收稿日期 :2005212223

基金项目 :国家 863 项目 (20022AA2212071)资助

作者简介 :岳桂东 (19792　)男 ,博士生 ,研究方向 :玉米基因组学.

3 通讯作者

　文章编号 :167129352(2006) 0420168205

干旱胁迫下开花期玉米消减文库的构建及分析

岳桂东1 ,胡孝瑞2 ,庄云龙1 ,张举仁1 3

(1. 山东大学生命科学学院 , 山东 济南 250100 ;2. 山东大学国防科学技术研究院 , 山东 济南 250100)

摘要 :分别以 1 d 干旱和 7 d 干旱处理的开花期玉米顶叶 cDNA 为 tester ,正常生长的玉米顶叶 cDNA 为 driver ,利用

抑制性差减杂交技术构建了两个干旱胁迫下开花期玉米消减文库. 两个文库的重组率均高于 95 % ,插入片段集中

在 300～600 bp 之间. 对两个文库部分克隆进行测序发现 ,文库中含有脱水素、蔗糖合成酶、甜菜碱醛脱氢酶 , DRE

结合因子等大量的抗旱相关基因 ,说明两个干旱胁迫下开花期玉米抑制性消减文库已经构建成功 ,且具有重要

意义.

关键词 :玉米 ;抗旱 ;抑制性消减杂交

中图分类号 :Q786 　　　文献标识码 :A

Construction and analysis of suppression subtractivehybridization library from the leaves of maize flowering plants

under Drought Stress

YUE Gui2dong1 , HU Xiao2rui2 , ZHUANG Yun2long1 and ZHANGJu2ren1 3

(1. School of Life Science , Shandong Univ. , Jinan 250100 , Shandong , China ;

2. National Defence Technology Institute , Shandong Univ. , Jinan 250100 , Shandong , China)

Abstract : In order to identify genes induced during the drought stress response in flowering maize (Zea mays) , suppression sub2tractive hybridization (SSH) was performed using cDNAs prepared from flowering maize leaves treated with drought stress for one

day and 7days as testers and cDNAs from unstressed flowering maize leaves as drivers. Two subtractive cDNA libraries were con2structed , in which the rate of recombination was 95 % and the size of inserts ranged from 300 bp to 600 bp. Analysis of sequences

from the positive clones picked randomly revealed that many drought stress associated genes , including dehydrin , sucrose synthase

3 , betaine aldehyde dehydrogenase and DRE binding factor 1 , etc. , were obtained. The successful construction of the two subtract2ed cDNA libraries enables us to identify new different expressed genes involved in the resistance mechanism of flowering maize.

Key words : maize ; drought stress ; suppression subtractive hybridization

　　据统计 ,在世界范围内 ,干旱缺水对农业和社会

造成的损失相当于其他各类自然灾害造成的损失之

和[1 ] . 玉米是全球第一大作物、我国第二大作物 ,干

旱是影响其产量的重要限制因素 ,一般可使玉米减

产 20 %～30 %. 玉米对干旱的反应取决于新陈代谢

能力、形态结构和发育阶段[2 ],开花期是玉米需水临

界期 , 对干旱胁迫反应最敏感 ,此时逢遇干旱会使

产量下降幅度最大[3 ,4 ]. 利用分子生物学方法分离克

隆开花期玉米干旱胁迫诱导表达的基因、鉴定其功

能、明确其在植物抗旱性方面的作用 ,是开展玉米抗

旱基因工程研究的重要内容.

抑制差减杂交 (SSH) 是近年发展起来的一种简

便而高效的差异表达基因筛选技术[5 ],该技术通过

两轮差减杂交和两次抑制性 PCR ,使差异表达基因

得到有效的富集并得以克隆 ,在分离克隆差异表达

基因的应用上表现出了独特的优越性[6 ]. 目前 ,采用

　第 41 卷 　第 4 期　Vol. 41 　 No. 4

　 　 　 　 　山 　东 　大 　学 　学 　报 　(理 　学 　版)

JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY　 　 　 　 　

2006 年 8 月 　Aug. 2006 　

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SSH技术研究植物抗逆基因已成为植物生物学研究

的热点之一[7 ].

　　本工作利用 SSH 技术构建了 1 d 干旱和 7 d 干

旱胁迫下开花期玉米抑制性消减文库 ,对文库部分

克隆进行了测序和应用生物信息学工具进行分析 ,

发现了一批抗旱相关基因 ,为获得玉米全长抗旱基

因和开展抗旱基因工程研究是有意义的.

1 　材料与方法

1. 1 　实验材料

实验所用植物材料为玉米骨干自交系 DH4866.

大肠杆菌 DH5α由实验室自己保存 ,OligotexR○

mRNA

Kit 购自 QIAGEN 公司 ,PCR2selectTm

cDNA Subtraction

Kit 购自 Clontech 公司 ,HotStart Taq 酶和 DNA Marker

购自 Takara 公司 ,TΠA 克隆载体 p GEM2T easy Kit 购

自 PROMEGA 公司.

1. 2 　方法

1. 2. 1 　材料的处理

挑选大小均一饱满的种子种在花盆中 ,待玉米

雄穗抽出顶叶时分两组 ,一组正常浇水作为对照 ,另

一组进行干旱处理 ,在胁迫处理后第 1、3、5、7 d 早晨

和下午从顶叶下第 3 片叶剪取小块用于渗透势测

定 ,并根据测定值确定浇水量以维持植株处于干旱

胁迫状态. 在干旱胁迫处理过程中 ,分别取干旱处

理 1 d 和 7 d 植株的顶叶和同期对照植株的顶叶用

于构建抑制性消减文库. 顶叶离体后迅速用液氮速

冻 , - 70 ℃保存.

1. 2. 2 　总 RNA 的提取及 mRNA 纯化

液氮研磨玉米叶片至粉末 ,采用酸酚 - 异硫氰

酸胍法提取总 RNA. 按照 OligotexR○

mRNA Kit 操作

手册分离 mRNA.

1. 2. 3 　抑制性减法杂交

分别以干旱处理 1 d 和 7 d 的植株顶叶 cDNA 为

tester ,以未处理植株顶叶的 cDNA 为 driver 进行抑制

性减法杂交 ,具体操作依照 CLONTECH 试剂盒 PCR2select

TmcDNA Subtraction Kit 进行. 即从总 RNA 中分

离纯化出 mRNA 反转录合成 cDNA ,再将 tester cDNA

用限制性内切酶 RsaI酶切后分为两份 ,分别与接头

1、2R(Adaptor 1、2R)连接 ,制成 tester21cDNA 和 tester22RcDNA ,16 ℃连接过夜. 然后将它们分别与 driver

cDNA 进行第一次杂交 ,68 ℃杂交 8 h ,再将两组第一

次消减杂交体系混合 ,再加入过量的变性 driver 进

行第 2 次杂交 ,68 ℃过夜. 杂交产物稀释后 ,以第 1

轮的 PCR 引物 primer1 及巢式 PCR 引物 nested

primer1和 nested primer2R 进行第一次 PCR 扩增和第

二次 PCR 扩增.

以未消减组的 PCR 结果作对照. 将 tester21cDNA和 tester22RcDNA 混合制备成 12C作为 PCR 反

应模板 ,同样以引物 primer1 及巢式 PCR 引物 nested

primer1 和 nested primer2R 进行第一次 PCR 扩增和第

二次 PCR 扩增.

1. 2. 4 　cDNA 文库的构建

从上述的差减杂交 cDNA 的二次 PCR 产物 (共

25μL ) 中取出 3μL , 与 1μL p GEM T2Easy Vector

(50 ng)在 4 ℃下连接过夜. 从连接体系 10μL 中取

2μL用反应液转化 DH5a 感受态细胞 ,于 X2galΠIPTG

Amp 琼脂平板上挑取白色菌落 ,点种于盛有液体 LB

培养基的 96 孔板中 ,37 ℃培养过夜后 ,加 15 %甘

油 ,液氮速冻 , - 70 ℃保种.

1. 2. 5 　DNA 测序与序列分析

挑取文库阳性克隆在 37 ℃,220 rΠmin 振荡下过

夜培养 ,用碱裂解法提取质粒 ,测序工作由山东大学

生命科学学院核酸测序中心完成. 序列经去除载体

序列和引物序列后 ,将所得的 EST用 BLAST软件搜

索 GeneBank 进行同源性分析.

2 　结果与分析

2. 1 　干旱处理的鉴定

本实验中 ,在不同时间段剪取干旱胁迫处理的

和未干旱处理的叶片用于渗透势测定 ,结果见图 1.

由结果可见干旱处理材料的叶片渗透势持续低于对

照.

图 1 　叶片的渗透势 (Ψπ)横坐标1 ,3 ,5 ,7 :在干旱处理的第 2 ,4 ,6 ,8 d 早晨 8 :00 测定叶

片渗透势 ;横坐标2 ,4 ,6 ,8 :在干旱处理的第 2 ,4 ,6 ,8 d 下午 15 :30 测定

叶片渗透势.Fig. 1 　Osmolarity of leaves

1 ,3 ,5 ,7 : Osmolarity measured at 8 :00 AM. on the 2nd , 4th , 6thand 8th day respectively ;

2 ,4 ,6 ,8 : Osmolarity measured at 15 :30 PM. on the 2nd , 4th , 6thand 8th day respectively.

　第 4 期 岳桂东 ,等 :干旱胁迫下开花期玉米消减文库的构建及分析 169　　 　

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2. 2 　RNA的提取和 mRNA的分离

紫外分光光度计检测总 RNA 在波长 230 nm、

260 nm、280 nm 处的吸收值 ,得出 A260ΠA280 在 1. 9

与 2. 0 之间 ,说明所提取的总 RNA 纯度较高. 1. 0 %

琼脂糖凝胶电泳检测 ,总 RNA 的 28SrRNA、18SrRNA

两条带清晰锐利 ,亮度比基本上呈 2∶1 的关系 (图

2) ,表明 RNA 未出现降解 ,完整性比较好.

图 2 　玉米顶叶总 RNA 电泳图Fig. 2 　Total RNA electrophoresis of maize leaves

2. 3 　双链 cDNA的合成

用起始量为 2μg 的 mRNA 反转录合成 cDNA ,

对反转录产物进行电泳 ,以确认 cDNA 的质量. 从

图 3 看出与试剂盒所提供的对照 mRNA 反转录合成

的 cDNA(泳道 3)相比较 ,用于建库的 cDNA(泳道 1、

2)同样在 300～3 000 bp 之间呈现出弥散条带 ,这表

明 mRNA 和 cDNA 的质量都比较好 ,可以满足下一

步实验的要求.

图 3 　mRNA 反转录产物电泳图M为分子量 MarkerλΠHind Ⅲ;

1. 驱动 cDNA ;2. 检测 cDNA ; 3.对照 cDNA.Fig. 3 　The mRNA reverse transcript electrophoresis

MindicatesλΠHind Ⅲmarker ;1. driver cDNA ;2. tester cDNA ; 3. control cDNA.

2. 4 　消减杂交后两次 PCR的结果分析

从图 4 看出 ,第一次 PCR 扩增的电泳带较弱 ,

第二次 PCR 扩增后可看到明显的电泳带 ,这说明消

减基因得到了富集. 消减产物经过两轮的消减杂交

和两次抑制 PCR 后扩增出了弥散的条带 ,而未消减

的扩增条带亮度大 ,说明玉米干旱诱导基因得到了

很好的均一化和差减.

图 4 　两轮 PCR 产物电泳图M为分子量 Marker DL2000 ;1～4 为阴性对照、阳性对照、未差减对照、差减杂交产物的第一次 PCR 产物 ;5～8 为差减杂交产物、未差减对照、阳性对照、阴性对照的第二次 PCR 产物.

Fig. 4 　The electrophoresis of the first and second PCR productsM. DL2000 ;Lane1～4. The first PCR products of negative control , positive con2trol , unsubtracted control and subtracted samples ;Lane5～8. The second PCR products of subtracted samples , unsub2tracted control , positive control and negative control.

2. 5 　SSH文库的质量分析

蓝白斑检测显示干旱处理 1 d 和 7 d 两个玉米

顶叶消减文库的重组率均高于 95 %. 从两个文库中

随机挑取 22 个白色克隆 (重组克隆) 进行菌落 PCR ,

观察到插入片段的大小分布在 250～850 bp 范围内 ,

主要集中在 350～600 bp 之间 (图 5) ,插入片段大小

符合要求.

图 5 　消减文库部分克隆的 PCR 扩增结果M为分子量 Marker DL2000 ;1～22 为重组质粒 PCR 产物.Fig. 5 　PCR analysis of partial clones from the subtracted library

M. DL2000 marker ; lane 1～22. PCR products from differentclones.

2. 6 　EST序列分析

对两个文库部分克隆进行测序分析. EST 序列

检索发现 ,在这两个消减文库中含有脱水素 ( de2hydrin) 、蔗糖合成酶 (Sucrose synthase 3) 、甜菜碱醛脱

氢酶 (betaine aldehyde dehydrogenase) , DRE结合因子

(DRE binding factor 1)等一批抗旱相关基因. 参照拟

南芥中基因功能分类方法 ,这些 EST 序列分类见

表 1.

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表 1 　ESTs 所代表的基因功能分类Tab. 1 　Functional classification of the ESTs of partial clones from two subtracted libraries

功能分类 干旱处理 1 d 文库 EST条数及举例 7 d 干旱处理文库 EST条数及举例

氨基酸代谢 6 ; Ferredoxin2dependent glutamate synthase , monode2hydroascorbate reductase , etc.

7 ; amino2acid N2acetyltransferase , aminotransferase ,etc.

糖类代谢 13 ; sucrose synthase 3 ,62phospho212fructokinase , etc. 12 ; sucrose synthase 3 ,carbonic anhydrase , etc.

脂类代谢 10 ; myo2inositol phosphate synthase ,acetyl2coenzyme Acarboxylase , etc.

7 ; C24 sterol methyl oxidase ,sterol2C5 (6)2desaturase ,etc.

其他代谢 9 ; S2adenosylmethionine decarboxylase , betaine alde2hyde dehydrogenase , etc.

6 ; NADPH2cytochrome P450 reductase , inorganic py2rophosphatase ,etc.

能量相关 4 ; succinic semialdehyde dehydrogenase non2photosyn2theticNADP2malic enzyme , etc.

4 ; Chlorophyll aΠb2binding protein CP29 precursor ,chlorophyll synthase , etc.

转录相关 28 ; phosphoinositide phosphatase , MADS2domain tran2scription factor zinc finger protein , etc.

19 ; BTH2induced protein phosphatase 1 , homeodomainprotein , DRE binding factor 1 (dbf1) ,etc.

蛋白合成 13 ; 30S ribosomal protein S162like , ribosomal proteinL19 , etc.

14 ; ribosomal protein S4 , 40S ribosomal protein , etc.

蛋白质加工与降解类 15 ; lectin2like protein , ubiquitin2specific protease ,etc.

16 ; 10 kDa chaperonin , aspartic proteinase , etc.

细胞信号转导 21 ; serineΠthreonine protein kinase , protein kinaseAFC3 , etc.

10 ; MAP kinase 5 , MAP kinase 4 , etc.

细胞运输相关26 ; sugar transporter , P2type ATPase Sucrose Trans2

porter , etc.14 ; sugar transporter ,plasma membrane H +2ATPase ,

etc.

细胞防御13 ; dehydrin (dhn22) ,phospholipase D heat shock 70

KD protein , etc.4 ; dehydrin (dhn22) ,heat shock protein 70 , UVB2re2

sistance protein UVR8 , etc.

亚细胞定位 10 ; WD repeat protein ,histone H2A protein , etc. 9 ; O2acetylserine ( thiol ) lyase , Lysyl2tRNA syn2thetase ,etc.

其他分类 18 ; RNA helicase , etc. 11 ; GTP2binding protein2like , etc.

未分类 103 88

总计 279 221

3 　讨论

植物在生长发育过程中 ,要受到许多不良环境

的影响. 为适应环境 ,在长期的进化中植物己逐渐

建立起适应和抗性机制. 当植物受到干旱胁迫时 ,

植物体内会产生一系列生理生化反应 ,涉及大量的

干旱胁迫反应基因的表达与调控 ,分离这些基因并

鉴定其功能 ,明确它们在植物抗旱方面的作用 ,是近

年来植物抗旱性研究的重点. cDNA microarray 和

SSH是两个能够高效高通量分离差异表达基因的方

法 ,在植物基因克隆中颇受重视. 使 cDNA microarray

技术可有效地筛选到表达差异较小的基因 ,但 cDNA

microarray 成本高且对基因序列依赖度高. SSH 是

Diatchenko 等建立的一种应用 PCR 方法的消减杂交

技术[5 ] ,设计巧妙 ,具有高度敏感性、操作简便、周期

短 ,阳性率高等突出优点 ,自 1996 年问世以来便受

到了广泛的关注 ,到目前已有很多成功报道[8 ,9 ]. 虽

然该技术的一大缺点是在建库过程中 cDNA 需要经

过限制酶消化从而得到的只是基因片段 ,但这些基

因片段可通过末端快速扩增 ( Rapid amplification of

cDNA ends , RACE) 或者 Internet 网上电子克隆快速

地得到基因的全长[10 ] . 与 cDNA microarray 相比 ,SSH

中两次 driver cDNA 均过量 ,可能会掩盖 tester cDNA

中某些有表达差别的 cDNA 而丢失一些差异较小的

基因 ,但 SSH在分离差异表达基因中不需已知基因

序列信息且具有上述的优点 ,可以认为 SSH 是高通

量分离植物抗旱基因的首选技术. 本实验结果为该

观点提供了有力证据 ,为干旱诱导的玉米差异表达

基因的高通量克隆打下了良好的基础.

本研究以开花期玉米为材料 ,分别对其进行 1 d

和 7 d 的干旱胁迫 ,构建了相应的消减文库 ,期望能

从 1 d 文库中克隆到一些植株遭受干旱后瞬时快速

上调表达的基因 ,从中筛选感应干旱胁迫和信号转

导的基因 ;期望从 7 d 文库中分离出一些参与植株

耐旱反应的效应基因 ,并在此基础上了解相关的代

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谢途径. 该方面的研究工作正在进行.

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(编辑 :于善清)

　172　　 山 　东 　大 　学 　学 　报 　(理 　学 　版) 第 41 卷 　

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