TESIS
EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO Y DEL CONTENIDO DE HEMOCITOS
CIRCULANTES TOTALES EN JUVENILES DE CAMARÓN BLANCO, LITOPENAEUS
VANNAMEI, EXPUESTOS A DIETAS EXPERIMENTALES CON DIFERENTES
NIVELES DE PROTEÍNA Y PROBIÓTICOS.
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS MARINAS Y COSTERAS
ORIENTACIÓN EN ACUACULTURA
PRESENTA:
YENNI MORALES CRISTOBAL
DIRECTORES:
DR. ANGEL I. CAMPA CORDOVA DR. MARCO CADENA ROA
LA PAZ, B.C.S. NOVIEMBRE DE 2012
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR
AREA INTERDICIPLINARIA DE CIENCIAS DEL MAR
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MARINA
DEDICATORIA
A mis padres (Margarita y Erasto) por ser el pilar fundamental en todo
lo que soy, porque creyeron en mi y por su incondicional apoyo,
porque en gran parte gracias a ustedes, hoy puedo ver alcanzada mi
meta, ya que siempre estuvieron impulsándome en los momentos más
difíciles. Va por ustedes, por lo que valen, porque admiro su fortaleza y
por lo que han hecho de mí.
A ustedes mis princesitas hermosas (Dasha aileen y Karolay) que son
mi razón de ser ¡las amo!
A mis hermanos y toda mi familia que de una u otra forma me han
apoyado y animado a concluir este presente.
Mil palabras no bastarían para agradecerles su apoyo, su comprensión
y sus consejos en los momentos difíciles.
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Ángel I. Campa Córdova, por su gran apoyo y paciencia, que hicieron
posible la realización de este trabajo, también por sus enseñanzas y consejos que
aportaron a mi formación profesional y personal.
Al Dr. M. Martin terrazas Fierro, por la orientación, aporte de idea al trabajo, sin
duda fue un gran apoyo.
Al CONACYT por otorgarme la beca de maestría.
A la M. C. Irasema Luis por su apoyo y su dedicación en la capacitación y
compartir parte del conocimiento como profesionista, en el desarrollo de los
experimentos y la parte microbiológica que se realizo, muchas gracias y por la
amistad que me brindo, sinceramente mi respeto para usted.
A la Chula por el asesoramiento en el laboratorio de patogénesis.
A Sandra de la Paz Reyes del laboratorio de nutrición experimental, quien tuvo la
disposición de auxiliarme y apoyarme durante el desarrollo de los bioensayos.
A Wilberth Serrano por el apoyo en los bioensayos experimentales como olvidar
esas caminatas de los fines de semana.
A norma angélica y Víctor Manuel del laboratorio de diagnostico microbiológico
por las enseñanzas de las técnicas de tinción e identificación bacteriana.
Al Dr. Jaime Holguín, por brindarme un espacio en el laboratorio de
fitopatología.
A Ernesto Goytortua por enseñarme a usar equipo de la planta de alimento y
asesoramiento en nutrición.
A todos los compañeros del laboratorio de patologia.
A todos mis compañeros y amigos de CIMACO (Claudia, karlita, Ruth, edwin),
por el cariño y apoyo moral que siempre he recibido de ustedes, en especial a ti
Ruth que fuiste mi asesora en la escritura y por aclarar mis dudas de este
trabajo.
Y por aquellas personas que me ofrecieron su ayuda, y por si se me olvido
alguien mil gracias a todos.
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN 2. ANTECEDENTES 2.1. Generalidades de la biología de camarones peneidos 2.1.1. Ciclo de vida de los camarones 2.2. La camaronicultura 2.2.1. Importancia económica 2.3. Nutrición general y hábitos alimenticios del camarón 2.3.1. Detección del alimento 2.3.2. Fuentes de proteínas para camarón 2.3.3. Proteínas y aminoácidos 2.3.4. Carbohidratos 2.3.5. Lípidos 2.3.6. Minerales y vitaminas 2.4. Sistema de defensa 2.4.1. Mecanismos de defensa 2.5. Microorganismos benéficos; probióticos 2.5.1. Uso de probióticos en acuacultura 2.5.2. Beneficios de los probióticos 2.5.3. Efectos beneficiosos del uso de los Bacillus como probióticos 2.5.4. Uso de levaduras en acuacultura 3. JUSTIFICACIÓN 4. OBJETIVOS 5. MATERIALES Y METÓDOS 5.1. Bioensayo I 5.1.1. Determinacion del efecto de tres niveles de inclusión de proteína cruda en el alimento sobre el crecimiento y utilización del alimento en juveniles de camarón L. vannamei 5.1.2. Organismos 5.2. Preparacion de los alimentos experimentales 5.2.1. Ingredientes 5.2.2. Formulación de los alimentos 5.2.3. Fabricación de alimentos 5.2.4. Alimentos experimentales 5.2.5. Analisis químico proximal de los ingredientes y alimentos 5.3. Sistema experimental 5.3.1.Diseño experimental 5.4. Bioensayo II
1 4 4 6 6 7 8 10 11 13 15 15 16 17 18 19 20 22 22 24 26 28 29 29 29 29 30 30 30 31 33 34 35 36 37
5.4.1. Determinacion de crecimiento, supervivencia y CTH en juveniles de camarón blanco alimentados con un nivel de proteína en el alimento, con y sin mezcla probiótica 5.4.2. Organismo 5.4.3. Cepas probióticas 5.4.4.Preparacion de las mezclas probióticas 5.5. Alimento experimental 5.5.1. Sistema experimental 5.5.2. Obtencion y conteo total de hemocitos circulantes (CTH) 5.5.3. Evaluacion de parámetros zootécnicos 5.5.4. Análisis estadísticos 6.RESULTADOS 6.1. Bioensayo I 6.1.1. Parámetros físico químicos 6.1.2. Análisis químico proximal de los ingredientes 6.1.3. Composición química proximal de los alimentos experimentales 6.1.4. resultados zootécnicos 6.1.5. Supervivencia 6.1.6. Conteo total de hemocitos (CTH) 6.2. Bioensayo II 6.2.1. Parámetros físico químicos 6.2.2. Análisis químico proximal de los ingredientes y alimento 6.2.3. Resultados zootécnicos 6.2.4. Conteo total de hemocitos 7. DISCUSIÓN 7.1. Crecimiento de camarones juveniles de L. vannamei alimentados con tres niveles de proteína 7.2. Crecimiento de camarones juveniles de L. vannamei, alimentados con un nivel de proteína, adicionado con mezclas probióticas 7.3. Conteo total de hemocitos circulantes en juveniles de camarón blanco L. vannamei 8. CONCLUSIONES 9. RECOMENDACIONES 10. BIBLIOGRAFIA
37 37 38 39 39 39 41 42 43 44 44 44 44 46 47 50 51 53 53 53 54 59 60 60 67 71 76 78 79
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I. Composición de los alimentos utilizados durante el primer
bioensayo de crecimiento en juveniles de camarón blanco L vannamei
Tabla II. Valores promedios de los parámetros físicos químicos del agua de
cultivo durante los 40 días de experimento
Tabla III. Composición proximal de los ingredientes utilizados para la
preparación de las dietas experimentales
Tabla IV. composición química proximal de los tres alimentos usados en el
primer bioensayo de crecimiento para juveniles de L. vannamei
Tabla V. Variables de peso final, consumo aparente de alimento, conversión
alimenticia y supervivencia de juveniles de L. vannamei, alimentados
durante 40 días con tres niveles de proteína
Tabla VI. Valores promedios de los parámetros físicos químicos de la calidad
del agua durante el desarrollo del segundo experimento
Tabla VII. Resultados de las variables medidas durante el bioensayo II de
crecimiento
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ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Vista lateral de la morfología de los camarones peneidos
Figura 2. .Sistema de cultivo utilizado para la evaluación de los alimentos
experimentales en el laboratorio de Nutrición Experimental
Figura 3. peso de L. vannamei alimentados con distintos niveles de proteina
(38, 41 y 44% PC) durante 40 dias de cultivo
Figura 4. pesos promedios de camarones juveniles de L. vannamei
despues de haber sido tratados con tres alimentos con distintos nivele
de proteina (38, 41 y 44% PC) durante 40 dias de cultivo
Figura 5. Consumo aparente de alimento, en juveniles de camarón
cultivados durante 40 días
Figura 6. .Supervivencia de juveniles de L. vannamei tratados con 38, 41 y
44% de PC durante 40 días de cultivo
Figura 7. Conteo Total de Hemocitos Circulares (CTH) en juveniles de
camarón blanco L. vannamei alimentados durante 40 días con alimentos
conteniendo 38, 41 y 44% PC
Figura 8. Peso de juveniles de camarón blanco L. vannamei, durante 45 días
de cultivo, alimentados con tres diferentes tratamientos: Trat.1) 38% PC;
Trat.2) 38%PC+ mix bacilos; 1x106 UFC/ml); Trat.3) 38%PC + mix levaduras;
1x106 UFC/ml y un control
Figura 9. .Peso promedio de los 3 diferentes tratamientos utilizados en
juveniles de L. vannamei cultivados durante 45 días
Figura 10. Consumo aparente de alimento en juveniles de L. vannamei
cultivados durante 45 días alimentados con 3 distintos tratamientos: Trat.1)
4
36
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56
57
38% PC; Trat.2) 38%PC+ mix bacilos; 1x106 UFC/ml); Trat.3) 38%PC + mix
levaduras; 1x106 UFC/ml y un grupo control
Figura 11. Supervivencia de juveniles de camarón L. vannamei alimentados
con tres distintos tratamientos: a) control; b) 38%PC (t1); c) 38%PC+ mix
bacilos; 1x106 UFC/ml (t2); d) 38%PC + mix levaduras; 1x106 UFC/ml (t3)
Figura 12. Conteo Total de Hemocitos (CTH), en juveniles de camarón L.
vannamei alimentados con los siguientes tratamientos: a) control; b) 38% PC
(Trat.1), c) 38% PC+ mix bacilos (Trat. 2); d) 38% PC + mix levaduras (Trat.
3), durante 45 días de cultivo experimental
58
59
RESUMEN El cultivo de camarón representa el arte acuícola más tecnificado de las últimas décadas, la producción se ha expandido debido al incremento en la población. El alimento es un factor que influye en la calidad y desarrollo de los camarones, la calidad nutricional del alimento y su manejo en los estanques son sumamente importantes en el cultivo, ya que tienen gran influencia sobre los factores que determinan el resultado final. Se ha demostrado ampliamente que las proteínas son el principal factor del cual depende el crecimiento del camarón. Por otra parte, el cultivo sigue siendo afectado en diferentes partes del mundo por la diseminación de diversas enfermedades infecciosas, provocadas por bacterias y virus las cuales han provocado importantes pérdidas, por tal razón desde tiempos atrás se han venido realizando estudios relacionados con la inmunología del camarón y compuestos que pudieran favorecer el sistema inmune del mismo. En el presente trabajo se evaluó el crecimiento, factor de conversión alimenticia, supervivencia, y el conteo total de hemocitos (CTH) como un parámetro para determinar inmunidad en juveniles de camarón blanco L. vannamei alimentados con distintos niveles de proteína y probióticos. En la primera parte del estudio, se evalúo el efecto de tres dietas con 38%, 41% y 44% de proteína durante 40 días, alimentando tres veces al día, suministrándo el 10% de la biomasa de cada acuario, realizando monitoreo diarios de los parámetros fisicoquímicos, conteo de organismos, conteo de alimento residual, así como también biometrías cada 15 días, luego de cada biometría se hicieron los ajustes correspondientes de la ración de alimento diario para cada acuario. Al final del primer bioensayo se seleccionó una dieta. Posteriormente, se llevó a cabo un segundo bioensayo, donde se evaluó la dieta seleccionada en el primer bioensayo la cual consistió en el alimento con 38% de proteína, además se evaluó un mix de Bacillus como segundo tratamiento (38% + mix Bac 1x106 cel/g de alimento), un mix de levaduras como tercer tratamiento (38% + mix Leva 1x106 cel/g de alimento) y un control, utilizando alimento comercial marca PIASA (35% de proteína). Para ambos bioensayos se determinó el porcentaje de supervivencia, crecimiento, consumo de alimento, factor de conversión alimenticia y el conteo total de hemocitos como parámetro de inmunidad. Dentro de los resultados obtenidos, el comportamiento de los parámetros físico químicos del agua (oxigeno disuelto, temperatura y salinidad) registrados durante los dos periodos experimentales, no presentaron variaciones significativas en los cultivos, comportándose dentro de los rangos normales recomendados para camarones peneidos. Los resultados obtenidos de crecimiento, en el primer bioensayo, se observaron diferencias significativas entre los tratamientos y el grupo control favoreciendo el incremento en el peso desde la etapa inicial, no mostrando diferencias significativas entre los tratamientos utilizados (38, 41 y 44% de proteína). Se observó que con niveles de 38% de proteína o superiores, los camarones presentaron mejor comportamiento, además tomando en cuenta el aspecto económico, el tratamiento con 38% de proteína fue el que reunió las mejores condiciones, debido a que resulto un buen alimento para
el crecimiento del camarón, lográndose de esta forma disminuir el nivel de proteína en la dieta comercial. Los valores de conversión alimenticia fueron mayores en los tres niveles de proteína experimentales en comparación con los del grupo control. No se encontraron diferencias entre los tres niveles evaluados considerándose como buenos valores de conversión alimenticia. La supervivencia obtenida en todos los tratamientos se registro entre el 90 y 100 %, no encontrando diferencias significativas entre los tratamientos y el grupo control. En el segundo bioensayo se agregaron mezclas probióticas en el alimento conteniendo 38% de proteína, obteniendo diferencias significativas en las variables de crecimiento respecto al grupo control (sin probióticos) pero no entre los tratamientos, indicando con estos resultados que un alimento con calidad nutricional se refleja en un rápido crecimiento y mejor salud del camarón. La determinación del factor de conversión alimenticia presentó valores mayores promedios en los tres tratamientos respecto al control. Se obtuvieron supervivencias entre el 80% y el 93% en los tratamientos y un 63.33% en el grupo control sin embargo, no hubo diferencias significativas entre los grupos tratados y el control. En los resultados del conteo total de hemocitos para el primer experimento, se observaron incrementos en los camarones alimentados con 38, 41 y 44% de proteína, no habiendo diferencias significativas entre los tratamientos pero sí entre los camarones tratados con el alimento de 41% de proteína y el grupo control. El conteo total de hemocitos circulantes en el segundo bioensayo no mostro diferencias entre los tres tratamientos, pero el tratamiento tres (38% + mix Leva 1x106 cel/g de alimento) registro un incremento significativo de hemocitos circulantes en comparación con grupo control. Con relación al CTH, se concluye que los niveles de proteína y la inclusión de probióticos influyen en el contenido de hemocitos circulantes en los camarones, resultando indicadores importantes ya que son las principales células efectoras del sistema inmune. El adicionar mezclas probióticas en el alimento, se demostró que sirven como aditivos en el alimento para camarón blanco, incrementando el número total de hemocitos.
1
I. Introducción
En México una de las actividades que ha adquirido mayor importancia en los
últimos años es la acuacultura, arrojando beneficios sociales y económicos los
cuales a su vez se han traducido en una fuente de alimentación con un elevado
valor nutricional. En forma radical el cultivo de crustáceos, particularmente de
camarón ocupa un lugar importante, debido a la importancia en términos
económicos que este recurso representa para la región del Noroeste del Pacífico
Mexicano. El cultivo de camarón representa el cultivo más tecnificado siendo
además un producto con calidad de exportación (Alvarez y Avilés, 1995). La
calidad nutricional del alimento y su manejo en la estanquería son sumamente
importantes en el cultivo de camarón, ya que tienen gran influencia sobre los
factores que determinan el resultado final. Es necesaria la formulación de dietas
efectivas, nutricionalmente adecuadas y con costos bajos, para lo cual es
imprescindible el estudio de diversos aspectos nutricionales (Galindo et al, 2002).
Las proteínas son los nutrimentos más importantes en el alimento del camarón, ya
que son esenciales para la síntesis de enzimas, hormonas y hemocianina,
constituyen el sustento del sistema inmune, participan en la construcción de
tejidos, su reparación y mantenimiento, siendo además una fuente importante de
energía catabólica para el camarón (Pascual et al, 2003; Guo et al, 2006; Pascual
et al, 2006). Se ha demostrado ampliamente que, las proteínas son el principal
factor del cual depende la velocidad de crecimiento del camarón, pero hasta ahora
poco se ha investigado sobre la formulación de alimentos balanceados sustentada
en la calidad de la proteína (aminoácidos esenciales) en sustitución de la cantidad
(Forster y Dominy, 2006).
La proteína es el componente principal de la hemolinfa y se ha demostrado que
una deficiencia proteica en el alimento repercute de manera directa en la
concentración del nutrimento en ese fluido corporal (Pascual et al, 2006). Lo
2
anterior es importante en virtud de que la hemocianina contenida en la hemolinfa
es también un reservorio de proteína para el camarón y juega un papel en el
control de la precisión osmótica dependiendo de las condiciones de salinidad en el
agua, actuando como molécula adaptativa de acuerdo a los cambios ambientales
(Cuzon et al, 2004).
El desarrollo de la industria camaronera, ha estado caracterizado por el
surgimiento de muchas restricciones en la producción, entre ellas la más
importante es la ocurrencia de enfermedades infecciosas.
La resistencia de los camarones contra organismos invasores es fuertemente
influenciada por su estado inmunológico. Los crustáceos tienen un sistema de
defensa menos desarrollado que en peces u otros vertebrados; más
específicamente, estos carecen de memoria adaptativa; es decir que no son
capaces de producir inmunoglobulinas y dependen aparentemente de sistemas
innatos de defensa. El entendimiento de los mecanismos de defensa de los
camarones en combinación con diferentes estrategias puede contribuir a un mejor
manejo de las enfermedades. De hecho, existen diferentes métodos para conocer
el estado de salud o enfermedad de los animales. Entre ellos, la evaluación de
parámetros inmunológicos y fisiológicos incluyendo concentración de proteína en
la hemolinfa, conteo total de hemocitos, actividad fenoloxidasa, producción de
radicales libres, actividad fagocítica o variables de campo como pueden ser
pruebas de estrés, sobrevivencia, y crecimiento pueden ser utilizados como
indicadores del estado de salud de los camarones (Rodríguez y Le Moullac, 2000).
La función básica de un sistema de defensa es el mantenimiento de la integridad
biológica del individuo, lo cual se logra por una adecuada capacidad para
diferenciar lo propio de lo extraño. Esta característica permite eliminar partículas,
parásitos e incluso células propias alteradas o envejecidas. El fenómeno parece
ser dependiente del reconocimiento de diferencias física, química, fisicoquímicas y
biológicas en las células (Lackie, 1980) y un proceso de defensa es iniciado por
una célula o molécula que reconoce un determinado patrón de no propiedad. El
3
camarón al igual que los otros invertebrados, posee factores celulares y factores
humorales (Vargas-Albores, 1996), los cuales constituyen un sistema de defensa
eficiente. La respuesta celular es un conjunto de mecanismos de defensa donde
se requiere la presencia de las células sanguíneas, hemocitos que son los
responsables de la fagocitosis, la encapsulación y la formación de nódulos.
El uso de probióticos como suplementos de la alimentación animal de granja,
originalmente fueron incorporados en alimentos para aumentar el crecimiento del
animal y mejorar su salud aumentando su resistencia a las enfermedades. Los
resultados obtenidos en muchos países han indicado que algunas de las
bacterias utilizadas en los probióticos son capaces de estimular el sistema
inmune (Fuller, 1992). Las bacterias son adicionadas a los sistemas de producción
acuícola para mejorar o manipular las comunidades microbianas en el agua y
sedimento, para reducir o eliminar a las especies patógenas seleccionadas, y para
mejorar el crecimiento y supervivencia, de las especies acuáticas en cultivo
(Irianto y Austin, 2002). Los probióticos utilizados en estudios acuícolas incluyen
bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, bacteriófagos, levaduras y algas
unicelulares (Irianto y Austin, 2002). Por otro lado, Los probióticos tienen un efecto
benéfico en los procesos de digestión en animales acuáticos y contribuyen a la
nutrición del hospedero, especialmente por ácidos grasos y vitaminas (Venkat et
al, 2004). También existen antecedentes que demuestran que existe una clara
relación de la cantidad de proteína en el alimento sobre la respuesta inmune del
camarón blanco, ya que existe una reducción en los hemocitos (sistema profenol-
oxidasa) y en su actividad (fagocitosis) en dietas con un menor nivel de proteína
(Kureshy y Davis, 2002), pero hasta ahora no hay información sobre el efecto de
dietas formuladas en base a calidad de proteína y su relación con el sistema
inmune del camarón blanco, la cual es uno de los objetivos del presente trabajo de
tesis. Al tomar en cuenta la alimentación del camarón como factor primordial
durante su cultivo, es indispensable encontrar los medios para obtener un
alimento eficiente, de calidad y que estimule un rápido crecimiento lo que
4
disminuye el costo de producción. Se puede lograr un crecimiento importante en la
acuacultura si se obtienen dietas bien balaceadas de buena calidad y que cubran
los requerimientos nutricionales de la especie cultivada. La eficiencia de un
alimento balanceado depende mucho del valor nutricional de sus ingredientes y
principalmente de las fuentes proteicas que poseen tales como la harina de
pescado, harina de soya, levadura, etc. (Espinoza, 1992).
2. Antecedentes
2.1. Generalidades de la biología de camarones peneidos
Los camarones penaeidea forman parte del antiguo grupo de los Natantia,
en el cual fueron ubicados por, Boas (1880), como los peneidea. Dentro de esta
familia
Figura 1. Vista lateral de la morfología de los camarones peneidos.
se encuentra el camarón blanco Litopenaeus vannamei es un invertebrado marino
que se encuentra agrupado dentro de los artrópodos, subfilo crustáceo y
pertenece a la familia penaeus, clase; malacostraca, orden; decápoda. Se
5
caracteriza por tener un tronco compuesto por 14 segmentos más el telson de los
cuales los ocho primeros forman el tórax y los últimos seis el abdomen; todos los
segmentos portan apéndices, los que se encuentran en el abdomen anterior son
llamados pleópodos y son usados para nadar y los posteriores son llamados
periopódos y son usados para caminar en el fondo. El cuerpo tiende a ser
cilíndrico o comprimido lateralmente, tiene un cefalotórax definido y porta un rostro
aserrado con forma de quilla. Posee un exoesqueleto conformado por quitina que
suele ser delgado y flexible. El cordón nervioso se extiende a lo largo del vientre,
su órgano excretor es la glándula antenal que lanza al medio sustancias de
desechos. El sistema circulatorio es abierto, el corazón se encuentra localizado
dorsalmente en el cefalotórax y compuesto por vasos sanguíneos que transportan
la hemolinfa la cual posee cobre y acarrea oxigeno, por lo que desarrolla un color
azuloso, el oxigeno y el dióxido de carbono es transportado desde y hasta las
branquias de donde se realiza el intercambio gaseoso (Ruppert et al, 1996).
Los camarones se alimentan por medio de filtración en el fondo, presentan una
boca en posición ventral y el aparato digestivo se ensancha a lo largo del dorso
para formar una glándula digestiva grande llamada hepatopáncreas que excreta
enzimas digestivas, esta glándula digestiva se compone de los divertículos del
intestino, los espacios entre estos túbulos hepatopancreaticos son los senos o
lagunas tisulares y su principal función es la absorción de nutrientes,
almacenamiento de lípidos y producción de enzimas digestivas (Johnson, 1980).
6
2.1.1. Ciclo de vida de los camarones
El ciclo de vida del camarón inicia en la plataforma continental, cuando los
adultos se reproducen, los huevos fecundados son liberados al océano y quedan a
merced de las corrientes marinas donde eclosionan como larvas nauplio. Todos
los estadios larvarios son de vida planctónica, por lo que son arrastrados por las
corrientes hacia la zona costera. Durante la fase de postlarva, estas migran hacia
las lagunas estuarinas en busca de zonas de refugio y alimentación, los
camarones permanecen en estas áreas salobres con vegetación sumergida y son
utilizadas como áreas de crecimiento durante 7 a 9 meses, antes de migrar
nuevamente al mar a donde llegan como adultos (Alpuche et al, 2005).
2.2. La camaronicultura
La acuacultura de camarón se ha expandido significativamente a lo largo de
América latina y Asia durante la década de los 80´s (Moss, 2002). Actualmente la
producción acuícola del camarón a nivel global se encuentra alrededor de 1,
568,386 mt (Rosenberry, 2005). Casi el 84% del camarón cultivado proviene de
Asia, destacando como productores principales Tailandia, china, Vietnam e india.
En occidente, ecuador es el mayor productor de camarón.
Dentro de la explotación de los recursos marinos, la captura y comercialización
del camarón es una de las actividades económicas más rentables en varios
países. En el pacifico, mexicano habitan tres especies de peneidos que se
explotan comercialmente: Litopenaeus vannamei, L.stylirostris y farfantepanaeus
californiensis, siendo la más importante L. vannamei, que se cultiva principalmente
en Sinaloa, sonora, Nayarit y Baja California Sur, la cual se caracteriza por preferir
salinidad baja.
7
En forma radical el cultivo de crustáceos, particularmente de camarón ocupa un
lugar importante, debido a la importancia en términos económicos que este
recurso representa para la región del Noroeste del Pacífico Mexicano. El cultivo de
camarón representa el cultivo más tecnificado siendo además un producto con
calidad de exportación (Álvarez y Avilés, 1995). La FAO (2003) menciona que en
los últimos años la producción de camarón se ha expandido debido al incremento
en la población y la demanda por los productos del mar que cada vez es mayor.
En el 2001, el camarón fue la segunda especie más importante en acuacultura,
con un valor estimado de 4.8 billones de dólares (FAO, 2003).
2.2.1. Importancia económica
La camaronicultura es una actividad relevante y de gran importancia económica,
se ha vuelto una actividad de riesgo que requiere de fuertes inversiones y eficiente
administración. En general la actividad está dejando de ser una práctica familiar
con escaso componente técnico y girando rápidamente hacia comportamientos
industriales y empresariales. Actualmente la acuicultura es la actividad
agroindustrial de mayor desarrollo a nivel mundial, con un volumen global superior
a los 60 millones de toneladas y un valor de alrededor de 15 mil millones de
dólares, con lo que contribuye en más de 40 % a la producción de organismos
acuáticos. Dentro de la actividad, la camaronicultura es una de las que ha
mostrado un desarrollo más explosivo tanto a nivel mundial como en nuestro país.
Asia es la región con el mayor desarrollo en el cultivo de la mayoría de las
especies, siendo China, el país líder en esta actividad. Sin embargo, en términos
de crecimiento, algunos países de América Latina, incluyendo México, están ahora
en el escenario mundial. La camaronicultura mexicana creció alrededor de 17 %
en sólo dos años y se espera un crecimiento sostenido en los próximos años
(Martinez-Cordova et al, 2008 ). En México, el camarón fue la especie pesquera
8
que mayor actividad económica generó durante el año 2009, se pescaron y
cultivaron un poco más de 162 mil toneladas de camarones, con un valor
comercial total de 8 mil millones de pesos esta suma representó 46.8% de los
ingresos pesqueros totales en el país (Conapesca, 2009).
2.3. Nutrición general y hábitos alimenticios del camarón
El camarón presenta deferentes hábitos alimenticios durante su ciclo de
vida. En condiciones naturales, los camarones peneidos juveniles son
considerados omnívoros o detritívoros. En estudios de contenido estomacal, que
se han hecho en diferentes especies se han encontrado; pequeños crustáceos,
poliquetos, algas y detritos. (Wikins, 1976).
En general, el crecimiento y sobrevivencia del camarón silvestre depende de
factores como la calidad del agua, alimento natural y un hábitat protector. Existen
evidencias que las preferencias alimenticias cambian con la edad y el estado
fisiológico (Marte, 1980). El objetivo del cultivo es proveerle adecuada calidad de
agua, ambiente y nutrición para un rápido crecimiento o densidades mucho
mayores que las encontradas en ambientes naturales.
La nutrición es una rama de la fisiología que estudia el conjunto de procesos
involucrados en la obtención de energía y nutrimentos para realizar las funciones
vitales del organismo tales como mantenimiento, crecimiento y reproducción, por
lo tanto, involucra la ingestión, la digestión, la absorción y el transporte de
nutrientes, así como la remoción de productos de desecho (Akiyama et al, 1991).
Los nutrimentos principalmente proteínas, glúsidos y lípidos son los intermediarios
entre la alimentación y el metabolismo (Guillaume y Ceccaldi, 1999). Los
camarones peneidos están entre los organismos más importantes y extensamente
9
cultivados en el mundo. En un principio, los requerimientos nutricionales de
camarones peneidos fueron definidos en los años 70s (Kanazawa, 1989 y
Deshimaru et al, 1985). Existen diferencias entre los requerimientos nutricionales
de especies de camarones peneidos sin embargo los requerimientos para
Litopenaeus vannamei siguen siendo estudiados.
La nutrición del camarón es un asunto complejo porque sus requerimientos
cambian a lo largo de sus ciclos de vida, por lo que las fórmulas deben ser
específicas para cada ciclo. Más aún, los alimentos naturales suplementan a los
manufacturados y los granjeros deben manejar los estanques como un
ecosistema, y maximizar los beneficios de los alimentos naturales y
manufacturados.
Las fuentes de nutrientes pueden variar, pero ciertos nutrientes son requeridos por
todos los animales en crecimiento, y son conocidos como nutrientes esenciales o
indispensables. Un nutriente esencial es aquel que no puede ser sintetizado a un
nivel requerido para un normal crecimiento y mantenimiento. La proteína es
requerida para el crecimiento, no hay proteínas esenciales, sino aminoácidos
esenciales (las proteínas están compuestos por aminoácidos). A pesar de que los
carbohidratos (ej. harina de trigo) son fuentes de energía, no son carbohidratos
esenciales, porque pueden ser derivados de varios ingredientes, almacenados y
liberados a través de varios procesos metabólicos; además los lípidos de la dieta
son otra fuente de energía. Finalmente, están los ácidos grasos esenciales
(componentes de lípidos), vitaminas y minerales.
Los nutrientes esenciales pueden ser muy bien diferenciados en términos
cuantitativos. Las proteínas, lípidos y carbohidratos son referidos frecuentemente
como macronutrientes. Su presencia en el alimento comprende una porción
substancial del espacio disponible o peso de la dieta. Los micronutrientes (ej.
minerales y vitaminas) son requeridos, relativamente en poca cantidad por el
camarón. El término "micro", sin embargo, no debe ser interpretado como
implicando que ciertos nutrientes son menos importantes. Algunas vitaminas son
10
requeridas en muy pocas concentraciones para la producción comercial de
alimentos (ej. ácido ascórbico, alrededor de 100 mg/kg. de materia seca), sin
embargo, su inclusión es absolutamente requerida para un adecuado
mantenimiento y crecimiento.
2.3.1. Detección del alimento
Las antenas y anténulas intervienen en la quimio-recepción, búsqueda y
reconocimiento del alimento, a través de quimiorreceptores llamados astetascos
que se encuentran en el flagelo lateral de las anténulas. Los movimientos de las
antenas tienen como función aumentar la exposición de los estetascos a los
químicos propiciando la circulación del agua.
El camarón tiene la capacidad de detectar el alimento a distancia, mediante los
receptores antenales, y una vez que sea dirigido a él, por contacto lo degusta,
utilizando los receptores presentes en periópodos y apéndices bucales, dando
como respuesta la aceptación o el rechazo del alimento (Mendoza et al, 1996).
La capacidad de percibir la presencia y detectar el sabor del alimento,
representa una estrategia energética, que permite minimizar el tiempo de
búsqueda y maximizar la proporción neta de energía o de ingredientes ingeridos,
estrategia que puede ser utilizada eficazmente tanto en el diseño de los alimentos
balanceados como en la forma de distribución.
El uso de sustancias atractantes permite que los alimentos sean localizados y
consumidos más rápido por los animales. Estos compuestos son generalmente
extraídos de organismos marinos, también moléculas orgánicas como
aminoácidos libres o bases nitrogenadas. Extractos solubles de diferentes
organismos marinos: calamar, krill, pescado incluyendo aceite de pescado y de
calamar. La manera de aplicar estos atractantes en los alimentos balanceados
11
puede ser mezclado como aditivo con los demás ingredientes de la fórmula, o por
aspersión sobre los pellets terminados (Cruz-Suarez, 1996).
2.3.2. Fuentes de proteínas para camarón
Las proteínas se clasifican de acuerdo a su origen: animal, vegetal y
microbiana. Las proteínas más utilizadas comercialmente en la preparación de
alimentos para camarón se presentan como harinas y principalmente son de
origen animal marino.
Tacón, (1989) resume experiencias en juveniles de peces y camarones
alimentados con raciones en las que una porción significativa de la proteína
dietética es suministrada en forma de aminoácidos “libres” dando como resultado
un crecimiento subóptimo y una eficiencia de conversión alimenticia baja,
comparada con animales alimentados con proteína entera o con proteínas en las
que los aminoácidos son elementos constitutivos de estas. Sin embargo también
menciona que en general, los aminoácidos incorporados a la dieta en forma libre,
son asimilados más rápidamente por los peces, en comparación con los
aminoácidos que integran la proteína.
Una buena fuente de proteínas son los vegetales que son usadas en menor grado
en las dietas para camarón porque son menos atractantes, su composición en
aminoácidos es menos balanceada y muchas contienen productos tóxicos como el
factor anti trípsico de la soya, el algodón etc.; aflatoxinas u otros hongos muy
tóxicos. En la práctica solo las mejores proteínas vegetales son utilizadas; como la
harina de pasta de soya. También están las proteínas de origen microbiológico
como las levaduras desprovistas de factores antinutricionales y las bacterias
fermentadoras de alcoholes. Substituciones de hasta un 30% se han revelado
12
eficaces, mientras que porcentajes mayores requieren suplementación con
aminoácidos libres.
La elaboración de alimentos de alta calidad es una necesidad vital para el
desarrollo de la industria acuícola (Campabadal y Celis, 1996). La calidad de estos
alimentos está determinada por el tipo, calidad y composición de ingredientes que
se utilicen, la formulación de la dieta y los métodos de procesamiento empleados
en su elaboración, ya que pueden influir en la palatabilidad y disponibilidad de
nutrientes (Campabadal y Celis, 1996). La calidad de proteína se resume
esencialmente en dos características: coeficiente de utilización digestiva y valor
biológico (equilibrio de aminoácidos esenciales y principalmente del valor relativo
del aminoácido esencial menos abundante con respecto a los requerimientos:
aminoácido limitante).
Las harinas de pescado son un ingrediente comúnmente utilizado en las dietas de
animales domésticos, ya que son una fuente rica en proteína cruda y lípidos, las
harinas de pescado pueden ser elaboradas de diferentes especies de pescados,
incluso existen harinas de pescado que son elaboradas con subproductos de
pescado (desechos del fileteo, vísceras, etc.) estos factores afectan variando el
contenido y digestibilidad de los nutrientes (mayor o menos contenido de huesos
“contenido de cenizas” y aceite) en el producto final (Miles y Chapman, 2006).
Adicionalmente el proceso de elaboración de las harinas afecta la digestibilidad de
la proteína (Opstvedt et al, 2003).
La soya tiene el mejor perfil proteico nutricional de todas las plantas. A partir del
fríjol de soya se pueden obtener varios productos de soya como lo son: La harina
o pasta de soya, la cual se obtiene como un subproducto durante el proceso de
extracción del aceite del fríjol de soya, las hojuelas de soya delipidadas son
sometidas a un proceso de calentamiento y posteriormente convertidas en harina
(el contenido de fibra y proteína de este ingrediente es de alrededor de 7 y 44%
respectivamente, aunque, el nivel de proteína de este ingrediente se puede
13
incrementar hasta un 48% eliminando la cascarilla de soya antes de la extracción
del aceite). La soya integral se obtiene a partir del grano de soya descascarillado
(extrusión, tostado o micronizado) lográndose un producto rico en proteína y
lípidos. Este ingrediente se caracteriza por contener un alto contenido de lípidos y
fibra. Mediante la eliminación de los carbohidratos presentes en la harina de soya
se pueden elaborar otros productos con un nivel mayor de proteína tal como el
concentrado de soya. El aislado de proteína se obtiene por extracción de la
proteína a partir de las hojuelas delipidadas (Peisker, 2001).
Los productos de trigo son utilizados como fuente de energía, su proteína es
altamente digestible en especies acuícolas y adicionalmente son utilizados como
aglutinantes naturales que mejoran la estabilidad de los alimentos en el agua
(Gatlin III et al, 2007; Hertrampf, 2007). Cerca del 90 al 95% del trigo producido en
el mundo es trigo común
2.3.3. Proteínas y aminoácidos.
Las proteínas, carbohidratos y lípidos son los principales nutrimentos y son
los intermediarios entre la alimentación y el metabolismo. La cantidad y calidad de
la proteína en la dieta son los principales factores que influyen sobre el
crecimiento de los camarones (Gutiérrez, 2002). Se ha demostrado que las
proteínas son el principal componente de los ecosistemas bentónicos donde
habitan los camarones penaeidos (Rosa et al, 2000) y el componente más
importante en una dieta para acuacultura, debido al costo y el requisito nutricional
de los organismos (García et al, 1996).
Las proteínas son los componentes más importantes del cuerpo de los animales,
representan aproximadamente el 70 % del peso seco del camarón. La proteína es
14
usualmente el nutriente más costoso y el rango de contenido proteico (referido
como proteína cruda) en los alimentos va desde 18% hasta 45%.
Los elevados requerimientos proteicos en las dietas de los camarones se
atribuyen a sus hábitos alimenticios carnívoros/omnívoros y al uso preferencial de
la proteína dietética sobre los carbohidratos como fuente de energía.
Las proteínas son compuestos orgánicos nitrogenados complejos, constituidos
por aminoácidos (Schneider, 1985). Las proteínas son nutrientes indispensables
para la estructura y funcionamiento de los camarones y son utilizadas
continuamente para el crecimiento basal y reparación de los tejidos. El
requerimiento proteico, varía en función de la edad del organismo (Guillaume,
1999).
Los aminoácidos se dividen en esenciales y no esenciales. Los esenciales son
aquellos que el organismo no puede sintetizar o al menos no en cantidades
suficientes. Se ha sugerido que la composición de aminoácidos de los alimentos
debería ser muy similar al de los animales a alimentar (Mente et al, 2002). Tacón
(2002) menciona que en las dietas se recomienda que incluyan a los diez
aminoácidos considerados como esenciales para los crustáceos: treonina, valina,
metionina, isoleusina, leucina, fenilalanina, lisina, triptófano, histidina y arginina.
Varios autores reportan distintos niveles óptimos de proteína en dietas, pero en
general los valores están alrededor del 35%(Tacon 1989; Kureshy y Allen 2000).
Aunque muchos alimentos comerciales para camarón usados en México rondan el
35% y hay algunos que llegan a contener hasta 40% de proteína cruda (Cruz et al,
2002).
En el caso de los crustáceos y especialmente en los estadios larvarios y de
juveniles, es ampliamente reconocido que los aminoácidos esenciales (AAE)
deben ser aportados por el alimento para mejorar el crecimiento y sobrevivencia
de los organismos en cultivo (Gutiérrez, 2002). En general, entre mas se aproxime
15
el patrón de AAE de la proteína a los requerimientos dietéticos de AAE de la
especie en cuestión, mayor será su valor nutricional y utilización (Tacón, 1989).
2.3.4. Carbohidratos
Los carbohidratos son compuestos químicos que contienen carbono hidrógeno y
oxígeno dispuestos en determinada manera (Schneider, 1985). Los carbohidratos
pueden usarse como fuente de energía como reserva de glucógeno en la síntesis
de quitina, ácidos nucléicos y en la formación de esteroides y de ácidos grasos
(Cruz Suarez et al, 1994). Pueden ser utilizados como una fuente de energía con
mezclas de proteínas y lípidos. Los azúcares complejos y polisacáridos pueden
ser usados mas efectivamente que los azúcares simples (Deshimura et al, 1985).
Los almidones son frecuentemente usados como una fuente excelente de
carbohidratos y para ligar los ingredientes de las formulaciones.
2.3.5. Lípidos
Los lípidos se agrupan en grasas, esteroides y fosfolípidos y son una combinación
especial de carbono, hidrógeno y oxígeno (Schneider, 1985). Con respecto a la
nutrición lipídica, son los principales vehículos de las vitaminas liposolubles y
proveen otros compuestos como esteroles y fosfolípidos. Los requerimientos
cuantitativos de lípidos varían según las especies, en general se recomiendan
valores entre 6 y 7.5% (Akiyama, 1991; Tacón, 1987), recomiendan un mínimo de
10% de lípidos y una relación 5:1 de lípidos de origen marino y vegetal. La
provisión de suficientes lípidos está basada en la satisfacción de los
requerimientos de ácidos grasos altamente insaturados (HUFA). Los fosfolípidos
(FL) son requeridos por el camarón para un adecuado crecimiento y
sobrevivencia. Las lecitinas de soya han sido ampliamente utilizadas para la
suplementación dietaria de poslarvas de camarón debido a su importancia
16
comercial y a los componentes activos principalmente (FL). Basados en recientes
estudios, se recomiendan niveles de 1.25 a 6.5% dependiendo de las especies de
camarón, estadio de desarrollo y la pureza de la lecitina (Cotteau et al, 1997).
2.3.6. Minerales y vitaminas
Con frecuencia, el fósforo y calcio son los minerales más limitantes en la
formulación de alimentos comerciales para la producción de camarones. El fósforo
es único ya que se encuentra únicamente como un sólido y no se solubiliza en
agua. Puede encontrarse en muchas plantas verdes o granos en forma indigerible
conocido como fitato o ácido fítico.
Por esta razón, al analizar su digestibilidad, solo un tercio a un cuarto del fósforo
en alimentos a base de soja es considerado disponible para el camarón. Para
proveer una adecuada dieta en fósforo, se debe incluir en una forma purificada
(ej., fósforo monobásico, dibásico, tribásico). Estas formas purificadas también
tienen digestibilidad variable. El contenido de fósforo total de alimentos para
camarón usualmente es de 1.5-2.5% (como base alimenticia), pero solo alrededor
de 50% de ello está disponible para el crecimiento del camarón. Los paquetes
vitamínicos (con suplementos minerales) son componentes necesarios de los
alimentos comerciales para camarón solo cuando la productividad natural del
estanque no es adecuada (muy altas densidades de siembra). Muchos alimentos
para camarón son frecuentemente suplementados con paquetes de premix de
vitaminas o precursores de vitaminas. Estos son generalmente incluidos de una
forma preventiva contra infecciones de virus y bacterias patógenas.
17
2.4. Sistema de defensa
Los invertebrados a lo largo del tiempo han desarrollado un sistema inmune o de
defensa para protegerse de agentes extraños y mantener su integridad biológica.
El sistema inmune de los invertebrados se caracteriza por la ausencia de
moléculas del tipo de inmunoglobulinas y células linfoides, estos organismos no
poseen un sistema inmunológico específico y son considerados organismos de
poca memoria inmunológica. Tienen mecanismos de defensa innata que está
basado en componentes celulares y humorales que cooperan entre ellos, lo que
esta interrelacionado con la detección y eliminación de patógenos extraños. En la
mayoría de los invertebrados los componentes humorales están representados
por péptidos antimicrobianos, especies reactivas de oxigeno y de nitrógeno,
enzimas que regulan los procesos inmunes y moléculas asociadas al
reconocimiento de agentes extraños. El componente celular está formado por
hemocitos, que son las células sanguíneas. El hemocele de los crustáceos tiene
circulación abierta y las células sanguíneas que se encuentran en este sistema
denominadas hemocitos son análogas a los glóbulos blancos de los vertebrados.
(Vargas, 2002, Maldonado et al, 2003, Zarain-Herzberg y Pacheco- Marges,
2007).
La hemolinfa, es el tejido de transporte y uno de los principales tejidos de reserva
de nutrientes. Ahí se encuentran las moléculas nutricionales que son
transportadas a los distintos tejidos internos por lo que pueden ser utilizadas como
indicadoras del estado nutricional (Pascual, et al. 2003).
18
2.4.1. Mecanismos de defensa
Las reacciones de respuesta celular son llevadas a cabo directamente por los
hemocitos. Esta células sanguíneas se cree pueden ser análogas a los leucocitos
de vertebrados y están clasificados en tres tipos dependiendo de la presencia y
tamaño de gránulos citoplasmáticos: hialinos, semi-granulares y granulares
(Holmblad y Söderhäll, 1999). Aunque la proporción y la función de los hemocitos
puede variar de una especie a otra, en general se considera que los hemocitos
granulares y semi-granulares son capaces de producir melanina por medio del
sistema pro-fenoloxidasa (Johansson y Söderhäll, 1988), en cambio los hemocitos
hialinos y en menor proporción los semi-granulares son responsables de realizar el
proceso de fagocitosis (Giulianini et al, 2007).
La fagocitosis es la más común de las reacciones de defensa celular, proceso
durante el cual células fagocíticas reconocen y se unen a partículas extrañas
como bacterias, esporas, virus o células envejecidas del propio organismo y
posteriormente son internalizadas en una vacuola llamada fagosoma donde son
destruidas (Vázquez et al, 1998; Kim, 2006). La formación de nódulos y la
encapsulación son respuestas multicelulares para eliminar las partículas extrañas,
que por su tamaño, no pueden ser fagocitadas por células individualmente
(Vázquez et al., 1998). Cuando la invasión se produce por una excesiva cantidad
de microorganismos, que no pueden ser fagocitados, los hemocitos proceden a
formar nódulos o bien encapsularlos (Bayne, 1990).
El sistema profenoloxidasa, se encuentra asociado con varios procesos
fisiológicos tales como la esclerosis, la pigmentación de cutícula y la cicatrización
de las heridas. Se encuentra ubicado dentro de vesículas en los hemocitos
granulares y semigranulares. El componente principal del sistema es la enzima
profenoloxidasa que en su forma activa oxida fenoles a quinonas y
19
espontáneamente se forma melanina. En la formación de esta última los
intermediarios previenen el crecimiento de microorganismos inhibiendo las
proteinasas y las quitinasas de patógeno. Existen otros factores de respuesta
como la producción de enzimas líticas, proteasas y péptidos antimicrobianos
(Ceniacua, 1997)
2.5. Microorganismos benéficos; probióticos
Durante los últimos años, algunos organismos unicelulares han llamado la
atención de los investigadores en cuanto a la posibilidad de usarlos en la
alimentación de especies acuícolas cultivadas. Diversos tipos de levaduras,
distintas algas unicelulares y algunas bacterias han sido los protagonistas
principales de una serie de estudios encaminados a comprobar su papel nutritivo
y la posibilidad de incluirlos en las dietas de organismos marinos.
El concepto de ingerir microorganismos vivos con el propósito de manipular la
microflora y mejorar la salud intestinal y el bienestar general de un organismo,
tiene sus primeras raíces a inicios del siglo XX. La palabra probiótico fue acuñada
por Parker, derivada de dos vocablos griego que significa para la vida, de acuerdo
con esta definición son microorganismos o sustancias provenientes de
microorganismos que contribuyen al equilibrio microbiano intestinal. Esta definición
incluye cultivos, células y metabolitos microbianos. El uso de probioticos y el
efecto de manipular la micro flora intestinal fue inicialmente observado por
Mechnikoff (1907), quien reportó los efectos benéficos de las bacterias
productoras de acido láctico en la prevención y tratamiento de enfermedades
intestinales.
20
Esta práctica actualmente se encuentra sujeta a mucha investigación con la
finalidad de obtener bacterias efectivas contra microorganismos patógenos, así
como para establecer los beneficios generales en el huésped. La mayoría de
productos que se han propuesto para uso en la acuicultura son los probióticos,
entre ellos existen diferentes grupos como las bacterias ácidos lácticas y géneros
como Vibrio, Bacillus y Pseudomonas, principalmente (Austin et al.1995; Garriques
y Arévalo, 1995; Ringo y Gatesoupe, 1998; Verschuerer et al, 2000; Sullivan,
2001).
Se considera probiótico aquel que contiene bacterias vivas que permanecen
activas en el intestino y ejercen importantes efectos fisiológicos al ser ingeridos
en cantidades suficientes, tienen efecto muy beneficioso, como contribuir al
equilibrio de la flora intestinal y potenciar el sistema inmunológico (Seh-lelha,
2008), dando como resultado un rápido crecimiento y mejor salud del animal.
La interacción entre la cepa probiotica y la microflora intestinal puede basarse en
la competición con bacterias patógenas por sitios de adhesión a los receptores
epiteliales, por nutrientes y a la producción de sustancias especificas como son
las bacteriocinas (Rodriguez y Le Moullac, 2000; Rengpipat et al, 2000; Simon,
2005; Vazquez et al, 2005).
2.5.1. Uso de probióticos en acuacultura
Gatesoupe, (1991) Presenta a los probióticos como una alternativa para eliminar
los riesgos de proliferación de vibrios oportunistas y mejorar la tasa de
sobrevivencia y de crecimiento de las larvas de peces.
Los probioticos son una alternativa prometedora al uso de antibióticos, reduciendo
las posibilidades de colonización y desarrollo de potenciales bacterias patógenas;
21
bajo el principio de exclusión competitiva y la estimulación del sistema inmune
(Fuller, 1989; Gatesoupe, 1999).
Los beneficios que han sido observados son: mejora la tasa de producción de
rotíferos y evita la proliferación de vibrios dominantes, lo que permite el desarrollo
de una flora más diversa. Los probióticos usados mejoran el peso de los peces y
las esporas de bacilo mejoran la tasa de sobrevivencia de las larvas de peces, en
caso de infección experimental o accidental con vibrios oportunistas, todos estos
efectos pueden ser debido a sustancias antibióticas provenientes de los
probióticos.
La compañía Diamond V de E.U.A recomienda el uso de la levadura en alimentos
para trucha, bagre, anguila y camarón, en un nivel de 0.5 y 1% en la dieta, ya que
provee de metabolitos y otros factores. Al someter su levadura y el de otras
compañías al proceso de peletizado, ello indican que aun las encapsuladas o
protegidas, mueren a causa del peletizado o presentan una desactivación del 86 al
99.9%, sin embargo los metabolitos no sufren variaciones y son estos, los que
mejoran el crecimiento de los animales.
Moriarty (1999), señala que con el uso de probióticos en acuicultura; la salud de
los animales mejora por la remoción o disminución de la densidad de población de
patógenos, mejorando la calidad del agua a través de una degradación más rápida
de la materia orgánica. Por otra parte en el caso de ciertas cepas (Bacillus sp. V.
alginolyticus) ha permitido tener en los animales un índice inmunitario mayor
respecto al tratamiento control (Gullian, et al. 2003).
22
2.5.2. Beneficios de los probióticos
Estos microorganismos pueden ser añadidos al agua o al alimento, en el manejo
del sistema de cultivo para el control de enfermedades.
El efecto benéfico de los probióticos se atribuye en general a tres mecanismos
diferentes (Wang et al, 2000, Verschuere et al, 2000), que a su vez pueden
deberse a varias causas:
Mejoramiento de la calidad del agua; Ya sea por metabolización de la materia
orgánica o por interacción con algunas algas.
Exclusión competitiva de bacterias nocivas; Competencia por nutrientes, por
sitios de fijación en el intestino o fuentes de energía disponible. Aumento de la
respuesta inmunológica del hospedero.
Aportes benéficos al proceso digestivo del hospedero; Aporte de macro y
micronutrientes para el hospedero o aporte de enzimas digestivas y por ende se
incrementa la tasa de crecimiento. Producción de componentes inhibidores como
antibióticos, bacteriocinas y quelantes que disminuyen el crecimiento del
patógeno.
El uso de mezclas probióticas son más efectivas que las cepas independientes en
el control de patógenos, y en el mejor establecimiento de poblaciones probióticas,
observándose procesos sinérgicos entre cepas que han potenciado los resultados
deseados (Douillet, 2000).
2.5.3. Efectos beneficiosos del uso de los Bacillus como probióticos.
Las bacterias del género Bacillus microbiológicamente son consideradas como
Gram positivas en forma de bastoncillo, agrupadas en cadenas, motiles y
flagelación perítrica, formadoras de endosporas, anaerobias estrictas o
23
facultativas, no son adherentes, y son productoras de sustancias antimicrobianas y
enzimas hidrolasas.
Entre las especies de mayor importancia como probióticos pertenecientes a este
género están Bacillus cereus, B. licheniformis, B. subtilis y B. natto (Jawets, 1996).
Anon (1998), da a conocer que la producción de endosporas es una característica
típica de todas las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium. Estas son
pequeñas estructuras ovoides o esféricas, en las que pueden transformarse estas
bacterias y constituyen formas celulares muy resistentes al calor y al medio
adverso. Otros de los elementos que caracteriza a los Bacillus sp. Es la
producción de enzimas hidrolíticas que ayudan a mejorar la utilización de los
alimentos. Dentro de estas se encuentran las proteasas, amilasas y las
glicosidasas que descomponen las complejas moléculas de los alimentos y las
transforman en nutrientes más simples. Estos compuestos son absorbidos más
rápidamente por el animal o pueden ser empleados por otras bacterias
beneficiosas para el establecimiento de una microflora intestinal balanceada. El
empleo de las bacterias del género Bacillus y sus endosporas también viene dado
por su capacidad de producción de enzimas, estas además de mejorar la digestión
en el hospedero, son capaces de inhibir el crecimiento microbiano de bacterias
dañinas. Las endosporas por su parte, estimulan el sistema inmune contribuyendo
a la resistencia contra el desafío de patógenos ambientales (Lopez-Villagomez y
Cruz-Benavides, 2011).
El empleo de endosporas de bacillus sp. Puede contribuir a una disminución de la
acidez del intestino, favoreciendo el crecimiento de Lactobacillus en el tracto
gastrointestinal, estimulando el sistema inmune, contribuyendo a la resistencia
contra el desafío de patógenos ambientales, inhibiendo y controlando el
crecimiento microbiano de bacterias dañinas y favoreciendo al proceso digestivo.
24
2.5.4. Uso de levaduras en acuacultura
Al tomar en cuenta la alimentación del camarón como factor primordial durante su
cultivo, es indispensable encontrar los medios para obtener un alimento eficiente,
de calidad y que estimule un rápido crecimiento lo que disminuye los costos de
producción. La eficiencia de un alimento balanceado depende mucho del valor
nutricional de sus ingredientes y principalmente de las fuentes proteicas que
poseen tales como , harina de pescado, camarón, pasta de soya, levadura,
etc.(Espinoza, 1992).
Quiñonez (2008), indica que los hongos unicelulares, usualmente de forma
ovalada, con estados vegetativos que se reproducen predominantemente por
gemación o fisión, dando por resultado un crecimiento unicelular, aunque algunas
pueden ser dimórficas o bifásicas y crecer como micelio bajo condiciones
ambientales apropiadas. Este grupo de microorganismos está incluido
taxonómicamente en la división Eumycota y dadas sus características de
reproducción sexual, se pueden ubicar en tres subdivisiones: Ascomycota, que
comprende a levaduras que pueden formar esporas contenidas dentro de un asca;
Basidiomycota, en donde los representantes forman esporas externas localizadas
sobre basidios o esterigmas y Deuteromycota en donde se incluyen todas aquellas
levaduras para las que no ha sido posible demostrar que presentan una fase
sexual en su ciclo de vida. Las levaduras registran una amplia distribución en un
variado tipo de hábitats terrestres. Sin embargo, es poco lo que se sabe de las
levaduras de ecosistemas acuáticos, particularmente del marino. También hay
algunas levaduras que son capaces de distribuirse en ambientes salinos no
marinos y son altamente halofílicas o halotolerantes (Ochoa y Vásquez-Juárez,
2004).
En los últimos años el uso de levaduras dentro de la acuacultura ha venido
creciendo, han llamado mucha la atención, en cuanto a la posibilidad de usarlos
25
en la alimentación de especies acuícolas cultivadas. Diversos tipos de levaduras
(Candida lipolytica, torula, S. cerevisiae y Tetraselmis sp.). La elección de estos
microorganismos se debe a diversas ventajas, entre las cuales destaca las
siguientes: el contenido proteico suele ser muy elevado (entre el 40 y 70% de
proteína de la materia seca); su alta velocidad de reproducción, junto con el hecho
de que hacen que se pueda cultivar de forma continua, en pequeños espacios y
con relativa independencia de clima; Fuente de nutrientes: aminoácidos,
vitaminas, oligoelementos; optimización en el proceso de absorción de minerales,
especialmente de zinc, potasio y cobre; propiedades absorbentes, la que los
convierte en fuente de nutrientes y además actúan como amortiguador de pH
(Aguirre-Guzmán, 1994).
26
3. JUSTIFICACIÓN
Es importante considerar que para optimizar el cultivo sustentable es imperativo
cuidar la calidad del agua, ya que su degradación provoca que los animales sean
más propensos al estrés, enfermedades y a presentar una menor tasa de
crecimiento, en gran medida el éxito del cultivo del camarón depende de la calidad
del alimento y de su adecuado manejo. Los alimentos constituyen un factor
decisivo para el éxito de esta actividad y representan generalmente el gasto mayor
en los sistemas de cultivo, del 50 -70% del costo total de producción en cualquier
cultivo de organismos acuáticos, es por ello que la alimentación y nutrición se ha
convertido en una de las áreas de investigación-desarrollo de mayor interés para
la camaronicultura (Tacón, 1995).
La calidad del alimento es importante en el cultivo de especies de interés
comercial, el contenido de proteína influye en el crecimiento y respuesta inmune,
lo cual representa un factor importante en la salud del camarón. Al cubrir el
requerimiento nutricional del camarón en unidades de proteína digerible en
sustitución del contenido de proteína total, se da un paso importante en la
formulación, definiendo con mayor precisión el nivel de calidad del alimento y
permitiendo ofrecer la cantidad de proteína utilizada. Una dieta balanceada, con
un adecuado contenido de nutrientes, es determinante para obtener una buena
tasa de supervivencia y de crecimiento, así como para lograr tasas de conversión
óptimas. En gran medida los resultados de las investigaciones van a depender,
entre otros factores, de la metodología empleada para su determinación, el
empleo de diferentes fuentes de nutrientes, regímenes de alimentación y
condiciones de cultivo, lo que dificulta la comparación de los mismos, no sólo entre
especies, sino también dentro de la misma especie. Además, esta situación se
debe a que como rasgo general, los camarones son animales
carnívoros/omnívoros, que en su dieta natural incluyen una amplia variedad de
27
alimentos, tales como fito y zooplancton, vegetales y animales de mayor tamaño,
así como detritus de diversos orígenes. Se suma a esta característica, la variación
no sólo a nivel de especie, sino también en cada fase del ciclo de vida de estos
organismos, que depende de las condiciones en que cada una de éstas se
desarrolla. Es por ello, que no se puede hablar de una composición óptima de
pienso en general para peneidos. Uno de los aspectos básicos para establecer el
alimento más adecuado que promueva los máximos crecimientos al menor costo,
lo constituye el conocimiento de los requerimientos nutricionales de la especie
objeto de cultivo.
La camaronicultura se enfrenta a un constante reto contra las mortalidades
causadas principalmente por microorganismos de origen viral y bacteriano en los
estanques de cultivo. Se han venido buscando alternativas al uso de antibióticos,
una de ellas es la utilización de microorganismos benéficos utilizados como
aditivos incluidos en el alimento, los cuales tienen la capacidad de modular la
microbiota intestinal, activar el sistema inmune del hospedero, o mejorar su
digestión. Es importante, antes de su aplicación en el campo de cualquier
nutriente y/o aditivo, realizar estudios controlados en el laboratorio a fin de
establecer las dosis y frecuencia de aplicación adecuadas. Con el presente
estudio de investigación se pretende evaluar el efecto de tres niveles de proteína
y microorganismos benéficos sobre el crecimiento y conteo total de hemocitos,
para obtener así organismos mejor nutridos y que ofrezcan mayor resistencia ante
cualquier episodio potencial de infección, activando previamente el sistema
inmune mediante el incremento del número de hemocitos circulantes.
28
4. OBJETIVOS
Objetivo general
Evaluar dietas con distintos niveles de proteína y probióticos sobre el crecimiento
e incremento de hemocitos en juveniles de camarón blanco L. vannamei.
Objetivos particulares
Determinar crecimiento de juveniles de camarón blanco alimentados con
tres niveles de proteína. Seleccionar un nivel de proteína.
Determinar crecimiento en juveniles de camarón blanco alimentados con un
nivel de proteína y con mezclas probióticas.
Determinar conteo total de hemocitos en juveniles previamente
alimentados distintos niveles de proteína y con mezclas probióticas.
29
5. MATERIALES Y MÉTODOS
Se realizaron dos bioensayos de crecimiento en el laboratorio de Nutrición
Experimental, del centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C.
(CIBNOR) para evaluar alimentos con tres niveles de proteína cruda (29, 32 y
35%) como primer bioensayo y un nivel de proteína seleccionado (29%) con y sin
probiótico en el alimento para camarones de Litopenaeus vannamei (segundo
bioensayo).
5.1. Bioensayo I
5.1.1. Determinación del efecto de tres niveles de inclusión de proteína
cruda en el alimento sobre el crecimiento y utilización del alimento en
juveniles de camarón L. vannamei
5.1.2. Organismos
Se utilizaron juveniles de camarón blanco del pacifico L. vannamei obtenidos
de los estanques de cultivo del CIBNOR. Los organismos fueron aclimatados al
manejo y condiciones de cautiverio en el Laboratorio de Nutrición Experimental del
CIBNOR durante 20 días antes de iniciar el experimento, en tanques de fibra de
vidrio con capacidad de 1,500 litros a una temperatura de 29°C y con una
salinidad de 40‰. Los organismos fueron alimentados dos veces al día (10:00am
y 16:00pm) con un alimento comercial PIASAMR para camarón con 35% de
proteína en base húmeda.
30
5.2. Preparación de los alimentos experimentales
5.2.1. Ingredientes
Para la fabricación de los alimentos experimentales se utilizaron los siguientes
ingredientes: pasta de soya, harina de pescado, butirato de hidróxido tolueno
(BHT), carboximetil celulosa (CMC), DL-metionina, Lisina-HCl y L-treonina, fueron
donados por el Laboratorio y Almacén de Alimentos Balanceados de la Posta
Zootécnica de la Universidad Autónoma de Baja California Sur. La harina de trigo
fue adquirida de una casa comercial (Mercado Bravo, La Paz, B.C.S.), el aceite de
pescado, alginato de sodio, lecitina, pre mezcla de vitaminas, pre mezcla de
minerales, fosfato dibásico de sodio, cloruro de colina y vitamina C, fueron
adquiridos en la planta de alimentos balanceados para camarón PIASA S.A. de C.
V. ubicada en el Parque Industrial en La Paz, B.C.S.
Los ingredientes utilizados fueron pulverizados y tamizados usando para ello
un pulverizador (Molinos pulvex, D.F. México) y un tamiz de 250µm,
respectivamente. Se almacenaron en bolsas de plásticos selladas y depositadas
en cubetas herméticas bajo condiciones de refrigeración (4°C) hasta el momento
de la toma de muestras para los análisis químicos respectivos o para la
fabricación de los alimentos experimentales.
5.2.2. Formulación de los alimentos
Los alimentos para camarones fueron formulados con la ayuda del programa
NutrionMR (Guadalajara, Jalisco, México). En la formulación de los alimentos
experimentales se empleó la base de datos generada con los resultados del
análisis químico proximal de los ingredientes (Tabla III).
31
Los tres niveles de proteína usados en el primer bioensayo se planearon
tomando en consideración las demandas de proteína cruda recomendadas
previamente para camarones peneidos (Akiyama y Dominy, 1990). Los niveles de
metionina, lisina y treonina cristalinas fueron calculados de acuerdo al
requerimiento estimado por (Tacón et al. 2002), con el objeto de conseguir
alimentos que cubrieran con los requerimientos para un buen crecimiento y
desarrollo de los camarones.
5.2.3. Fabricación de alimentos
Se elaboraron alimentos para juveniles de camarón blanco con tres niveles de
proteína, consistió en elaborar alimento con 29%, 32%, 35% de proteína cruda
(PC) suplementados con aminoácidos cristalinos (metionina, lisina y treonina),
más un control en el que se utilizó alimento de la casa comercial PIASA S.A. de
C.V.
Los alimentos se elaboraron en la Planta de Alimentos del CIBNOR basándose en
el método reportado por Civera y Guillaume, (1989).
Para la preparación primero se mezclaron el 50% de la harina de trigo, harina de
pescado y pasta de soya, las cuales fueron premezcladas por 15 minutos,
posteriormente se agregaron los ingredientes secos menores en donde se
incluyeron a la pre mezcla de vitaminas, fosfato dibásico de sodio, pre mezcla de
minerales, cloruro de colina, vitamina C y el antioxidante Butil-hidroxi-tolueno
(BHT), los cuales fueron premezclados manualmente con una cuchara metálica en
un recipiente de vidrio antes de ser agregados a la mezcladora. Para la mezcla
se empleó una mezcladora vertical (kitchen AidMR, St. Joseph, MI, EUA), con un
tiempo de 15 minutos en el mezclado.
32
Posteriormente se hizo una emulsión con el aceite de pescado y la lecitina de
soya; misma que fue incorporada a la mezcla de ingredientes secos y mezclado
durante 10 minutos. Una vez homogenizados los ingredientes, se agregó el cloruro
de colina disuelto en agua a 40°C, en un 35% del peso de la mezcla seca total de
cada alimento, y se mezclaron durante 8 minutos adicionales. La masa húmeda
resultante con textura similar a plastilina fue extruida en un molino de carne (Tor-
ReyMR Monterrey, N.L. México) en dos ocasiones para obtener pellets de 2 mm de
diámetro, los cuales fueron cortados manualmente y secados en una estufa con
flujo de aire a una temperatura de 37°C hasta que los pellets alcanzaron una
humedad aproximada del 10%, Por último, los alimentos fueron embolsados,
etiquetados y almacenados bajo refrigeración 4°C hasta su uso.
33
5.2.4. Alimentos experimentales
Se evaluaron tres alimentos experimentales (Tabla I) con distinto nivel de
proteína (29%, 32% y 35%). Se utilizó como control alimento comercial (PIASA).
Tabla I. Composición de los alimentos utilizados durante el primer bioensayo de
crecimiento, en juveniles de camarón blanco L. vannamei.
Ingrediente Nivel de proteína cruda (%)
29.0 32.0 35.0
Harina de pescado 24.0 28 33.3
Harina integral de trigo 33.2 25.2 20
Pasta de soya 26.0 30 30
Aceite de sardina 4.0 4 4
Alginato de sodio 2.0 2.0 2.0
Lecitina de soya 2.0 2.0 2.0
Premezcla de vitaminas1 1.8 1.8 1.8
Fosfato dibásico de sodio 1.2 1.2 1.2
Premezcla de minerales2 0.5 0.5 0.5
Cloruro de colina (62% agente activo) 0.2 0.2 0.2
Vitamina C (35% agente activo)1 0.09 0.09 0.09
Butil-hidroxi-tolueno (BHT) 0.004 0.004 0.004
carboximetil celulosa (CMC) 4.9 4.9 4.9
DL-metionina 0.015 0.008 ------
Lisina-HCl 0.014 ----- ------
L-treonina 0.054 0.045 0.033
Total 100.0 100.0 100.0
1VITCRU0409: Acetato de vitamina A, 15000 IU: D3, 7500 IU; E, 400mg; K3, 20 mg; Tiamina
monohidrató, 150 mg; riboflavina, 100 mg; piridoxina HCl, 50 mg; ácido pantoténico, 100 mg;
34
niacina, 300 mg; biotina, 1 mg; inositol, 500 mg; ácido fólico, 20 mg; cianocobalamina, 0.1 mg. 2MINCRU0409 (g/kg alimento): MgSO4 7H2O, 0.5; ZnSO4 7H2O, 0.09; KCl, 0.5; MnCl2 4H2O,
0.0234; CuCl2 2H2O, 0.005; Kl, 0.5; CoCl2 6H2O, 0.0025.
5.2.5. Análisis químico proximal de los ingredientes y alimentos
Se analizaron por triplicado los ingredientes y los alimentos experimentales. El
análisis químico proximal fue determinado de acuerdo a la metodología
recomendada por el A.O.A.C (2005). La humedad se determinó por secado en
estufa a 70°C durante 24 h. La cuantificación de cenizas (c) o minerales (método
N° 942.05), se desarrolló por incineración de las muestras en una mufla
(Thermolyne modelo F6000, Dubuque, IA, EUA) a 550 °C durante 6 h.
Para la determinación de proteína cruda se utilizó la metodología (N° 2001.11) se
realizó de manera indirecta cuantificando la concentración de nitrógeno en las
muestras en un digestor (kjeltec modelo 2040, Foss Tecator, Höganäs, Suiza) y
en un destilador automático (Kjeltec modelo 2300, Foss Tecator, Höganäs, Suiza)
con la técnica micro Kjeldahl. La cuantificación de extracto etéreo (EE) (método
N° 2003.05), se hizo usando un sistema de auto extracción (Soxtec Avanti
modelo 2050, Foss Tecator, Höganäs, Suiza), usando como solvente extractor el
éter de petróleo. Para determinar la fibra cruda (método N° 978.10), se usó una
hidrólisis ácido-básica con ácido sulfúrico e hidróxido de sodio en un digestor
(Fibertec modelo M6, Foss Tecator, Höganäs, Suiza) equipado con una unidad de
extracción caliente (modelo 1020, Foss Tecator, Höganäs, Suiza) y una unidad de
extracción fría (modelo 1021, Foss Tecator, Höganäs, Suiza).
Se calculó el extracto libre de nitrógeno (ELN), a partir de la diferencia entre 100 y
la suma de las determinaciones anteriores. En la medición de energía bruta se usó
un calorímetro adiabático (Parr Instrument Co., Modelo 1261, Moline, IL, EUA). Se
usaron crisoles de acero inoxidable en donde se colocaron pastillas de 1g secadas
35
previamente a 70°C en una estufa por 12 h, se empleó alambre (10 cm) con una
aleación de níquel-cobre el cual estaba en contacto con la muestra, la cual fue
incinerada en una cámara de combustión inyectada con oxígeno. Los residuos
líquidos de la combustión fueron recuperados y titulados con carbonato de sodio
0.725 N; se usó naranja de metilo como indicador, se cuantificó la cantidad de
alambre calcinado en la combustión para los cálculos de la energía liberada.
5.3. Sistema experimental
El sistema de cultivo consistió en 12 acuarios de fibra de vidrio con capacidad de
60 litros (50 x 55 x 38 cm); cada uno con malla mosquitero para evitar la fuga de
organismos, un calentador sumergible de 200 W (EBO-JAGER, Eheim GmbH y
Co., KG Deizisau, Alemania) ajustable para mantener la temperatura del agua
alrededor de 28 °C. Un exhaustor externo para airear el agua por medio de un
soplador de 5 HP y con ello conseguir valores de oxígeno disuelto iguales o
mayores a 5 mg/L.
Se abasteció a los acuarios con agua de mar pasando por un filtro de arena de 70
micras (Cristal-Flo, Modelo T240BP1 Santa Rite Industries Inc., Delavan, WI,
EUA). El agua se bombeó hacia los acuarios, pasando previamente a través de
filtros de arena (70m), de cartuchos (10 y 5m) y luz ultravioleta.
Se realizó el control artificial del fotoperiodo con un reloj automático (timer) con 12
horas de luz constante a partir de las 6:00 am y 12 horas de oscuridad con un
sistema de iluminación de luz de neón de 200 W.
36
Figura 2. Sistema de cultivo utilizado para la evaluación de los alimentos
experimentales en el laboratorio de Nutrición Experimental.
5.3.1. Diseño experimental
Se realizó un bioensayo que tuvo una duración de 40 días con juveniles de
camarón con un peso inicial promedio de 0.24 ± 0.03 g, alojados aleatoriamente
en una densidad de 10 organismos por acuario, con tres replicas (acuarios) por
tratamiento, (120 organismos en total), Los camarones tuvieron un periodo de
aclimatación en los acuarios por dos días antes de iniciar el bioensayo.
Se les suministró el alimento utilizando el 10% de la biomasa total de los
organismos, posteriormente se ajustó en función al consumo diario, de forma que
siempre hubiera un excedente. El alimento fue distribuido en tres raciones al día
(9:00, 13:00 y 17:00 hrs).
37
Diariamente antes del recambio de agua y labores de limpieza, se monitorearon
los siguientes parámetros fisicoquímicos en el agua de cada acuario: temperatura
(termómetro de mercurio), salinidad (refractómetro Sper Scientific 300011) y el
oxígeno disuelto con un oxímetro portátil (YSI, modelo 55-12FT). Se realizó
limpieza diaria de los acuarios por medio de sifoneo, eliminando mudas,
organismos muertos, heces excretadas y restos de alimento, se hizo un recambio
diario del 60% del volumen total del agua. Esto se hizo por la mañana antes de
ofrecer la primera alimentación; diariamente se realizó conteo de alimento residual
y de organismos, para estimar el alimento consumido y supervivencia. Se llevaron
a cabo biometrías a los 15, 30 y 40 días de cultivo, pesando por separado a cada
uno de los organismos de los acuarios utilizando una balanza analítica (con
precisión de d= 0.01 g y máximo 200 g), después de haberlos secado con papel
absorbente. Al finalizar el bioensayo se tomaron muestras de hemolinfa de los
camarones tratados, para determinar el conteo total de hemocitos circulantes.
5.4. Bioensayo II
5.4.1. Determinación de crecimiento, supervivencia y CTH en juveniles
de camarón blanco alimentados con un nivel de proteína en el alimento, con
y sin mezcla probiótica.
5.4.2. Organismos
Se utilizaron juveniles de camarón blanco del pacifico L. vannamei obtenidos de
los estanques de cultivo del CIBNOR. Los camarones fueron aclimatados al
manejo y condiciones de cautiverio en el laboratorio de nutrición Experimental del
CIBNOR, durante 15 días, en tanques de fibra de vidrio con capacidad de 1,500
litros a una temperatura de 29°C y con una salinidad de 40%o. Los organismos
38
fueron alimentados dos veces al día (10:00 y 16:00h) con un alimento comercial
PIASAMR para camarón con 35% de proteína en base húmeda.
5.4.3. Cepas probióticas
Se utilizaron seis cepas experimentales obtenidas de la colección de bacterias y
levaduras del CIBNOR, para realizar las evaluaciones experimentales: tres de las
cepas de bacilos fueron aisladas del hepatopáncreas de animales silvestres sanos
de L. vannamei (cepas YC5-2, YC3-B y C2-2) y las tres restantes fueron
levaduras, dos fueron aisladas del medio marino (Candida insectorum
DHHBCS005 y Debaryomyces hansenii DHHBCS006) y la otra de cítricos
(Debaryomyces hansenii L1).
Previo al bioensayo las cepas mantenidas en crio-conservación (-80°C) fueron
descongeladas y cultivadas individualmente en placas con agar TSA (trypticase
soy Agar) 2.5% NaCl para las bacterias a 37°C por 24 h y en PDA (Patata
Dextrosa Agar) las levaduras a 30°C por 24 h. Las colonias fueron extraídas del
agar y suspendidas en tubos de ensaye conteniendo 10 ml de solución salina 3%
NaCl. La suspensión de las bacterias fue concentrada hasta alcanzar una
absorbancia de 1.0 a una densidad óptica de 540 nm (espectrofotómetro)
equivalente a 1 x 109 UFC/mL y para el caso de las levaduras la suspensión de
las levaduras fue concentrada hasta alcanzar una absorbancia de 1.0 a una
densidad óptica de 600 nm (espectrofotómetro) equivalente a 3 x 107 UFC/mL.
39
5.4.4. Preparación de las Mezclas probióticas
Una vez obtenidas las concentraciones deseadas para cada cepa, en un aspersor
de plástico conteniendo 5 mL de solución salina, se agregó el 33.3 % de cada
suspensión bacteria, para así obtener una concentración final de 1 x 106 UFC/mL,
la cual se le agregó al alimento utilizando cajas petri grandes donde se colocó el
alimento, esto se llevó a cabo en condiciones asépticas, utilizando una campana
de flujo laminar. Este procedimiento también se realizó para el caso de las
levaduras utilizando la misma concentración final.
5.5. Alimento experimental
Con base a los resultados del bioensayo 1 (ver sección 6.1.4.) fue seleccionado el
alimento con 38% de proteína cruda (PC), utilizándolo para el segundo
experimento en el cual se utilizó alimento comercial (PIASA) como control. En la
tabla I sección 5.2.4, se muestra la composición del alimento utilizado.
La metodología para la fabricación del alimento, fue igual a la descrita en la
sección 5.2.3.
5.5.1. Sistema experimental
El segundo bioensayo consistió en evaluar la dieta seleccionada del bioensayo
anterior que fue de 38% PC, para el cual se eligieron 3 tratamientos: 1) alimento
con 38% PC; 2) dieta con 38%PC + mix de bacilos 1x106 UFC/ml; 3) dieta con
40
38% PC+ mix levaduras; 1x106 UFC/ml; 4) dieta control, (alimento comercial,
PIASA, 35% PC).
El sistema de cultivo consistió en 12 acuarios de fibra de vidrio con capacidad de
60 litros (50 x 55 x 38 cm); cada uno con malla mosquitero para evitar la fuga de
organismos, un calentador sumergible de 200 W (EBO-JAGER, Eheim GmbH y
Co., KG Deizisau, Alemania) ajustable para mantener la temperatura promedio del
agua a 28 ± 0.5 °C. Un exhaustor externo para airear el agua por medio de un
soplador con 5 HP de capacidad y con ello conseguir valores de oxígeno disuelto
iguales o mayores a 5 mg/L en los tanques de cultivo.
Los acuarios se abastecieron con agua de mar filtrada a través de un filtro de
arena de 70 micras (Cristal-Flo, Modelo T240BP1 Santa Rite Industries Inc.,
Delavan, WI, EUA). El agua se bombeó hacia los acuarios, pasando previamente
a través de filtros de arena (70m), de cartuchos (10 y 5m) y luz ultravioleta. Se
realizó control artificial del fotoperiodo con un reloj automático (timer) con 12 horas
de luz constante a partir de las 6:00 am y 12 horas de oscuridad con un sistema
de iluminación de luz de neón de 200 W.
El segundo bioensayo tuvo una duración de 45 días se utilizaron juveniles de
camarón con un peso inicial promedio de 0.14 ± 0.02 g, colocados
aleatoriamente a una densidad de 10 organismos por acuario, con tres réplicas
(acuarios) por tratamiento, (120 organismos en total). Los camarones tuvieron un
periodo de aclimatación en los acuarios por dos días antes de iniciar el bioensayo.
Los tratamientos fueron adicionados diariamente, suministrando el alimento al
10% de la biomasa total de los organismos. Posteriormente la cantidad de
alimento suministrada se ajustó en función del consumo diario, de tal forma que
siempre hubiera un pequeño excedente. El alimento fue distribuido en tres
raciones al día (9:00, 13:00 y 17:00 hrs).
41
Diariamente antes del recambio de agua y de las labores de limpieza, se
monitorearon parámetros fisicoquímicos en el agua de cada acuario: temperatura,
salinidad y oxigeno disuelto con un oximetro portátil (YSI, modelo 550A, YSI
Incorporated, Yellowspring, OH, EUA). Se realizó la limpieza de los acuarios por
sifoneo, eliminando mudas, organismos muertos, heces excretadas y restos de
alimento, se realizó diariamente un recambio del 60% del volumen total del agua,
esto se hizo por la mañana antes de ofrecer la primera alimentación; se contaron
diariamente los organismos y el alimento residual, para estimar la supervivencia y
el alimento consumido.
Se realizaron biometrías a los 15, 30 y 45 días de cultivo, pesando por separado a
cada uno de los organismos de cada acuarios utilizando una balanza analítica de
precisión de d= 0.01 g y un máximo de 200 g.
5.5.2. Obtención y conteo total de hemocitos circulantes (CTH)
Al finalizar cada uno de los bioensayos, se tomaron tres organismos al azar por
tratamiento (primer bioensayo) y seis organismos por tratamiento (segundo
bioensayo). La hemolinfa se extrajo de la base del pleopodo del primer segmento
abdominal cerca del poro genital, utilizando una jeringa de 3.0 ml conteniendo un
volumen de 500 µl de solución anticoagulante pre enfriada a 4°C la cual fue
diseñada con base a los valores iónicos y osmóticos de la hemolinfa del
camarón (450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM EDTA-Na2, 10 mM HEPES, pH 7.3,
850 mOsm kg-1) Vargas-Albores et al. (1996). Posteriormente después de la
extracción de hemolinfa, la muestra fue colocada en tubos Eppendorf estériles de
1.5 ml y se mantuvo en una cama de hielo, para su procesamiento inmediato.
42
El conteo total de hemocitos se realizó de acuerdo con la técnica descrita por
Campa-Córdova et al, (2002). Se tomaron 100 µl de hemolinfa y se colocó en un
tubo de Eppendorf conteniendo 400 µl de solución fijadora (anticoagulante +
formaldehido, al 10%). Los hemocitos fueron contados por observación al
microscopio utilizando una cámara Neubahuer, se depositó en la cámara un
volumen conocido de muestra, y se contó el número de hemocitos totales (sin
diferenciar hemocitos hialinos, semi-granulares y granulares) en cada cuadrante.
El número o conteo total de hemocitos se expresó en millones de hemocitos por
ml.
5.5.3. Evaluación de parámetros zootécnicos
Se evaluaron los parámetros zootécnicos de los dos bioensayos realizados, donde
los organismos fueron pesados individualmente utilizando una balanza modelo
QT-200 con una capacidad máxima de 200 g y una precisión de 0.01 g. Después
de haberles eliminado el exceso de agua con papel absorbente, se determinó:
supervivencia, peso corporal, consumo aparente de alimento y conversión
alimenticia.
Supervivencia (%) = número final de organismos X 100
Número inicial de organismos
Consumo aparente de alimento= alimento suministrado – alimento residual
Estimación visual del alimento residual en los acuarios.
Conversión alimenticia (CA) = alimento aparente consumido (g)
Incremento en peso corregido (g)
43
5.5.4. Análisis estadísticos
Los resultados obtenidos de ambos bioensayos relacionados con las variables de
peso final, conversión alimenticia y supervivencia fueron sometidas a un análisis
de varianza de una vía (ANOVA Statistica versión 6.0). Cuando se encontraron
diferencias entre los tratamientos, se utilizó la prueba de Tukey para determinar
qué tratamientos fueron distintos o similares entre sí.
44
6. RESULTADOS
6.1. Bioensayo I
6.1.1. Parámetros físico-químicos
Los parámetros físico químicos se mantuvieron durante el desarrollo del
experimento dentro de los rangos de tolerancia establecidos para el cultivo del
camarón. La tabla II, indica los valores promedio de los parámetros del agua
determinados durante el experimento.
Tabla II. Valores promedios (± desviación estándar) de los parámetros físicos químicos del agua de cultivo durante los 40 días de experimento.
6.1.2. Análisis químico proximal de los ingredientes
En la tabla III, se muestran los resultados de la composición química proximal de
los ingredientes utilizados en la fabricación de los alimentos, fabricados para los
experimentos. Los resultados más relevante son los valores proteicos de la harina
de pescado y la pasta de soya mostrando una concentración de proteína cruda de
66.9% y 44.43%, respectivamente. Por otro lado la harina de trigo presentó la
menor cantidad de proteína cruda con 13.84%.
Parámetro físico químico Valor promedio
Oxigeno (mg/l) 5.44 ± 0.3
Temperatura(°C) 28 ± 0.2
Salinidad (ppm) 40 ± 0.26
45
El mayor contenido de fibra cruda se obtuvo en la harina de soya con un mayor
porcentaje de 3.93%, seguido de un 1.45% en la harina de trigo y el menor
contenido de fibra se obtuvo en la harina de pescado con un 0.03%. Por otra
parte, el mayor contenido de cenizas se encontró en la harina de pescado con
12.98%, seguida por la harina de soya (7.75%) y la menor cantidad de cenizas se
presentó en la harina de trigo (1.29%). Respecto a la energía bruta, el mayor
contenido se registro en la harina de pescado (5445.25 cal/g), y el menor en la
harina de soya (4569.75 cal/g).
En lo que se refiere a el extracto etéreo se obtuvo mayor contenido en la harina
de pescado con 13.15% y menor cantidad en la harina de soya (1.15%).
Tabla III. Composición proximal (promedio ± desviación estándar) de los
ingredientes utilizados para la preparación de las dietas experimentales.
*Extracto libre de nitrógeno
INGREDIENTE HUMEDAD
(%)
PROTEINA
(%)
EXTRACTO
ETEREO
(%)
FIBRA
CRUDA
(%)
CENIZAS
(%)
*ELN
(%)
ENERGÍA
(cal/g)
Harina de
pescado
3.16 ±
0.09
66.9 ±
0.28
13.15 ±
0.05
0.03 ±
0.05
12.98 ±
0.11 6.94
5445.25 ±
0.00
Harina de
Soya
7.2 ±
0.02
44.43 ±
0.05
1.15 ±
0.02
3.93 ±
0.26
7.75 ±
0.05 42.74
4569.75 ±
39.07
Harina de
Trigo
6.76 ±
0.04
13.84 ±
0.15
1.63 ±
0.02
1.45 ±
0.03
1.29 ±
0.05 81.79
4060.38 ±
54.33
46
6.1.3. Composición química proximal de los alimentos experimentales.
En la tabla IV. se pueden observar los resultados de la composición química
proximal de los tres alimentos empleados en el primer bioensayo en el cual se
evaluó crecimiento para seleccionar el mejor nivel de proteína incluido en el
alimento del camarón.
Los resultados obtenidos de los análisis químicos proximales son el producto de la
combinación de los distintos ingredientes usados durante el proceso de
formulación. Los valores que se observan entre la cantidad de proteína formulada
(29, 32 y 35%) que se aprecia en la primera columna, y la proteína cruda
analizada que se muestra en la segunda columna (38, 41 y 44% PC), son
distintos, no se obtuvieron semejanzas entre la formulada 0 esperada. Por lo tanto
se tomaron en cuenta los niveles de proteína, resultados de los análisis químicos
proximales.
Tabla IV. Composición química proximal de los tres alimentos usados en el primer
bioensayo de crecimiento para juveniles de L. vannamei.
(g/100g de materia seca, ± desviación estándar)
Alimento
% PC
Formulada
Proteína
(%)
Extracto
Etéreo
(%)
Fibra Cruda
(%)
Cenizas
(%)
1
29 38.0 ± 0.11 9.15 ± 0.15 1.02 ± 0.05 7.48 ± 0.02
2
32 41.0 ± 0.25 8.93 ± 0.11 1.20 ± 0.02 0.00 ± 0.00
3
35 44.0 ± 0.18 10.09 ± 0.09 1.21 ± 0.12 8.83 ± 0.01
47
6.1.4. Resultados zootécnicos
Los resultados obtenidos para las variables de peso vivo final, consumo de
alimento, conversión alimenticia y supervivencia en camarones tratados con 3
niveles de proteína incluidos en el alimento y cultivados durante 40 días se
muestran en la Tabla V. El crecimiento de los organismos experimentales se
muestra en la figura 4.
Tabla V. Variables de peso final, consumo aparente de alimento, conversión
alimenticia y supervivencia de juveniles de L. vannamei alimentados durante 40
días con tres niveles de proteína
Consumo aparente de alimento (CAA), factor de conversión alimenticia (FCA). Valores para cada
columna teniendo la misma letra no son significativamente diferentes (p>0.05).
Durante el primer bioensayo se realizaron biometrías cada 15 días para observar
el comportamiento del crecimiento en los camarones. A partir de la primera
biometría (a los 15 días), se observaron diferencias significativas (p<0.05) entre el
Alimento
% PC Peso Final
(g)
CAA
(g) FCA
Supervivencia
(%)
Control
35.0 2.90 ± 0.39a
4.49 ± 0.13a 1.56 ± 0.05a 77 ± 25.2a
1
38.0 4.53 ± 0.96b
16.6 ± 0.95b 3.67 ± 0.15b 100 ± 0a
2
41.0 4.84 ± 1.25b
17.7 ± 1.67b 3.69 ± 0.38b 100 ± 0a
3
44.0 4.43 ± 1.5b
17.0 ± 0.49b 3.88 ± 0.46b 97 ± 5.7a
48
peso del grupo control y el pesos de los camarones tratados con 38, 41 y 44%
PC. Este comportamiento se mantuvo hasta el final del experimento, no
observando diferencias entre los pesos promedios de los camarones alimentados
con los tres nieles de proteína experimental, pero si con respecto al grupo control
de camarones. Figura 3.
Figura 3. peso de L. vannamei alimentados con distintos niveles de proteina (38,
41 y 44% PC) durante 40 dias de cultivo. *Diferencias significativas (p<0.05).
Los camarones tratados con el alimento control (p<0.05), registraron el menor
peso promedio con 2.90 g, seguido por los tratados con 44, 38, y 41% de PC,
registrando valores al final del primer bioensayo de 4.43, 4.53 y 4.84 g,
respectivamente. No se encontraron diferencias significativas entre los camarones
tratados con los tres niveles de proteína (figura 4).
*
*
*
49
Figura 4. pesos promedios de camarones juveniles de L. vannamei despues de
haber sido tratados con tres alimentos con distintos nivele de proteina (38%, 41%
y 44% PC) durante 40 dias de cultivo. Letras distintas indican diferencias
significativas (p<0.05).
En los resultados obtenidos del consumo aparente de alimento no se encontraron
diferencias significativas entre los grupos tratados con 38, 41 y 44% de PC,
registrando promedios de 16.6, 17.7 y 17.0 g. respectivamente. Sin embargo
dichos valores fueron significativamente mayores (p<0.05) a lo encontrados en el
grupo control (4.49 g).
alimentos; LS Means
Current effect: F(3, 107)=13.794, p=.00000
Effective hypothesis decomposition
Vertical bars denote 0.95 confidence intervals
control alimento 1 alimento 2 alimento 3
alimentos
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0P
eso
s (
g)
a
b
b
b
50
Figura 5. Consumo aparente de alimento, en juveniles de camarón cultivados
durante 40 días. Las Letras distintas indican diferencias significativas (p<0.05).
El factor de conversión alimenticia obtenido en el primer bioensayo resulto similar
entre los alimentos con niveles de 38, 41 y 44% de PC, mostraron valores
significativamente mayores (p<0.05) (3.67, 3.69 y 3.88, respectivamente) a los
encontrados con el grupo control (1.56).
6.1.5. Supervivencia
De acuerdo al análisis estadístico realizado no se encontraron diferencias
significativas (p> 0.05) de supervivencia respecto a los camarones alimentados
con 3 niveles de proteína cruda y los camarones del grupo control. Mediante
observación, los camarones presentaron buen comportamiento, sin embargo, la
a
b
b b
51
mayor supervivencia promedio registrada fue en aquellos camarones alimentados
con 38, 41% de PC (100%) seguido de 44%PC (97%) y con menor supervivencia
el grupo control con el 77% (Figura 6).
Figura 6. Supervivencia de juveniles de L. vannamei tratados con los tres
alimentos experimentales durante 40 días de cultivo.
6.1.6. Conteo total de hemocitos (CTH)
El conteo total de hemocitos obtenido al final del experimento en los camarones
tratados con diferentes niveles de proteína se observa en la figura 7. De acuerdo
con el análisis estadístico, se observó un incremento significativo (p<0.05) en los
organismos alimentados con 41%PC (5 x 106 hemocitos mL-1) respecto al grupo
control (1x106 hemocitos mL-1). No hubo diferencias significativas entre los grupos
52
de camarones tratados con 38, 41 y 44% PC registrando valores de 4 x106, 5 x106
y 3 x106 hemocitos mL-1 respectivamente.
Figura 7. Conteo Total de Hemocitos Circulares (CTH) en juveniles de camarón
blanco L. vannamei alimentados durante 40 días con alimentos conteniendo 38,
41 y 44% PC. Barras con letras distintas representan diferencias significativas
(p<0.05) entre alimentos.
a
ab
bb
bb
bb ab
bb
bb
bb
b
b
b
b
b
b
b
53
6.2. BIOENSAYO II
6.2.1. Parámetros físico químicos
Los parámetros físico químicos analizados durante el desarrollo del experimento
se mantuvieron dentro de los rangos de tolerancia establecidos en cultivo de
camarón. Los valores obtenidos del oxigeno, temperatura y salinidad se muestran
en la tabla VI.
Tabla VI. Valores promedio (± desviación estándar) de los parámetros físicos
químicos de la calidad del agua durante el desarrollo del segundo experimento.
Parámetro físico químico Valor promedio
Oxigeno (mg/l) 5.84 ± 0.73
Temperatura(°C) 28.5 ± 0.2
Salinidad (ppm) 36.11 ± 1.71
6.2.2. Análisis químico proximal de los ingredientes y alimento
En la tabla III y sección 6.1.2. se muestran los resultados de los análisis
proximales de los ingredientes utilizados en el alimento del segundo experimento,
y en la tabla IV, se presentan los resultados del análisis proximal (en base seca
del alimento (38% PC) usado en el experimento de crecimiento para evaluar el
efecto del uso de un nivel de proteína reforzado o no con probióticos. Este nivel de
54
proteína (38% PC), fue utilizado en el primer experimento, fue seleccionado para
ser utilizado en este segundo experimento debido que incremento en peso y CTH
en los camarones tratados respecto a los no tratados (control), a pesar de que
entre los otros dos alimentos de experimentación (41 y 44% PC) no existieron
diferencias significativas (p<0.05).
6.2.3. Resultados Zootécnicos
Los resultados obtenidos en las variables de peso final, consumo de alimento,
conversión alimenticia y supervivencia que se obtuvieron en los camarones
después de 45 días de experimentación se muestran en la tabla VII.
Tabla VII. Resultados de las variables medidas durante el bioensayo II, de
crecimiento.
TRATAMIENTOS
Peso Final
(g)
CAA
(g)
FCA
Supervivencia
(%)
Control 2.71±0.94a 2.21± 0.44a 0.81 ± 0.06a 63.33 ±11.5a
Tratamiento 1 4.42±1.6b 6.98 ± 0.43b 1.56 ± 0.18b 80 ± 17.3a
Tratamiento 2 3.95±1.65b 5.87± 0.16b 1.52 ± 0.26b 83.33 ± 11.55a
Tratamiento 3 4.21±1.46b 6.09 ±0.62b 1.45 ± 0.05b 93.33 ± 5.77a
Consumo aparente de alimento (CAA), factor de conversión alimenticia (FCA). Letras
distintas representan diferencias significativas (p<0.05)
55
Los resultados del peso final obtenido en el segundo bioensayo se muestran en
la figura 9, los juveniles tratados durante 45 días con una dieta de 38% PC y con
dietas adicionando probióticos, mostraron al final del experimento valores más
altos con el tratamiento 1 (38% PC) registrando un peso promedio de 4.42g,
similar a los camarones tratados con la dieta 2 (38%PC+ mix bacilos; 1x106
UFC/ml) y los tratados con la dieta 3 (38%PC + mix levaduras; 1x106 UFC/ml),
con valores de 3.95 y 4.21g, respectivamente. Estos valores fueron
significativamente mayores (p<0.05) a los del grupo control, ya que este grupo
registró el menor peso promedio con 2.71g. Estas diferencias en peso empezaron
a registrarse a partir de los 15 días de cultivo, cuando se realizo la primera
biometría, presentando el grupo control con un menor peso de 0.38g, y un
respecto al grupo de camarones con el mayor peso promedio 0.53g con la dieta 3.
A los 30 días de cultivo, la biometría arrojó que el mayor peso promedio se
mantuvo con el tratamiento 3 (1.69 g), respecto al menor peso promedio registrado
que fue el grupo control con un peso promedio de1.12 g. Por otra parte a los 45
días del bioensayo el mayor peso lo presento el tratamiento 1 seguido del
tratamiento 2 y 3. Ver figura 8.
56
Figura 8. Peso de juveniles de camarón blanco L. vannamei, durante 45 días de cultivo,
alimentados con tres diferentes tratamientos: Trat.1) 38% PC; Trat.2) 38%PC+ mix
bacilos; 1x106 UFC/ml); Trat.3) 38%PC + mix levaduras; 1x106 UFC/ml y un control. (*)
Diferencias significativas (p<0.05).
Figura 9. .Peso promedio de los 3 diferentes tratamientos utilizados en juveniles de L.
vannamei cultivados durante 45 días. Letras distintas muestran diferencias significativas
(p<0.05).
* *
*
*
*
57
Los datos obtenidos para el consumo aparente de alimento muestran que,
no se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos 1, 2 y 3, con
promedios de 6.98, 5.87 y 6.09g respectivamente. Los valores anteriores fueron
significativamente mayores (p<0.05) que los registrados en el grupo control (2.21
g).
Figura 10. Consumo aparente de alimento en juveniles de L. vannamei cultivados durante
45 días alimentados con 3 distintos tratamientos: Trat.1) 38% PC; Trat.2) 38%PC+ mix
bacilos; 1x106 UFC/ml); Trat.3) 38%PC + mix levaduras; 1x106 UFC/ml y un grupo
control. Las letras distintas indican diferencias significativas (p<0.05)
El factor de conversión alimenticia fue similar (p>0.05) entre el tratamiento
1, 2 y 3, con valores promedio de 1.56, 1.52 y 1.45, respectivamente. Los
camarones tratados con las dietas experimentales registraron valores
significativamente mayores (p< 0.05) a los encontrados con los camarones
alimentados del grupo control (0.81).
b b
b
a
58
La supervivencia obtenida al final del bioensayo, a los 45 días de cultivo no
registro diferencias significativas (p>0.05) entre los tratamientos experimentales.
Sin embargo, la mayor supervivencia promedio se observó en los camarones
alimentados con el tratamiento 3 (93.3%) y la menor supervivencia en los
camarones perteneciente al grupo control (63.3%). Las muertes se presentaron
a partir de los 30 días de cultivo. En la figura 11, se puede observar la
supervivencia desde el inicio del bioensayo hasta el final, a los 45 días.
Figura 11. Supervivencia de juveniles de camarón L. vannamei alimentados con tres
distintos tratamientos: a) control; b) 38%PC (t1); c) 38%PC+ mix bacilos; 1x106 UFC/ml
(t2); d) 38%PC + mix levaduras; 1x106 UFC/ml (t3), durante 45 días de cultivo.
59
6.2.4. Conteo total de hemocitos
El conteo total de hemocitos obtenido en el segundo bioensayo (Figura 12),
después de la alimentación de los camarones con tres diferentes dietas, muestra
un incremento significativo (p<0.05) en la concentración de hemocitos en los
grupos de camarones alimentados con el tratamiento 3 (38%PC + mix levaduras;
1x106 UFC/ml), con un promedio de 14x106 hemocitos mL-1 , comparado con el
grupo control que registro menor valor de hemocitos circulantes con 5x106
hemocitos mL-1. No se registraron diferencias significativas entre las 3 dietas
experimentales utilizadas (p>0.05).
Figura 12. Conteo Total de Hemocitos (CTH), en juveniles de camarón L. vannamei
alimentados con los siguientes tratamientos: a) control; b) 38% PC (Trat.1), c) 38% PC+
mix bacilos (Trat. 2); d) 38% PC + mix levaduras (Trat. 3), durante 45 días de cultivo
experimental. Letras distintas indican diferencias significativas (p<0.05).
a
ab ab
b
60
7. Discusión
7.1. Crecimiento de camarones juveniles de L. vannamei alimentados
con tres niveles de proteína.
El comportamiento de los parámetros físico químicos del agua (oxigeno disuelto,
temperatura y salinidad) registrados durante el periodo experimental, no presento
alteraciones adversas al cultivo. Comportándose dentro de los rangos normales
recomendados para camarones peneidos, los valores de dichos parámetros se
muestran en la tabla II. Hay que considerar que estos parámetros son
importantísimos, ya que influyen directamente en los requerimientos y
crecimiento de los camarones (Allan y Maguire, 1991)
Como en todos los sistemas de cultivo de animales, el crecimiento y producción de
camarón de cultivo depende completamente de lo suplementario e ingesta de
nutrimentos y alimentos; este último representa el principal y más alto costo de
operación de la mayoría de los cultivos semi-intensivos e intensivos. La necesidad
de elevar los rendimientos en la producción de camarones exige la búsqueda de
formulas alimenticias eficientes que permitan incrementar las tallas de los
animales. Por ello, se han venido formulando objetivos en torno a la identificación
de nuevas fuentes de proteína, buscando la manera de disminuir los niveles de
harina de pescado en los alimentos mediante la sustitución, de forma parcial o
total, por las fuentes de proteínas alternativas (De la Higuera, 1985), para tratar de
disminuir el costo del alimento. En este presente trabajo se realizo la evaluación
de tres niveles de proteína utilizando fuentes de proteína vegetal,
suplementándolos con aminoácidos cristalinos (lisina, metionina y treonina).
Las materias primas utilizadas para formular los alimentos que se usaron en este
estudio fueron la harina de pescado, harina de soya y harina de trigo. De acuerdo
con los resultados de los análisis químicos proximales; la harina de pescado fue la
que presentó el mayor contenido de proteína (66.9%) seguida de la pasta de soya
(44.43%) con menor contenido la harina de trigo (13.84%), estos resultados
61
coinciden con los reportados por Parra (1992); Cruz-Suarez et al, (1996); cruz-
Suarez (2000).
La harina de pescado es considerada como la fuente de proteína de calidad,
regularmente forma parte de las dietas de peneidos, esto se debe a su alta
palatabilidad y regularmente contiene altos niveles de energía y proteína
digestibles, tiene excelentes niveles de aminoácidos esenciales disponibles para
los requerimientos de varias especies tanto de peces y crustáceos (Webster y
Tidwell, 1992; Hardy, 1998). De aquí que dos tercios de la proteína en las dietas
provengan de la harina de pescado (McCoy, 1990). Por etas razones se
considera que no hay límite para la utilización de la harina de pescado en los
alimentos comerciales salvo el precio (Akiyama et al, 1991). Por la alta demanda
que ha tenido sea elevado, por lo tanto es uno de los ingredientes más costosos,
por lo que se buscan fuentes de proteínas alternativas, varios autores han
encontrado buenos resultados utilizando harina de soya en comparación con las
harinas de pescado y harina de camarones, dando respuesta que es superior
como un promotor de crecimiento para camarones peneidos (sick, 1973).
Venkataramiah et al, (1975) postulan que la adición de materia vegetal a la
alimentación ha demostrado un mejoramiento en la eficiencia de conversiones
alimenticias y sobrevivencia de camarones juveniles. Che et al, (1985) sugieren
que el reemplazo de proteína animal con proteína de origen vegetal con
diferentes niveles y calidad de proteína, se justifica en el proceso de crecimiento,
maximizando a un bajo costo el alimento para juveniles de camarones.
La formulación de los alimentos experimentales del presente trabajo, se planearon
tomando en consideración las demandas de proteína cruda recomendadas
previamente para camarones peneidos (Akiyama y Dominy, 1990). Los niveles de
metionina, lisina y treonina cristalinas fueron calculados de acuerdo al
requerimiento estimado por Tacon et al, (2002). Los valores obtenidos de los
análisis químico proximal de los alimentos experimentales (tabla IV) con respecto
62
a la proteína no concuerdan con la cantidad de proteína formulada, consideramos
que se debe probablemente a varias razones; la primera por el hecho de que los
reportes de la composición química se expresan convencionalmente en base seca
(AOAC, 2005), mientras que los niveles de proteína de los alimentos están
expresados en base húmeda, segunda, según Terrazas, 2010 menciona que la
proteína digerible generalmente es menor a la cantidad de proteína cruda
analizada, otra cuestión sería que la formulación no se haya hecho bien. por lo
tanto se tomaron en cuenta los porcentajes de proteína obtenidos de los análisis
proximales.
Al analizar en conjunto los resultados para todas las variables de crecimiento
medidas en este bioensayo, se observó que los diferentes tratamientos tuvieron
efectos positivos, ya que favorecieron el incremento de los pesos desde la etapa
inicial, no mostrando diferencias significativas entre ellos indicando que los
diferentes niveles de proteína (38, 41 y 44%) (Tabla V) se comportaron de la
misma manera. Por lo tanto, se considera que con niveles iguales o superiores a
38% de proteína fueron los que presentaron un mejor comportamiento. Otro
aspecto que se tiene que tomar en cuenta es que si entre ellos analizamos
además el aspecto económico resulta ser que la dieta con nivel de proteína de
38% es la que reúne las mejores condiciones nutricionales, por lo que este nivel
protéico puede sugerirse como buen alimento para el crecimiento, lográndose de
esta forma reducir el nivel de proteína en la dieta comercial, permitiendo la
sustitución efectiva de ingredientes de origen vegetal y aminoácidos cristalinos,
con bajo costo y además para reducir la producción de desperdicios. Estos
resultados concuerdan con Parra, (1992) donde demostró que no existen
diferencias significativas entre el peso ganado y los porcentajes de proteína
utilizados en dietas de 25, 30 y 35% de proteína, indicando que los diferentes
niveles de proteína se comportarón de la misma forma. Por otra parte Galindo et
al, (2002) También reporta que con dietas de 28 y 33% de proteína obtuvieron
crecimientos no significativos entre ambos tratamientos. Cruz-Suárez et al, (2000)
63
evaluaron el efecto de 4 niveles de proteína 20, 25, 30 y 35%, para L. vannamei y
L. stylirostris utilizando fuentes de proteína animal y vegetal, mostrando que la
respuesta al nivel de proteína fue asimétrica para ambas proporciones
animal/vegetal donde los mejores crecimientos fueron provistos por las dietas con
un nivel de inclusión de proteína igual o mayor al 25% de proteína en la dieta.
Diversos autores han estudiado el efecto del nivel de proteína dietaria sobre el
crecimiento y la tasa de conversión, algunos recomiendan niveles de proteína
altos para camarones de 40 a 45%, (Akiyama et al, 1991) Tacon, (1989)
recomienda 40% de proteína, para L. vannamei, colvin y Brand, (1977) proponen
como óptimo 30-35% de proteína en dietas de postlarvas y menos de 30 % para
juveniles. Martinez-Córdova et al, (2002), observó que L. vannamei, se desarrolla
adecuadamente con alimentos con 25% de proteína en estanques productivos.
Pérez-Velázquez et al, (2008) demostraron que la inclusión de proteína cruda en
concentraciones de 25, 30, 35 y 40% en el alimento para camarones (L.
vannamei) y al ajustar el consumo de alimento a fin de obtener concentraciones
iguales de proteína por un periodo de 28 días, no generó diferencias en la
ganancia de peso final o en la tasa de crecimiento entre los grupos de camarones
alimentados con 35 y 40% de proteína, ni entre los grupos que recibieron 25 y
30% de proteína en sus alimentos, obteniendo un peso final de 1.96 y 2.09 g.
respectivamente. Por otra parte Huai et al, (2010), compararon 4 niveles de
proteína cruda (35.5~41.3) o sus equivalentes en proteína digerible (29.8~35.3%),
encontrando que es factible reducir el nivel de ese nutrimento en el alimento en
juveniles de camarón blanco sin afectar su rendimiento productivo, siempre y
cuando sean suplementados los aminoácidos limitantes, tales como la metionina,
la lisina y la treonina.
La evaluación de los alimentos (38, 41 y 44 % de proteína) que se plantearon en
este estudio, permitió conocer la utilización de fuentes de proteína vegetal como
animal suplementados con aminoácidos cristalinos; metionina, lisina y treonina
64
adicionándolos como aminoácidos limitantes, reduciendo así el nivel de proteína a
38% en el alimento para juveniles de camarón L.vannamei, sin afectar su
rendimiento productivo, y así se disminuyó la cantidad de harina de pescado,
obteniendo un alimento de mejor calidad nutricional y con menor cantidad de
proteína.
La formulación a un perfil de aminoácidos digestibles es una herramienta útil para
compensar el nivel de calidad de los ingredientes alimenticios utilizados; su
impacto positivo en el rendimiento zootécnico de los animales se espera sea
mayor con respecto a la formulación a aminoácidos totales o en los casos en
donde se empleen materias primas de menor calidad (Terrazas et al, 2005). En
décadas anteriores, la industria de alimentos balanceados para animales
terrestres empleaban como criterio para la formulación la concentración total de la
proteína en el alimento (Fernandez, 1996) en lugar de formular para mejorar el
perfil de aminoácidos esenciales, meta hacia la que se pudo avanzar con el uso
de aminoácidos cristalinos hasta que se inició la oferta comercial de los mismos
(Terrazas, 2010). Ello ocurrió primero con el uso de metionina para la alimentación
de aves (González y Pesti, 1994) y posteriormente con lisina y treonina para la
producción de cerdos (Cuaron, 1993).
En el caso de la acuacultura, la producción intensiva de peces está más avanzada
en el tema del uso de aminoácidos para la formulación de alimentos, mientras que
en el caso del camarón se ha generado una controversia sobre el uso de
aminoácidos cristalinos en los alimentos, ya que se asume que existe una
importante lixiviación de aminoácidos hacia el agua con la inmersión y la
manipulación del alimento por parte del camarón, antes de su ingestión (Cruz-
Suarez et al, 2005). Se han propuesto estrategias para reducir la lixiviación de los
aminoácidos cristalinos en el agua por medio del uso de sustancias aglutinantes,
dando resultados positivos en la respuesta de crecimiento del camarón (Terrazas,
2010), como en el caso de nuestro estudio, que se utilizó carboxi- metil-celulosa
con el propósito de reducir el problema de lixiviación en los alimentos evaluados,
65
ya que se ha demostrado que es uno de los compuestos que han sido útiles para
mejorar el uso de los aminoácidos cristalinos en alimentos para camarón
(Millamena et al, 1999).
Los aglutinantes o sustancias protectoras de los aminoácidos cristalinos pueden
ser adicionados en dos formas: la primera directamente al aminoácido y la
segunda, incorporando esos compuestos a la mezcla total de ingredientes que
conforman el alimento al momento de su fabricación (Alam et al, 2004,2005). En
este trabajo se optó por la segunda opción, sin embargo, la cantidad de dichos
aminoácidos en la mezcla no pudo ser analizada en el laboratorio, sin embargo, la
respuesta de crecimiento del camarón, obtenida en los bioensayos realizados,
permitió afirmar que sí pudo ser utilizada para su crecimiento. Chi et al, (2009)
evaluaron tres métodos de protección de L-metionina cristalina, sin encontrar
diferencias entre los tratamientos, en donde se protegió al aminoácido y al
tratamiento donde se utilizó el aminoácido en forma directa; esto concuerda con
los resultados benéficos obtenidos sobre el peso final de los camarones en
nuestros bioensayos, con la adición de aminoácidos sin proteger (metionina, lisina
y treonina) adicionados en alimentos bajos en proteína (Huai et al, 2010). Por lo
dicho anteriormente, la disponibilidad biológica de proteína y aminoácidos es un
elemento importante a considerar, porque está relacionado con la cantidad de
nitrógeno retenida por el camarón (Terrazas, 2010), por lo tanto las proteínas son
los componentes de los alimentos complementarios más importantes para el
crecimiento óptimo de los camarones, en cuanto a la cantidad y calidad de la
fuente proteica (chen et al, 1985) y la presencia de aminoácidos esenciales en
estas raciones respondería con una mayor síntesis de proteínas en sus tejidos
(Parra, 1992). Kanasawa, (1985), asume que la diversidad de los niveles óptimos
de proteína para los camarones se debe a varios factores, principalmente a las
diferencias de hábitos alimenticios y de comportamientos (bentónicos o de nado
libre, carnívoro u omnívoro), edad de la especie y fuente proteica usada (fuente
animal o vegetal).
66
En el alimento consumido se pudo observar una notable diferencia entre el grupo
control y los tratamientos, a pesar de que la ración inicial suministrada para todos
los camarones fue del 10% de la biomasa total, de esta manera en cada biometría
realizada se pudo ajustar la ración de manera considerable la cantidad de alimento
suministrado a cada unidad experimental. La cantidad de alimento consumido por
la población tiene alta y bajas durante el periodo experimental, indicando que la
población no consume la misma cantidad de alimento por unidad de biomasa, sino
que hay variaciones que pueden estar determinadas por varios factores, como por
ejemplo los estadios de muda, el tipo de alimento, fotoperiodo, etc. La conversión
alimenticia (Tabla V) fue mayor en los tres niveles de proteína experimentales en
comparación con los del grupo control, no se encontraron diferencias entre los tres
niveles evaluados considerándose los resultados como valores buenos de
conversión alimenticia. En este caso Cruz-Suarez et al, (2000), reporto resultados
similares al evaluar el efecto de 4 niveles en la relación proteína cruda / energía
bruta (P/E = 50, 60, 70 o 80 mg prot./kcal, para niveles de proteína de = 20, 25, 30
o 35%), obteniendo las mejores tasas de conversión alimenticia utilizando niveles
de proteína mayor o igual al 25% de proteína en L. vannamei. Es el caso de este
estudio donde también se obtuvieron resultados de manera similar entre los tres
niveles de proteína evaluadas.
En nuestro estudio, la supervivencia en todos los casos se consideró buena al
presentarse entre el 90 y 100 %, no encontrando diferencias significativas entre
los tratamientos. Probablemente la mortalidad que se presentó en los alimentados
con 44% de proteína, pudo ser por el periodo de muda y los organismos
recurrieron al canibalismo, que es un comportamiento común en los crustáceos.
En este caso Parra, (1992), indica que el porcentaje promedio de sobrevivencia
para varias especies de Penaeus está entre el 80 y 100%; nuestros resultados
están dentro de este rango, a excepción del grupo control donde la sobrevivencia
estuvo por debajo de este rango (73.3%).
67
7.2. Crecimiento de camarones juveniles de L. vannamei, alimentados con
un nivel de proteína, adicionado con mezclas probióticas
En este segundo experimento de crecimiento también fue importante el monitoreo
de los parámetros fisicoquímicos, manteniéndose entre los rangos de tolerancia
establecidos en el cultivo de camarón (Tabla VI).
Durante los últimos años se han venido desarrollando estudios buscando
alternativas para el control de enfermedades infecciosas en los cultivos, una de
ellas han sido los probióticos; que son microorganismos vivos que permanecen
activos en el intestino y ejercen importantes efectos fisiológicos, al ser ingeridos en
cantidades suficientes teniendo efectos benéficos, entre ellos contribuir al
equilibrio de la flora intestinal y potenciar el sistema inmunológico (Seh-lelha,
2008), la utilización de la inmunoestimulación como forma natural de defensa en
los camarones, es una alternativa al uso de antibióticos y quimioterapéuticos, bajo
el principio de exclusión competitiva (Gullian, 2001). Varios estudios han
demostrado que el uso de mezclas probióticas son más efectivas que las cepas
independientes en el control de patógenos, ya que la posibilidad de establecer
poblaciones probióticas a pesar de las variaciones ambientales es mayor, además,
también se han observado procesos sinérgicos entre cepas, que han
incrementado los resultados deseados (Douillet, 2000). En este caso Sotomayor y
Balcazar, (2003) mencionan que las mezclas de cepas probióticas tienen
propiedades como agentes de biocontrol para el uso en laboratorios y granjas de
cultivo, reduciendo la presencia de vibrios patógenos en los sistemas acuícolas.
Varios autores piensan que la alimentación con peletizado comercial puede
alterar paulatinamente la anatomía digestiva, lo que llevaría a un mejor acceso de
bacterias en la colonización del tracto intestinal. En este presente trabajo se
realizó la evaluación de mezclas probióticas de Bacillus (cepas YC5-2, YC3-B y
C2-2) y levaduras (Candida insectorum DHHBCS005, Debaryomyces hansenii
68
DHHBCS006 y Debaryomyces hansenii L1), adicionadas al alimento, considerado
de calidad nutricional del mismo y previamente evaluado en un bioensayo anterior.
De acuerdo con los resultados de las variables de crecimiento medidos en este
estudio, no se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos con
probióticos incluidos en el alimento con nivel de proteína de 38% (Tratamiento 2 y
Tratamiento 3) y con tratamiento con el nivel de proteína de 38% sin probiótico
(Tratamiento 1), pero sí con respecto al control, que consistió en alimento
comercial (35% de proteína) sin probiótico. Esto nos indica que un buen alimento
de calidad nutricional se refleja en un rápido crecimiento y mejor salud del animal.
De esta manera se comprueba que los probióticos son una alternativa capaz de
mejorar la condición de los organismos en los cultivos, además de tener otros
beneficios de control de calidad del producto final. En el consumo de alimento, no
se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos (Tratamientos 1, 2 y
3. Tabla VII , Figura 10 ), pero si las hubo entre los tratamientos respecto al grupo
control esto indica que el consumo de alimento está relacionado con el incremento
de peso promedio obtenidos, al igual que los resultados del factor de conversión
alimenticia (FCA) encontrándose los mayores valores de FCA en los tres
tratamientos, encontrando diferencias significativas con respecto al control. Se
obtuvieron supervivencias entre el 80% y el 93% en los tratamientos y un 63.33%
en el control, no se encontraron diferencias significativas entre los tratados y el
control. Durante todo el bioensayo se observó buena actividad motriz, buena
aceptación en el consumo de los tratamientos empleados, esto fue reflejado en los
pesos promedios obtenidos.
El género Bacillus si bien no se encuentra dentro de los géneros comunes en
ambientes marinos por tratarse de un microorganismo de origen telúrico, ha sido
aislado del intestino de crustáceos (Rengpipat et al, 2000), peces marinos (Sugita
et al, 1998), y bivalvos (Sugita et al, 1981). Resultados similares a este trabajo con
Penaeus vannamei, Guillan (2001) en un ensayo de evaluación de cepas
69
probióticas como inmunoestimulantes, registró incremento significativo en el peso
promedio de los camarones, respecto al control, así también mejorando la
respuesta inmunitaria de P. vannamei, al usar las cepas: Bacillus p64, Vibrio p62 y
V. alginolyticus (cepa Ili). Por otra parte, Sotomayor y Balcazar (2003) en un
estudio que hicieron evaluando cuatro cepas probióticas Ili (V. alginolyticus), p62 y
p63 (Vibrio sp.) y p64 (Bacillus sp.) ante tres cepas patógenas de forma in vitro,
presentando éstas, mayor capacidad de inhibición sobre el crecimiento de Vibrio
sp. patógeno. De igual forma Rengpipat et al (1998) reportó resultados similares
en postlarvas de 30 días de camarón P. monodon con la utilización de Bacillus
S11 como probiótico en el alimento. Después de alimentar durante 100 días con
células frescas, no encontraron diferencias significativas en crecimiento entre los
tratamientos probióticos, pero sí entre probióticos y el control. El mismo autor
Rengpipat et al (2000), luego de alimentar 90 días con Bacillus 39 S11 en tanques
de P. monodon, encontró que los tratados con probióticos tuvieron mayor
supervivencia que los no tratados, sin embargo, no obtuvieron diferencias
significativas en el crecimiento, atribuyendo estos resultados a diferentes
condiciones de cultivo. Guillan (2001), al evaluar cepas probióticas como
inminoestimulantes reportó una supervivencia del 100% para todos los
tratamientos (Bacillus p64, Vibrio P62 y V. alginolyticus (cepa Ili)). A diferencia de
nuestro trabajo no se encontraron diferencias significativas con respecto a la
supervivencia entre tratamientos ni con el control, se cree que estas altas
mortalidades se deban a la incidencia de la presencia de personal ajeno a los
experimentos, recordemos que los camarones son organismos sensibles a la
presencia y ruidos, estresándose rápidamente, lo que ocasiona la alteración de
los organismos, brincando hacia fuera de los acuarios provocándoles la muerte.
Otro factor pudo ser las etapas de mudas ya que en los crustáceos es algo
característico el que se presente canibalismo entre ellos.
Dentro de las ventajas del uso de probióticos, se considera su influencia en la
actividad digestiva mediante síntesis de vitaminas o cofactores; mejora en la
70
actividad enzimática, pre digestión de proteínas, producción de exoenzimas
eficientes en romper polímeros de celulosa y almidón (Fuller, 1989; Gatesoupe,
1999; Ziemer y Gibson, 1998; Jory, 1998). De acuerdo con Guillan (2001), estas
propiedades podrían ser la causa del incremento en el peso, influyendo en una
mejora sustancial de la digestión o absorción de nutrientes. La vía de
inmunoestimulación es un factor muy importante, sobre todo en organismos
pequeños, donde la eficiencia de la estimulación se debe evaluar con métodos
eficientes. Por otra parte, las levaduras se han utilizado en numerosas
investigaciones como única fuente de proteína en las dietas de diversos peces y
pese a la deficiencia en aminoácidos esenciales y alto contenido en ácidos
nucléicos, se ha comprobado que algunas levaduras pueden ser usadas para
sustituir, al menos parcialmente, a la harina de pescado en las dietas para peces,
siempre que su precio y/o disponibilidad en el mercado lo permita (Aguirre-
Guzmán, 1990). Realmente es escasa la información sobre el uso de mezclas
probióticas de levaduras y bacterias en alimento para camarón, en cambio donde
más se han utilizado cepas con características probióticas son en peces, por
ejemplo Lara-Flores et al, (2002) realizaron un estudio comparativo de un
probiótico comercial contra microorganismos aislados del tracto gastrointestinal de
la tilapia, ellos observaron resultados favorables especialmente con la levadura
Saccharomyces cerevisiae, la cual dio lugar a un mayor crecimiento y mejor
eficiencia alimenticia en comparación con los peces que ingirieron un probiótico
comercial o con los que no recibieron ningún aditivo. Otros ejemplo de estudios
con probióticos son los de Quiñonez, (2008) afirma que al final de su experimento
a los 120 días en tilapia en la etapa de alevín, obtuvo un peso promedio de los
peces alimentados con alimento comercial + DO (DRYOIL® (aceite vitaminado) )
fue de 99,52 ± 2,59g, los peces alimentados con alimento comercial + DO +
mezcla probiótica (5 x 104 ufc/g) pesaron 97,26 ± 3,12 g, los peces alimentados
con alimento comercial + mezcla probiótica (1 x 106 ufc/g) pesaron 96,64 ± 4,52 g,
mientras que los peces alimentados con alimento comercial + DO + mezcla
71
probiótica ( 1 x 107 ufc/g) pesaron 97,36 ± 4,09 g no hubo diferencias significativas
entre los tratamientos. Por otra parte Palacios, et al. (2007) en una investigación
realizada en el sábalo amazónico, demuestra que existen diferencias estadísticas
significativas entre los tratamientos. Estableciendo que el tratamiento donde se
adicionó 2,0 g/kg de probiótico (Bacillus y S. cerevisiae) al concentrado comercial
con 32% de proteína, presentó el mejor resultado con un incremento de 88,52
g/mes, en comparación con el testigo donde no se adicionó probiótico obteniendo
un incremento de apenas 76,57 g/mes. Así también Guevara et al. (2003) en un
estudio realizado en Colombia, en el que adicionaron probióticos a base de
bacterias como Bacillus, Lactobacillus y levaduras del género Saccharomyces al
alimento para tilapia roja en la fase de levante o engorde, demostraron que existió
un efecto positivo, puesto que hubo diferencias significativas para tratamientos con
dosis de 6, 4, y 2 g respectivamente, donde el de mejor desempeño productivo fue
el tratamiento con 6 g de probiótico para las variables: incremento de peso,
longitud estándar final y conversión alimenticia final, en comparación con el control
o testigo que no fue aplicado el probiótico. Esto sustenta que la utilización de
probióticos es viable en los cultivos.
7.3. Conteo total de hemocitos circulantes en juveniles de camarón blanco
L. vannamei
En el presente trabajo se determinaron el conteo total de hemocitos (CTH) a los
camarones, llevándose a cabo dos bioensayos el primero consto alimentar con
tres niveles de proteína (38%, 41 y 44%), esto con el fin de probar si los niveles
de proteína tienen efecto en el incremento de hemocitos de los camarones,
comparando entre los tres tratamientos ante un control (alimento comercial que
comúnmente es utilizado en las granjas camaroneras). En el segundo bioensayo;
después de haber probado los tres niveles de proteína se optó por seleccionar un
72
solo nivel de proteína (38%), al cual se le adicionaron mezclas probióticas de
bacterias y levaduras. Es importante mencionar que estos microorganismos ya
han sido objeto de estudios anteriormente, probándolos individualmente por medio
de inmersión e incluidos en el alimento peletizado, dando buenos resultados como
incremento en peso, estimulación en el sistema inmune en peces, bivalvos,
camarones (adultos y postlarvas), a partir de estos resultados se tomaron en
cuenta dichos aislados para este trabajo, seleccionando la concentración que dió
mejores resultados previos y así evaluarlos mezclados en juveniles de camarón
L. vannamei.
El método utilizado para el conteo de hemocitos fue la cámara de Neubauer, el
cual permitió una clara observación de las células sanguíneas a contar, a través
de esta técnica, se pudo diferenciar las células de cualquier otra estructura extraña
presente en la hemolinfa de los camarones, esto coincide con los reportes de
Vargas-albores et al. (2005), Maldonado et al. (2003), Audelo et al. (2007). El
conteo hemocitario total tiene relación con la resistencia a patógenos (Rodriguez y
Le Moullac, 2000).
En el primer bioensayo, al obtener los resultados del CTH, no se encontraron
diferencias significativas entre los tratados con 38, 41 y 44% de proteína, pero si
se observó mayor incremento de hemocitos en los tratados con 41% de proteína
habiendo diferencias significativas con respecto al grupo control (alimento
comercial marca PIASA, 35% de proteína). Por lo tanto esto se corrobora con lo
dicho por Pascual et al, (2003), que las proteínas son compuestos constituidos
por unidades sencillas, donde los aminoácidos ocupan una posición central por ser
la base para la formación de enzimas, hormonas y hemocianina, todos ellos
componentes de la respuesta inmunitaria. Podríamos decir que los niveles de
proteína sí influyen en el incremento de hemocitos de los camarones, por lo que
son importantes ya que las principales células del sistema inmune son los
hemocitos.
73
El número de hemocitos libres puede variar y en la mayoría de los casos
disminuir dramáticamente durante una infección, así nuevos hemocitos necesitan
ser producidos y liberados por el tejido hematopoyético especializado; tejido que
ha sido identificado en varias especies de crustáceos (Johansson et al, 2000).
Estas células pueden remover y eliminar partículas extrañas del hemocele y
tejidos, alrededor del órgano digestivo, producen productos antimicrobianos de
importancia para la defensa inmunitaria y llevan a cabo proceso como fagocitosis
o actividades de encapsulación, la principal función del sistema inmune, es
“mantener la individualidad biológica” (Vargas-Albores, 2002, Maldonado et al,
2003, Zarain-Herzberg y pacheco-Marges, 2007). La capacidad para limpiar los
tejidos de bacterias invasivas, es de vital importancia para mantener la salud en
los camarones. Le Moullac et al, (1998) reportaron que camarones P. stylirostris
con un bajo CTH sometido a una situación de hipoxia, eran mas sensibles a la
infección con V. alginolyticus virulento. Por eso es importante que los animales
estén alimentados adecuadamente con una buena dieta.
En los resultados del segundo bioensayo, no se encontraron diferencias
significativas entre los tres tratamientos (38% PC (Trat.1), 38% PC+ mix bacterias
a 1x106 UFC/g (Trat. 2) y 38% PC + mix levaduras a1x106 UFC/g (Trat. 3)). Pero si
notándose incrementos de hemocitos en comparación con el grupo control,
resaltando que en el tratamiento tres hubo un mayor incremento de hemocitos en
comparación con el grupo control. Investigaciones sobre el sistema inmune de
camarones, han demostrado que es posible aumentar la resistencia a
enfermedades mediante la ingestión de aditivos alimentarios llamados
inmunoestimulantes (Carrillo-Fuentes, 2000). Estos compuestos, se encuentran
disponibles como tratamientos alternativos, actuando como moléculas de alarma
que activan el sistema inmune. La mayoría son compuestos químicos que se
encuentran como elementos estructurales de bacterias, micelios de hongos y
levaduras, que accidentalmente se ha encontrado que poseen propiedades
inmunoestimulantes (Raa, 1996). Las levaduras son bien conocidas en el área de
74
nutrición animal por producir poliaminas, las cuales incrementan la maduración
intestinal (Peulen et al., 2000). Estos estudios nos demuestran que la utilización de
bacterias o levaduras probióticas, estimulan el sistema inmune de los camarones,
induciendo el incremento de hemocitos circulares, al ser activados también
producen sustancias bactericidas como peróxido de hidrógeno (H2O2) y anión
superóxido (.O-2) que pueden incrementar la resistencia a enfermedades (Song y
Hsieh, 1994), jugando un papel importante en la defensa celular. Un decrecimiento
de hemocitos circulantes en crustáceos, esta correlacionado con una potencial
susceptabilidad a patógenos (Le Moullac y Haffner, 2000). Se ha reportado que
dietas suplementadas con algunas cepas vivas de Saccharomyces cerevisiae y
Debaryomyces hansenii estimulan el sistema inmune de peces y camarones
(Gatesoupe, 2007; Soltanian et al., 2007). En un estudio Pacheco-Marges (2011)
evaluó el efecto de Las cepas DH5, DH6 y LL1 de Debaryomyces hansenii sobre
la respuesta antioxidante de L. vannamei, donde concluye que estas cepas tienen
valor nutricional reflejado en el contenido de proteínas en hemocitos y la
concentración de hemocitos totales, además de inducir incremento en respuestas
antioxidantes. En cuanto a bacterias Guillan, (2001) reportó que el número total de
hemocitos y la concentración total de proteínas plasmáticas en tres tratamientos
(V. alginolyticus Ili, Bacillus P64 y Vibrio P62) no registraron diferencias
significativas entre los tratamientos expuestos, durante 20 días encontrándose
dentro de los valores normales, indicando que la administración de las cepas
bacterianas no deteriora la salud de los camarones. Esto concuerda con lo
obtenido en el presente trabajo, donde tampoco se encontraron diferencias
significativas entre los tratamientos. Las bacterias por naturaleza presentan
mecanismos antagónicos que les permite subsistir en determinados ecosistemas.
La estimulación del sistema inmune por la utilización de cepas probióticas ha sido
reportada por Famularu et al, (1997) y Gatesoupe (1999), como una característica
a considerar en la selección de las bacterias. La inmunoestimulación, es una
alternativa para mantener el sistema de defensa activo, aumentando la resistencia
75
a virus o controlando poblaciones bacterianas patógenas, que puedan afectar la
salud del hospedero. En los camarones, varios componentes microbianos se han
utilizado como estimulantes de las funciones celulares del hospedero, entre ellos
están los β-glucanos (BG), lipopolisacáridos (LPS) y peptidoglucanos (PG), estos
compuestos pueden activar directamente funciones celulares aunado a la
participación de inmuno proteínas del plasma para mejorar la eficiencia de la
respuesta inmune (Vargas-Albores et al, 1998). Los BG están presentes en la
pared celular de levaduras y hongos, los LPS son los principales componentes de
la pared celular de las bacterias Gram (-) siendo considerados por ciertos
investigadores como herramientas potenciales en la prevención de enfermedades
(Newman, 1996). Los PG proceden de la pared celular de bacterias Gram (+). Sin
embargo los Bacillus, han sido vinculados a la producción de poliximina,
bacitracina, tricodin y gramicidin.
Al contrario de los vibrios, la mayoría de los microorganismos perteneciente al
género Bacillus no ha sido asociado a patologías de organismos acuáticos, razón
por la cual se ha promovido su uso (News, 1996).
Por lo dicho anteriormente se considera que los probióticos a pesar de ser
inmunoestimulantes también ayudan en el crecimiento y desarrollo de los
organismos. Realmente se requiere de más estudios para profundizar en el
conocimiento relacionado con estas cepas, para establecer en un futuro
sustentable en el uso de probióticos en la prevención de enfermedades del
camaron L. vannamei.
76
8. CONCLUSIONES
Los diferentes niveles de proteína evaluados generaron efectos positivos,
ya que favorecieron el incremento de los pesos desde la etapa inicial, no
mostrando diferencias significativas entre ellos indicando que los diferentes
niveles de proteína (38, 41 y 44%) se comportaron de la misma manera.
La dieta con nivel de proteína de 38% es la que reúne las mejores
condiciones nutricionales, por lo que este nivel protéico puede sugerirse
como buen alimento para el crecimiento, lográndose de esta forma reducir
el nivel de proteína en la dieta comercial, permitiendo la sustitución efectiva
de ingredientes de origen vegetal y aminoácidos cristalinos, con bajo costo
y además para reducir la producción de desperdicios.
Los niveles de proteína sí influyen en el incremento de hemocitos de los
camarones, por lo que son importantes ya que las principales células del
sistema inmune son los hemocitos.
Los probióticos a pesar de ser inmunoestimulantes también ayudan en el
crecimiento y desarrollo de los organismos.
Estos estudios nos demuestran que la utilización de bacterias o levaduras
probióticas, estimulan el sistema inmune de los camarones, induciendo el
incremento de hemocitos circulares, mejorando la condición de los
organismos en los cultivos, además de tener otros beneficios de control de
77
calidad del producto final. Esto sustenta que la utilización de probióticos es
viable en los cultivos.
La utilización de acuarios en laboratorio para este experimento ofreció
condiciones favorables, ya que se facilita el manejo de los animales y los
resultados son más concretos.
78
9. RECOMENDACIONES
En futuras investigaciones llevar a cabo estudios sobre la estabilidad de los
probióticos al entrar en contacto con el agua, y las perdidas por lixiviación,
ya que estos factores pueden interferir en los resultados.
Se requiere de más estudios para profundizar en el conocimiento
relacionado con estas cepas, para establecer en un futuro sustentable en el
uso de probióticos en la prevención de enfermedades del camarón.
Se sugiere posteriormente, realizar experimentos en campo en condiciones
naturales y probar con otras especies de cultivo para poder comparar y
ratificar los resultados obtenidos.
79
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