Upload
roxana-mihaela
View
105
Download
3
Embed Size (px)
Citation preview
ANALIZELE PROBELORANALIZELE PROBELORBIOLOGICEBIOLOGICE
-- BIOANALIZABIOANALIZA --
Prof.dr.ing. GabrielProf.dr.ing. Gabriel--Lucian RADULucian RADU
14 cursuri14 cursuriStandardizarea procesului de analizăStandardizarea procesului de analizăC9
Procedee de analiză complexăProcedee de analiză complexăC8.
Biosenzori cu aplicaBiosenzori cu aplicattiiii îîn bioanalizăn bioanalizăC7.
Metode imunochimice de analizăMetode imunochimice de analizăC6.
Metode electroanaliticeMetode electroanaliticeC5.
Metode spectrometrice de analizăMetode spectrometrice de analizăC4.
MetodeMetode ssi tehnici de separarei tehnici de separareC3.
Metode de prelevare a probelor biologice siMetode de prelevare a probelor biologice siprelucrarea in vederea analizeiprelucrarea in vederea analizei
C2.
PrincipiilePrincipiile ssi aplicai aplicattiile bioanalizeiiile bioanalizeiC1.
ConConttinuturiinuturiCapitolul
TITULARI DISCIPLINAProf.dr.ing. Gabriel-Lucian RADU
S.l.Dr. Emanuela CRACIUN
Studenţii vor fi evaluaţi în mod continuu, atât în cursul semestrului, cât şi lafinal, alocându-se următoarele ponderi în notarea finală:
Activitate la curs (răspuns la întrebări, implicareîn activitatea din cadrul cursului, teme de casă) 10% din nota finalăPerformanţa în activităţile aplicative 40% din nota finalăExamen 50% din nota finală
•Activităţile evaluate şi ponderea:10% activitatea pe parcurs, 40% evaluare laborator, 50% examen
b) Cerinţele minimale pentru promovare:Parcurgerea tuturor lucrărilor de laborator;
Obţinerea a 50% din punctajul total;Obţinerea a 50% din examenul final.
c) Calculul notei finale:Calculul notei finale prin rotunjirea punctajului final total.
EVALUARE
Domenii de aplicabilitateDomenii de aplicabilitate
monitorizareamonitorizarea calitatiicalitatii vietiivietii sisi mediuluimediului
valorificareavalorificarea deseurilordeseurilor
iindustriandustria chimicochimico--farmaceuticafarmaceutica
biologiebiologie--bbiotehnologieiotehnologie
medicinamedicina
aparareaparare
INSTRUMENTUL BIOANALITICINSTRUMENTUL BIOANALITICidealideal
selectivselectiv
specificspecific
reproductibilreproductibil
utilizareutilizare simplasimpla
compactcompact
rapidrapid
ieftinieftin
fiabilfiabil
AlegereaAlegereametodeimetodei sisi instrumentuluiinstrumentului
probaproba
instrumentinstrument
metodametoda
**stareastarea dede agregareagregare
**omogenitateaomogenitatea
**istoriaistoria probeiprobei
**securitateasecuritatea
**sensibilitateasensibilitatea
**mediumediu (t, p, etc.)(t, p, etc.)
**acceptabilitateaacceptabilitatea
TEHNICATEHNICAMETODAMETODA
PROCEDEUPROCEDEUPROTOCOLPROTOCOL SP
ECIF
ICIT
ATEA
•• CALITATIVACALITATIVA•• SEMISEMI--CANTITATIVACANTITATIVA
•• CANTITATIVACANTITATIVA
INFORMATIAANALITICA
•• SCREENINGSCREENING•• RUTINARUTINA
•• RECUNORECUNOASTEREASTERE•• STANDARDSTANDARD•• REFERINTAREFERINTA
•• PRIMARAPRIMARA
INCR
EDER
EA
Clasificarea metodelor analitice în funcţie decantitatea de determinat
10-2μgSub-micro1 μgUltra-micro1 mgMicro10 mgSemi-micro100 mgMacro
Marimeaaproximativa
Metoda
Tehnicile de analiză si principalele aplicatii
Calitativa si cantitativa pentruCalitativa si cantitativa pentrumajoritatea.majoritatea.
Caracteristicile radiaCaracteristicile radiaţţiilor ionizanteiilor ionizantenucleare emise de analitnucleare emise de analit
Analizaradiochimica
Calitativa si cantitativa pentruCalitativa si cantitativa pentrumajoritatea.majoritatea.
Proprietatile electrice ale analituluiProprietatile electrice ale analituluiin solutiein solutie
Analizaelectrochimica
Caracterizarea compusilorCaracterizarea compusilormajoritari sau minoritarimajoritari sau minoritarisinguri sau in amestecsinguri sau in amestec
Schimbări fizice sau chimiceSchimbări fizice sau chimice îînnanalit atunci când esteanalit atunci când este îîncălzit sauncălzit saurăcitrăcit
Analiza termica
Separarile cantitative siSepararile cantitative sicalitative ale amestecurilorcalitative ale amestecurilor
Diferite proprietăDiferite proprietăţţi fizicoi fizico--chimice alechimice aleanalianaliţţilor separatiilor separati
Cromatografia sielectroforeza
Calitativa sau structuralaCalitativa sau structuralapentru majoritatea majorepentru majoritatea majore îînnjos pentru a urmărijos pentru a urmăricomponentele nivel izotopcomponentele nivel izotopraporturiraporturi
Masa analitului sau fragmente din eaMasa analitului sau fragmente din eaSpectrometria demasa
Calitativa,cantitativa sauCalitativa,cantitativa saustructurala pentrustructurala pentrucomponentele majorecomponentele majore
Lungimea de undăLungimea de undă şşi intensitateai intensitatearadiaradiaţţiilor electromagnetice emiseiilor electromagnetice emisesau absorbite de analitsau absorbite de analit
Spectrometriaatomica simoleculara
Cantitativa pentru componenteCantitativa pentru componentemajore sau minoremajore sau minore
Volumul soluVolumul soluţţiei reactivului standardiei reactivului standardreacreacţţionează cu analitulionează cu analitul
Titrimetria
Cantitativa pentru componenteCantitativa pentru componentemajore sau minoremajore sau minore
Greutatea analitului pur sau compusGreutatea analitului pur sau compuscu stoichiometrie cunoscutacu stoichiometrie cunoscuta
Gravimetria
Principalele domeniiPrincipalele domeniide aplicarede aplicare
Proprietatea masurataProprietatea masurataTehnicaTehnica
TEHNICATEHNICA
M E T O D AM E T O D A
ProceduraProcedura
ProtocolProtocol
ProcesulProcesul bioanaliticbioanaliticPrelucrareaPrelucrarea
datelordatelorOperatiiOperatii
preliminarepreliminare
RezultateRezultateProbaProbabrutabruta
MasurareaMasurarea sisitrasabilitateatrasabilitatea
MODEL
PROBA
ANALIZA
PLAN
EVALUARE
Defineste scopul
Selecteaza procesul analitic,numarul analizelor si centrele deanaliza pe baza scopurilor sicosturilor
Colecteaza probele, testepreliminare
Efectueaza operatii de ajustareaconditiilor, separarea intereferente,efectueaza masurarile siachizitioneaza datele
Selecteaza dintre date valoarea ceamai buna, estimeaza sigurantavalorii, revizuieste si repeta daca estenecesar
REPREZENTAREA PROCESULUI ANALITIC GLOBALREPREZENTAREA PROCESULUI ANALITIC GLOBAL
Strategia analiticăObținerea probei
Pregătirea probei
Aplicarea metodei de analiză
Obținerea datelor legate de greutatea sau volumul probeipregătite
Prepararea soluțiilor standard ale analitului sau a altorsubstanțe care vor reacționa cu analitul
Standardizarea soluțiilor sau calibrarea echipamentului
Obținerea datelor experimentale
Raportarea rezultatelor
Prelucrarea datelor
BazeleBazele măsurării instrumentale măsurării instrumentaleTraductori, Procesoare de semnal, Afișatoare și Surse de Curent
Soluții standardSoluții cu probe Traductor Procesoare
de semnal
Sursă de curent
Dispozitivde afișare
Traductor - convertește o proprietate a soluției în semnal electric
Procesoare de semnal - convertește semnalul într-o formăutilizabilă
Dispozitiv de afișare - afișează semnalul într-o formă ce poate fiînțeleasă de analist
ComponentComponentele de baza aleele de baza ale unuiunuiiinstrumentnstrument
GENERATOR
SEMNAL
Detector
Tranductor
Procesor
SemnalInregistrator
SURSA DECURENT
Semnal
analitic
SemnalSemnal
electricelectricmecanicmecanicopticoptic
Semnal
iesire
- semnal electric proporțional cu concentrația
TendinteleTendintele inin domeniuldomeniul dezvoltariidezvoltariiinstrumentelorinstrumentelor bioanaliticebioanalitice
prezentprezent
viitorviitor multinivelmultinivel
multimod
multimod
modmod
dimensiunedimensiune
mul
tidi
men
sion
alm
ulti
dim
ensi
onal
com
plex
itat
eco
mpl
exit
ate
MULTIFUNCTIONALMULTIFUNCTIONAL
hardware
marimeamarimea ((u.au.a.).)
inte
rfet
ein
terf
ete
elec
tron
ice
elec
tron
ice software
Molaritatea: Numarul de moli dintr-o substantaintr-un dm3de solutie Un mol: egal cu masa moleculara a
substantei Masa moleculara:
Da: daltonikDa: Kilodaltoni = 1000 DaMr: nici o unitate
Masa moleculara relativa== MasaMasa molecularmolecularaa aa unei substanunei substanttee iinn
raport curaport cu 1/12 din1/12 din masa atomicmasa atomicaa aa 1212CC.. 17
Unitatea S.I. pentru exprimareaconcentratiilor
• Conversie mol, mmol si µmol in volume diferitepentru a da diferite concentratii
•• SubstanteleSubstantele biologicebiologice suntsunt frecventfrecvent prezenteprezente ininconcentratiiconcentratii relativrelativ scazutescazute. In. In sistemelesistemele ““in vitroin vitro””volumelevolumele solutiilorsolutiilor utilizateutilizate frecventfrecvent inin scopuriscopuriexperimentaleexperimentale suntsunt, de, de asemeneaasemenea,, micimici.. ConsecintaConsecintaesteeste caca solutiilesolutiile experimentaleexperimentale suntsunt, de, de obiceiobicei inin mmolmmoldmdm --33,, µµmol dmmol dm--33 sisi nmolnmol dmdm--33 decatdecat molar.molar.
RaportulRaportul SemnalSemnal // ZgomotZgomotSemnalSemnal == informainformattiaia despredespre analitanalit carecare
este de interes pentru chimisteste de interes pentru chimistZgomotZgomot == informainformattiaia externexternaa care nucare nu
esteeste necesarnecesaraa deoarecedeoarece degradeazdegradeazaaacurateacuratetteaea ssii precizia analizeiprecizia analizei ssiimicmicssoreazoreazaa cantitatea decantitatea de analitanalit carecarepoate fipoate fi detectatdetectatS/Z = meS/Z = mediadia//deviadeviaţţiaia standard = x/sstandard = x/sS/Z = 1/ RSDS/Z = 1/ RSD
undeunde RSD =>RSD => deviadeviaţţiaia standardstandard relativărelativă, s/x, s/x
Surse deSurse de zgomotzgomotîîn analizelen analizele intrumentaleintrumentale
•• Zgomot chimicZgomot chimic•• rezultă din variabilerezultă din variabile iincontrolabilencontrolabile
ccareare afectează analiza chimică afectează analiza chimică•• Zgomot instrumentalZgomot instrumental•• TTipuriipuri•• Zgomot termicZgomot termic•• ZgomotZgomot ţţintăintă•• Zgomot slabZgomot slab•• Zgomot de mediuZgomot de mediu
ModalităModalităţţi pentru reducereai pentru reducerea zzgomotuluigomotuluiÎÎmpământarempământare şşi protejarei protejareAmplificatori diferiAmplificatori diferiţţiiFiltrareFiltrareModulareModulare““TăiereaTăierea”” semnaluluisemnaluluiBlocarea amplificatorilorBlocarea amplificatorilor
MetodeMetode SoftwareSoftware-- S/ZS/Z intensitatea laintensitatea la nn0.50.5,, undeunde nn este mediaeste media mmaasursuraarilorrilor-- AdunareaAdunarea intensitatiiintensitatii medii amedii a semnalelorsemnalelor
Media semnalelor 1Media semnalelor 1--3, 53, 5--7,etc7,etc..-- FiltrareFiltrare DigitalDigitalaa-- Metode de CorelareMetode de Corelare-- AdunareaAdunarea intensitatiiintensitatii medii amedii a semnalelorsemnalelor
Se observă că scalaverticală este maimică decât numărulscanărilor. Astfel,zgomotul creşte învaloare absolutăodată cu creştereanumărului scanărilor.Totusi, valoarearelativă a semnaluluianalitic creşte.
Efectul medierii semnalelor
SurseleSursele dede eroareeroare inin bioanalizabioanaliza
100%100%
10%10%
1%1%
samplingsampling analizaanalizapropriupropriu--zisazisa
prelucrareaprelucrareadatelordatelor
coeficientcoeficientdede variatievariatie
timptimp40%40% 30%30%20%20%
Erori de masurare: Toate procesele de masurare sunt supuse erorilorce afecteaza datele numerice si care decurg dintr-o varietate de cauze.
Erori absolute si relative: O eroare absoluta este diferenta numericadintre o valoare masurata si o valoare reala sau o valoare acceptata. Eroarearelativa este eroarea absoluta impartita la valoarea reala sau acceptata.
Erori determinate: Sunt cunoscute ca fiind erori sistematice, eleaparand, in general, din surse determinate, identificabile, care duc lavarierea valorilor masurate de la valoarea reala la cea acceptata.
Erori nedeterminate: Sunt cunoscute si sub numele de erori aleatorii,ele aparand dintr-o varietate de surse necontrolate si cauzeaza mici variatiialeatorii in masuratorile cantitative cand masurarea este repetata de unnumar de ori.
Erori cumulate: Cand diferite masuratori sunt combinate pentru acalcula un rezultat analitic global, erorile asociate acestor masurariindividuale contribuie la erori totale sau acumulate.
ERORI IN MASURARILE ANALITICE
SurseleSursele dede erorierori (I)(I)ErorileErorile de lade la reactivireactivi-- Reactivii si solvenReactivii si solvenţţii suntii sunt impuri.impuri.-- Depozitarea improprie de reactivi.Depozitarea improprie de reactivi.-- Neglijarea datei de expirare a reactivului.Neglijarea datei de expirare a reactivului.-- Evaporarea reactivilor.Evaporarea reactivilor.-- Respectare gradelor siRespectare gradelor si puritpuritaaţţilorilor diferite.diferite.Erorile materialului de referinţă- Impuritatea materialelor de referinţă.- Erorile de la introducerea unor substanţe.- Schimbările datoritã depozitãriinecorespunzãtoare.- Erorile în pregãtirea materialul de referintă.- Utilizarea materialul de referintă expirat.
SuSurserselele dede erorierori (II)(II)MetodeleMetodele generale alegenerale ale erorilorerorilor-- Devierea de la procedura deDevierea de la procedura de analizanalizaa-- NeluareaNeluarea iinn seama a limitei deseama a limitei de detectdetectieie-- NeluareaNeluarea iinn seama aseama a spaspattiuluiiului dede cocollectareectare-- Calcularea erorilorCalcularea erorilor (dilu(diluaariri, amestecuri,, amestecuri,adadaaugari)ugari)
-- FFolosiolosirearea unorunor procedurprocedurii analiticanaliticee inincorectcorectee
ErorileErorile dede calibrarecalibrare-- Erorile aleErorile ale mmaasurarilorsurarilor volumetricevolumetrice-- Erorile deErorile de ccaantarirentarire-- ReglareaReglarea inexactinexactaa aa echipamentechipamentuluiului
SurseleSursele dede erorierori (III)(III)ErorileErorile dede lala echipamentechipamentEchipamentul nu este curat.Echipamentul nu este curat.IIntretinereantretinerea lui estelui este neglijatneglijataa..InfluenInfluenttaa temperaturii,temperaturii, electricielectricitattatiiii sisi influeninfluenttaa mmagneticagneticaa..EroriErori îîn folosirea auton folosirea auto--pipetepipetelorlor necalibratenecalibrate, pipetele, pipetele nunu
suntsunt ataatassateate in modin mod corectcorect sausau sunt contaminasunt contaminatte.e.EroriErori iinn folosirea pipetelor defolosirea pipetelor de sticlsticlaa (se pot(se pot deterioara,deterioara,
materialemateriale de calitate mai slaba,de calitate mai slaba, eleele potpot fifi ccontaminaontaminatteeanterioranterior).).
ErorileErorile lala spectrospectrometrumetru (lungimea de undã gre(lungimea de undã greşşita, lampã deita, lampã deintensitate insuficientã, optica murdarintensitate insuficientã, optica murdarăă, ignorarea efectului de, ignorarea efectului deddeviaeviaţţieie,, îîn mod incorect zeroul configurat, introducerea probein mod incorect zeroul configurat, introducerea probeiîîntrntr--o camera luminoasa).o camera luminoasa).
Erorile cuveErorile cuveii (defecte ce nu sunt luate(defecte ce nu sunt luate îîn consideran consideraţţie,sticlaie,sticlanecorespunzãtoare de cuvnecorespunzãtoare de cuvaa, cantitate insuficienta, umedã, cantitate insuficienta, umedã ppeeexterioar, bulele de aer, contaminareexterioar, bulele de aer, contaminare))..
SurseleSursele dede erorierori (IV)(IV)InregistrareaInregistrarea semnalelorsemnalelor sisi descriereadescrierea erorilorerorilor-- Domeniul incorect deDomeniul incorect de raportareraportare-- Erorile deErorile de citirecitire-- EErorilerorile dede scrierescriere-- Schimburile deSchimburile de informainformaţţiiii
CalcululCalculul erorilor.erorilor.-- Erorile aritmeticErorile aritmeticee, erorile de, erorile de virgulvirgulaa,,
unitunitaattii incorecteincorecte-- ErorileErorile circularecirculare-- NeluareaNeluarea iinn calculcalcul aa valorilvaloriloror volumuluivolumului
dede reactivreactiv adaugatadaugat-- ErorileErorile iinn factorul defactorul de diluarediluare
VARIABILITATEA BIOLOGICAVARIABILITATEA BIOLOGICA
Identificarea naturii variaIdentificarea naturii variațțieiieibiologicebiologice
Ce seCe se îînnțțelege prin termenul deelege prin termenul devariavariațției biologică in contextuliei biologică in contextulbiochimiei clinice?biochimiei clinice?
O componentă a diversităO componentă a diversitățțiiiimăsuratorilor biochimiei determinatemăsuratorilor biochimiei determinatede fiziologia subiectelor observate.de fiziologia subiectelor observate.
ComponenteleComponentelevarianvarianțțeiei îînnmăsurarilemăsurarilebioanaliticebioanalitice
•• VarianVarianțța analiticăa analitică•• VarianVarianțță biologică la un subiectă biologică la un subiect•• VarianVarianțță biologicăă biologică îîntre subiecntre subiecțții
Surse deSurse deVariaVariațțieie
BiologicăBiologică
•• Ritmuri biologice(timpulRitmuri biologice(timpul))•• HomeostazieHomeostazie•• VârstăVârstă•• SexSex•• EtnieEtnie•• PatologiePatologie•• StimuliStimuli
CuantificareaCuantificarea variatieivariatiei biologicebiologice
•• Cum se faceCum se face cuantificareacuantificarea variatieivariatiei biologicebiologice??TrebuTrebuie analizateie analizate componentelecomponentele varianteivariantei::
σσ²²totaltotal ==σσ²²analiticanalitic ++ σσ²²iindividualndividualăă ++ σσ²²ggruprup
σσ²² analiticanalitic ==VariaVariannțțaa mediemedie dede testeteste identiceidentice îînn termentermen dede varianvarianțțăăanaliticanaliticăă
σσ²² iindividualndividualăă =Media biologic=Media biologicăă îînn varianvarianțțaa subiecsubiecțțilorilor
σσ²²ggruprup=Varian=Varianțțaa valorilor mijlociivalorilor mijlocii îîntre subiecntre subiecțți. Variani. Varianțța in punctele dea in punctele desetare homeostaticesetare homeostatice
CuantificareaCuantificareavariavariațțieiiei biologicebiologice
•• Cum se faceCum se face experimentulexperimentul??–– SubiectiSubiecti CCââțți?i?
–– ColectareaColectarea exemplarelorexemplarelorNumNumăăr?Frecver?Frecvennțța?a?
–– AnalizareaAnalizarea exemplareloexemplareloDiminuareaDiminuarea σσ²²analiticanalitic ??
–– AnalizareaAnalizarea datelordatelorValoriValori extreme?Statisticextreme?Statisticăă??
–– AplicareaAplicarea rezultatelorrezultatelor analizeianalizei
VariaVariațția biologicăia biologică șși utilizareai utilizareaintervalelor de referinintervalelor de referințțăă
ProceduriProceduri--ProtocoaleProtocoale•• Erorile analitice trebuie reduse cât mai mult.Erorile analitice trebuie reduse cât mai mult.•• Analiza idealăAnaliza ideală::
•• Un singur tip de reactivi de testareUn singur tip de reactivi de testare•• Un singur analizorUn singur analizor șși sistem analitici sistem analitic•• Număr cât mai mic de seriiNumăr cât mai mic de serii
CondiCondițțiile ar trebui sa reducă variabilele preiile ar trebui sa reducă variabilele pre--analitice.analitice.•• SubiecSubiecțți sănătoi sănătoșșii•• Moduri normale de viaModuri normale de viațțăă•• Fără droguriFără droguri(alcool , tutun )(alcool , tutun )•• Flebotomie de la aceeaFlebotomie de la aceeașși persoanăi persoană•• AcelaAcelașși moment al zilei la intervale regulatei moment al zilei la intervale regulate•• Stabilirea unor reguli pentru transportulStabilirea unor reguli pentru transportul
probelor, prelucrareprobelor, prelucrare șși păstrarei păstrare
CantitateUnități
Grup Medie CVI CVG Indicele deindividuali
tate
µµmol/Lmol/L bărbatbărbat (7)(7) 83.983.9 3.43.4 6.86.8 0.540.54
µµmol/Lmol/L FeFemeiemeie(8)(8) 71.471.4 4.94.9 11.811.8 0.410.41
µµmol/Lmol/L** totitoti (15)(15) 83.983.9 4.14.1 14.114.1 0.290.29
µµmol/Lmol/L ?? ?? 5.35.3 14.214.2 0.40.4
µµmol/Lmol/L**** N= 20N= 20BarbatBarbat 77FFeemeiemeie 1313
7777 4.74.7 14.414.4 0.330.33