ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE SALUD PÚBLICA

ESCUELA DE MEDICINA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

Fecha: 23 de octubre de 2013

Curso: 4to B

Docente: Dra. Rosa Vélez Pazmiño

Estudiante: Francisco Santillán Freire

Práctica Nº: 5

Tema: Observación de muestras de medios de cultivo

Marco teórico:

Introducción

Los microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos, pero no requieren de

mayor espacio para su continua reproducción, por lo que es sencillo crear un ambiente

artificial dentro de un tubo de ensayo, un matraz o una caja Petri. El recipiente debe

estar completamente estéril previo a la inoculación de microorganismos, y posterior a

esta debe ser protegido contra posibles factores contaminantes externos. Para ello la

caja Petri cuenta con una tapa que lo hace correctamente, que al voltearla no solo

evita la contaminación externa de la muestra, sino también la fuga de microorganismos

que se encuentran en la muestra. En el caso de matraces o tubos de ensayo, existen

tapones especiales como los de algodón que evitarán la fuga o ingreso de

microorganismos, de la misma forma existen tubos de tapa rosca que son más

seguros incluso al momento de manipularlos.1

Los medios de cultivo son indispensables para el aislamiento y separación de

microorganismos, especialmente de bacterias, lo que permitirá su correcta

identificación y por lo tanto un diagnóstico asertivo. Para ello se procede a la siembra

del microorganismo que no es más que la estriación desde la muestra inoculada

previamente inoculada, lo que permitirá separar a la bacteria en colonias facilitando su

estudio.

Colonia llamamos al conjunto de gérmenes idénticas características hereditarias,

tintoriales y metabólicas, que se desarrollan generalmente en un medio sólido. La

morfología de la colonia es característica de cada tipo de bacteria, por lo tanto es muy

importante determinar el color, densidad, consistencia, forma y tamaño para tener una

pauta de la identificación de un microorganismo.

Al trabajar con cultivos bacteriológicos es importante que estos sean manejados

asépticamente evitando contaminación tanto de la muestra como del personal que

manipula esa muestra y su entorno.

Existen muchos microorganismos que constituyen la flora normal, y que cumplen

funciones importantes, en la siguiente práctica se aislará e identificarán

microorganismos presentes en la faringe.

Objetivos

Aislar cocos Gram positivos y negativos a partir de una muestra de secreción

faríngea.

Aplicar pruebas enzimáticas para su identificación.

Observar a través del microscopio los microorganismos que se han formado en

el medio de cultivo

Reconocer las reacciones de hemólisis.

Materiales

Hisopos

Cajas Petri con agar sangre

Cajas Petri con agar EMB

Placas portaobjetos

Incubadora

Microscopio

Sangre con EDTA

Tubos de ensayo

Palillos

Lápiz graso

Reactivos

Peróxido de hidrogeno

Colorante Gram

Azul de metileno

Aceite de inmersión

Suero fisiológico

Discos de bacitrina

Discos de optoquina

Plasma sanguíneo con EDTA

Desarrollo de la práctica

Se tomará una muestra de secreción orofaríngea, una muestra de acné, y una muestra

nasofaríngea para identificar los microorganismos presentes en estas zonas. Luego,

se procederá a identificar el tipo de microorganismo, basándose en la morfología de la

colonia, el tipo de reacciones hemolíticas, coloración Gram y pruebas enzimáticas.

Procedimiento

1. Permitir que los medio de cultivo adquieran la temperatura ambiente, ya que

medios fríos pueden inhibir el crecimiento de algunos tipos de bacterias.

2. Tomar una muestra de secreción orofaríngea, nasofaríngea o de acné con un

hisopo estéril.

3. Junto a un mechero encendido, abra la caja Petri e inocule la muestra en un

lado superior de la caja, tanto en el agar sangre como en el EMB.

4. No inocules en áreas grandes, ya que esto dificultará la estriación y el

aislamiento posterior de las colonias.

5. Con otro hisopo o un asa bacteriológica esterilizada, estríe sobre el inóculo de

extremo a extremo hasta 1/3 de la caja.

6. Si utiliza el asa bacteriológica, esterilice y enfríe a partir de la estriación

anterior, evitando el contacto con el lugar de inoculación para evitar la

formación de aerosoles.

7. Usando el paso anterior realice 2-3 estriaciones más.

8. Realice cortes en el agar sangre para observar de mejor manera las reacciones

de hemólisis.

9. Al estriar en tres planos se puede cuantificar a groso modo los

microorganismos presentes

a. Si crecen solamente en la primera estriación: Escasos

b. Si crecen en la 2ª estriación: Moderado

c. Si crecen en la 3ª estriación: Abundante

Ilustración 1 Imagen tomada de Rodriguez, E. Bacteriología General: Principios y Prácticas de Laboratorio. 1ª Edición. Costa Rica: Universidad de Costa Rica. 2005. p. 107,108, 109, 152-18. Disponible en:

http://books.google.com.ec/books?id=vwB0fgirgN0C&printsec=fr

Recomendaciones

Al estriar, utilice toda la superficies del medio de cultivo, no realice únicamente

líneas.

No es necesario esterilizar el asa en cada estriación si se trabaja con muestras

que contienen pocas bacterias o cultivos puros.

Las estriaciones deben estar juntas, excepto la 3ª donde se trata de separar las

colonias.

Nunca estríe sobre una estriación previa.

Inocule las cajas Petri a 37ºC por 24-48hs. Llévelas a la incubadora y observe

el crecimiento bacteriano.

Identificación

Para la identificación bacteriana, se valoran los siguientes parámetros:

Morfología y aspecto de las colonias.

Coloración Gram de las colonias que se desarrollan en el agar.

En casos de ser cocos Gram positivos, realizar pruebas de catalasa.

Catalasa

Enzima hemoproteica que descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en oxígeno y

agua. El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del

metabolismo oxidativo o aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el

peróxido de hidrogeno es letal para las células bacterianas.

La prueba de catalasa se hace generalmente en lámina portaobjetos (en ocasiones en

tubo), y se la utiliza para diferenciar a Streptococcus negativos de Staphylococcus

positivos y Micrococcus positivos, así como Bacillus positivos de Clostridium positivos.2

El procedimiento para esta prueba es el siguiente:

1. Con el asa bacteriológica esterilizada transfiera una colonia bien aislada hacia

el portaobjetos estéril.

2. Añadir 1-2 gotas de H2O2 al 15%.

3. Observe si se forman burbujas luego de añadir el reactivo, si se forman pocas

burbujas luego de 20-30 segundos, la prueba no puede considerarse como un

resultado positivo.

4. Anote los resultados.

5. Descarte la placa en un recipiente con desinfectante para luego someterlo al

autoclave.2

En el caso de identificar Staphylococcus, realice la prueba de coagulasa, utilizada

para distinguir los Staphylococcus patógenos de los no patógenos.

Coagulasa

Enzima termoestable que tiene la capacidad de convertir el fibrinógeno en fibrina y es

importante para diferenciar el género Staphylococcus.

Tienes dos tipos de prueba, uno en tubo y otra en placa.

La prueba en tubo detecta la coagulasa libre o estafilocoagulasa, que transforma la

protrombina en estafilotrombina que convierte el fibrinógeno en fibrina.

Procedimiento:

1. Inocule una muestra del cultivo a probar en un tubo con plasma estéril.

2. Incubar el tubo en baño maría a 37ºC.

3. Para evidenciar la formación del coágulo, observe el tubo cada 30min, en

posición inclinada.

4. Esta inclinación permite que el coágulo se forme en el fondo del tubo, caso

contrario el líquido se recorrería a la pared del tubo.

5. Si a las 4hs la prueba es negativa, incube por 24hs a baño maría a 37ºC.

La prueba en placa detecta la coagulasa fija que se encuentra en la membrana, y es

aquella que media la fijación del fibrinógeno con el estafilococo y los aglutina,

formando el grupo conocido como factor de agrupamiento.

Procedimiento

1. Coloque una gota de agua destilada en una placa portaobjetos estéril.

2. Tome una muestra de cultivo e inocúlelo en la gota, si se aglutina, pase a la

prueba con tubo.

3. En caso de que no haya aglutinación, agregue una gota de plasma y mezcle.

4. Observe si se forma un precipitado granular entre los primero 5-20 segundos

formada la suspensión bacteriana.

5. Si ese precipitado es fuerte constituye una prueba positiva.

6. Si la precipitación es débil u ocurre luego de 20 segundos, se debe realizar la

prueba en tubo.

7. Una prueba positiva en lámina es válida únicamente cuando la suspensión

bacteriana no se autoglutina.

8. La aglutinación se puede observar a través del microscopio a 200x.

Si identifica Streptococcus, realizar la prueba de bacitrina y optoquina.

Bacitrina

Prueba utilizada para la identificación de Streptococcus β hemolítico del grupo A.

Este antibiótico interfiere la formación de unidades de peptidoglicano y es cpaz de

romper la membrana citoplasmática bacteriana. La prueba se la realiza en una placa

Petri de agar sangre.

Procedimiento

1. Divida la placa en tres secciones e inocule densamente cada uno de los

Streptococcus a probar, rotule adecuadamente.

2. Sumerja las pinzas en alcohol de 95% y pasarlas luego por la llama del

mechero para esterilizarlas.

3. No acerque el alcohol a la llama, no sumerja las pinzas encendidas en el

recipiente con alcohol. Note que la llama de las pinzas con alcohol es

difícil de observar.

4. Colocar un disco de bacitrina en el centro de cada uno de los rayados

realizados.

5. Presione levemente el disco contra el agar con el fin de que se adhiera al

medio.

6. Incubar a 35ºC por 24hs.

7. Observe la formación de halos y anote los resultados

Optoquina

Prueba para el estudio de Streptococcus α hemolítico, especialmente al S. pnumoniae.

La optoquina u optoquín (hidrocloruro de etilhidroxicupreína), es un derivado

hidrosoluble de la quinina capaz de inhibir el crecimiento del S. pneumoniae debido a

cambios de la tensión superficial lo que afecta a la membrana celular bacteriana y

aumenta su fragilidad. De igual manera se la utiliza en un medio de cultivo con agar

sangre.

Procedimiento

1. Divida la placa en tres secciones e inocule densamente cada uno de los

Streptococcus a probar, rotule adecuadamente.

2. Sumerja las pinzas en alcohol de 95% y pasarlas luego por la llama del

mechero para esterilizarlas.

3. No acerque el alcohol a la llama, no sumerja las pinzas encendidas en el

recipiente con alcohol. Note que la llama de las pinzas con alcohol es

difícil de observar.

4. Colocar un disco de optoquina en el centro de cada uno de los rayados

realizados.

5. Presione levemente el disco contra el agar para que se adhiera al medio de

cultivo.

6. Incubar a 35ºC por 24hs en atmósfera con CO2 incrementado.

7. Examine el disco en busca de zonas de inhibición y mida su diámetro.

8. Anote los resultados2

Interpretación

Sensible: presencia de inhibición alrededor del disco.

Resistente: cuando el crecimiento no es inhibido alrededor del disco.

Los casos de halos intermedios deben resolverse por acumulación de pruebas

a favor o en contra.

Observaciones

La clara diferencia en la formación de colonias fue que ciertos tipos de colonias

se formaron en el agar sangre mientras que en el EMB no, esto se debe por su

selectividad que a diferencia del agar sangre no lo es.

El conocimiento básico para la toma y tinción de muestras fue clave en esta

práctica, ya que se obtuvo una calidad visual alta al momento de observar

microorganismos al microscopio.

El halo formado nos permitió distinguir los diferentes tipos de hemolisis que

sucedieron en el medio agar sangre.

En ningún momento se dejó de lado las normas de bioseguridad aprendidas,

esto fue un factor determinante en la recolección y tinción de muestras.

Conclusiones

El conocimiento base de normas de bioseguridad, toma de muestras y tinción

de las mismas nos permitió obtener resultados de calidad, comprobándolo al

momento de llevar las muestras al microscopio.

El uso del mechero fue fundamental para la creación de un diámetro de

seguridad al momento de manipular los medios de cultivo.

Las reacciones de hemólisis permite identificar el tipo de bacteria con la que se

está tratando, por ende asegura un mejor diagnóstico.

El uso de los medios de esterilización debe ser preciso caso contrario se

contaminaría el personal y el entorno en donde se encuentra manipulando

muestras.

Preguntas de investigación

1. Defina enzima, sustrato, que valor tienen las pruebas enzimáticas en el

diagnóstico microbiológico?

Las enzimas son proteínas cuya acción biológica consiste en la catálisis de reacciones

del metabolismo las cuales transcurrirían muy lentamente sin su intervención. El

concepto de catálisis implica la influencia del catalizador en la reacción acelerándola

sin consumirse en dicho proceso. El sustrato es la molécula sobre la que actúa la

enzima.3

2. Cuál es el sustrato de la reacción de catalasa y coagulasa? Por qué produce

burbujas en la reacción de catalasa positiva? Por qué se forma el coágulo en la

prueba de coagulasa?

Los cocos gram positivos son los productores de catalasa. El sustrato de la catalasa

es el peróxido de hidrógeno generado por otras enzimas, resultando oxígeno y agua,

es por esto que se forman burbujas frente a la reacción positiva de la catalasa, es S

auereus es el único que produce reacciones positivas a catalasa y coagulasa por lo

que es fácil de identificar.

El sustrato de la coagulasa producida por el S. aureus es el fibrinógeno del plasma y

activa una cascada de reacciones que provocan la coagulación del plasma. La

coagulasa ligada o factor de afinidad por el fibrinógenose detecta con una prueba

rápida de portaobjetos cuyo resultado se considera positivo si se observa aglutinación

de microorganismos sobre un portaobjetos de vidrio4, 5

3. Que puede inhibir la actividad de la catalasa?

La formación de catalasa es reprimida por los hidratos de carbono fermentables en el

medio, por lo que se recomienda el empleo de caldo con carne picada como medio de

crecimiento cuando se comprueba la catalasa.

La formación de catalasa y peroxidasa es reprimida en las células que desarrollan en

medios que contienen glucosa como sustrato primario.

El agregado de tolueno inhibe las reacciones catalíticas y peroxidativas.

La catalasa es inactivada por la luz del sol en condiciones de aerobiosis.6

4. Porqué se forman colonias en el agar sangre y no en el EMB?

Porque el agar sangre es un medio rico en nutrientes por lo que se desarrollan

muy fácilmente colonias de diversos microorganismos, a diferencia del agar

EMB que además de poseer un escaso aporte de nutrientes, es un medio

selectivo solamente para bacilos Gram negativos especialmente del tipo

entérico.6

5. Porqué en el EMB hubo desarrollo de los elementos que va a observar y

el agar sangre no?

Por su bajo aporte de nutrientes, lo que limita a la formación de

microorganismos que cumplan estas características como por ejemplo los

bacilos Gram negativos.7

6. Qué factores hay que tener en cuenta al momento de preparar un medio

de cultivo?

a. Usar en todo momento normas de bioseguridad.

b. Al tomar los diferentes tipos de agar se debe utilizar las medidas

correctas antes y después de mezclarlas con agua, ya que de

esta manera asegura una muestra de mejor calidad y una

diferenciación adecuada.

c. El tipo de bacteria que queremos aislar.

d. identificar el agar necesario para el cultivo de microorganismo.

e. Preparar el medio cerca de un mechero, antes y después de

inocular la muestra.

f. Procure invertir la caja Petri una vez inoculada para evitar la

propagación de microorganismos.

g. Refrigerar a la temperatura indicada (36º) para evitar una

alteración del medio de cultivo.

h. El material que se use para preparar un medio de cultivo debe

estar completamente estéril, con el fin de asegurar una muestra

totalmente pura.

i. Asegúrese que los datos del paciente, el tipo de muestra tomada,

fecha, se encuentren rotuladas en la caja Petri.8, 9

7. Tipos de hemólisis?

Existen tres tipos:

a. Alpha: lisis parcial de los eritrocitos que rodea una colonia. Produce

una coloración verde o pardo en el medio de cultivo

b. Beta: lisis completa de eritrocitos. Produce una eliminación de sangre

por debajo de las colonias y a su alrededor.

c. Gamma: no existe hemólisis. Halos incoloros10

8. Que tipos de estructuras se observan en el azul de metileno?

Se observa bacterias de un color azul intenso y leucocitos polimorfonucleares

de una tonalidad más clara. Se la puede complementar con tinción Gram, ya

que bacterias Gram negativas como la H. influenzae o la N. meningiditis no

suelen teñirse con la tinción Gram.11

9. De que organismos se trata en el EMB?

Se trata de bacterias del tipo bacilos, ya que la combinación eosina y azul de

metileno inhibe la formación de bacterias Gram positivas o negativas

fastidiosas como los estreptococos o estafilococos.7

Bibliografía

1. Villanueva, J. Microbiología. 2ª Edición. España: Reverté. 1992. p. 18, 19, 20,

21. Disponible en: http://books.google.com.ec/books?id=2u-

6Q2XCMDgC&pg=PA18&dq=aislamiento+de+microorganismos&hl=en&sa=X&ei=oWN

nUvGxHYnskQeIhYDQBA&ved=0CDUQ6AEwAg#v=onepage&q=aislamiento%20de%20

microorganismos&f=false

2. Rodriguez, E. Bacteriología General: Principios y Prácticas de Laboratorio. 1ª

Edición. Costa Rica: Universidad de Costa Rica. 2005. p. 107,108, 109, 152-18.

Disponible en:

http://books.google.com.ec/books?id=vwB0fgirgN0C&printsec=frontcover&dq=micro

biologia+general+rodriguez&hl=es&sa=X&ei=OQRoUuySJ8G-

kQfu6YHABA&ved=0CD8Q6wEwAw#v=onepage&q=microbiologia%20general%20rodri

guez&f=false

3. Montero, C. Manual de Técnicas de Histoquímica Básica. México: Universidad

autónoma de San Luis Potosi. 1997. p 114.

4. Nelson, P. Física Biológica: energía información y vida. New York: Freeman

and Company. 2004. p 143.

5. Forbes, B. Diagnóstico Microbiológico. 12ª Edición. Buenos Aires: Medica

Panamericana. 2009. p 257, 258, 259.

6. Faddin, M. Pruebas Bioquímicas para la identificación de Bacterias de

Importancia Clínica. 3ª Edición. Buenos Aires: Médica Panamericana. 2003. p

86

7. Laboratorios Britania. Argentina: Laboratorios Britania. 2010. [actualizado 2010,

citado 23 de octubre de 2013]. Disponible en:

http://www.britanialab.com/productos/236_hoja_tecnica_es.pdf

8. Laboratorios Britania. Argentina: Laboratorios Britania. 2010. [actualizado 2010,

citado 23 de octubre de 2013]. Disponible en:

http://www.britanialab.com/productos/231_hoja_tecnica_es.pdf

9. GARCIA, P. FERNANDEZ DEL BARRIO, M. Microbiología Clínica Práctica.

2nda Edición .Cádiz: Respeto-Cadiz. 1994. p. 50, 51, 52, 53, 54, 55. Disponible

en:

http://books.google.com.ec/books?id=4N8qVKckrUUC&pg=PA51&dq=medios

+de+cultivo&hl=en&sa=X&ei=YUBVUttM08TgA6mXgdgJ&ved=0CDcQ6wE

wAg#v=onepage&q=medios%20de%20cultivo&f=false

10. Prats, G. Microbiología Clínica. 1ª Edición. Madrid: Médica

Panamericana. 2005. p. 24, 25, 26, 27. Disponible en:

http://books.google.com.ec/books?id=TdsoWPEYaoUC&pg=PA24&dq=medios+de+cult

ivo&hl=es&sa=X&ei=PFpnUpOUFNCFkQfM8oDABA&ved=0CDUQ6wEwAQ#v=onepage

&q=medios%20de%20cultivo&f=false

11. KONEMAN, W. Diagnóstico Microbiológico: Texto y Atlas a color. 6ta. Edición.

Edit. Médica Panamericana. Buenos Aires. 2008. p.