Zastosowanie kalorymetrii ITCw badaniach białek
Katarzyna Breer
Kalorymetria, czyli ,,mierzenie ciepła’’
• DSC (differential
scanning calorimetry)
• ITC (isothermal titration calorimetry)
www.microcal.com
T – const, p – const 81 M domena SH2 Lck
ligand 0.4mM fosfopeptyd TEGOqYQPQPA
Current Opinion in Structural Biology
Leavitt and Freire 2001
Warianty metody
• Enzym/substrat/inhibitor
• Single injection
• Dysocjacja (dimeru)
Kalorymetr ITC
VP-ITC
• Objętość celki ~1.4 ml
• Objętość strzykawki ~ 270l
• Peltier 2-800C
• Szum 0.5 ncal/s
Jakie informacje można uzyskać z krzywej miareczkowania ITC?
0,0 0,5 1,0 1,5-18
-15
-12
-9
-6
-3
0-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0 20 40 60 80 100 120 140
Time (min)
µca
l/sec
Molar Ratio
kcal
/mol
e of
inje
ctan
t
QL=HL
QML=HML
Hcal
Miareczkowanie ~8 M PNP (cielęce) Guaniną
20 mM Hepes pH 7.0, 250C
Identyczne, nieoddziałujące miejsca wiązania
– frakcja miejsc zajętych – frakcja miejsc wolnych
])[1( LKa
[L]t[L] +
nM]t
QnM]t
·V0HML
2
)1()()1()()(
0
iQiQ
V
dViQiQiQ i
Parametr sigmoidalności
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
Ka=1M-1
H=-15 kcal/molN=1
Maximum Conc. : 3 mM Minimum Conc. : 0.01 mM Optimal Conc. : 0.1 mM Simulated Conc. : 0.03 mM
H (
kcal
/mol
e of
inje
ctan
t)
Molar Ratio
here
C = Ka [M]t
10 < C < 1000
Wiseman et al. 1989
Ka ~108 – 109 M-1
])[1( AK
KK
A
Bapp
Leavitt and Freire 2001
KA ~KB
Proteaza HIV-1
Wiązanie kompetycyjne
])[1( AK
BA
AA
])[1( BK
AB
BB
MAMAAH
MBMBBH
Słaby inhibitor Silny inhibitor
Q(i) = V0 [M]t (HAA(i) + HBB(i))
Sigurskjold 2000
dG (T,p,N) = –SdT + Vdp + idNi
Parametry termodynamiczneU(S,V,N) = TS – pV + N
dU (S,V,N) = TdS – pdV + idNi
Naturalne zmienne ITC to (T,p,N)
G (T,p,N) = U – TS + pV = iNi
dG 0 Proces spontaniczny
Energia chemiczna
G = U + pV – TS = H – TS
Związek entalpii, entropii i energii swobodnej Gibbsa
• Wiązania wodorowe• Oddziaływania van der
Waalsa• Oddziaływania
elektrostatyczne
• Solwatacja
• Wewnętrzne stopnie swobody
dG = dH – TdS
Wkład entalpowy (cieplny)
Wkład entropowy
G = -RTln Ka
N = 0.6
Ka = (4.9 0.4) 106 M-1
Hcal = -14.2 0.1 kcal/mol
S = -5.0 kcal/mol
0,0 0,3 0,6 0,9 1,2
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
Molar RatioH
kca
l/m
ole
of
inje
cta
nt
~8 M PNP
250C, 20 mM Hepes pH 7.0
N = 0.5 0.1
Ka = (11.3 0.9) 106 M-1
0,01 0,1 1
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
c Gua [uM]
F/F
0
~0.2 M PNP
0,0 0,5 1,0 1,5-8
-6
-4
-2
0
2
4
6-0,8
-0,4
0,0
0,4
0,80 30 60 90 120 150 180
Time (min)µ
cal/s
ec
Molar Ratio
H k
cal/m
ole
of
inje
cta
nt
0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,150
100
150
200
250
300
Flu
ore
scence
[A
.U]
DFPP-DG [M]
[M]t = 0.92 M
[M]akt = 0.96 M
Ka = (5.3 2.5) 109 M-
1
• Niezależnie wiążące miejsca
Zachowania nieszablonowe
• Miejsca oddziałujące – kooperacja
])[1( 1
11 LK
[L]t[L] + M]t(n11H1+n22H2)
])[1( 2
22 LK
QtV0(n1H1 + n2H2)
])[1( 21
11 LK
][1
22 LK
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50
-6
-3
0
3
6
H
kca
l/mo
l of
inje
cta
nt
Molar Ratio
Miejsca wiążące niezależnie
0 1 2 3 4
-6
-3
0
3
6
Kooperatywne wiązanie
Miareczkowania PNP ligandem DFPP-DG
20 mM Hepes pH 7.0, 200C
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50
-6
-4
-2
0
2
4
6
H k
cal/m
ol o
f inj
ecta
nt
Molar Ratio
~40 M PNP 29-30 U/mg~20 M PNP ~34-35 U/mg~20 M PNP ~29 U/mg
N = 1.0
Ka = (1.2 0.5) 109 M-1
H = -5.7 0.04 kcal/mol
S = 6.6 kcal/mol
N1 = 0.8
K1 = (6.7 6.4 ) 1010 M-1
H1 = -6.3 0.05 kcal/mol
S1 = 8.2 kcal/mol
N2 = 0.2
K2 = (3.1 2.8) 108 M-1
H2 = 5.8 0.2 kcal/mol
S2 = 17.6 kcal/mol
Analiza van’t Hoff’a
2
0ln
RT
H
T
K
00)(ln)( STHTKRTTG a
R
S
TR
HTKa
00 1)(ln
Ka
Izobara van’t Hoff’a
Entalpia
van’t Hoff’a
)()()( 0HpH TTCTHTH
SpS T
TCTSTS ln)()( 0
T
THC p
)(0
Ka
Entalpia van’t Hoff’a
Polimeraza Klenowa
Datta et al., 2006
s
Hpa T
T
T
T
R
CTK ln1)(ln
Forma całkowa izobary van’t Hoff’a
Cp ~ - (0.9 – 1.2) kcal/(mol K)
Napędzana entropowo TH Napędzana entalpowo TS
Zależność Hcal(T)dla wiązania DFPP-DG przez PNP
• Cp – const.• Cp = -0.202 0.031
kcal/(mol K)
280 285 290 295 300
-8
-7
-6
-5
-4
-3
H k
cal/m
ol o
f inj
ecta
nt
Temperature [K]
Zależność Kas (T)
• Kas ~109-1011 M-1
• Poza zakresem pracy metody
3,32 3,36 3,40 3,44 3,48 3,52 3,5616
18
20
22
24
26
28
30
32
34
ln K
as
1/T [1000/K]
N = 0.9
Ka = (1.4 0.1) 107 M-1
H = -12.0 0.1 kcal/mol
TS = -2.4 kcal/mol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50
-6
-4
-2
0
2
4
ligand DFPP-DG
H k
cal/m
ol o
f inj
ecta
nt
Molar Ratio
N1 = 1.0
K1 = (0.2 1.7) 1011 M-1
H1 = -6.2 0.1 kcal/mol
TS1 = 7.6 kcal/mol
N2 = 0.1
K2 = (0.4 3.0) 109 M-1
H2 = 9.6 2.6 kcal/mol
S2 = 1.7 kcal/mol
0,0 0,5 1,0 1,5-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
Molar Ratio
H k
ca
l/m
ole
of
inje
cta
nt
ligand Guanina
Zmiany entropii i entalpii
S (T)= Ssolv (T) + Sconf (T) + Sinne(T)
Ssolv (T) = Cpln(T/TS)
H (T) = Hconf (T) + Hintrinsic (T)
Luić et al. 2004
ASAsolvent accessible surface area
H = Hconf + a(T)·ASAap + b(T) ·ASApol
Cp ap < 0 Cp pol > 0
Kompleksy białko – białko
Fab E8 cytochrom c
oraz przeciwciało E8
Mylvaganam et al., 1998
Cp ~ - (0.2 – 0.6)
kcal/(mol K)
Hcal – HvH = const
Miareczkowania proteazy HIV-1 indivinavirem
Przepływ protonów
• Acetate 0.1 kcal/mol• MES 3.7 kcal/mol
• ACES 7.5 kcal/mol
Happ = Hbind + nH+Hion
Todd et al., 2000
Kconf
K1K0
Równowaga dynamiczna
Eftink et al., 1983 log Kconf
Cp
app
jedna forma wiąże
obie formy wiążą ligand
Temperature
Kompleksy białko – DNA
Dragan et al., 2004
Jak projektować inhibitory?
4·109 M-15·1010 M-1
9·1010 M-1 1011 M-1
Muzammil et al., 2007
-14-12-10-8-6-4-2024
kcal/m
ol
G H -TS
Mutant V82F/I84V
-14-12-10-8-6-4-2024
G H -TS
-14-12-10-8-6-4-2024
kcal/m
ol
130x 15x 25x 40x
MDR mutant
-18-15-12-9-6-30369
kcal
/mol
G H -TS
-18-15-12-9-6-30369
700x 50x 20x 20x
Allosteria ,,entropowa”
Białko CAP
Na podstawie widm NMR 2D 1H-15N HSQC
BRAK ZMIAN KONFORMACYJNYCH
s – ms powolne ruchy domen
Podziękowania dla:
Romana Szczepanowskiego
Matthias’a Bochtler’a
• S > 0 woda została wypchnięta z powierzchni kompleksu
• S < 0 może mieć wiele przyczyn i nie koniecznie znaczyć, że hydratacja wzrosła, bądź się nie zmieniła
Energie wiązań:
Elektrostatyczne w wodzie ~1A 20kJ/mol
Wodorowe 4-25 kJ/mol
Hydrofobowe 4 kJ/mol
van der Waalsa 0. 5 kJ/mol