Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej
Anna Majewska
Warszawa, 2018
WIRUSY CHOROBOTWÓRCZE DLA CZŁOWIEKA
TOK BADANIA WIRUSOLOGICZNEGO
METODY STOSOWANE W DIAGNOSTYCE
WIRUSOLOGICZNEJ
OGÓLNA CHARAKTERYSTYKA WIRUSÓW
• Małe rozmiary (20 nm-300 średnicy)
• Brak budowy komórkowej
• Zależą całkowicie od żywych komórek
• Nie rosną na podłożach sztucznych
• Bezwzględne pasożytnictwo wewnątrzkomórkowe
• Posiadają jeden rodzaj kwasu nukleinowego
• Nie namnażają się przez podziały
• Są niewrażliwe na antybiotyki
kwas nukleinowy (DNA lub RNA)
DNA jest zwykle dwuniciowy (wyjątek parwowirusy)
RNA jest zwykle jednoniciowy (wyjątek reowirusy)
jednoniciowy RNA - o dodatniej (mRNA) lub ujemnej polarności (transkrypcja
do kopii o dodatniej polarności)
Budowa wirusa
kwas nukleinowy + kapsyd = nukleokopsyd
Funkcje kapsydu:
• ochronna
• udział w adsorpcji i wnikaniu wirusa do komórki przez interakcje
z receptorami błony komórkowej
Nukleokapsyd o symetrii ikosaedralnej
liczba kapsomerów
jest cechą taksonomiczną
adenowirusy
herpeswirusy
pikornawirusy
Nukleokapsyd o symetrii helikalnej (spiralnej)
• kapsomery spiralnie otaczają
kwas nukleinowy
• wydłużony kształt
rabdowirusy
filowirusy
wirus Ebola
Osłonka
nabyta z błony komórkowej podczas późnych faz replikacji
glikoproteiny
przyleganie do receptorów komórkowych
pobudzanie interakcji z białkami nukleokapsydu
(dojrzewanie potomnych cząstek wirusa)
osłonka wirusa
wszystkie wirusy o symetrii helikalnej
wirusy o symetrii ikosaedralnej:
togawirusy
herpeswirusy
retrowirusy
flawiwirusy
wirusy bezosłonkowe
oporne na wysuszenie, detergenty,
ekstremalne pH i temperatury
przenoszone droga oddechową i fekalno-oralną
wirusy osłonkowe
wymagają wilgotnego środowiska,
wrażliwe na kwasy i detergenty
Białka wirusowe
strukturalne
enzymatyczne
polimerazy wirusowe (replikacja)
proteazy
modyfikacja dużych protein w procesie translacji,
uwolnienie kwasu nukleinowego z nukleokapsydu
endonukleazy i ligazy (replikacja)
Postaci
pozakomórkowa
spoczynkowa – wirion
wewnątrzkomórkowa
aktywna – pozbawiony
białkowego płaszcza
komórka zakażona wirusem wścieklizny:
liczne wirusy (szare, pałeczkowate struktury)
i większe, ciemniejsze ciałka wtrętowe Negriego
Kryteria uwzględniane w klasyfikacji wirusów
wygląd, kształt i wielkość,
cechy kwasu nukleinowego,
• typ,
• liczba nici i ich postać (s, ds, liniowy, kolisty),
• liczba segmentów,
• masa cząsteczkowa,
• polarność genomu wirusowego,
symetria nukleokapsydu,
obecność osłonki lub jej brak,
stopień pokrewieństwa antygenowego,
Replikacja wirusów
• adsorpcja
• wniknięcie
• odpłaszczenie
• synteza białek wczesnych
• powielenie genomu
• synteza białek późnych
• składanie i dojrzewanie wirionów potomnych
• uwolnienie dojrzałych wirionów
WIRUS RECEPTOR RECEPTOR
KOMÓRKOWY WIRUSOWY
Reowirusy
HIV cząstka CD4 gp120
Ortomyksowirus
Wirus grypy sialyloligosacharydy hemaglutynina
Rabdowirus
Wirus wścieklizny receptor acetylocholinowy białko G
Hepadnawirusy
HBV receptor hepatocytowy Pre-S
Fuzja wirusowej osłonki z błona komórkową
Białko fuzji, doprowadza do połączenia osłonki wirusowej z błoną
komórkową, do cytoplazmy dostaje się nukleokapsyd, z którego uwalnia się
kwas nukleinowy (odpłaszczanie)
Translokacja – bezpośrednie przejście wirusa przez błonę komórkową, małe
wirusy
Penetracja
Endocytoza
Wpuklenie błony komórkowej. Wirus zamknięty w pęcherzyku pokrytym klarytyną, który wędruje w głąb cytoplazmy
penetracja
synteza
Replikacja kwasu nukleinowego
Synteza białek wirusowych
DNA przemieszcza się do jądra komórkowego
wirusy osłonkowe
egzocytoza, odzyskanie osłonki lipoproteinowej
(ortomyksowirusy, paramyksowirusy)
wirusy nagie – liza komórki
Wirusy lityczne
Cykl rozwojowy wirusa doprowadzający do rozpadu (lizy) atakowanej
komórki
Wirus wnika do komórki, „zmusza” ją do powielenia wirusowego kwasu
nukleinowego i do syntezy wirusowych białek.
Powstają potomne cząsteczki wirusa, które opuszczają komórkę, niszcząc ją.
Wirusy lizogenne
Wirus nie powoduje śmierci komórki, ulega włączeniu do komórkowego DNA.
DNA wirusa jest przekazywany komórkom potomnym w procesach podziałów
komórkowych.
Zjawisko to uznaje się za przyczynę niektórych zmian nowotworowych, a wirusy
je wywołujące nazywamy wirusami onkogennymi.
Drogi zakażenia
powietrzna
inhalacyjna
pokarmowa
fekalno-oralna
wertykalna
krwiopochodna
kontakt płciowy
wektory
autoinokulacja
kontakt bezpośredni (zakażone powierzchnie)
Zakażenie pierwotne
Zakażenie wtórne (latencja)
Zakażenie miejscowe
Zakażenie narządowe
Wiremia
zakażenie narządów docelowym
(tropizm OUN, wątroba, płuca, jelita, skóra, wirusy pantropowe)
latencja
zakażenie latentne, utajone
komórki nerwowe – HSV-1, HSV-2, HHV-3
limfocyty B – HHV-4 (EBV)
limfocyty T – HHV-5 (CMV)
reaktywacja ze stanu latencji – czynniki reaktywacji:
bodźce termiczne, psychiczne, fizyczne, hormonalne, zakaźne
OBJAWY ZAKAŻENIA
pierwsze objawy: gorączka, bóle mięśniowe, złe samopoczucie –
aktywacja dopełniacza i uwalnianie cytokin
objawy miejscowe – wysypka, obrzęk ślinianek, nieżyt nosa –
działanie cytopatogenne wirusa
objawy narządowe – ostra faza choroby
procesy nowotworowe
zakażenia przetrwałe – retrowirusy, papillomawirusy
zakażenia wertykalne – zakażenie płodu, noworodka
materiał diagnostyczny
wczesna postekspozycja
faza objawów klinicznych (wirusy oddechowe)
ozdrowieńcy
kontrola postępów leczenia
wymaz z błony śluzowej nosa i gardła
plwocina
krew/surowica krwi
moc, kał
wymazy ze zmian skórnych, zeskrobiny
aspiraty
fragmenty tkanek
metody diagnostyczne
obraz kliniczny
hodowla komórkowa,
obserwacja mikroskopowa: CPE, immunofluorescencja, mikroskopia
elektronowa
wykrywanie „składników” wirusowych
wykrywanie przeciwciał
Hodowla wirusów
diagnozowanie zakażeń
badania naukowe
produkcja antygenów (szczepionki, testy diagnostyczne)
Metody hodowli
hodowle komórkowe
żywe układy:
zwierzęta laboratoryjne
zarodki ptasie
PIERWOTNE
Komórki uzyskane ze świeżo izolowanych tkanek lub narządu
WTÓRNE - USTABILIZOWANE
PÓŁCIĄGŁE CIĄGŁE
diploidalne, aneuploidalne,
ograniczona liczba pasaży (40-50), najczęściej wywodzą się
utrzymują swój garnitur chromosomalny, z tkanki nowotworowej,
ulegają aberracji i degeneracji, VERO, HeLa,
(MRC-5, WI-38),
Hodowle komórkowe
Hodowla w naczyniach – szkło, nietoksyczny plastik – przyleganie do
powierzchni tworząc jednowarstwową hodowlę – monolayer
Hodowla w zawiesinie – mieszadła magnetyczne
Hodowle komórkowe
Pożywki do hodowli komórkowych zawierają
- cukry,
- aminokwasy,
- witaminy,
- sole mineralne,
- związek buforujący (do pH 7,2-7,4),
- wskaźnik barwny pH,
- antybiotyki,
- surowicę (najczęściej płodową cielęcą)
w stężeniu 10-20% pożywka wzrostowa
w stężeniu 2-5% pożywka utrzymująca
Permisywność
Wirus zakaża się i replikuje tylko w tych liniach komórkowych, których
komórki zawierają odpowiedni dla gatunku wirusa receptor (komórki
permisywne, zezwalające)
NAZWA TKANKA WIRUS
POCHODZENIE MORFOLOGIA
HeLa człowiek rak szyjki macicy nabłonkowa Polio 1, adenowirusy, herpeswirusy
Hep-2 człowiek rak krtani nabłonkowa Polio 1, adenowirusy, flawiwirusy
BHK-21 chomik nerka fibroblasty adenowirusy, herpeswirusy
Vero małpa nerka nabłonkowa SV 40, herpeswirusy
WI-38 człowiek płuca fibroblasty Polio 1, 2, VSV, adenowirusy
PK świnia nerka nabłonkowa VSV, Coxsackie B2 - B6,
flawiwirusy, herpeswirusy
nie wszystkie wirusy mogą namnażać się we wszystkich liniach komórkowych, wirus
replikuje się tylko w komórce permisywnej tj. zezwalającej, która posiada odpowiedni
dla danego wirusa receptor.
Micrograph showing the viral cytopathic effect of
herpes simplex virus (multi-nucleation, ground glass chromatin).
A – okołojądrowe „halo” , powiększone hyperchromatyczne jądro
B – duże jądro, nieregularne rozmieszczenie chromatyny, nieregularna osłonka
ZMIANY CYTOPATYCZNE (CPE)
WTRĘTY- ciałka wtrętowe, widoczne w barwionych, zakażonych
komórkach za pomocą mikroskopu świetlnego.
Są to skupiska wirusów lub wirusy otoczone komórkowymi elementami
białkowymi i lipidowymi lub składniki komórkowe powstałe pod
wpływem zmienionego metabolizmu zakażonej komórki.
wtręty cytoplazmatyczne
wtręty jądrowe (herpeswirusy)
Wtręty A (HSV, VZV) – ostro
odgraniczone, otoczone jasną przestrzenią
od chromatyny jądrowej
Wtręty B (poliowirus, żółtej febry) –
mniejsze.
Wtręty jądrowe i cytoplazmatyczne
(wirus odry)
CPE - wirus odry w linii komórkowej HeLa, syncytia, wtręty cytoplazmatyczne
(barwienie hematoksyliną)
Skupiska powiększonych i zaokrąglonych
komórek, utrata mostków cytoplazmatycznych
(grona winogron) - adenowirusy
Transformacja nowotworowa komórek
wzrost jednowarstwowy zastąpiony jest chaotycznym i
wielowarstwowym, grudkowate skupiska, aberracje
chromosomów
ZMIANY NIECYTOPATYCZNE
1. Hemadsorpcjaortomyksowirusy,
paramyksowirusy
2. Interferencjapodwójne zakażenie = oporność na
zakażenie komórki innym wirusem
Hemaglutynacja [Hirst 1941]
Stosowania do wykrywania wirusów
posiadających na swej otoczce
hemaglutyniny np. wirusa grypy
Uwolnione wirusy w pożywce hodowlanej
+ krwinki czerwone = aglutynacja erytrocytów
konglomeraty erytrocytarnowirusowe
Dokładna identyfikacja wirusa namnożonego w hodowli
komórkowej wymaga zastosowania
dodatkowych technik diagnostycznych