Overview

� PCR: Principi e applicazioni in genetica molecolare

� Mutation Detection Strategy:

Mutazioni puntiformi DHPLC

Delezioni/duplicazioni MLPA

L’invenzione della PCR

• Ideata da Kary Mullis nel 1983

• La prima pubblicazione è apparsa nel 1985

• Premio Nobel per la chimica nel 1995

PCR (polymerase chain reaction)

1 ciclo completo di PCR

PCR da DNAgenomico

I primers, complementari a sequenze esistenti, richiedono la

conoscenza delle sequenze fiancheggianti

55 anni faIl Progetto Genoma Umano…

Human Genome Human Genome

sea3093

95.0%

CNCs

1-3%

Genes

(exons)

1.5-2 %

~~3,080,000,0003,080,000,000 bp; ~bp; ~25,000 25,000 genesgenes

Geni umani clonati,

1.5% del genoma

Geni con mutazioni che causano malattie genetiche

6may07

24418 2036

The Human Gene Mutation Database (HGMD)

6428

915

10996

4421

990

155

681

511

3779

30412

7742

0 4000 8000 12000 16000 20000 24000 28000 32000

67030 mutations in 2478 genes

Repeat variations

Complex rearrang

Missense

Nonsense

Splicing

Regulatory

Small Insertions

Small Deletions

Small Ins/Del

Gross Ins & Dupl

Gross deletions

Sin

gle

base

pair

substitu

tions

Genome browser: Ensemble

Genome browser: UCSC

Get a sequence ready to primer design

Progettazione dei Primers

Primers That Form Dimers

• A primer may form a dimer with itself or with the other primer.

• Primer dimers can be an excellent, but unwanted, substrate for the Taq polymerase.

Primers That Form Hairpins

• A primer may be self-complementary and be able to fold into a hairpin

• The 3´ end of the primer is base-paired, preventing it annealing to the target DNA.

Bioinformatic tools: Primer3

http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm

Scelta dei Parametri

…Primer 3 output

Scelta della target region

Folding DNA prediction: mfoldhttp://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/dna-form1.cgi

Folding output

Optimising the PCR Reaction

• Annealing temperature of the primers.• The concentration of Mg2+ in the reaction.• The extension time.• (The denaturing and annealing times.)• (The extension temperature.)• (The amount of template and polymerase

— “more is less”.)

Optimising the Annealing Temperature

• Primers have a calculated annealing temperature(e.g. 54°C).

• Temperature must be confirmed practically.

• Temperature steps of 2°C above and below.

Optimising the Mg2+ Concentration

• The fidelity of the PCR depends on [Mg2+].

• Vary [Mg2+] in steps of 0.5 mM.

• Sometimes a compromise between yield and specificity.

Relazione tra Magnesio e dNTP

Aumentare la concentrazione dei dNTP richiede un adeguato aumento

delle concentrazione del Mg perche’ la reazione di PCR avvenga

Parametri fisici di PCR: numero di cicli

•La variazione di resa piu’ evidente e’ intorno ai 24 cicli; spesso 28-30x sono

sufficienti per la maggior parte degli amplimeri.

•Si ha solo un picolo guadagno aumentando il numero di cicli fino a 60x

Un esempio di mutation

detection: analisi dei geni

TSC in pazienti con diagnosi

clinica di Sclerosi Tuberosa

Tuberous Sclerosis Complex

� Autosomica dominante: frequenza 1/6000

� 2 geni malattia: TSC1 (9q34) e TSC2 (16p13)

� Sporadica (75%), familiare (25%)

� Espressione clinica molto variabile:

� da forme con chiazze ipomelanotiche e displasie corto-sottocorticali

cerebrali asintomatiche, ad epilessia, ritardo mentale, rabdomiomi cardiaci,

insufficienza renale e linfangioleiomomatosi polmonare.

� Amartoma: lesione caratteristica in diversi organi

* Quando i tuberi corticali e l’eterotopia della sostanza bianca compaiono contemporaneamente, vengono considerati un unico segno di sclerosi tuberosa** Quando sia linfangiomiomatosi che angiomiolipomi renali sono presenti, devono essere presenti anche altri segni per poter porre diagnosi di sclerosi tuberosa.

1. Angiofibromi facciali o placche fibrose

2. Fibromi ungueali o periungueali non traumatici

3. Tre o più macchie ipomelanotiche

4. Chiazze zigrinate

5. Amartomi retinici nodulari multipli

6. Tuberi corticali*

7. Noduli subependimali

8. Astrocitomi subependimali a cellule giganti

9. Rabdomiomi cardiaci, singoli o multipli

10. Linfangiomiomatosi**

11. Angiomiolipomi renali**

Segni maggiori

Criteri diagnostici di Sclerosi Tuberosa

* Quando i tuberi corticali e l’eterotopia della sostanza bianca compaiono contemporaneamente, vengono considerati un unico segno di sclerosi tuberosa

1. Difetti focali dello smalto disseminati

2. Polipi amartomatosici rettali

3. Cisti ossee

4. Eterotopia della sostanza bianca*

5. Fibromi gengivali

6. Amartomi extra renali

7. Aree ipopigmentate della retina

8. Macchie cutanee a “Coriandolo”

9. Cisti renali multiple

→ presenza di due segni maggiorio di un segno maggiore e due segni minori.

→ presenza di un segno maggiore e un segno minore.

→ presenza di un segno maggiore o due segni minori.

CERTA

PROBABILE

POSSIBILE

Segni minori

Segni TS sono età-dipendenti e non sono presenti in tutti i pazienti

Renal Cysts,

Angiomyolipomas

Facial

Angiofibromas

Peri-Ungueal

Fibromas

Hypomelanotic

maculae

Subependymal

Nodules

20 week 0 5 10 20 30 40

Cardiac

Rhabdomyomas

Cortical

Tubers

Age (years)

Giant-Cell

Astrocytoma

Prenatal

Lymphangio-

leiomyomatosis

Retinal

hamartoma

TSC1

23 esoni, 21 codificanti

8,6 kb mRNA (4,5 kb utr)

Proteina: amartina 130 kDa

TSC242 esoni, 41 codificanti

5,4 kb mRNA

Proteina: tuberina 180 kDa

TSC2

• cr. 16p13.3• 42 esoni, 41 codificanti• 5,4 kb mRNA• Proteina: tuberina 180 kDa

TSC1

• 55 kb sul cr. 9q34• 23 esoni, 21 codificanti• 8,6 kb mRNA (4,5 kb utr)• Proteina: amartina 130 kDa

Il Complesso TSC

Aumento della dimensione delle cellule nei mutanti di TSC1 o TSC2 in Drosofila

940 famiglie TSC (~ 3100 individui )da > 50 centri del Gruppo Collaborativo Italiano TSC

75 % 25 %

mut. confermata de novo

anamnest. sporadiciprobandi SPORADICI

probandi “FAMILIARI”

43 % TSC1 57 %80 % TSC2 20 %

15-7-2008

MissenseIns/delSplicingStop

Large del.

Coiled-coilHamartin interaction

Rabaptinbinding?

GAPdomain

Steroid receptorbinding?

Tuberin interaction

Rho activation

21 4 7 9 10 11 12 13 14 16 19 22 238 20 2163 5 181715

Coiled-coilself interaction

ERM binding

TSC1

TSC2

63 4 8721 5 41403938373635343332313028262524222120191817161514131211109 2723 29

15-7-2005

85 23%

285 77%

tot. mut: 370

AKT phosf.

Screening di mutazioni nei geniTSC

• Dimensione dei due geni da analizzare (64 esoni)

• Mancanza di chiari hot spot mutazionali

• Diverse tipologie di mutazioni

Protocollo in uso

DHPLC (mut. puntiformi)/sequenza dei profili HD + MLPA

(delezioni)

Sensibilita’ dell’ 85-90%

• La cromatografia in fase liquida ad alte prestazioni è una tecnica di separazionead elevata efficienza e selettività che consente di caratterizzare differenti molecole in base a specifiche caratteristiche chimiche, chimico-fisiche e steriche (dimensionali e strutturali).

HPLC:High Performance Liquid Cromatography

Advantages of DHPLC• No sample preparation, uses PCR products directly

• Automated, run 24 hours a day unattended

• Perform 450 automated analyses per day

• Per analysis cost of under $1 per sample.

Considerazioni sui costi dell’analisi

�Sequenza diretta = 6-8.50 euro

�Costo del sequenziamento diretto (64

amplimeri) = 380-540 euro

�Costo analisi dHPLC (64 amplimeri) = 64 euro

�Numero di sequenze medie per pz (dopo

dHPLC) = 3 (18-25 euro)

Risparmio per ogni probando analizzato= 375 euro circa

Anatomy of the System

Sistema cromatografico

E’ costituito da:Fase stazionaria: solida, costituita da un polimero di polistirene-divinil-benzene(diametro dei pori circa 2 micron) impaccata in una colonna cromatografica.

Fase Mobile: liquida, costituita dal solvente( di solito un tampone) che scorreattraverso la colonna.

PRC & Formazione degli HD

Interazione tra DNA e colonna cromatografica

Why denaturing HPLC…

Le cariche negative dei gruppi fosfato della molecola di DNA sono attratte dalle cariche positive dei gruppi ammonio del TEAA (controione)

Le molecole di DNA con il mismatch eluiscono prima dal

sistema cromatografico (interazione più debole)

UV Detector e data analysis

Stanford DHPLC Melt Calculator

http://insertion.stanford.edu/melt.html

Navigator melting profiles page

Frammento WT

Frammento mutato

RTm +2 64 ° C

Ctrl emizig.

MUT. POS

RTm 62 ° C

RTm 62.4 ° C

Rtm 63.8 ° C

Comportamento della molecola di DNA a diverse Rtm: esone 12 TSC2

g.1312 A>T, p.K438X

Sensibilita’ analitica: Esone 16

RTm 56.1° C

Met666Thr (t>c)wt

Met666Arg (t>g)

Gly671Arg (g>a)

ATG AAT GAA AAG GTT GGG

666 671

ACG

AGG

AGG

RTm 56.1° C

Met666Arg

Gly671Arg

Elaborazione del dato cromatografico

Met666Thr

RTm 62 ° C

867.3

g.1618 -39 c>t872.3

g.1618 -14 c>t886.3

g.1618 -14 c>t

-39 c>t

RTm 63 ° CEs. di SNP ricorrenti: esone 15 TSC1

RTm 61 ° C

Es. di mutazione: Famiglia in esone 7 TSC1

Fatherhealthy

Sonaffected

TSC1 ex07: 574delT

L191 fs> +17aa->stop

Mother healthy

Complicazione all’analisi al

dHPLC: alcuni casi particolari

il gene mutato è presente in un individuo malato, ma non in tutte le cellule o in tutti i tessuti

talvolta le cellule del sangue con la mutazione sono troppo poche per essere identificate dal test

MOSAICISMO genetico

capelli

cute

?

sangue

MOSAICISMO: quanto frequente ?

2 o più figli con la stessa mutazionee genitori sani, senza mut. nel sangue:

Mosaicismo nella linea germinale

5 su 211 famiglie ( 2-3 %)

nel genitore malato nel probando

9 / 211 (4 %) 9 / 211 (4 %)

Non tutte le cellule del sangue del genitore malato

sono mutate: Mos.Somatico18 su 211 ( 8 % )

D

F

M

64° RTm+2

Paternal Mosaicism (DHPLC pos., SEQ. neg.)

Father

Daughter affected

Motherhealthy

TSC2 ex 9

T A C C A G G

T A C N A G G

991 C>TQ325X

homoz. w.t. seq.

affected

Fam. 131

100 : 0

95 : 5

90 : 10

80 : 20

70 : 30

60 : 40

55 : 45

50 : 50

allelic ratio wt : mut

0

10

20

40

60

80

90

100

MUT cells %

100 : 0

95 : 5

90 : 10

80 : 20

70 : 30

60 : 40

55 : 45

50 : 50

allelic ratio wt : mut

ST 198 ST 177DHPLC DHPLC

Polymorphisms in the seq. recognized by theprimers must be excluded using external

primers

Mut in CISpreferential

amplification of w.t. allele

Mut in TRANS

preferential amplification of mutant allele

After amplification of a fragment of DNAcontaining the SNP, an oligonucleotide primer is annealed immediately upstream or downstream from the SNP.

In the presence of the appropriate dNTPs and ddDNTPs, the primer is extended (Sequenase) by one or more bases depending upon the sequence at the polymorphic site.

PRIMER EXTENSION

Principio della Primer Extension

C

T

21 bp

20 bp

+ ddCTP, ddTTP

CT

Reverse

A

G20 bp

G

21 bp

+ ddGTP, ddATP

A

Forward

G A

Forward Reverse

CG

A

T

Daughter131.3

Mutated allele (991 C>T)

T

A

C

G

Normal allele

Fam. 131: Mosaicism confirmed by Primer Extension

Father131.1

C

G

T A

Ricerca di delezioni

Advantages of MLPA

• Detection of copy number of 45 genomic DNA sequences in a simple to perform, PCR based, reaction.

• Requires only 20 ng human DNA

• Only a thermocycler and a sequence type electrophoresis system are required.

• Identical protocol for many different applications.

• High throughput ; Results available within 24 hrs.

• All reagents have proved to be very stable.

• Including electrophoresis, total reagent costs are < EUR 15,- / reaction.

Disadvantages of MLPA

� Reactions are more sensitive to contaminants (PCR

inhibitors e.g. phenol)

� Cannot be used to investigate single cells

� Is not a method to detect unknow point mutations

SALSA MLPA probes

• Denaturation• Hybridization• Ligation• Amplification

MLPA technique

Hybridysation & Ligation1. The MLPA probemix is added to denatured genomic

DNA2. The two parts of each probe hybridise to adjacent

target sequences3. Probes are ligated by a thermostable ligase

4. A universal primer pair is used to amplify all ligated probes.The amplification product of each probe has a unique length (130 480 bp).

Amplification

Profilo di delezione del gene MSH2

normale•

•

••

••

••

••

•

•••

•

•

deleto

Delezione esoni 2-5 del gene STK11

Non deleto (controllo)

e2e3 e4 e5

Delezione esoni 2-5 STK11

Gene MSH2: delezione esone 8

e8 Delezione esone 8MSH2

Non deleto (controllo)

Polimorfismo nell’ esone 6 (MSH2) riduce l’efficienza di ibridazione e simula una delezione

TCTCTGGCCTGCCTTGCTGAATAAGTGTAAAACCC

984C>T ligation site

1,04

1,191,07

0,99 0,99 1,01 1,04 1,08 1,111,111,100,94

0,63

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40M

SH

2 ex

4

c tr l

c r11

p13

MLH

1 ex

5

MS

H2

ex5

MLH

1 ex

6

MS

H2

ex6

MLH

1 ex

7

MS

H2

ex7

MLH

1 ex

8

MS

H2

ex8

MLH

1 ex

9

c tr l

cr17

q21

MS

H2

ex9

Sonda Media SDMSH2 ex4 1,04 0,07ctrl cr11p13 1,10 0,09MLH1 ex 5 0,94 0,04MSH2 ex5 1,11 0,06MLH1 ex6 1,19 0,10MSH2 ex6 0,63 0,09MLH1 ex7 1,07 0,04MSH2 ex7 0,99 0,03MLH1 ex8 0,99 0,05MSH2 ex8 1,01 0,05MLH1 ex9 1,04 0,04

ctrl cr17q21 1,08 0,10MSH2 ex9 1,11 0,08

conclusioni