INGENIERIA GENETICAINGENIERIA GENETICA

ERIKA LILIANA SANCHEZ RINCON ERIKA LILIANA SANCHEZ RINCON

INSTITUCION EDUCATIVA PANAMERICANOINSTITUCION EDUCATIVA PANAMERICANOPUENTE DE BOYACAPUENTE DE BOYACA

20092009

- Medicina: - Medicina: diagnóstico y caracterización de enfermedadesdiagnóstico y caracterización de enfermedades

- Agricultura: - Agricultura: plantas transgénicasplantas transgénicas

- Industria farmaceútica: - Industria farmaceútica: producción de proteínas con fines producción de proteínas con fines terapeúticosterapeúticos

- Industria alimentaria: - Industria alimentaria: mejoramiento de cepas, aditivos mejoramiento de cepas, aditivos alimenticios (ej. vainillina)alimenticios (ej. vainillina)

- Industria química: - Industria química: productos naturales, biopolímeros, productos naturales, biopolímeros, etanoletanol

Aplicaciones:

Algunas Técnicas que permitieron transferir información Algunas Técnicas que permitieron transferir información genética de un organismo a otrogenética de un organismo a otro

- enzimas de restricción permite generar moléculas - enzimas de restricción permite generar moléculas recombinantesrecombinantes

- desarrollo de vectores- desarrollo de vectores

- técnicas de transformación- técnicas de transformación

Enzimas de restricción

Vectores de clonado:Vectores de clonado:

- plásmidos - plásmidos (10 kb)(10 kb)

- bacteriófagos- bacteriófagos (20 kb)(20 kb)

- cósmidos- cósmidos (50 kb)(50 kb)

- YAC - YAC (200 - 800 kb)(200 - 800 kb)(yeast artificial chromosome)(yeast artificial chromosome)

Vectores de clonado: plásmidos, fagos, cósmidos

Plásmidos: pBR322 y pUC 19

• Pequeño tamaño

•Origen de replicación independiente

• Sitios únicos de corte con ER

• Número múltiple de copias

• Marcador seleccionable

• Hospedero adecuado y conveniente

Características generales de los Características generales de los plásmidosplásmidos como como vectores de clonadovectores de clonado::

pBR322pBR3224361 bp4361 bp

Orígen de Orígen de replicaciónreplicación

Marcadores Marcadores genéticosgenéticos

Sitios de restricción únicosSitios de restricción únicos

Cósmidos y cromosomas artificiales (BAC, YAC)

Cósmidos como vectores de clonado:

• derivados del fago derivados del fago λλ, sin regiones , sin regiones codificantescodificantes

• permite el clonado de grandes permite el clonado de grandes fragmentos de ADNfragmentos de ADN

• la presencia de sitios la presencia de sitios coscos permite permite su encapsulamiento su encapsulamiento in vitroin vitro

• La infección (transducción) es La infección (transducción) es más eficiente que la más eficiente que la transformacióntransformación

• Se mantiene como plásmido en Se mantiene como plásmido en E. coliE. coli

Bacteriófagos: ejemplo fago lambda modificadoBacteriófagos: ejemplo fago lambda modificado

Cromosomas artificiales como vectores de clonado:

YACs (yeast artificial chromosomes)YACs (yeast artificial chromosomes)

- muy estable (se replica muy estable (se replica como un cromosoma)como un cromosoma)

- permite el clonado de permite el clonado de grandes moléculas de grandes moléculas de ADNADN

También existen los BAC (bacterial artificial chromosome)También existen los BAC (bacterial artificial chromosome)

Clonación molecular

http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/plasmidcloning_fla.html

Animación

Animación:

http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/pcr.html

Biblioteca genómica

Clonado de genes eucariotasClonado de genes eucariotas

transcriptasa reversa ARN ADNs transcriptasa reversa ARN ADNs ADNd ADNd

¿Cómo seleccionamos el clon ¿Cómo seleccionamos el clon recombinante que nos interesa?recombinante que nos interesa?

Selección del clon recombinante buscadoSelección del clon recombinante buscado

La selección puede basarse en:

resistencia a antibióticos

características nutricionales (marcadores auxotróficos)

resistencia a compuestos tóxicos

La selección se realiza en medio sólido

Réplica en placa

Selección del clon de interésSelección del clon de interés

a)a) Por hibridación con Por hibridación con sondas de ADNsondas de ADN

Otros métodos de selección se basan en la Otros métodos de selección se basan en la expresión de la expresión de la proteínaproteína codificada por el gen de interés: codificada por el gen de interés:

b) inmunodetección: utilización de un anticuerpo específico para la b) inmunodetección: utilización de un anticuerpo específico para la proteína de interés asociado con un anticuerpo que de una proteína de interés asociado con un anticuerpo que de una reacción reacción colorimétricacolorimétrica

c) Detección de c) Detección de una una actividad actividad enzimática enzimática característicacaracterística

Expresión Expresión de los genes clonadosde los genes clonados

PromotorPromotorSitio de unión Sitio de unión del ribosomadel ribosoma

Señal de Señal de terminaciónterminación

En procariotas:En procariotas:

En eucariotas es similar pero con los componentes que En eucariotas es similar pero con los componentes que permiten la transcripción y traducción eucariotapermiten la transcripción y traducción eucariota

- promotor- promotor- terminador- terminador- sitio de unión a - sitio de unión a

ribosoma (en procariotas)ribosoma (en procariotas)

- sitios único de corte de - sitios único de corte de enzimas enzimas

- marcadores genéticos- marcadores genéticos- orígen de replicación- orígen de replicación- tamaño pequeño- tamaño pequeño

Vector de ExpresiónVector de Expresión

PromotoresPromotores

Constitutivos: Constitutivos: siempre están transcribiéndosesiempre están transcribiéndose

Regulables: Regulables: se mantienen “apagados” y son inducidos por algún se mantienen “apagados” y son inducidos por algún cambio en el medio (inductor, cambio de T)cambio en el medio (inductor, cambio de T)

Fuerza del promotor: Fuerza del promotor: determina el nivel de transcripcióndetermina el nivel de transcripción

El nivel de expresión depende del promotor y del número de copias del vector de expresión

Número de copias del vector de expresión:Número de copias del vector de expresión:

depende del orígen de replicación que tenga puede ir desde una copia depende del orígen de replicación que tenga puede ir desde una copia hasta cerca de 100hasta cerca de 100(1-4: bajo número de copia; 10-100: alto número de copia)(1-4: bajo número de copia; 10-100: alto número de copia)

Clonado y expresión de proteínas heterólogas no está limitado a Clonado y expresión de proteínas heterólogas no está limitado a procariotas como hospederos, también se han utilizado eucariotas (Ej. procariotas como hospederos, también se han utilizado eucariotas (Ej. S. cerevisiae, P. pastoris, A. nigerS. cerevisiae, P. pastoris, A. niger))

La ingeniería genética no queda restringida a la expresión de La ingeniería genética no queda restringida a la expresión de proteínas sino que también utiliza otras herramientas como:proteínas sino que también utiliza otras herramientas como:

- deleción de genes- deleción de genes

- desregulación de rutas metabólicas- desregulación de rutas metabólicas

- generación de diversidad- generación de diversidad

La ingeniería genética también se aplica a plantas y animales La ingeniería genética también se aplica a plantas y animales Los principios básicos son similares Los principios básicos son similares

Mutagénesis sitio dirigida:

Mutagénesis dirigida en casette: deleción, interrupción o desregulación de genes

Otras técnicas utilizadas en ingeniería genética:

Purificación de proteínas recombinantes

Proteínas de Fusión:

Algunos sistemas de expresión se han desarrollado de forma que Algunos sistemas de expresión se han desarrollado de forma que permitan un proceso de purificación simple de la proteína permitan un proceso de purificación simple de la proteína recombinanterecombinante

Fusión con proteína de unión a maltosa - columna de amilosaFusión con proteína de unión a maltosa - columna de amilosa

Fusión con glutatión transferasa - columna de glutatiónFusión con glutatión transferasa - columna de glutatión

Adición de una cola de His - purificación en columna de NiAdición de una cola de His - purificación en columna de Ni

Hospederos para sistemas de expresión

Escherichia coliEscherichia coli

Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae

Picchia pastorisPicchia pastoris

BaculovirusBaculovirus

Cultivos celulares (líneas celulares de mamíferosCultivos celulares (líneas celulares de mamíferos))

Animales o plantas transgénicosAnimales o plantas transgénicos

Criterios de elección de un sistema de expresión

RendimientoRendimiento

Facilidad de purificaciónFacilidad de purificación

Necesidad de modificaciones post-traduccionalesNecesidad de modificaciones post-traduccionales

CostosCostos

Diseño experimentalDiseño experimental

Preferencias de uso de codonesPreferencias de uso de codones