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HERRAMIENTAS PARA LA DETECCIÓN DE ALÉRGENOS: ESTADO ACTUAL, RETOS Y NECESIDADES
ACTUACIONES DEL CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN
CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN
Mª Isabel Prieto SantosServicio de Biotecnología
Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos FIAB Madrid, 18 de octubre de 2016
CentroNacional deAlimentación
Métodos de detección de alérgenos Características y limitaciones
Posibles soluciones Retos Conclusiones
Índice:
Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB , Madrid 18 de octubre de 2016
CentroNacional deAlimentación
REGLAMENTO (UE) Nº 1169/2011 (Anexo II): Sustancias que causan alergias o intolerancia:
Cereales con glutenCrustáceos
Huevos Pescado Cacahuetes
Soja Leche Frutos de cáscaraApio Mostaza
Sésamo Sulfitos Altramuces Moluscos
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Estado ActualLimitaciones en la aplicación de la legislación UE en el etiquetado de alérgenos
• Falta de criterios normativos para la detección (Métodos de detección)
• Falta de umbrales de alérgenos (Límite de detección)
Involuntaria - Contaminación cruzada Excesivo etiquetado de precaución, sin relación con el riesgo real:
´puede contener trazas de …‘producido en una fabrica que utiliza….…
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Detección de ADN del alimento alergénico
Métodos inmunológicos
Métodos Cromatográficos
Métodos de Análisis de Alérgenos
Métodos Biología Molecular
Detección proteína o proteínas alergénicas
Detección proteína o fracciones de proteínas (péptidos)
Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB. Madrid 18 de octubre de 2016
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Métodos Inmunológicos: La mayoría de los kits comercialesdisponibles para el análisis en rutina de alérgenos de alimentos sebasan en métodos inmunológicos. Los Ensayos inmunoenzimático(ELISA) son los más ampliamente utilizados debido a que sonsensibles y específicos para la detección de proteínas alergénicas yfáciles de usar.Sin embargo, los kits comerciales para análisis cuantitativos utilizandiferentes tampones de extracción y diferentes calibrantes, sediferencian en la calidad de los anticuerpos utilizados y losresultados varían entre marcas comerciales y lotes.Las principales limitaciones incluyen efectos de la matriz, laextracción insuficiente de la proteína, la insuficiente especificidaddebido a reacciones cruzadas y la insuficiente reproducibilidad delos resultados.
Scientific Opinion on the evaluation of allergenic foods and food ingredients for labelling purposes, EFSA Journal 2014;12(11):3894, http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/3894.pdf
Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB . Madrid 18 de octubre de 2016
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Métodos basados en la detección de una o más proteínas o fragmentos proteicos (alérgeno), mediante la uniónespecífica antígeno-anticuerpo
Métodos Inmunológicos
Enzimoinmunoensayo ELISA
TIRAS Inmunoreactivas (LFD)
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Características de los sistemas Inmunológicos
• Alta sensibilidad• Cuantitativos• Aplicación Materias Primas y
Producto Procesado• Equipamiento: Lector de microplacas• Experiencia su realización
• Muy sencillos• Cualitativos/semicuantitativos• Rápidos ( 5-10 minutos)• Útiles “Control de Riesgo” (APPCC)• Materias primas• Sensibilidad declarada
(entre 1 mg/kg - 10 mg/kg )• Requieren confirmación
ELISATiras (FDL)
• Detectan Proteínas Alergénicas• Especificidad• Sensibilidad• Fácil Realización• Gran disponibilidad en el mercado
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Limitaciones analíticas de los Métodos Inmunológicos-1
Extracción de proteínas alergénicas
Efecto de la matriz (grasas, taninos, acidez, etc...)
Efecto del procesado (tratamiento térmico, hidrólisis, fermentación etc…)
Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB.. Madrid 18 de octubre de 2016
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1.‐ Solución Cocktail con Etanol al 80% ‐‐ 2.‐ Solución de Guanidina / ‐mercaptoetanol / Isopropanol ‐‐3.‐ Solución 1 con Gelatina de pescado ‐‐ 4.‐ Solución 1 con leche desnatada
Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB.. Madrid 18 de octubre de 2016
Estudio del efecto de los taninos de la fruta (CNA)
Matriz ricas en taninosMatriz libre de taninos
mg/kg de gluten
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▄ Sin desengrasar▄ Desengrasado
Efecto del pH en la detección de huevo en salsas
▄ pH ácido▄ pH neutro
Determinación de caseína
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Diferencias de los Resultados en los distintos sistemas ELISA
Detectan diferentes proteínasDiferente anticuerposDiferentes calibrantes Diferentes unidades de expresión de resultadosDiferencia en los límites de detecciónVariación entre marcas comerciales y lotes
Limitaciones analíticas de los Métodos Inmunológicos-2
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0
5
10
15
20
25
30
35
Cac
ahue
te (m
g/kg
)
BioKits Romer Labs R-Biopharm Neogen
Resultados diferentes ELISAS
FAPAS Proficiency Test 2776C
FAPAS 2776‐ C Cacahuete en chocolate
•Biokits 11,8 mg/kg• Romer Labs 8,7 mg/kg• R‐Biopharm 24,2 mg/kg • Neogen 15,0 mg/kg
Valor asignado:
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TEPNEL BIOKITSAgraQuant®
A B C DHuevo 0,4 mg/kg 0,25 mg/kg 0,5 mg/kg 1 mg/kg
Caseína 0,2 mg/kg 0,25 mg/kg 2,5 mg/kg 1 mg/kg
Β-lactoglobulina 10 μg/kg 0,2 mg/kg 5 mg/kg 0,1 mg/kg
Soja 40 μg/kg 0,3 mg/kg 2,5 mg/kg 2,5 mg/kg
Cacahuete 1 mg/kg 1,5 mg/kg 2,5 mg/kg 1 mg/kg
Diferente LD/LC
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β-lactoglobulina en un alimento :
Sistema A : < 10 µg/kgSistema C: < 5 mg/kg
RESULTADO : NO DETECTADO
Cacahuete en un alimento (1,5 mg/kg) :
Sistema A (LC 1 mg/kg): 1,5 mg/kg Sistema C (LC 2,5 mg/kg): < 2,5 mg/kg ?
DETECTADO NO DETECTADO
ETIQUETAR
NO ETIQUETAR
Ejemplos :
Qué pasa entre 10 µg/kg y 5 mg/kg ???
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rente expresión de resultados
función de la solución calibrante utilizada
s sistemas proponen conversiones en la expresión de resultados
HUEVO LECHE CACAHUETE huevo entero en mg/kg proteína de leche cacahuete
proteína clara de mg/kg leche entera en polvo
Proteína de cacahuete
ovomucoide mg/kg caseína
mg/kg β lactoglobulina
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ción de muestras fortificadas con NIST SRM 8445
Comparativo kits ELISA Determinación de huevo
RAS Valor Esperado mg/kg
1 2 3 4mg/kg (ppm) proteína
clara de huevomg/kg (ppm) mg/kg (ppm) mg/kg (ppm)
Huevo entero en polvo Huevo entero en polvo Huevo entero en polvo
do 1,5 0,53 3,4 1,72 1,6
a 1,5 0, 75 2,4 1,7 1,6
do 3 1,1 5,6 3,15 4
a 3 1,21 6,8 3,05 3
do 6 3,2 9,5 6,1 5,6
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o Comparativo kits ELISA Determinación de Avellana1 2 3 4LC LC LC LC
z ETIQUETADO0,5 mg/kg de Proteína de avellana
1 mg/kg de Avellana
2,5 mg/kg de Avellana
2,5 mg/kg de Avellana
NO ETIQUETADO > 5 mg/kg 35 mg/kg 15,5 mg/kg > 20 mg/kg
inasNO ETIQUETADO 0,7 mg/kg 2,9 mg/kg 4,9 mg/kg 8,3 mg/kg
Avellana 2% NO DETECTADO NO DETECTADO 3,6 mg/kg NO DETECTADO
Rastros de avellana NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO
Puede contener trazas de nueces, almendras y soja
NO DETECTADO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO
Trazas de frutos secos NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO
d
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s Indirecto : Amplificación de un fragmento del gen del alérgeno o na secuencia genética específica presente en el Alimento o ente
aciónados
PCR tiempo final
odos Biología Molecular
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R tiempo real
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os basados en la detección de ADN permiten laón del alimento alergénico, en lugar de la proteína
nica y son complementarios a ensayos inmunológicos. ADNeralmente más estables que las proteínas y por lo tantodo para el análisis de alimentos procesados. Losimientos de extracción y amplificación están biencidos. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tanto afinal como en tiempo real permiten el análisis que varios
nos a la vez. El análisis del ADN se convierte en el método den siempre que no están disponibles kits de ELISA o no seanicos para el análisis de un alimento alergénico/ingredienteico (por ejemplo el apio). PCR en tiempo real puedecionar resultados cuantitativos y permite el análisis de
kit i l tá di ibl
Opinion on the evaluation of allergenic foods and food ingredients for labelling purposes, nal 2014;12(11):3894, http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/3894.pdf
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blemas en la extracción (presencia de inhibición en mentos procesados)ultados cualitativos / semicuantitativos
• Cuantificación ng ADN (número de copias)unos alérgenos no pueden diferenciarse por PCR Carne vacuno /lecheaves /huevo
rente distribución entre ADN y proteína ADN en baja concentración, leche, proteína de clara de huevo,concentrados de proteína: Falsos negativos
ciones analíticas de los métodos biológicos:
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AD DE MEDIDA/EXPRESIÓN DE RESULTADOS
PROTEÍNAS ADN
Cantidad de ADN (nº de copias) detectado
dad de ingrediente énico o proteína énica por kilo de ento (mg/kg)
No se puede establecer una correlación entre cantidad de PROTEÍNA y cantidad
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SULTADOS PCR
stras fortificadas con 5 mg/kgde Soja
Bollería Líquidos Salsas Postres
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ación ELISA/PCR sobre muestras reales (Detección de Avellana)
MUESTRAS ELISA (mg/kg) PCR Bollo 8 DETECTADOGalleta de chocolate > 20 DETECTADOGalletas < 2,5 NO DETECTADOBombón > 20 DETECTADOTurrón de cacahuete < 2,5 DETECTADOCereales de trigo y chocolate > 20 DETECTADOBarrita de cereales > 20 DETECTADOMuesli > 20 DETECTADOBarrita de trigo y chocolate > 20 DETECTADOCereales Fruta y fibra > 20 DETECTADOBarquillo relleno de cacao > 20 DETECTADOBizcocho cubierto de chocolate < 2,5 NO DETECTADOCopos de maíz < 2,5 NO DETECTADODesayuno a la taza < 2,5 NO DETECTADOGalleta < 2 5 NO DETECTADO
RAS DUDOSAS ontener trazas avellana)
UESTRAS VAS (No figura
RAS POSITIVAS avellana como rediente)
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LC MS/MS
NAica
Digestión Enzimática
IONES:dificultad analíticaAS :dianas en un único análisis
Péptidos
Cromatografía:HPLCLC MS/MS
odos Cromatográficos
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Qué queremos detectar ?• Detección del ingrediente:
Alimento
• Detección del alérgeno:Proteína alergénica
ción de un Método de análisis
do analizar? cto final: Cumplir la Legislación ia Prima: Identificar alérgenos
- Suficiente para cumplirla legislación
-Más información para el paciente
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o de matriz- Matriz grasa ADN X ELISA
- Productos hidrolizados ADN ELISA X
uraleza del alérgeno buscado
Apio
S
vamos a analizar?
ADN I ifi id d
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ETOS O DESAFIOS:
Determinar umbrales tóxicos
Materiales de Referencia Certificados
EuroPrevall
VITAL
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SPONIBILIDAD MATERIALES DE REFERENCIA
: MR disponibles
Alérgeno MATERIAL PROCEDENCIA CERTIFICACION
Huevo RM 8445 ( Whole egg powder) NIST Contenido proteico (ELISA)
mina/Gluten PWG standar Prolamin Group Alérgeno
Leche BCR-638 IRMM Contenido proteico
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al de Referenciancipal problema para la cuantificación de alérgenos poros inmunológicos, espectrometría de masas o los métodoss en ADN es la falta de disponibilidad de materiales decia certificados (MRC).les de referencia (no certificados) desarrollados por diferentestores están disponibles comercialmente para los alérgenostarios más importantes, pero los resultados obtenidos puedencomparables.equiere la disponibilidad de MRC para laificación de alérgenos alimentarios.
Opinion on the evaluation of allergenic foods and food ingredients for labelling purposes, nal 2014;12(11):3894, http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/3894.pdf
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les soluciones
Muestras Fortificadas: muestra preparada por adición de una determinada cantidad de alérgeno
obrantes de ensayos de intercomparaciónValor de Referencia : Valor Asignado en el ensayo
(Con cada Kit ???)
tilización de reactivos químicos (cuando el alérgeno exista reactivo, Proteína purificada ej. caseína, β-lactoglobulina, etc…)
tilización del alimento alergénicoreparación de muestras control: Valor teórico
“Incurred”: muestra adicionada y sometida
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QUETADO PRECAUTORIOaración voluntaria que usan los fabricantes en lasetas de los alimentos que indica la presenciancial y no intencionada de un alérgeno
77 % ‐ Puede contener trazas de…….6 % ‐ Puede contener indicios de….13 % ‐ Elaborado en fábrica que utiliza……3 % ‐ Aroma de …..
uestras analizadas con etiquetado precautorio:
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BGL 28%
Caseína 39%
Avellana60%
Cacahuete
Huevo10%
Apio 13% Soja 30%
Total Muestras analizadas
Muestras Positivas %
18 5 28a 18 7 39a 10 6 60ete 18 4 22
10 1 108 1 1310 3 30
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IÓN INTERNA :firmación, a través del examen y el aporte de evidencias objetivas, de que se los requisitos particulares para un uso especifico previsto (Norma UNE/IEC 005)
o garantizar los resultados ?
Comprobarresultadospor el
sonbles en elo
• repetibilidad• Reproducibilidad
PRECISIÓN DEL MÉTODO
• Comprobar en distintas matrices• Aceptable (Recuperación 80% ‐120%)
EXACTITUD DEL MÉTODO
• LD Límites de detección• LC Límites de cuantificaciónLD/LC
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nización de los métodos de detección
UNE‐ EN 15633‐1:2009. “Productos alimenticios: Detección de alérgenos mediante métodos inmunológicos‐Parte 1: Consideraciones generales”
UNE‐ EN 15634‐1:2009. “Productos alimenticios: Detección de alérgenos mediante métodos de biología molecular‐Parte 1: Consideraciones generales”
UNE‐ EN 16388 IN‐:2012. “Productos alimenticios: Detección de alérgenos alimenticios. Formato para proporcionar información sobre métodos inmunológicos y métodos de biología molecular ”
DACION DE MÉTODOS POR ORGANISMOS INTERNACIONALES
UNE‐ EN 15842:2010. “Productos alimenticios: Detección de alérgenos Consideraciones generales y Validación de métodos”
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clusiones /Necesidades
eación de un Laboratorio Europeo de eferencia. Armonizar métodostablecer Umbrales de toxicidad / Límites gales ateriales de referencia
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Muchas Gracias
Servicio de Biotecnología ‐ CNAMª Isabel Prieto Santos [email protected]ª del Camino Martín‐Forero Buendía [email protected]