INTRODUCCIÓNLa fotosíntesis es un proceso de suma importancia para la biosfera porque

convierte la energía de la radiación solar en energía química que puede ser

usada por todas las formas de vida. La fotosíntesis comprende dos

reacciones globales diferenciadas. En la primera se realiza la transducción de

energía, y en la segunda la reducción y fijación del carbono.

Los pigmentos fotosintéticos son los únicos que tienen la capacidad de

absorber la energía de la luz solar y hacerla disponible para el aparato

fotosintético. Los cloroplastos de las plantas superiores contienen siempre

varios pigmentos, clorofila a, clorofila b, algunas xantofilas y carotinas.

Todos estos pigmentos son insolubles en agua, pero se disuelven fácilmente

en algunos solventes orgánicos.

Además de las clorofilas y carotenoides, muchas plantas poseen otros

pigmentos, tales como antocianos, flavonoles, etc.

En este trabajo práctico realizaremos experimentos de extracción de

diferentes pigmentos vegetales, tales como: clorofilas a y b, xantofilas,

carotenoides y pigmentos antocianicos. Se analizaran las características

de estos diferentes pigmentos fotosintéticos y accesorios que se

encuentran en los diferentes tipos de vegetales que usaremos. Luego se

identificaran los diferentes pigmentos que se encuentran en las hojas de

espinaca, con el uso de un cromatograma. Se realizara la separación de

las xantofilas a partir de un extracto de espinaca. Se determinaran las

características físicas y químicas de las clorofilas y pigmentos

antocianicos y por último se explicara porque hay cambios de coloración

en las flores, cuando se someten a diferentes PH.

Esperamos que con estas aplicaciones podamos lograr los objetivos de

esta práctica y conocer de esta manera los diferentes pigmentos que se

encuentran en las frutas hojas y flores de una planta.

OBJETIVOSGENERAL

Analizar las características de los diferentes pigmentos fotosintéticos y

accesorios que se encuentran en los diferentes tipos de vegetales.

ESPECÍFICOS

Identificar los diferentes pigmentos que se encuentran en las hojas de

espinaca, con el uso de un cromatograma.

Realizar la separación de las xantofilas a partir de un extracto de

espinaca.

Determinar las características físicas y químicas de las clorofilas.

Determinar las características físicas y químicas de los pigmentos

antocianicos.

Explicar porque hay cambios de coloración en las flores, cuando se

someten a diferentes Ph.

DESARROLLO METODOLOGICOENSAYO RECURSOS-TÉCNICOS

1. MATERIALES

Papel absorbente.

Papel filtro

Mortero de porcelana.

Embudo

Beaker

Caja de Petri

Tubos de ensayo.

MATERIAL BIOLÓGICO

hojas frescas de espinacas o frijol. Arena de cuarzo.

REACTIVOS.• Alcohol al 95 %. NaOH al 5 %. Ácido acético glacial. CuSO4

Carbonato de calcio.

EQUIPOS: Grapadora Lámpara

RECURSOS HUMANOSVianys Gomez Arias, Sharon Gutiérrez, Mimí Parra, TaidethArias y Ailin Acosta. Con la asesoría del docente GustavoRohenes Gale, licenciado en biología de la universidadindustrial de Santander (UIS).

RECURSOS ECONÓMICOS: Hojas de espinacas

Papel absorbente.

Papel filtro

Con una balanza pesar 5-8 gramos de hojas de espinacas.

En un beaker adicionar agua y sumergir las hojas de espinacas.

Agregamos carbonato de calcio. Colocamos a hervir durante 2

minutos.

con papel absorbente secamos las hojas.

En un mortero de porcelna trituramos.

Adicionamos alcohol al 95% y seguimos triturando.

Descantamos y filtramos la disolucion de pigmentos con un

papel filtro.

Agregamos 50 ml de alcohol al macerado.

Ensayo 1.1

En un frasco con lados planos y paralelo

vertimos el extracto

Con la ayuda de la lamparailuminamos con luz fuerte

por medio de un haz.

Fluorescencia

RESULTADOS Y ANALISIS

Ensayo N 1 EXTRACCIÓN DE LOS PIGMENTOS VEGETALES

1.1. Cuando una solución de clorofila es iluminada con luz blanca o azul se produce

un fenómeno de excitación molecular. La luz emitida por fluorescencia es siempre

de mayor longitud de onda y de menor energía que la luz incidente, pues siempre

algo de esa energía se disipa en forma de calor.

Esta emisión de luz por parte de la clorofila, demuestra que es capaz de realizar

reacciones fotoquímicas.

Las clorofilas son poco estables in vitro, especialmente bajo iluminación intensa. El

átomo central de magnesio es fácilmente reemplazado por hidrógeno, dando lugar a

las feofitinas respectivas, pigmentos de color pardo oliva.

Los pigmentos migran a distintas velocidades de acuerdo a su solubilidad. De este

modo se puede efectuar una separación entre ellos y cada compuesto puede ser

definido por una magnitud específica denominada Rf (relación de frente), que tiene

valores entre 0 y 1.

SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFIA

Ensayo 1.2

5 ml del extracto + 1 ml de agua (control)

Se presenta un color más claro en la disolución no se observa un

cambio significativo con respecto a la muestra.

5 ml del extracto + 1 ml de NaOH al 5 % Se presenta un color verde biche en la disolución.

5 ml del extracto + 1 ml de ácido acético glacial Se presenta un color verde intenso.

5 ml del extracto + 1 ml de CuSO4 al 5 % Se presenta una coloración más verde.

Al igual que la clorofila en la estructura, las feofitinas son en realidad

productos de descomposición. Están "gastando" clorofila que ha perdido un

ion pero que permanece en la hoja y continúa brindando a la hoja su color.

El ion perdido proviene del componente de magnesio.

La clorofila puede sufrir distintos tipos de alteraciones. La más frecuente,

es la pérdida del átomo de magnesio, formando la llamada feofitina, de un

color verde oliva con tonos marrones, en lugar del verde brillante de la

clorofila. Esta pérdida del magnesio se produce por sustitución por dos

iones H+, y consecuentemente se ve favorecida por el medio ácido.

La pérdida es irreversible en medio acuoso, por lo que el cambio de color de

los vegetales verdes es un fenómeno habitual en procesos de cocinado,

enlatado, etc. La clorofila b es algo más estable que la clorofila a. Hay que

tener en cuenta que los vegetales son siempre ácidos, y que en el

tratamiento térmico se liberan generalmente ácidos presentes en vacuolas

en las células, y que hacen descender el pH del medio.

En la clorofila puede hidrolizarse el enlace éster que mantiene unido el grupo

fitol. Esta hidrólisis está catalizada por el enzima clorofilasa, presente en los

vegetales verdes. La estructura que queda al eliminarse el fitol recibe el

nombre de clorofilida. Su color es semejante al de la clorofila, y

consecuentemente su formación no representa un problema desde ese punto de

vista, e incluso son algo más estables que las propias clorofilas frente a la

pérdida del magnesio

La feofitina es capaz de unir eficientemente iones de Zn o de Cu en el lugar

que ocupaba el magnesio, formando pigmentos estables y de color verde

atractivo. La toxicidad del cobre limita su uso, pero los complejos cúpricos de

clorofilas o clorofilidas están autorizados en la Unión Europea como colorantes

alimentarios en algunos productos.

Tomamos una remolacha cortamos en tajadas bien

delgadas.

Adicionamos en un beacker que contiene 100

ml de agua destilada.

Colocamos a hervir durante 20-30 minutos.

Luego que este ebfriado el extracto procedemos

hacer el filtrado.

Al observar los cambios de color determinar su PH con el peachimetro.

Despues gota a gota agregamos disolucionde acido acetico al 0,2

N.

Con el peachimetro determina su PH

nuevamente.

En un tubo de ensayo agregamos 5 ml del

extracto.

Continuamos adicionando acido; para ver si ocurre cambios.

determinar su PH.

Repetimos el procedimiento; pero con una disolucion de NaOH

al 0,1 N.

Anotamos los cambios dados y los PH

producidos.

Pigmento Reactivo Observación Imagen

Extracto de

remolacha

Al introducir las

tajaditas de

remolacha al beaker

con agua destilada

hirviendo, a medida

que fue

aumentando la

temperatura estas

fueron presentando

decoloración. para

medir el pH se

utilizó el pH-metro y

el pH de esta

solución fue de 5.90

Extracto de

remolacha

Ácido acético Luego de

agregarle el ácido

acético se

observa una

coloración

amarilla

Y también se le

tomó el pH que

fue de 2.83, lo

cual indica que el

pH es acido.

Extracto de

remolacha

Hidróxido de

sodio

Se observa una

coloración

purpura y su pH

fue de 11.33, lo

cual indica que el

pH es básico.

Lo que obtuvimos de la extracción fue la Betanina, unpigmento que se conocen colectivamente como betalaínas. Labetanina es una sustancia que consiste en el extractoacuoso de la raíz de la remolacha roja Beta vulgaris. Seextrae generalmente tras la cocción en agua, y presenta uncolor rosado. Las betalaínas y las antocianinas sonmutuamente excluyentes, por lo que cuando se encuentranbetalaínas en una planta, estarán ausentes las antocianinas,y viceversa.El pH obtenido del extracto inicial, fue de 5.90, un valoradecuado, ya que el pH normal de las verduras se encuentraentre 4.6 y 6.4, lo que hace que se prolongue la conservaciónde las verduras e inhiba la reproducción demicroorganismos.

Luego al añadir las gotas de ácido acético la solución cambio aun color amarillo, debido al descenso de su pH a 2,83, lo queindica que se acidifico aún más. Este cambio ocurrió porque elácido acético tiene la capacidad de ceder protones (H+). Endisolución acuosa, el ácido acético puede perder el protón delgrupo carboxilo para dar su base conjugada, el acetato. SupKa es de 4,8 a 25 °C, lo cual significa, que al pHmoderadamente ácido de 4,8, la mitad de sus moléculas sehabrán desprendido del protón. Esto hace que sea un ácidodébil.En el caso de las betalaínas, al ser ionizables en medio ácido,sufren cambios de color tanto a un pH por debajo de 3.5pero no se hidrolizan por lo cual se pueden utilizar paraalimentos ácidos. Su máxima estabilidad está entre pH 5 y 6.Con el NaOH su pH aumento convirtiéndose en una soluciónalcalina, pero manteniendo prácticamente el color original.

Ensayo 2.2

PIGMENTOS ANTOCIANICOS

FLORES

En un frasco pequeño con agua; agregamos flores blancas, azules y rojas.

Colocamos el frasco en una capsula de petri de mayor tamaño que la base

del frasco.

Vertir en la capsula un poco de hidroxido de amonio

concentrdo.

Tapamos con un frasco invertido. para crear una

atmosfera de vapor al rededor de las flores.

Repetir el procedimiento con HCl concentrado.

Anotar el cambio de color en las flores en cada

procedimiento.

Las antocianinas identificadas fueron La delfinidina la cual brinda

colores azules a las flores, como el caso de las violetas. Como casi todas

las demás antocianidinas, es sensible a la acidez (pH) del medio, y cambia

de color desde el azul en medios básicos a rojo en soluciones ácidas.

La Peonidina provee a las flores el color purpura-roja. Como la mayoría

de las antocianidinas, es sensible al pH y cambia su color de rojo al azul

cuando su valor de pH sube. Esto se debe a que las antocianidinas son

unos cromóforos altamente conjugados. Cuando el pH cambia se ve

alterado el grado de la extensión de la conjugación (casi el doble), que

también altera la longitud de la onda de la energía luminosa absorbida por

la molécula. (Las antocianidinas naturales son más estables en un

medioambiente de pH bajo; a pH 8.0 la mayoría se convierte incoloro.) A

un pH 2.0, la peonidina posee un color rojo cereza; a un pH 3.0 rosa

amarillento; a un pH 5.0 un morado-rojo como la uva y a un pH 8.0 un azul

profundo; a diferencia de muchos anthocyanidinas,

Las Antoxantinas son un tipo de pigmentos Flavonoide, característicos

de las plantas. Son pigmentos solubles en agua con un rango de color

que va desde el blanco o incoloro, hasta el crema o amarillo, a menudo

en los pétalos de las flores. El color de las antoxantinas es

generalmente blanco en medio ácido y amarillo en un medio alcalino.

Estos pigmentos son muy susceptibles a cambios en el color con

minerales y iones metálicos, similar a lo que sucede con las

Antocianinas. Los pétalos blancos de la flor se pusieron amarillos en

presencia de vapores de amoniaco, por su contenido de flavonas y/o

flavonoides.

La reacción del amoniaco con el agua produce iones hidróxido, los

cuales, explican el sabor y demás propiedades de las soluciones

alcalinas.

FLORES TRATADAS CON ÁCIDO CLORHÍDRICO (HCL)

CONCENTRADO.

Las antocianinas son las responsables de la coloración, rojo azul y violeta.

Su estabilidad está determinada por el grado de oxidación, la

temperatura, la fuerza iónica, la acidez y la interacción con otros

radicales y moléculas complejas. moléculas en las que se produce el efecto

batocrómico, que consiste en que al cambiar la acidez, es decir el pH, se

pasa del rojo anaranjado en condiciones ácidas, como el de la

pelargonidina, al rojo intenso-violeta de la cianidina en condiciones

neutras, y al rojo púrpura-azul de la delfinidina, en condiciones alcalinas.

El pH tiene efecto en la estructura y la estabilidad de las antocianinas. La

acidez tiene un efecto protector sobre la molécula. En soluciones acuosas

a valores de pH inferiores a 2, básicamente la totalidad del pigmento se

encuentra en su forma más estable de ion oxonio o catión flavilio de color

rojo intenso. El ion flavilio es susceptible al ataque nucleofilico por parte

del agua. Este es deficiente en electrones y por lo tanto muy reactivo, lo

que lo hace muy sensible a cambos de pH.

Las antocianinas tienen su máxima expresión de color a PH ácidos, y su

forma incolora se produce a pH neutros o alcalinos.

Los cambios de pH son factores muy importantes en determinación de

antocianinas ya que éstas son más estables en un medio ácido que en un

medio neutro o alcalino.

Una de las propiedades más singulares de las antocianinas es su capacidad

para cambiar de color en función del pH, mostrando una amplia gama de

tonos, desde el rojo, pasando por el púrpura o el azul, hasta el amarillo (al

aumentar el pH), de modo que actúan como indicadores naturales del pH.

Esto es debido a que su estructura experimenta una amplia variedad de

transformaciones moleculares en función de la concentración de protones.

Ensayo 3.1

SEPARACION DE XANTOFILAS

En una balanza pesar 20 gr de hojas de espinaca (spinacea oleracea)

Elimine las nervaduras de las hojas.

Colocar pedazos de hojas en un mortero.

Macerar poco a poco adicionando pequeñas de hojas y de alcohol etilico

al 90%.

siga macerando hasta obtener una pasta suave.

Filtre el extracto hasta obtener una disolucion de

clorofila pura.

Vierta 5 ml del filtrado en un tubo de ensayo.

Adicione un volumen adicional ala gasolina.

Tapar con un corcho y gire el tubo invirtiendolo

suavemente varias veces.

Observe la separacion de la xantofila del

extracto de la clorofila.

Ensayo N 3 SEPARACION DE XANTOFILAS

El alcohol tiene la propiedad de extraer algunas características de los

compuestos con los cuales es mezclado, por esta razón permite la

separación de la xantofila en la disolución.

Al momento de añadirse la gasolina que a su vez permite el arrastre y

separación de clorofila. Ya que este tiene afinidad por algunos

pigmentos como lo es con la clorofila y es llamado separador.

• Se determinaron las características físicas y químicas de lasclorofilas y antocianinas La estructura de la moléculas declorofila tiene dos partes: un anillo de porfirina (sustituidacon pequeños grupos enlazados, sustituyentes) y una cadenalarga llamada fitol. El anillo de porfirina es un tetrapirrol,con cuatro anillos pentagonales de pirrol enlazados paraformar un anillo mayor que es la porfirina, el color verdeen los vegetales es debido a la presencia de estos pigmentosllamados clorofila a y clorofila b. Las antocianinaspertenecen al grupo de los flavonoides y son glucósidos delas antocianidinas, es decir, están constituidas por unamolécula de antocianidina, que es la aglicona, a la que se leune un azúcar por medio de un enlace glucosídico, sonresponsables de una gama muy amplia de colores, desde elincoloro hasta el púrpura.

• Las antocianinas tienen la capacidad para cambiar de color enfunción del pH, mostrando una amplia gama de tonos, desdeel rojo, pasando por el púrpura o el azul, hasta el amarillo (alaumentar el pH), de modo que actúan como indicadoresnaturales del pH. Esto es debido a que su estructuraexperimenta una amplia variedad de transformacionesmoleculares en función de la concentración de protones. Enmedio acido las flores, mantuvieron su color ya que lasantocianinas son más estables en medios ácidos que enmedios alcalinos. En el medio alcalino perdieron su color.

• Se encontraron otros pigmentos llamados betalaínas estosson metabolitos secundarios de las plantas nitrogenados queactúan como pigmentos rojos y amarillos. Las betalaínas y lasantocianinas son mutuamente excluyentes, por lo que cuandose encuentran betalaínas en una planta, estarán ausentes lasantocianinas, y viceversa. A este grupo pertenece labetanina, responsable del color de la remolacha