Modificación enzimática de la celulosa para la

obtención de nanocristales.

Oscar Aragón Fonseca

Departamento de Madera, Celulosa y Papel, Universidad de Guadalajara, México.

Al 11 de junio del 2013

RESUMEN. El presente estado del arte trata sobre la modificación enzimática de la

celulosa para la obtención de nanocristales. Históricamente se ha reportado la

obtención de los nanocristales de celulosa a partir de hidrólisis ácida, pretendiendo

nuevas alternativas para la obtención de este producto, se ha vuelto la mirada a la

modificación enzimática. Con lo siguiente se espera proveer un panorama actual

sobre el aprovechamiento de esta técnica y los resultados obtenidos hasta la fecha en

la literatura consultada.

INTRODUCCIÓN

La celulosa es la fuente polimérica más abundante y renovable disponible en todo el planeta1. Es un

homopolímero lineal de monómeros de D-glucopiranosa ligados por enlaces β-(14)-, en principio

muy simple. La biomasa celulósica incluye a los residuos agrícolas y forestales, parte de los

desperdicios sólidos municipales, así como los cultivos herbáceos y maderables2. Típicamente, las

cadenas de celulosa en las paredes primarias de las células vegetales tienen grados de polimerización

(DP) en el rango de 5000 a 7500 unidades de monómeros de glucosa, alcanzando rangos de 10000 a

15000 en el caso del algodón. La unidad repetitiva básica de la celulosa es la celobiosa (figura 1),

disacárido de D-glucopiranosa ligado por enlaces (14)-. A temperatura ambiente, los anillos de

glucosa relativamente rígidos se encuentran en su energía más baja, conformando cadenas plegadas

4C1

2.

Figura 1. Celobiosa, la unidad básica repetitiva de la celulosa (tomado de: Wyman, 2005).

A pesar de su simplicidad, la estructura física y morfológica de la celulosa nativa es compleja y

heterogénea. Durante la biosíntesis de la celulosa, se adhieren cadenas individuales de glucosa unas con

otras por puentes de hidrógeno y por fuerzas de van der Waals para cristalinizar y formar redes

insolubles (figura 2).

Figura 2. Cristal de celulosa I según el modelo de Meyer-Misch (tomado de: Sjöström, 1993).

Ahora se ha reconocido a la celulosa como una potencial fuente renovable para biocombustibles y

químicos de origen biológico. Su estructura sobresaliente y única hace al polímero disponible por

reacciones de funcionalización como una clase interesante y valiosa de material polimérico cuya

atracción se espera que crezca en el futuro. El descubrimiento de nuevos complejos de solutos y

solventes para la celulosa ha creado oportunidades para la aplicación de más vías de síntesis diversas y

de diferentes tipos3.

I. ANTECEDENTES

1.1 Generalidades

La aplicación de celulosa como precursor para realizar modificaciones químicas fue muy explotado

incluso antes de que su naturaleza polimérica haya sido determinada y bien entendida4. Los

nanocristales de celulosa fueron descritos por primera vez por Bengt Rånby en 1949. Desde entonces la

se han reportado matrices reforzadas (compositos) con algunos polímeros como epoxi-resinas, acetato

de polivinilo, poliuretano y poliésteres. Más recientemente se han reportado el refuerzo con polímeros

hidrofóbicos, como polipropileno y poli(estireno-co-butadieno) y polibutadieno. Además, se han

desarrollado recientemente compositos a base únicamente de celulosas de diferente tipo (compositos

completamente de celulosa)5.

Bondeson y sus colaboradores reportaron, en 2006, que los nanocristales de celulosa son nanocristales

con un alto módulo de elasticidad, los cuales son preparados por la hidrólisis ácida de las fibras de

celulosa de diferentes fuentes6. De igual forma, las nanofibrillas se han aislado mediante la hidrólisis

ácida y por desdoblamiento mecánico. Los rendimientos varían dependiendo de la materia prima con la

que se esté trabajando (tabla 1)2. Mientras que la hidrólisis ácida produce nanocelulosa altamente

cristalina, la desfibrilación mecánica de las nanofibrillas ha tenido menor cristalinidad con una

distribución bimodal de tamaños.

Predicho Límite inferior Límite superior

Media de tamaño (µm) 0.262 0.015 0.569

Rendimiento (%)

40.35 24.85 52.65

Tabla 1. Valores predichos con condiciones óptimas7 con intervalo de confianza de 95% (tomado de:

Bondeson, 2006)

1.2 Sistemas enzimáticos

En los inicios de los 1980s, Bayer y Lamed describieron por primera vez un complejo multienzimático

en C. thermocellum, una bacteria celulítica, anaeróbica, hemofílica, que fue etiquetado como

“celulosoma”8.

Una de las aproximaciones más promisoras es la utilización de una amplia gama de enzimas

hidrolíticas existentes de manera natural las cuales actúan sobre varios polisacáridos presentes en las

paredes de las células vegetales. Estas enzimas se encuentran en numerosas bacterias y hongos con el

objeto de explotar los materiales de las plantas como una fuente nutritiva9.

Hasta el 2004, se habían identificado los codones de más de 1800 proteínas que hidroxilan enlaces

glucosídicos (glucosido-hidroxilasa). Los módulos catalíticos de las glucosido-hidroxilasas se han

clasificado en 90 familias basadas en la similitud de las secuencias9.

Las celulasas son el grupo de enzimas extracelulares incluyendo las endoglucanasas, exoglucanasas, y

β-glucosidasa. Estas enzimas actúan secuencialmente sobre la celulosa y la convierte en moléculas de

glucosa. Las exoglucanasas actúan en los extremos reductores y no-reductores de los oligosacáridos y

libera unidades de celobiosa, las cuales consisten en dos o tres unidades de glucosa. La estructura

tridimensional de los sitios activos de las exoglucanasas tiene forma de túnel circular para la

interacción con el sustrato uniéndose a los hidrógenos10

(figura 3 y 4).

Figura 3. Modelo en tres dimensiones de endoglucanasa (Tomado de: PubMed Structures).

.

Figura 4. Modelo en tres dimensiones de exoglusanasa, en donde se aprecia la posición en donde se

posiciona la celulosaizquierda

. Aminoácidos que catalizan la hidrólisis y sitios reactivosderecha

(tomado de:

Schubot, 2004).

1.3 Procesos de obtención

Hasta el 2005, mucha de la investigación se dedicó a entender el rol de las enzimas hidrolíticas de los

hongos en los procesos naturales de la degradación vegetal. El objetivo de estos procesos era la

aplicación de nuevas herramientas para el análisis directo de la biomasa, incluyendo métodos

mejorados para el uso del microscopio electrónico y del microscopio óptico para escanear campos

cercanos (NSOM) como pruebas de la acción enzimática2.

1.4 Aplicaciones

Típicamente, los humanos han empleado la biomasa celulósica para usos tales como la construcción,

estabilización de suelos, nutrición animal, y en la industria papelera. Sin embargo, las porciones de

biomasa de la celulosa y la hemicelulosa representando alrededor del 40 – 50% y 20 – 30% del peso

seco, respectivamente, son polisacáridos que se pueden romper en azúcares y ser alterados

químicamente o por fermentación para producir combustibles o químicos con valor agregado2. Los

azúcares de tales fuentes han sido utilizados para generar etanol y otros productos durante tiempos de

guerra con enfoques como el proceso de Scholler durante los 1940s y en economías controladas como

la que conformaba a la Unión Soviética11

.

La investigación en los últimos ahora 30 años ha avanzado en la conversión biológica de la biomasa

celulósica al punto de volverse competitiva económicamente para la producción de combustibles y

químicos que tienen una importante ventaja estratégica, ambiental y económica12

. Hasta el 2005, el reto

era superar el riesgo de comercializar con tecnología única en su tipo y continuar con el avance en los

procesos de hidrólisis para que los combustibles y los químicos de fuentes celulósicas fuesen

competitivos sin subsidios2.

II. ESTADO ACTUAL

Los nanocristales de celulosa (nanofibras) representan una nueva fuente biológica emergente para

producir rellenos reforzados13

. El principal proceso para aislar los nanocristales de las fibras de

celulosa se basa en hidrólisis ácida. Las regiones amorfas son hidrolizadas más fácilmente, mientras

que donde las regiones que tienen una mayor resistencia al ataque ácido se mantienen intactas. Sin

embargo, siguiendo un tratamiento ácido que hidrolice la celulosa, se producen los nanocristales. Los

nanocristales obtenidos tienen una morfología y cristalinidad similar que las fibras de celulosa

originales. La ocurrencia actual del anclaje del ácido se debe a las diferentes cinéticas en la hidrólisis

de los dominios cristalinos y amorfos. En general, la hidrólisis ácida de la celulosa nativa induce una

rápida disminución en su grado de polimerización (DP)14

.

Hasta el 2009 se habían utilizado las enzimas como pre-tratamiento para producir nanoestructuras de

celulosa15

. Ya se había demostrado que el blanqueamiento de la celulosa aunando una combinación de

fuerzas de corte con alta presión e hidrólisis enzimática resulta en fibras a nanoescala más largas y con

mayor entrecruzamiento con diámetros en rangos de escala nanométrica. Además de ser más amigables

con el medio ambiente, esta ruta puede resultar en DP más alto de las moléculas de celulosa y mantener

el radio de aspecto, en contraste con la microfibrilación de la celulosa (MFC), un tratamiento

mecánico16

.

2.1 Sistemas enzimáticos.

Las celobiohidrolasas o exoglucanasas son un tipo de celulasas las cuales pueden atacar a la celulosa en

los extremos resultando en unidades de celobiosa. Las endoglucanasas hidrolizan las regiones amorfas

de manera aleatoria. En general, es necesario utilizar un paquete de celulasas y hemicelulasas que

actúan sinérgicamente en la hidrólisis de la celulosa, puesto que no se tiene una sola enzima que

degrade celulosa13

. La mayoría de los métodos que usan enzimas para realizar la hidrólisis, contienen

predominantemente endoglucanasas y/o exoglucanasas. Estos procesos resultan en nanofibras en el

rango de cristales sencillos con la mayor parte de las fibras estando en fase amorfa15

.

2.2 Procesos de obtención.

La producción de celulasas ha sido extensamente estudiada en los últimos años, debido a sus

aplicaciones en varias industrias. La producción de celulasas puede ser incrementada estudiando la

línea microbiana, la composición del medio y otros factores que controlan el crecimiento y la

producción. Se utilizan diferentes materiales lignocelulósicos para la producción económica de enzimas

como el maíz, el bagazo, arroz y otros17,18

.

Muy pocos estudios se han concentrado en la hidrólisis enzimática seguidos por sonicación para la

producción de nanofibras de celulosa15

, aunque esto es posible. Filson en el 2009, utilizó una mezcla de

múltiples componentes enzimáticos con actividad endoglucanansa predominantemente, tomando en

cuenta observaciones previas de la influencia de las condiciones experimentales tales como la

temperatura, el medio y el pH en los rendimientos de la producción de nanocristales. Estos

nanocristales tuvieron anchura de 30 – 80 nm y longitud de 100 nm – 1.80 µm sugiriendo que están

fuera del rango de la categoría de cristal solitario13

.

El tratamiento de pulpa reciclada con endoglucanasas en diferentes condiciones experimentales de

temperatura, medio y pH produce nanocristales de celulosa a diferentes rendimientos. Este rendimiento

de los nanocristales de celulosa en los experimentos de Filson (2009) fueron mayores en agua y

endoglucanasas con dos diferentes métodos de calentamiento: convencional y con microondas. Para

ambos modos de calentar, el tratamiento con la enzima endoglucanasa en agua resultó en los

rendimientos más altos de nanocristales de celulosa (tabla 2)13

.

Límite inferior Límite superior

Calentado convencional 28.1 29.9

Calentado con microondas

35.7 40.7

Tabla 2. Rendimiento para la obtención de nanocristales en condiciones óptimas (adaptado de: Filson,

2009).

2.3 Aplicaciones.

Desde una perspectiva biotecnológica, la degradación enzimática de la celulosa es un proceso

crucialmente importante y tiene un amplio rango de aplicaciones en la industria alimenticia, la

nutrición animal, textil, combustible y la industria química19

.

Los nanocristales de celulosa tienen una media de potencial zeta de -31.37 mV, una indicación de una

estabilidad favorable de los nanocristales de celulosa para un tiempo extendido. Además, la estabilidad

de suspensiones de nanocristales de celulosa en agua deionizada sugiere su idoneidad como

nanorrelleno para hacer polímeros nanocompositos de nanocristales de celulosa reforzados13

.

III. PERSPECTIVAS

Hasta el 2012 se sigue reportando que la hidrólisis química sigue proveyendo de mayores

rendimientos, menor costo y menos consumo de materia prima aunque más agresivos con el medio

ambiente que los procesos enzimáticos. En la literatura revisada se vislumbra un método más amigable

con el ambiente para la producción de nanocristales de celulosa utilizando endoglucanasas. En un

futuro será necesario incluir enzimas específicas para romper el contenido amorfo de la celulosa para la

obtención de nanocristales a partir de las fibras y para optimizar los pre-tratamientos, tiempos y dosis

enzimáticas en la reacción, y los niveles y tiempos de sonicación.

La producción transgénica de celulasas en sistemas bacterianos podría conllevar a la generación de

bioreactores adecuados para la producción de estas enzimas. Esta proyección es una tentativa solución

a los para producción a nivel piloto de nanocristales de celulosa a partir de la hidrólisis enzimática, de

esta manera resultar en una aproximación como alternativa verde y económicamente competitiva,

contra la actúa producción basada en la hidrólisis ácida.

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