação apresentam uma seta no sentido do enzima, as que saem apresentam
uma seta no sentido oposto.
Ainsworth (1975)
Esta forma de representação não mostra os intermediários formados. O
numero 1 corresponde ao enzima e o numero 11 corresponde a isomerização.
O simbolo ⁼ significa que a reação é reversível.
Mecanismo Theorell-Chance (1951)
Utiliza-se este mecanismo quando o composto intermediário não é
detetado experimentalmente.
Aula 13 a 16 – Cine ticã Enzimã ticã (cont.)
Michaelis e Menten (Hipótese do Equilíbrio Rápido)
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Van Slyke e Cullen (hipótese do estado estacionário para [EA])
Briggs e Haldane (hipótese do estado estacionário para [EA])
Equação comum
[ ] [ ]
[ ]
Sendo que [ ] [ ] [ ].
Como os ensaios são realizados em concentrações saturantes de
substrato, [ ] [ ] , no inicio a concentração de produto é insignificante em
relação à concentração de substrato, portanto, inicialmente [ ] [ ] . Obtém-
se então:
[ ] [ ] [ ]
Como geralmente a concentração de enzima inicial não é conhecida,
sabendo que a velocidade limite, V, é dada por:
[ ]
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Pode obter-se a seguinte equação:
[ ]
[ ]
Pode determinar-se os parâmetros cinéticos realizando um gráfico de
velocidade inicial em função da concentração de substrato:
Grandezas e unidades
[ ] ⇨Velocidade limite (mM s-1);
⇨ Constante catalítica ou número turnover (min-1)
⇨ Constante de Michaelis – concentração de substrato para a
qual a velocidade inicial é metade da velocidade máxima (mM)
⇨ Constante de especificidade (mM-1 min-1), determina a
“preferência” do enzima para os diferentes substratos, é uma medida da
eficiência catalitica
Unidades enzimáticas
U ⇨ quantidade de enzima que catalisa a formação de 1µmol de
produto por minuto (µmol min-1)
Katal (kat) ⇨ quantidade de enzima que catalisa a formação de 1
mol de produto por segundo (mol s-1)
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Formas alternativas da equação de Michaelis Menten
Pode-se variar a equação de Michaelis Menten de forma a obter as
constantes que pretendemos calcular:
Efeito da concentração do enzima
Quanto maior a concentração de enzima mais difícil será medir a
velocidade inicial da reação
Gráficos de 2 fases cinéticas
Nestes gráficos observa-se a diminuição da concentração de substrato
e de enzima livre, o aumento da concentração de produto e da concentração
do complexo enzima substrato. Observa-se um tempo inicial que corresponde
ao estado de pré-equilíbrio, e posteriormente a este tempo observa-se o estado
estacionário.
Para se observar o estado estacionário a diferença de concentração
entre o enzima e o substrato deverá ser da ordem 102.
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Eficiência
A razão
(unidade: s-1mM-1) permite saber a eficiência do enzima em
relação a um substrato. Quanto maior a razão, maior a eficiência. Quando a
razão é da ordem 108 (que é a velocidade de difusão dos metabolitos da célula)
o enzima denomina-se “wonderful enzyme”
Significado de Km
O valor de Km depende do substrato particular e das condições do
meio, como o pH, força iónica, temperatura, entre outros. O Km indica a
afinidade do complexo EA quando for maior que .
Km é dado por:
Enquanto a constante de dissociação, Kd é dada por:
[ ][ ]
[ ]
Km é igual a Kd se for menor que . Um Km elevado indica “weak
binding”, enquanto um Km baixo indica “strong binding”
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Parâmetros cinéticos
Os parâmetros cinéticos são:
Kcat
Km
Qual o substrato mais especifico?
Um maior
indica uma reação mais rápida para baixas concentrações
de substrato
Um maior Kcat indica uma reação mais rápida quando a concentração de
substrato é elevada
Constante de especificidade,
É o melhor parâmetro para comparar substratos que competem.
Quando esta constante é muito semelhante para dois substratos
coloca-se os dois substratos a competir experimentalmente.
Método de Lineweaver-Burk
Faz-se a inversão da equação de Michaelis Menten, obtendo-se:
[ ]
Representando
em função de
[ ] obtém-se uma
reta que, através do coeficiente angular, ordenada na
origem e abcissa na origem permite calcular os
parâmetros cinéticos.
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Método de Hanes
Método a utilizar em caso de
dúvida, pois é o mais correto.
Obtém-se a equação de Hanes
multiplicando a equação de Lineweaver-
Burk (que é o inverso da equação de MM)
por [A].
[ ]
[ ]
Método de Eadie-Hofstee
Caso o gráfico obtido seja linear, o enzima segue uma cinética
Michaeliana.
Método da Regressão Não Linear
Método iterativo;
Ajuste direto à equação da hipérbole, sem transformação dos erros;
Requer estimativas iniciais;
Requer meios computacionais.
Este método, no gráfico seguinte sobrepõe-se ao do método de
Hanes.
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Método da Regressão Hiperbólica
Aplicação do critério dos mínimos quadrados à equação da hipérbole,
tal como a regressão não linear, mas deduzindo fórmulas explícitas.
Critério dos mínimos quadrados
Fornece as melhores estimativas (menor variância), se:
1. Os erros nas medidas estão distribuídos segundo uma normal;
2. Só uma variável (variável dependente) está sujeita a erro (em cinética
enzimática é a velocidade);
3. Os pesos adequados são conhecidos;
4. Os erros não estão correlacionados, ou seja, a grandeza ou sinal de um
erro não tem influência na grandeza ou sinal de outro erro.
5. Erro sistemático pode ser ignorado, ou seja, a curva de distribuição para
cada erro tem média 0.
Métodos não paramétricos
Na prática, não é possível verificar a satisfação das condições de 1 a 5:
pouco se sabe sobre a distribuição dos erros.
Os métodos da estatística não paramétrica (ou "independentes da
distribuição") só exigem a satisfação da condição 5.
A regressão não paramétrica é baseada na generalização da noção de
mediana a espaços n-dimensionais. (2D no caso da equação de
Michaelis-Menten)
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Método direto (Eisenthal e Cornish-Bowden)
Não requer nenhum modelo do erro;
É um método simples e direto pois
não requer cálculos, requer apenas o gráfico
baseado nas retas do tipo:
[ ]
Experimentalmente, não se obtém uma
única interseção devido aos erros experimentais
associados aos valores. Faz-se então uso da
mediana das interseções
As interseções fora do primeiro quadrante não são consideradas.
Vantagens
Não requer cálculos;
Não implica ideias abstratas ou difíceis como distribuição normal
do erro;
Não necessita de saber qual o número de observações que se
deve fazer para cada concentração utilizada;
Insensível a outliers.
Mecanismo reversível de Michaelis Menten
No estado estacionário, a variação de x (concentração do complexo
EA) ao longo do tempo é nula:
A velocidade global da reação é dada pela equação:
E para quando a concentração de produto é igual a 0:
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A equação pode ser particularizada para quando a concentração de
substrato é igual a 0 (tem sinal negativo porque foi definido em termos de
variação de produto ao longo do tempo):
Comparando esta equação com a do sentido direto:
Obtém-se assim uma nova equação de velocidade geral, reversível:
Relação de Haldane
Sabe-se que no equilíbrio a velocidade de reação é nula, a
concentração de substrato variou desde o tempo inicial bem como a
concentração de produto, e que a constante de equilíbrio é a razão entre a
concentração de produto e a concentração de substrato:
Assim, da equação de velocidade geral reversível obtem-se:
A relação de Haldane é uma relação entre as constantes de
especificidade e constantes de equilíbrio:
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“One way enzymes”
Se o centro ativo do enzima for feito para complementar estritamente o
estado de transição, isto otimizará o enzima como catalisador para ambas as
direções. Contudo, se só uma direcção tiver significado fisiológico, a eficiência
nessa direção pode ser aumentada à custa da outra, desenvolvendo um centro
catalítico que reconheça melhor um reagente em detrimento do estado de
transição.
Aula 17 – Inibiçã o dã ãtividãde enzimã ticã (inibidores reversí veis e irreversí veis)
O melhor inibidor é o que tem como alvo o estado de transição do
enzima, ou seja, o complexo enzima-substrato.
Inibidores reversíveis: substancias que formam complexos dinâmicos
com o enzima
Inibição completa ou inibição linear: os parâmetros variam
linearmente com o inibidor.
Inibição hiperbólica ou inibição parcial: o complexo enzima-
substrato tem sempre atividade residual e os parâmetros cinéticos variam de
forma não linear com o inibidor
Classificação da inibição reversível
Competitiva (ou específica)
A velocidade limite mantém-se constante, o Km aumenta
(diminui a afinidade ao substrato) e a razão ⁄ diminui.
O enzima liga-se ao substrato (formando EA) ou ao inibidor
(EI) mas não a ambos (EAI)
O inibidor é estruturalmente semelhante ao substrato. A inibição
pode desaparecer aumentando a concentração de substrato.
Neste tipo de inibição o complexo enzima-substrato-inibidor (EAI)
não se dissocia no complexo enzima-substrato (EA), por isso a
constante de dissociação de EAI é infinita (Kii=∞)
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Mista
A velocidade limite diminui, o Km mantém-se
constante e a razão ⁄ diminui.
A inibição mista é em geral a inibição por produto.
Neste modelo não existem equilíbrios.
o Inibição não competitiva pura mista: é um tipo de inibição
mista, rara, em que a constante de inibição, Ki, é igual à
constante de dissociação de EAI, Kii.
Anti-competitiva (catalítica)
A velocidade limite diminui e o Km diminui (aumenta a
afinidade ao substrato) e a razão ⁄ mantém-se constante.
Neste tipo de inibição o inibidor só se liga a uma espécie
de enzima modificada, como por exemplo o complexo EA.
Na presença de inibidor o enzima passa a apresentar uma maior
afinidade para o substrato.
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O inibidor ao ligar-se ao EA impede a saída de
substrato uma vez que este não se liga ao enzima
diretamente (só à sua forma modificada). Assim, como a
espécie enzimática EI não existe, não há libertação de
substrato e portanto a constante de inibição é infinita (, Ki=∞)
Equações de velocidade da inibição reversível
Análise da Inibição (e cálculo de Ki e Kii)
Na determinação do tipo de inibição, os vários métodos de linearização
podem ser usados.
Gráfico de Hanes
Com inibidor, numa componente competitiva, aumenta o valor da
ordenada na origem. Numa componente anti-competitiva, aumenta o declive da
reta traçada.
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Gráfico linear direto
Num tipo de inibição
competitiva, no gráfico observa-se o
aumento de Km através da abcissa
dos pontos de interseção.
Na inibição mista
observa-se tanto o aumento do Km
como a diminuição da velocidade
limite. No caso da inibição não
competitiva pura (caso particular da inibição mista), o Km mantém-se constante
enquanto a velocidade limite diminui.
Na inibição anti-competitiva observa-se uma diminuição tanto do
Km como da velocidade limite.
Cálculo de K i e K i i
Os gráficos de Dixon e de Cornish-Bowden complementam-se na
determinação do tipo de inibição. Através do gráfico de Dixon pode-se
determinar o Ki, enquanto pelo gráfico de Cornish-Bowden pode-se determinar
Kii.
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Inibição pelo substrato
A utilização de concentrações elevadas de substrato pode levar à
inibição do enzima. A ligação do substrato a um segundo centro resulta em
inibição mista.
Para que o substrato não iniba o enzima, a concentração deste
deve estar entre 1/3 Km e 3 Km.
Inibição e ativação de enzimas
Inibição irreversível ou veneno catalítico: o inibidor liga-se
covalentemente ao enzima e a atividade deste diminui até ser nula. Este tipo de
inibição permite elucidar sobre grupos funcionais de centros ativos.
Reagentes com especificidade de grupo
Reagem com as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos.
Exemplo: Diisopropilfluorfosfato, iodoacetamida.
Marcadores de afinidade
Apresentam uma semelhança estrutural com o substrato e são
mais específicos que os reagente com especificidade de grupo. Exemplo: Tosil-
L-fenilalaninil clorometilcetona, que é análogo ao substrato para o
quimiotripsina.
Inibidores suicidas
Mecanismo de ação: são substratos modificados que inicialmente
seguem o mecanismo catalítico normal, mas depois há a formação de um
intermediário reativo que inativa o enzima por modificação covalente. Assim, o
enzima participa na sua própria inibição irreversível.
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Inibição – Base do desenho de drogas
A maior parte das drogas não são inibidores competitivos apesar de ser
aparentemente fácil desenhá-los.
A inibição deve ser comparada a velocidades constantes e não a
concentrações de substrato constantes;
O efeito do inibidor competitivo é facilmente retirado por pequenas
concentrações de substrato. O anticompetitivo é potenciado
Molécula “drug-like”
Regras dos 5 de Lipinski: resumo do que faz uma molécula
atravessar uma membrana por difusão passiva.
1. Não ser grande (massa molecular inferior a 500 Da);
2. Não ser lipófila (coef. partição etanol/agua 105)
3. Não ter grande capacidade de formar lig de H (máximo: 5 H dadores e
10 OH aceitadores)
O transporte mediado não deve ser considerado uma exceção!
Inibidor tight-binding – molécula que se liga fortemente mas de forma
reversível
Inibidor irreversivel – molécula que reage irreversivelmente levando à
perda de atividade do enzima
Inibidor mechanism-based ou inibidor suicida – “substrato” que leva
o enzima a reagir formando um estado inativado irreversível em vez de
produtos
Aula 18 – Deduçã o dã equãçã o de velocidãde de estãdo estãcionã rio
(me todo de King e Altmãn)
As concentrações das diversas espécies enzimáticas não variam ao
longo do tempo no estado estacionário, ou seja:
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Sendo , Concentrações das diversas formas enzimáticas do
mecanismo de catálise (incluindo a forma “livre” do enzima, ,
que é o somatório de todas as espécies enzimáticas envolvidas).
Pelo método de King e Altman obtêm-se expressões para , , …,
em função das constantes de velocidade dos vários passos do mecanismo.
Nestas expressões os denominadores são iguais em todas as espécies
enzimáticas e são a soma de todos os numeradores (de todas as espécies
enzimáticas).
A equação de velocidade é derivada a partir destas expressões,
considerando a formação do produto a partir de algumas das formas
enzimáticas.
Tome-se como exemplo o seguinte mecanismo:
1º passo Desenhar o padrão principal, onde
cada espécie de enzima corresponde ao
vértice de um polígono (como no exemplo
apenas existem 3 espécies enzimáticas, o
polígono obtido é um triângulo). Neste passo
também se deve identificar os processos que
levam à transformação entre cada espécie enzimática (por
exemplo para transformar E em EA o processo é k1A).
2º passo Desenhar todos os padrões possíveis contidos no
padrão principal. Regras:
i. Têm de conter todas as formas enzimáticas;
ii. Não existem ciclos (ou seja, os lados do polígono, n, são
reduzidos para n-1);
iii. Não têm em consideração a reversibilidade da
interconversão entre as duas formas.
Para o exemplo em estudo:
Apontamentos de Enzimologia, Licenciatura em Bioquímica
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Assim, para chegar à espécie enzimática E, os caminhos possíveis são:
EP EA E, o que corresponde a k-2k-1
EP E EA, o que corresponde a k-1k3
EAEPE, o que corresponde a k2k3
Logo a equação será:
∑
Para chegar à espécie enzimática EA, os caminhos possíveis são:
EP EA E, o que corresponde a k-1Ak-2
EP E EA, o que corresponde a k1Ak3
EEPEA: não existe porque a via EEP é irreversível
Logo a equação será:
∑
Para chegar à espécie enzimática EP, os caminhos possíveis são:
E EA EP, o que corresponde a k1Ak2
E EP EA, não existe porque a via EEP é irreversível
EAEEP: não existe porque a via EEP é irreversível
Logo a equação será:
∑
3º passo Escrever a equação de velocidade, tendo em conta os
passos da formação do produto. Neste caso o produto só se
forma a partir da espécie enzimática EP, na reação de k3:
Dividindo toda a equação pela concentração de E0, obtém-se:
Como
já é conhecido, substituindo obtém-se:
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∑
Concluindo:
Esta equação está na forma de Michaelis-Menten reversível
4º passo Agregar constantes, aplicando símbolos apropriados.
Sabendo que:
Obtém-se a seguinte equação:
Aula 19 – Cine ticã com 2 substrãtos (ou mãis)
Introdução
As reacções multi-substratos seguem equações complexas que
descrevem como se ligam os substratos e em que sequência.
A análise destas reacções é muito mais simples se a concentração de
um substrato A for mantida constante e a concentração de um substrato B for
variada. Nestas condições, o enzima comporta-se como um enzima de um só
substrato e o gráfico de v vs. [S] fornece o Km e V aparentes para o substrato
B.
Se for realizado um conjunto destas medições a diferentes
concentrações fixas do substrato A, estes dados podem ser utilizados para
descobrir qual é o mecanismo da reacção.
A maioria das reacções inclui 2 substratos e dois produtos (reacções bi-bi):
As reacções bi-bi podem ser descritas cineticamente pelo modelo michaeliano aplicado
às reacções uni-uni, considerando a concentração de um dos substratos constantes
(saturante).
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Mecanismos Reaccionais com 2 substratos
Podemos dividir as reacções com dois substratos em duas categorias
principais:
1. Aquelas que envolvem um complexo ternário
Neste caso a reacção → , prossegue via complexo
ternário do tipo EAB e EPQ, onde: → e → .
Esta categoria pode também ser dividida:
a. Reacções onde o complexo ternário é formado por um
mecanismo sequencial, ou seja, reacções onde o substrato B só se pode ligar
ao enzima depois do substrato A já estar ligado. Segue-se um exemplo:
b. Reacções onde o complexo ternário é formado por um
mecanismo random, ou seja, qualquer um dos substratos se pode ligar
primeiro. Segue-se um exemplo:
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c. Mecanismo de Theorell-Chance, onde existe uma ligação
ordenada de substratos e libertação ordenada de produtos. No entanto, o
tempo de vida do complexo ternário é extremamente curto, pelo que se torna
cineticamente insignificante.
2. Aquelas que não envolvem um complexo ternário
a. Mecanismo ping-pong, onde é formada uma forma
modificada do enzima, E’, juntamente com o primeiro produto, antes do
secundo substrato se ligar:
Elucidação do mecanismo
1. Estudos na ausência de produtos (mantendo alternadamente
um dos substratos constantes);
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a. Sequencial, com B constante e A a variar
b. Não sequencial, com B constante e A a variar
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2. Estudos de inibição por um dos produtos (supondo
mecanismos reversíveis).
A adição de um só dos produtos só altera as equações de
velocidade por adição de termos ao denominador. O produto actua como
inibidor: pelo tipo de inibição elucida-se o mecanismo.
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Equação de Dalziel
Em Enzimologia, é a equação formal para reacções com 2 substratos.
Mecanismos Reaccionais com 3 ou mais substratos
Estes mecanismos são raros, mas importantes.
Um exemplo de enzimas que apresentam este tipo de mecanismos são
os aminoacil-tRNA sintetases. No entanto, 3 substratos não implicam 3
produtos (em geral TerBi).
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Exemplo de mecanismo TerTer
BiUniUniBi
Aula 20 – Simulãçã o de mecãnismos enzimã ticos
Simulação do mecanismo
Objectivo:
Obter as variações das concentrações ao longo do tempo.
- Todas: A, P, E, EA, mesmo aquelas que são difíceis de medir.
- Com as concentrações podem-se calcular velocidades
Motivação:
Explorar diferentes cenários: mudar o mecanismo, mudar constantes
cinéticas, mudar concentrações iniciais.
Vantagem:
Não se parte de hipóteses sobre a variação dos complexos EA, EP
(equilíbrio ou estado estacionário)
Verificamos à posteriori se essas hipóteses são razoáveis.
Princípios da simulação cinética
Relação fundamental entre as velocidades
das reações e as variações das concentrações ao
longo do tempo:
Por aplicação da lei de conservação da massa durante um intervalo Δt
e passagem ao limite quando Δt 0, obtém-se a Equação diferencial ordinária
(ODE).
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Onde os fatores que levam ao consumo de A têm sinal negativo e os
que levam à sua formação têm sinal positivo.
Estado estacionário e período pré-estado estacionário
Cinética de estado-estacionário (steady-state)
* concentração das espécies intemediárias EXi é constante
* velocidade de formação é aproximadamente a velocidade de
conversão
* podem ser feitas medidas em espectrofotométricas convencionais
Cinética de pre-steady-state
* Período inicial da reação durante o qual a formação de um
intermediário específico excede a sua conversão
* Medidas com espectrofotometria stopped-flow com dispositivo
mistura-rápida e um dead time para análise de dados de ~1 ms
Aula 21 – Enzimologiã in situ.
Determinações
In situ – significa no lugar. Em termos de Enzimologia in situ refere-se
ao estudo de enzimas no local onde eles se encontram (no seu habitat natural);
In vivo – refere-se à experimentação feita dentro ou no tecido vivo de
um organismo vivo, em oposição a um parcialmente ou totalmente morto.
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A concentração de proteína,
dissolvida, in vivo é de 100 mg/mL !
In vitro – processos biológicos que têm lugar fora dos sistemas
vivos, no ambiente controlado e fechado de um laboratório.
Enzimologia in situ
O objectivo desta área é estudar enzimas no seu habitat natural.
In vitro:
↓[proteína]
↑[substrato]
In vivo:
↑[proteína]
↓[substrato]
Utilizando-se NMR consegue medir-se a concentração de quase tudo.
É necessário preservar a concentração celular dos enzimas.
Como permeabilizar a célula de um modo suave? É necessário ter
em conta a concentração de proteína exposta ao meio reaccional.
O azul de Comassi é constituído por três espécies principais e por
nove espécies secundárias.
A digitonina é insolúvel em água à temperatura ambiente. Também é
um composto termoestável. Assim, na preparação da digitonina deve
aquecer-se a água e adicionar-se a digitonina em água quente para
que seja solúvel. Tem de se utilizar agitação. Caso contrário, há
sedimentação da levedura na cuvette.
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Aula 22 e 23 – Biocãtãlisãdores & Enzimãs ãmbientãis
Biocatálise:
Área fundamental da biotecnologia
É a utilização de um catalisador biológico (biocatalisador) numa
reacção química específica
Biocatalisador – inclui não só enzimas, mas também células,
organitos celulares, ribozimas, ou anticorpos catalíticos
Cooperação interdisciplinar:
Enzimas como biocatalisadores
1. A tecnologia de enzimas é uma alternativa mais “limpa” que os
processos químicos, que são menos “amigos do ambiente”
2. Usados diretamente no tratamento de desperdícios
3. Ferramentas analíticas na monitorização ambiental – biossensores
4. Transformam substratos naturais em produtos de elevado valor
acrescentado
5. Os enzimas podem ser naturais ou recombinantes, livres ou
imobilizados
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Células intactas como biocatalisadores
1. Não requerem regeneração de cofatores
2. Podem ocorrer reações secundárias
3. Necessitam de equipamento dispendioso, tempo de otimização das
condições operacionais, controlo preciso do metabolismo
4. Podem ser usadas células intactas livres ou imobilizadas
Enzimas ou células?
Vantagens do uso de enzimas como biocatalisadores
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Custo (elevado?) dos enzimas
Preços dependem de:
• Pureza
• Do tipo de enzima
• Próprio custo de produção do enzima, mas também da sua
contribuição para o produto final
• Não diferem muito do custo de outros catalisadores
O preço do enzima deve ser comparado com o valor do produto final.
Estabilidade de um enzima:
Muitos são instáveis a temperaturas elevadas ou valores
extremos de pH
Outros em solução podem perder actividade à temperatura
ambiente
É fundamental que o enzima seja estável nas condições de
operacionais do processo de fabrico.
Regeneração de cofactores em sistemas com enzimas:
• Cofatores como o NAD(P) ou NAD(P)+ nem sempre são fáceis de
regenerar
• Se o enzima for dependente de cofatores, tem que existir no meio um
sistema de regeneração dos cofatores, de forma económica e eficiente.
Exemplos de como regenerar os cofatores:
1. Usar uma reação acoplada! - O NADH necessário na reação de
redução é regenerado com o enzima álcool desidrogenase e
etanol (um reagente barato, logo o processo é económico)
2. Usar um cofator macro-molecularizado num reator de
membrana! - O NADH é ligado ao PEG (NADH-PEG),
aumentando a massa molecular do cofator. Isto permite que o
cofator fique retido dentro do reator (dentro da membrana) com
os enzimas, enquanto que o substratos e os produtos passam
pela membrana livremente.
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Fonte dos enzimas
Plantas
Animais
Microrganismos
Enzimas recombinantes
Imobilização de enzimas
Limitação do movimento, através de processos químicos ou físicos:
• Método eficiente, fácil, barato e universalmente aceite para aplicações
na indústria alimentar e em medicina
• A velocidade de reacção e o rendimento dependem de vários
parâmetros: tipo de suporte, pH, temperatura, concentração de substratos
• Optimização empírica
• Método mais comum: ligação a suportes (carriers) porosos
• É necessário o conhecimento das propriedades na superfície do
enzima: hidrofobicidade, grupos iónicos, grupos funcionais
• Pode ser necessário fazer engenharia da superfície do enzima
• Introdução de grupos funcionais de forma a aumentar as ligações, a
estabilidade e a actividade
• Alteração do ponto isoeléctrico
Vantagens da imobilização de enzimas
Reutilização do enzima após remoção dos produtos (reduz os custos)
Facilidade de isolamento do produto
Uso em processo contínuo (devido à reutilização)
Aumento da estabilidade do enzima
Limitações da imobilização de enzimas
Custo dos carriers e da imobilização
Alterações das propriedades
Problemas com a regeneração de cofatores
A produção poderá não conseguir
responder às necessidades de mercado
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Problemas com sistemas multienzimáticos
Perda de atividade durante a imobilização
A imobilização de enzimas pode ser feita de várias formas:
1. Cross-link
Método barato, mas não muito usado na imobilização de enzimas
solúveis com objetivo de biocatálise:
São poucos os enzimas imobilizados que apresentam
elevada atividade
Os agentes de cross-link podem desnaturar o enzima
Usado com sucesso em cristais de enzimas
Cross-link de proteínas com glutaraldeído:
2. Ligação a um suporte (carrier)
Método bastante utilizado na imobilização de enzimas
O suporte deve ser inerte e estável
Classificação do carrier (material de que é feito, origem ou
estrutura):
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o Inorgânico (Ex. sílica, vidro, argilas)
o Orgânico de fontes naturais (Ex. derivados da
celulose, dextrano, polisacáridos, agarose)
o Orgânico de materiais sintéticos (Ex. poliestireno,
polímeros acrílicos)
Características do carrier:
o Químicas - hidrofobicidade, estabilidade química e
microbiológica
o Morfológicas - diâmetro da partícula, tamanho do poro,
capacidade da superfície para adsorção
o Mecânicas - resistência à pressão e
compressibilidade, elasticidade
o Gerais - custo, food or pharma grade
Métodos mais utilizados – Adsorção
Os enzimas são adsorvidos à superfície (interna ou externa)
de um suporte através de interacções fracas (electrostáticas,
iónicas, de hidrogénio, van der Waals)
Com o passar do tempo os enzimas podem perder-se, uma
vez que as interacções envolvidas são fracas
Como se processa:
• Misturar o enzima com o material adsorvente, em
condições adequadas de pH e força iónica
• Incubar
• Lavar os enzimas não adsorvidos ou fracamente ligados
Métodos mais utilizados – Ligação covalente
Os enzimas são ligados covalentemente a uma matriz
É utilizada em gamas alargadas de pH, força iónica e outras
condições variáveis, por ser muito estável
Os grupos mais reativos no enzima são: amina e hidroxilo. No
entanto, os resíduos de lisina são os mais utilizados
o Elevada abundância à superfície da proteína
o Elevada reatividade
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o Geralmente não estão envolvidos no centro ativo dos enzimas
o Elevada estabilidade da ligação com o suporte
As ligações dependem do suporte e do grupo envolvido na reação.
Os enzimas podem ser inativados se a ligação promover alterações no
centro ativo. O sucesso deste método para a biocatálise depende da correta
conformação do enzima e acessibilidade do centro ativo
Este método pode ser combinado com um cross-linker, como o
glutaraldeído, de forma a formar agregados de proteína:
3. Entrapment ou encapsulamento
Entrapment:
Os enzimas são misturados com o precursor do
gel ou com os monómeros de gel; o gel forma-se (ou polimeriza
a partir do monómero) e o enzima fica preso no seu interior
O tamanho do poro do gel é crucial e depende do
tamanho do enzima que se pretende imobilizar
Encapsulamento:
A solução contendo os enzimas é encapsulada no
interior de uma estrutura que contém uma membrana
semipermeável (cápsula)
A membrana geralmente é de nitrato de celulose
ou nylon
Método barato e fácil, mas a sua eficácia depende da estabilidade
do enzima.
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Aplicações com enzimas imobilizados
Biorreatores – produção de L-aminoácidos por amino ciclases
(catalisam a desacetilação dos aminoácidos);
Biossensores – deteção e quantificação de diversos compostos em
amostras complexas;
Biorremediação – remoção e desintoxicação de contaminantes;
Imobilização de células
• Alternativa à imobilização de enzimas
• A característica mais importante é a atividade e estabilidade dos
enzimas de interesse
• Não é relevante se as células estão vivas ou mortas (permeabilizadas),
desde que os enzimas estejam ativos
• Os métodos utilizados são os mesmos descritos para a imobilização de
enzimas:
• Adsorção
• Ligação covalente
• Cross-link de células
• Encapsulamento ou aprisionamento (entrapment)
Aula 24 – Engenhãriã de proteí nãs
O catalisador ideal:
Maior estabilidade
Maior seletividade
Maior gama de substratos
Como obter novos e melhores biocatalisadores?
Screening clássico
o A partir de coleções de culturas
o Recolha de amostras de ambientes
Biblioteca ambiental de genes (environmental gene library)
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o Metagenoma ambiental: genomas combinados de todos os
microrganismos de um dado meio ambiente
o Screening das bibliotecas (ex. procurar clones com determinada
atividade)
Pesquisa em bases de dados
o Projectos de sequenciação de genomas e de sequenciação
massiva
o Muitos enzimas (ainda) não caracterizados
Melhoramento de um biocatalisador conhecido
o Desenho racional (engenharia baseada na estrutura, site-directed
mutagenesis)
o Evolução dirigida (mutagénese aleatória, gene shuffling)
Aula 25 – Engenhãriã de viãs metãbo licãs
Bioengenharia
Uma estirpe que produz um determinado produto de interesse pode ser
manipulada para produzir mais e novos produtos:
a. Combinação de substratos naturais com análogos do substrato
(precursor-directed biosynthesis);
b. Manipulação genética do enzima para utilizar análogos do substrato
com maior rendimento;
c. Engenharia de vias metabólicas, expressando genes heterólogos
para a obtenção de um novo produto;
d. Engenharia de vias metabólicas através da combinação de
diferentes vias biosintéticas (de diferentes organismos) num único organismo,
dando origem a um híbrido e novos produtos naturais
e. Síntese enzimática a partir de enzimas purificados, manipulados
geneticamente ou não, livres ou imobilizados, utilizando diferentes substratos;
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Engenharia de vias metabólicas
Envolve a construção e a manipulação do metabolismo celular através
da alteração das actividades e níveis de enzimas, endógenos ou heterólogos,
para atingir a biosíntese ou a biocatálise dos compostos de interesse.
Vantagens:
Aumento do rendimento
o Novos enzimas mais eficientes
o Utilização de menor quantidade de matéria-prima
o Menor produção de desperdícios
o Aumento dos níveis de produção
Maior eficiência relativamente aos processos químicos
Menor dependência de recursos naturais
Técnicas analíticas mais utilizadas:
Genómica
Transcriptómica
Proteómica
Metabolómica
Depende ainda da engenharia
de enzimas, da descoberta de novos
enzimas, da biologia e bioquímica de
sistemas (cataloga novas vias, novas
redes metabólicas e as estratégias de regulação de diferentes organismos -
com interesse para desenvolver novas funções celulares) e da biologia sintética
(desenvolve novas estratégias para perturbar as redes metabólicas endógenas,
permitindo a obtenção de dados de sistemas em condições de celulares não
fisiológicas).
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Simulação combinatória (in silico)
Análise in silico (simulação cinética) na optimização de vias
metabólicas:
Depende de modelos, o mais próximos possível da realidade,
baseados em parâmetros obtidos experimentalmente
Permite perceber os circuitos moleculares que controlam sistemas
biológicos complexos
Permite reduzir o tempo e os custos associados com os métodos
tradicionais experimentais
Permite simular o comportamento de determinados sistemas
metabólicos por alteração dos componentes do sistema
Passos que envolvem a simulação:
1º passo Abstração do modelo: Seleção de vias metabólicas que
incluam os principais componentes que controlam os fluxos metabólicos.
2º passo Construção do modelo: Desenvolvimento de um modelo
computacional (de referência) das vias metabólicas selecionadas, baseado no
conhecimento existente dos parâmetros do sistema (concentração de enzimas,
parâmetros dos enzimas,…).
3º passo Otimização do modelo: Perturbação do modelo de referência
(por ex. a deleção do gene ou a sobre-expressão do enzima) em posições
selecionadas (únicas ou múltiplas) de forma a aumentar a produção de um
determinado composto.
4º passo Teste experimental: Desenho de novas experiências (novas
estirpes, melhoradas) com base nos resultados das simulações.
5º passo Iteração do modelo: Otimização do modelo até o
comportamento experimental do sistema ser satisfatório, num processo cíclico.
6º passo Produção industrial: Scale-up das culturas com o objetivo de
produção do composto à escala industrial
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Biologia sintética e engenharia genética
Envolve a engenharia genética das vias biossintéticas naturais para a
produção de novos compostos utilizando vias metabólicas de outros
organismos.
A estratégia mais utilizada é a produção de pequenas moléculas em
hospedeiros microbianos através da expressão de vias biossintéticas
heterólogas.
Produção de proteínas recombinantes
Há uma grande procura de elevados níveis de produção de proteínas
por parte das indústrias farmacêutica e biotecnológica.
As culturas de células de mamíferos são ideais para a expressão e
produção de proteínas humanas, mas:
São caras
Não permitem a produção de proteínas em larga escala
Produção de proteínas recombinantes em células de insetos, fungos ou
bactérias com maior rendimento e baixo custo.
Utilização da via secretória de forma à proteína sair da célula à medida
que é expressa (facilidade de isolamento)
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Aulã 26 e 27 – Regulãçã o dã ãtividãde enzimã ticã
Porquê que é necessário haver regulação?
Manter homeostase;
Adaptação a mudança ambientais (de nutrientes…);
Catalisar vias metabólicas em sentidos diferentes (ciclos de substrato);
Capacidade de grandes mudanças de fluxos metabolitos com pequenas
variações de concentração dos metabolitos envolvidos.
Cinética Michaeliana é insuficiente
Se a concentração de substrato for muito superior ao Km, ao
variar a concentração de substrato a atividade do enzima não
vai ser alterada.
Se a concentração de substrato for igual ou inferior ao Km, a
variação da concentração de substrato leva a uma variação
moderada da atividade enzimática.
Para que a velocidade da reação varie de 10% para 90% da
velocidade máxima da reação, a concentração de substrato tem
de aumentar 81 vezes.
Modos de regulação
Quantitativos (escala de tempo lenta) – coarse control
– Regulação da síntese proteica (em vários passos possíveis)
– Regulação da proteólise
Neste tipo de regulação existe uma modificação na espécie enzimática
inicial.
[ ]
[ ]
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Qualitativos (escala de tempo rápida) – fine control
– Modificação covalente irreversível
– Modificação covalente reversível
– Modificação conformacional induzida por ligando
Neste tipo de regulação pode ocorrer uma modificação covalente que
leva à alteração da constante de velocidade, , ou modificações de
conformacionais que alteram a função do enzima.
Modificações covalentes irreversíveis
Proteína precursora inactiva (zimógeno)
Activada por acção de proteases
Comum em proteases com actividade extracelular
Digestão/coagulação sanguínea/resposta imune (sistema do
complemento)
Modificações covalentes reversíveis
Fosforilação/desfosforilação (muito comum): integradas em vias de
sinalização – amplificação de sinal
o Cinases de proteína fosforilam resíduos de:
– Serina/Treonina (geralmente ‐ regulação de metabolismo)
– Tirosina (geralmente – crescimento e diferenciação celular)
– mais raras: histidina, lisina, arginina, glutamato e aspartato
Outras modificações:
– Adenilação
– Ribosilação…
Modificações Conformacionais
Observações experimentais:
– Muitos enzimas do primeiro passo da via eram inibidos por produtos
do final da via estruturalmente distintos dos seus substratos e produtos;
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– Cinéticas sigmoidais;
– Oligómeros;
– Era possível interferir com ligação do inibidor sem afectar ligação de
substratos.
Alosteria
• Propuseram que inibidores (ou activadores, efectores) se ligassem
noutro local do enzima que não o centro activo;
• Este centro poderia estar distante do centro activo e ter forma
diferente – centro alostéreo;
• Ligação do efector poderia induzir modificações conformacionais que
teriam impacto no centro ativo.
O centro alostéreo pode ativar ou inibir o enzima:
Cooperatividade
Propriedade de enzimas e proteínas que respondem com grande
sensibilidade a variações de concentração de substratos ou efetores
Variação de velocidade com concentração de substrato (ou efector) não
hiperbólica – maioria dos casos apresentam cinéticas sigmóides
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A cooperatividade pode ser:
o Homotrópica (se o ligando for semelhante para todos os centros
ativos) ou heterotrópica (se os ligandos tiverem naturezas
diferentes)
o Pode ser positiva (se a ligação de um ligando promove a ligação
dos outros – o enzima pode deixar de apresentar sigmoicidade),
negativa (se a ligação de
um ligando impede a
ligação dos outros) ou
mista (se a ligação de
um ligando promove ou
impede a ligação dos
outros dependendo da
concentração a que se
encontra).
Exemplo mais conhecido: hemoglobina.
Proteína oligomérica com cooperatividade homotrópica positiva
Ligação do substrato a uma subunidade induz aumento de
afinidade nas restantes subunidades
Alosteria≠Cooperatividade ≠Oligomeria
Um enzima pode:
– Ter centros alostéreos sem apresentar cooperatividade e sem
ser oligomérico
– Ter cooperatividade sem ser oligomérico e sem ter centros
alostéreos
– Ser oligomérico sem ter alosteria nem cooperatividade
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Para ajustar ligação da hemoglobina ao oxigénio, Hill formulou a
seguinte equação:
[ ]
[ ]
Em que Y é a fração de proteína ligada, [A] é a concentração de
substrato, é a constante de semi-saturação, e é o coeficiente de Hill.
Para enzimas a equação é a seguinte:
[ ]
[ ]
Na equação de Michaelis Menten o coeficiente de Hill é igual a 1, ou
seja, não existe cooperatividade.
Quando a cooperatividade é positiva, h > 1; quando a cooperatividade é
negativa, h < 1.
Modelos explicativos
Modelo de Hill
No modelo de Hill a cooperatividade é extrema, ou seja, ou não há
ligação de substrato ou todos os centros têm substrato ligado.
O índice de cooperatividade apenas indica o número de centros de
ligação para o ligando na situação limite.
O gráfico de Hill obtém-se através da seguinte equação:
(
) [ ]
Onde h é o declive da reta e é a ordenada na origem.
Índice de cooperatividade ( ) – Razão entre as concentrações de
ligando para as quais e
Quando o h diminui, o aumenta e tem-se cooperatividade negativa.
Quando o h aumenta, o diminui e tem-se cooperatividade positiva.
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Modelo de Adair
Supõe-se que existem dois centros de ligação no enzima.
É um modelo geral para interação entre proteína e múltiplos ligandos,
assumindo associação/dissociação em equilíbrio.Este modelo soluciona o
problema do modelo de Hill, ou seja, a cooperatividade não é extrema.
São as constantes de cooperatividade intrínseca que ao variarem
permitem explicar a cooperatividade.
Se o valor de K, constante de dissociação microscópica, aumentar,
tem-se cooperatividade negativa.
Se o valor de K diminuir, tem-se cooperatividade positiva.
As definições de cooperatividade por Hill e Adair não são totalmente
equivalentes mas são quantitativamente idênticas (ambos definiram um índice
de cooperatividade: se se observar cooperatividade positiva pela equação de
Hill também se observará em Adair mas o valor será diferente, consoante a
equação que se aplique). A equação de Adair (quando aplicável) tem maior
significado físico dado que é mais adequado pensar-se que os ligandos se
ligam a tempos diferentes, mas não permite calcular .
Induced-fit
Surge o conceito de flexibilidade e desaparece o conceito de
proximidade. Segundo este modelo à uma alteração conformacional no enzima
e posteriormente ocorre a ligação do ligando: o centro ativo tem o potencial
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para ligar o substrato mas só adota a conformação correta quando este se liga
(alteração conformacional conseguida pela ligação dos diferentes grupos do
substrato com o enzima).
Este modelo permitiu explicar a alosteria e a cooperatividade como
efeitos à distância.
Modelos modernos de cooperatividade
Modelo MWC – Monod, Wyman,Changeux(1965)
Modelo Concertado ou Simétrico:
Enzimas oligoméros em que, na ausência de ligando, cada
subunidade pode estar em duas conformações: R (relaxada –
representada por um circulo) e T (tensa – representada por um
quadrado)
Substrato tem maior afinidade para a forma relaxada (Kr<Kt)
No oligómero, todas as subunidades têm a mesma conformação,
ou estão todos na forma relaxada ou todos na forma tensa.
Aforma tensa, Tn, está em equilíbrio com a forma relaxada, Rn,
com constante de equilíbrio
– constante alostérea.
A equação para geral é dada por:
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Casos particulares:
1. Quando n=1, apenas existe um centro de ligação por enzima,
logo:
2. L= 0, da equação
retira-se que T=0, ou seja, não existe a
forma tensa do enzima. Não existe cooperatividade. A equação
é dada por:
3. L→∞, da equação
retira-se que R=0, ou seja, não existe
a forma relaxada do enzima. Não existe cooperatividade. A
equação é dada por:
Resumindo, segundo este modelo:
Para haver cooperatividade são necessárias 2 conformações
(pelo menos)
Essas formas tem de ser funcionalmente diferentes (KR ≠ KT )
Explica modificadores alostéreos (efeitos heterotrópicos):
o Ativador – tem maior afinidade pela forma relaxada
o Inibidor – tem maior afinidade pela forma tensa.
Apontamentos de Enzimologia, Licenciatura em Bioquímica
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Modelo KNF‐Koshland, Némethy,Filme r
A proteína só pode ter diferentes conformações na presença de
ligandos.
Assim, as diferentes conformações não estão implícitas na proteína e só
ocorrem se houver ligandos.
A presença de ligandos induz uma alteração conformacional que é
perpetuada às outras subunidades.
Este modelo permite ultrapassar os problemas do modelo MWC, pois
admite a existência de formas híbridas e permite explicar a cooperatividade
negativa.
Quando A se liga ao enzima na forma T, a forma T passa à forma R.
Este modelo permite explicar diferentes tipos de fenómenos de
cooperatividade das ciências da vida.
Ambos os modelos existem porque admitem que as proteínas são
oligómeros. No entanto, pode haver cooperatividade em proteínas só com uma
subunidade.
Resumindo, este modelo:
Gera expressões de y vs a complexas, por exemplo:
A forma da curva é determinada pela relação entre KR:R e KR:T
K0.5 depende de KT, KA e KR:R
Consegue explicar cooperatividade positiva e negativa consoante
relação entre KR:R e KR:T
o
– Cooperatividade positiva (R:R mais estável que R:T)
o
– Cooperatividade negativa (R:T mais estável que R:R)
O enzima encontra-se
inicialmente na sua forma tensa e vai
passando para a forma ativa, relaxada,
conforme seja necessário.
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Modelos de associação‐dissociação
Cooperatividade pode resultar de equilíbrio entre formas de proteína
em diferentes estados de agregação (não há relação entre cooperatividade e
alterações conformacionais)
O ligando tem afinidades diferentes para as diferentes formas
Semelhanças com o modelo de simetria mas nas equações aparece
concentração de proteína (o que constitui uma vantagem prática)
Modelos cinéticos
Modelo de Ferdinand e Rabin
A cooperatividade pode surgir por motivos cinéticos.
Consequentemente, uma única cadeia pode ter cooperatividade sem ter uma
estrutura quaternária.
Modelo de Rabin
É o substrato que provoca alterações conformacionais no enzima (E’’A)
e é só assim que vai ser possível dar o produto.
‘’O enzima tem memória’’ e ‘’lembra-se’’ da conformação que tinha
quando o substrato estava em baixas concentrações. A este fenómeno
designa-se por histerese (tendência de um material ou sistema de conservar
suas propriedades na ausência de um estímulo que as gerou)