Enrique BrandanDepartmento de Biología Celular y Molecular Facultad de Ciencias BiológicasP. Universidad Católica de Chile

Solución a las Distrofias Musculares: ¿Fantasía o Realidad?

Frontal

Mastoide

Platina

Deltoides

Pectoral

Biceps

Serratus

Recto abdominal

Abdominal

Pelvis

Abductor

Cuadriceps

Vasto lateral

Sartorio

Vasto medial

Tibial anterior

Gastronemio

Soleo

Extensor

Sistema Muscular

más de 650 músculos

HuesoPerimisio

Vaso sanguíneo

Fibra Muscular

FasciaEndomisioEpimisioTendón

Complejo Distroglicán

Extracelular

Citoplasma Membrana Plasmática

Distrofina

Laminina

Matriz Extracelular

actina

Paciente original de Duchenne

LA MÁS COMÚN DENTRO DE LAS DISTROFIAS MUSCULARES, SIENDO UNA MIOPATÍA, DE ORIGEN GENÉTICO, HEREDITARIA Y AFECTANDO A

TODAS LAS RAZAS.

INCIDENCIA 1 EN 3500 NIÑOS.

FATAL EN LA SEGUNDA A TERCERA DECADA DE EDAD.

CICLOS REPETIDOS DE NECROSIS Y REGENERACION, PROGRESIVA DEBILADAD MUSCULAR Y FIBROSIS.

DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE

CONTROL

2años 5 años 10 años

DMD

Hombros ybrazos hacia atrásal caminar

Lomo hundido

Músculos traserosdébiles

Rodillas doblanhacia atrás

Musculatura inferiorgruesa (grasa y débil)

Contractura talón

Musculatura débilfrente piernas contractura puntade pies

Caminartorpe

Mal equilibriocaídas a menudo

Muslos delgadosy débiles

Vientre hacia afuera; musculaturaabdominal débil

Laminina-2

Matriz Extracelular

sarcolema

C

Ndistrofina

actina

-distroglican

a-distroglican

distrofina

distrofina núcleos

distroglicán

fibronectina

laminina

FORMACION Y REGENERACION DEL MUSCULO ESQUELETICO

músculo esquelético

fibrosis

Regeneraciónmuscular

diferenciación (miogenina)

Activación precursores

Músculo esquelético (células satélite)

daño

degeneraciónde la fibra

liberación de señalesintracelulares

inflamación

C2C12 myoblats(satellite cells derived)

Miogenina

Mioblastos Miotubos

Miosina

Fibra muscularaislada

Modelo Experimental de Regeneración Muscular

Daño Tóxico

Inyección de BaCl2 Tibialis Anterior (TA),

C57BL/6 wild-type

control 3 días 5 días 10 días

Control

3 días

5 días

10 días

Distrofia muscularde cintura

Distrofia muscularde nacimiento

Miopatíacongénita

Miopatía deMiyoshi

Mutaciones o Ausencia de Proteínas Específicas del Músculo Esquelético Producen Diferentes Distrofias

Distrofia MuscularDuchenne/Becker

Ratón mdx

Modelo Animal de Distrofia Muscular de Duchenne (mdx)

ECM

Laminina

sarcolema

C

Ndistrofinaactina

-distroglican

-distroglican

Normal mdx

distrofina

mdx 2 s 8 snormal 16 s

diafragma 12 s

diafragma mdx 12 s

TERAPIAS MOLECULARES, CELULARES Y FARMACOLOGICASPARA LA DISTROFIAS MUSCULARES

Terapia reemplazo de genes• células madres• células satélites• células derivadas de médula ósea (SP)• entrega de mini-genes contenidos en AV• Lentivirus • células genéticamente modificadas, permeables a la circulación

Manipulación ADN/ARN • oligos anti-sense• salto de exones

Reactivos farmacológicos• drogas que inducen den de utrofina• entrega viral de factores de crecimiento• IGF-1• miostatina• reactivos anti-inflamatorios• inhibidores de proteasas

Terapia reemplazo de genes• células madres• células satélites (SP• células derivadas de médula ósea (SP)• entrega de mini-genes contenidos en AV• Lentivirus• células genéticamente modificadas permeables a la circulación

Manipulación ADN/ARN • oligos anti-sense• salto de exones

Reactivos farmacológicos• drogas que inducen den de utrofina• entrega viral de factores de crecimiento• IGF-1• miostatina• reactivos anti-inflamatorios• inhibidores de proteasas

• Células aisladas de médula ósea de un ratón transgénico LacZ (células azul) bajo el control de un promotor músculo específico

• Músculos inducidos a regenerar y evaluados por células azules a 1, 2 y 3 semanas

• Células aisladas de médula ósea de un ratón transgénico LacZ (células azul) bajo el control de un promotor músculo específico

• Músculos inducidos a regenerar y evaluados por células azules a 1, 2 y 3 semanas

Mioblastos LacZtransplantados a primordios de las alas de un pollo,van a territorio muscular

mioblastos

miosina

mioblastos + miosina

Distrofia muscularde cintura

Distrofia muscularde nacimiento

Miopatíacongénita

Miopatía deMiyoshi Distrofia Muscular

Duchenne/Becker

Mutaciones o Ausencia de Proteínas Específicas del Músculo Esquelético Producen Diferentes Distrofias

Ratón transgénico que expresa una agrina modificada que reemplaza a laminina para la cura de la distrofia muscular congénita

Laminina normalune -distroglican y tiene sitio de unión Por la proteína agrina

En la distrofia muscular de nacimiento (congénita) se expresa una laminina con poca afinidad por -distroglican pero si por agrina

Agrina se modifico para que una además a -distroglican

Complejo Distroglicán

Extracelular

Citoplasma Membrana Plasmática

Distrofina

Laminina

Matriz Extracelular

actina

Agrina se modifico para que una además a -distroglican

Sitio de unión por -distroglicán

Sitio de unión a laminina

Agrina

Ratón transgénico que expresa una agrina modificada que reemplaza a laminina para la cura de la distrofia muscular congénita

Distrofia muscularde cintura

Distrofia muscularde nacimiento

Miopatíacongénita

Miopatía deMiyoshi Distrofia Muscular

Duchenne/Becker

Mutaciones o Ausencia de Proteínas Específicas del Músculo Esquelético Producen Diferentes Distrofias

WT

mdx

• Distrofina; 427.000 daltons (3685 aa)• Difícil poner en un virus• Becker distrofia mas suave que Duchenne• Contrucción de microdistrofina similar a Becker• Introducirla en un virus

mdx

wt

mdx

mdx

Distrofia muscularde cintura

Distrofia muscularde nacimiento

Miopatíacongénita

Miopatía deMiyoshi Distrofia Muscular

Duchenne/Becker

Mutaciones o Ausencia de Proteínas Específicas del Músculo Esquelético Producen Diferentes Distrofias

Terapia utilizando mensiaglobastos genéticamente modificados

13

5

Virus que contiene micro-distrofina infecta mensiangoblastos del perro distrófico para su amplificación

gen micro-distrofina

Mensangioblastos se cultivanVaso sanguíneo (intrasistémico)

micro-distrofina se introduce a un virus atenuado

Se evalúa el músculo y la capacidad de generar fuerza

2

4

6

….el futuro………

Problemas:

• Fibrosis• Inmunocompatibilidad• Demasiados territorios• Inflamación

Solución:

Continuar la investigación básica que genere el conocimiento necesario pararealizar aproximaciones experimentales que impliquen estrategias combinadas, evaluando el potencial impacto beneficioso de éstas en ensayos preclínicos

….el futuro………

Problemas:

• Fibrosis• Inmunocompatibilidad• Demasiados territorios• Inflamación