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MC Mg Sandro Casavilca ZambranoPatoacutelogo Oncoacutelogo
Profesor Facultad de Medicina UNMSMServicio de Patologiacutea Quiruacutergica
Departamento de PatologiacuteaINEN
Consultoriacutea de Tumores de Piel y SNC
Subconjuntos moleculares en el Melanoma
ESTADIOS CLINICOS
Estadio 0 Tis N0 Mo Estadio IA Tla N0 M0 Estadio IB Tlb N0 M0 T2a N0 M0 Estadio IIA T2b N0 M0 T3a N0 M0 Estadio IIB T3b N0 M0 T4a N0 M0 Estadio IIC T4b N0 M0 Estadio III Any T N1 M0 Any T N2 M0 Any T N3 M0 Estadio IV Any T Any N M1
BRA-Fbull Nombre v-raf murine sarcoma viral
oncogene homolog B
bull Locus 7q34
bull Serina treonina quinasa
bull BRAF se expresa maacutes alto en los tejidos neuronales y melanocitos
bull MEK es el uacutenico sustrato conocido Divisioacuten celular y diferenciacioacuten celular
RAS-RAF Pathway in Melanoma
ERKERK
BRAF
RAS activado
Normal cell proliferation and survival
MEK
P
Transduccioacuten de sentildealesOncogen BRAF
Transduccioacuten de sentildealesRAS-RAF normal
-Sentildeal decrecimiento
RTK
MutatedBRAF
Excessive cell proliferation and survival
MEK
RAS-GTP
bull Activacioacuten constitutiva es independiente a los
bull Factores extracelulares
bull No responde a la sentildeales de regulacioacuten normales
P
P P
BRAF = rapidly accelerated fibrosarcoma isoform B ERK = extracellular signal―regulated kinase GTP = guanosine triphosphate MEK = mitogen-activated protein kinase (MAPK) or ERK kinase P = phosphate RTK = receptor tyrosine kinase
8
Mutaciones del BRAF afectanla actividad quinasa
Estructura terciaria del BRAF quinasa
Posicioacuten 600
Segmento de activacioacuten
Sitio de unioacuten al ATP
adapted from Garnett MJ et al)
Todas las mutaciones analizadas en el V600 se clasifican como mutantes de alta actividad en comparacioacuten con BRAF nativo
D Aspaacutertico E Glutaacutemico K Lisina R Arginina
Sustitucioacuten de valina por glutamato
T1796A (Codon 600 Exon 15)
BRAFV600E
BRAF = rapidly accelerated fibrosarcoma isoform B E = glutamate UV = ultraviolet RAS-RAF = rat sarcoma-rapidly accelerated fibrosarcoma WT = wild-type
10
BRAFWTmdashINACTIVE326
BRAFWTmdashACTIVATED by addition of negatively charged phosphates25
BRAFV600EmdashCONSTITUTIVELY ACTIVATED by negatively charged glutamate (E)24
Mutaciones BRAF en Melanoma
No formacioacuten de nidos
Formacioacuten de nidos extensivos
Grading of cellular morphological features Examples indicate the extent of nesting cell shape and pigmentation (adapted from Viros A et al)21
Improving melanoma classification by integrating genetic and morphologic features Viros A et al PLoS Med 2008 Jun 35(6)e120
Improving melanoma classification by integrating genetic and morphologic features Viros A et al PLoS Med 2008 Jun 35(6)e120
Improving melanoma classification by integrating genetic and morphologic features Viros A et al PLoS Med 2008 Jun 35(6)e120
Teacutecnicas Moleculares
PCR Polymerase Chain Reaction PCR-RFLPRestriction Fragment Length
Polymorphism LCR Ligase Chain Reaction TMA Transcription-mediated amplification NASBA Nucleic acid sequence-based
amplification
PCR
Karan K Sra MDa Gisela Torres MD Molecular diagnosis of infectious diseases in dermatology Journal of American Academy of Dermatology NOVEMBER 2005-749765
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
La prueba se basa en dos procesos baacutesicos
bullPreparacioacuten manual de las muestras para obtener ADN genoacutemico a partir de FFPET y
bullAmplificacioacuten y deteccioacuten del ADN objetivo mediante PCR y pares de cebadores (primers) complementarios y sondas oligonucleoacutetidas con marcadores fluorescentes
Test de mutacioacuten BRAF-V600E
Biopsia escisional incisional o punch
Fijado con formalina al 10 tamponada miacutenimo 24 horas maacuteximo 48 horas Embebido en parafina (biopsia del tumor)
Seccionado para su revisioacuten histoloacutegica y coloracioacuten con HE
El patoacutelogo revisa la seccioacuten del tumor en busca de tejido patoloacutegico y emite su diagnoacutestico
La muestra analizada es enviada al laboratorio para la extraccioacuten del ADN y realizacioacuten del PCR
Manejo del especien quiruacutergico
Establecer normas baacutesicas para el enviacuteo de muestras al laboratorio de patologiacutea
Requisitos del espeacutecimen Fijacioacuten tisular Macroscopiacutea
Fijacioacuten tisular
Interrumpe los fenoacutemenos degradativos
En histotecnologiacutea cualquier defecto o error puede ser subsanado excepto los cometidos durante el proceso de fijacioacuten
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Fijador Formol tamponado al 10
-Formaldehiacutedo al 37 ndash 40100cc -Agua destiladahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip900cc -Fosfato de sodio dibaacutesico anhidrohellip65 g -Fosfato de sodio monobaacutesico monohidratadohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 g
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Frascos de plaacutestico con boca ancha y tapa hermeacutetica
Voluacutemen de formol Tiempo de exposicioacuten de la muestra al medio
ambiente (sin fijador) Muestra hemorraacutegica lavar con solucioacuten
salina Tiempo de fijacioacuten
Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
Coleccioacuten y Almacenamiento de la muestra
Resumen de las Caracteriacutesticas de la muestra
bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
HERRAMIENTA AUXILIAR QUE UTILIZA EL PATOLOGO PARA Diagnoacutestico PronoacutesticoTratamiento
MORFOLOGIA CLINICA iexcliexclUNA FIJACION ADECUADA Y UN
BUEN PROCESAMIENTO TECNICO
GRACIAS
Subconjuntos moleculares en el Melanoma
ESTADIOS CLINICOS
Estadio 0 Tis N0 Mo Estadio IA Tla N0 M0 Estadio IB Tlb N0 M0 T2a N0 M0 Estadio IIA T2b N0 M0 T3a N0 M0 Estadio IIB T3b N0 M0 T4a N0 M0 Estadio IIC T4b N0 M0 Estadio III Any T N1 M0 Any T N2 M0 Any T N3 M0 Estadio IV Any T Any N M1
BRA-Fbull Nombre v-raf murine sarcoma viral
oncogene homolog B
bull Locus 7q34
bull Serina treonina quinasa
bull BRAF se expresa maacutes alto en los tejidos neuronales y melanocitos
bull MEK es el uacutenico sustrato conocido Divisioacuten celular y diferenciacioacuten celular
RAS-RAF Pathway in Melanoma
ERKERK
BRAF
RAS activado
Normal cell proliferation and survival
MEK
P
Transduccioacuten de sentildealesOncogen BRAF
Transduccioacuten de sentildealesRAS-RAF normal
-Sentildeal decrecimiento
RTK
MutatedBRAF
Excessive cell proliferation and survival
MEK
RAS-GTP
bull Activacioacuten constitutiva es independiente a los
bull Factores extracelulares
bull No responde a la sentildeales de regulacioacuten normales
P
P P
BRAF = rapidly accelerated fibrosarcoma isoform B ERK = extracellular signal―regulated kinase GTP = guanosine triphosphate MEK = mitogen-activated protein kinase (MAPK) or ERK kinase P = phosphate RTK = receptor tyrosine kinase
8
Mutaciones del BRAF afectanla actividad quinasa
Estructura terciaria del BRAF quinasa
Posicioacuten 600
Segmento de activacioacuten
Sitio de unioacuten al ATP
adapted from Garnett MJ et al)
Todas las mutaciones analizadas en el V600 se clasifican como mutantes de alta actividad en comparacioacuten con BRAF nativo
D Aspaacutertico E Glutaacutemico K Lisina R Arginina
Sustitucioacuten de valina por glutamato
T1796A (Codon 600 Exon 15)
BRAFV600E
BRAF = rapidly accelerated fibrosarcoma isoform B E = glutamate UV = ultraviolet RAS-RAF = rat sarcoma-rapidly accelerated fibrosarcoma WT = wild-type
10
BRAFWTmdashINACTIVE326
BRAFWTmdashACTIVATED by addition of negatively charged phosphates25
BRAFV600EmdashCONSTITUTIVELY ACTIVATED by negatively charged glutamate (E)24
Mutaciones BRAF en Melanoma
No formacioacuten de nidos
Formacioacuten de nidos extensivos
Grading of cellular morphological features Examples indicate the extent of nesting cell shape and pigmentation (adapted from Viros A et al)21
Improving melanoma classification by integrating genetic and morphologic features Viros A et al PLoS Med 2008 Jun 35(6)e120
Improving melanoma classification by integrating genetic and morphologic features Viros A et al PLoS Med 2008 Jun 35(6)e120
Improving melanoma classification by integrating genetic and morphologic features Viros A et al PLoS Med 2008 Jun 35(6)e120
Teacutecnicas Moleculares
PCR Polymerase Chain Reaction PCR-RFLPRestriction Fragment Length
Polymorphism LCR Ligase Chain Reaction TMA Transcription-mediated amplification NASBA Nucleic acid sequence-based
amplification
PCR
Karan K Sra MDa Gisela Torres MD Molecular diagnosis of infectious diseases in dermatology Journal of American Academy of Dermatology NOVEMBER 2005-749765
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
La prueba se basa en dos procesos baacutesicos
bullPreparacioacuten manual de las muestras para obtener ADN genoacutemico a partir de FFPET y
bullAmplificacioacuten y deteccioacuten del ADN objetivo mediante PCR y pares de cebadores (primers) complementarios y sondas oligonucleoacutetidas con marcadores fluorescentes
Test de mutacioacuten BRAF-V600E
Biopsia escisional incisional o punch
Fijado con formalina al 10 tamponada miacutenimo 24 horas maacuteximo 48 horas Embebido en parafina (biopsia del tumor)
Seccionado para su revisioacuten histoloacutegica y coloracioacuten con HE
El patoacutelogo revisa la seccioacuten del tumor en busca de tejido patoloacutegico y emite su diagnoacutestico
La muestra analizada es enviada al laboratorio para la extraccioacuten del ADN y realizacioacuten del PCR
Manejo del especien quiruacutergico
Establecer normas baacutesicas para el enviacuteo de muestras al laboratorio de patologiacutea
Requisitos del espeacutecimen Fijacioacuten tisular Macroscopiacutea
Fijacioacuten tisular
Interrumpe los fenoacutemenos degradativos
En histotecnologiacutea cualquier defecto o error puede ser subsanado excepto los cometidos durante el proceso de fijacioacuten
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Fijador Formol tamponado al 10
-Formaldehiacutedo al 37 ndash 40100cc -Agua destiladahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip900cc -Fosfato de sodio dibaacutesico anhidrohellip65 g -Fosfato de sodio monobaacutesico monohidratadohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 g
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Frascos de plaacutestico con boca ancha y tapa hermeacutetica
Voluacutemen de formol Tiempo de exposicioacuten de la muestra al medio
ambiente (sin fijador) Muestra hemorraacutegica lavar con solucioacuten
salina Tiempo de fijacioacuten
Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
Coleccioacuten y Almacenamiento de la muestra
Resumen de las Caracteriacutesticas de la muestra
bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
HERRAMIENTA AUXILIAR QUE UTILIZA EL PATOLOGO PARA Diagnoacutestico PronoacutesticoTratamiento
MORFOLOGIA CLINICA iexcliexclUNA FIJACION ADECUADA Y UN
BUEN PROCESAMIENTO TECNICO
GRACIAS
ESTADIOS CLINICOS
Estadio 0 Tis N0 Mo Estadio IA Tla N0 M0 Estadio IB Tlb N0 M0 T2a N0 M0 Estadio IIA T2b N0 M0 T3a N0 M0 Estadio IIB T3b N0 M0 T4a N0 M0 Estadio IIC T4b N0 M0 Estadio III Any T N1 M0 Any T N2 M0 Any T N3 M0 Estadio IV Any T Any N M1
BRA-Fbull Nombre v-raf murine sarcoma viral
oncogene homolog B
bull Locus 7q34
bull Serina treonina quinasa
bull BRAF se expresa maacutes alto en los tejidos neuronales y melanocitos
bull MEK es el uacutenico sustrato conocido Divisioacuten celular y diferenciacioacuten celular
RAS-RAF Pathway in Melanoma
ERKERK
BRAF
RAS activado
Normal cell proliferation and survival
MEK
P
Transduccioacuten de sentildealesOncogen BRAF
Transduccioacuten de sentildealesRAS-RAF normal
-Sentildeal decrecimiento
RTK
MutatedBRAF
Excessive cell proliferation and survival
MEK
RAS-GTP
bull Activacioacuten constitutiva es independiente a los
bull Factores extracelulares
bull No responde a la sentildeales de regulacioacuten normales
P
P P
BRAF = rapidly accelerated fibrosarcoma isoform B ERK = extracellular signal―regulated kinase GTP = guanosine triphosphate MEK = mitogen-activated protein kinase (MAPK) or ERK kinase P = phosphate RTK = receptor tyrosine kinase
8
Mutaciones del BRAF afectanla actividad quinasa
Estructura terciaria del BRAF quinasa
Posicioacuten 600
Segmento de activacioacuten
Sitio de unioacuten al ATP
adapted from Garnett MJ et al)
Todas las mutaciones analizadas en el V600 se clasifican como mutantes de alta actividad en comparacioacuten con BRAF nativo
D Aspaacutertico E Glutaacutemico K Lisina R Arginina
Sustitucioacuten de valina por glutamato
T1796A (Codon 600 Exon 15)
BRAFV600E
BRAF = rapidly accelerated fibrosarcoma isoform B E = glutamate UV = ultraviolet RAS-RAF = rat sarcoma-rapidly accelerated fibrosarcoma WT = wild-type
10
BRAFWTmdashINACTIVE326
BRAFWTmdashACTIVATED by addition of negatively charged phosphates25
BRAFV600EmdashCONSTITUTIVELY ACTIVATED by negatively charged glutamate (E)24
Mutaciones BRAF en Melanoma
No formacioacuten de nidos
Formacioacuten de nidos extensivos
Grading of cellular morphological features Examples indicate the extent of nesting cell shape and pigmentation (adapted from Viros A et al)21
Improving melanoma classification by integrating genetic and morphologic features Viros A et al PLoS Med 2008 Jun 35(6)e120
Improving melanoma classification by integrating genetic and morphologic features Viros A et al PLoS Med 2008 Jun 35(6)e120
Improving melanoma classification by integrating genetic and morphologic features Viros A et al PLoS Med 2008 Jun 35(6)e120
Teacutecnicas Moleculares
PCR Polymerase Chain Reaction PCR-RFLPRestriction Fragment Length
Polymorphism LCR Ligase Chain Reaction TMA Transcription-mediated amplification NASBA Nucleic acid sequence-based
amplification
PCR
Karan K Sra MDa Gisela Torres MD Molecular diagnosis of infectious diseases in dermatology Journal of American Academy of Dermatology NOVEMBER 2005-749765
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
La prueba se basa en dos procesos baacutesicos
bullPreparacioacuten manual de las muestras para obtener ADN genoacutemico a partir de FFPET y
bullAmplificacioacuten y deteccioacuten del ADN objetivo mediante PCR y pares de cebadores (primers) complementarios y sondas oligonucleoacutetidas con marcadores fluorescentes
Test de mutacioacuten BRAF-V600E
Biopsia escisional incisional o punch
Fijado con formalina al 10 tamponada miacutenimo 24 horas maacuteximo 48 horas Embebido en parafina (biopsia del tumor)
Seccionado para su revisioacuten histoloacutegica y coloracioacuten con HE
El patoacutelogo revisa la seccioacuten del tumor en busca de tejido patoloacutegico y emite su diagnoacutestico
La muestra analizada es enviada al laboratorio para la extraccioacuten del ADN y realizacioacuten del PCR
Manejo del especien quiruacutergico
Establecer normas baacutesicas para el enviacuteo de muestras al laboratorio de patologiacutea
Requisitos del espeacutecimen Fijacioacuten tisular Macroscopiacutea
Fijacioacuten tisular
Interrumpe los fenoacutemenos degradativos
En histotecnologiacutea cualquier defecto o error puede ser subsanado excepto los cometidos durante el proceso de fijacioacuten
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Fijador Formol tamponado al 10
-Formaldehiacutedo al 37 ndash 40100cc -Agua destiladahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip900cc -Fosfato de sodio dibaacutesico anhidrohellip65 g -Fosfato de sodio monobaacutesico monohidratadohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 g
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Frascos de plaacutestico con boca ancha y tapa hermeacutetica
Voluacutemen de formol Tiempo de exposicioacuten de la muestra al medio
ambiente (sin fijador) Muestra hemorraacutegica lavar con solucioacuten
salina Tiempo de fijacioacuten
Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
Coleccioacuten y Almacenamiento de la muestra
Resumen de las Caracteriacutesticas de la muestra
bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
HERRAMIENTA AUXILIAR QUE UTILIZA EL PATOLOGO PARA Diagnoacutestico PronoacutesticoTratamiento
MORFOLOGIA CLINICA iexcliexclUNA FIJACION ADECUADA Y UN
BUEN PROCESAMIENTO TECNICO
GRACIAS
BRA-Fbull Nombre v-raf murine sarcoma viral
oncogene homolog B
bull Locus 7q34
bull Serina treonina quinasa
bull BRAF se expresa maacutes alto en los tejidos neuronales y melanocitos
bull MEK es el uacutenico sustrato conocido Divisioacuten celular y diferenciacioacuten celular
RAS-RAF Pathway in Melanoma
ERKERK
BRAF
RAS activado
Normal cell proliferation and survival
MEK
P
Transduccioacuten de sentildealesOncogen BRAF
Transduccioacuten de sentildealesRAS-RAF normal
-Sentildeal decrecimiento
RTK
MutatedBRAF
Excessive cell proliferation and survival
MEK
RAS-GTP
bull Activacioacuten constitutiva es independiente a los
bull Factores extracelulares
bull No responde a la sentildeales de regulacioacuten normales
P
P P
BRAF = rapidly accelerated fibrosarcoma isoform B ERK = extracellular signal―regulated kinase GTP = guanosine triphosphate MEK = mitogen-activated protein kinase (MAPK) or ERK kinase P = phosphate RTK = receptor tyrosine kinase
8
Mutaciones del BRAF afectanla actividad quinasa
Estructura terciaria del BRAF quinasa
Posicioacuten 600
Segmento de activacioacuten
Sitio de unioacuten al ATP
adapted from Garnett MJ et al)
Todas las mutaciones analizadas en el V600 se clasifican como mutantes de alta actividad en comparacioacuten con BRAF nativo
D Aspaacutertico E Glutaacutemico K Lisina R Arginina
Sustitucioacuten de valina por glutamato
T1796A (Codon 600 Exon 15)
BRAFV600E
BRAF = rapidly accelerated fibrosarcoma isoform B E = glutamate UV = ultraviolet RAS-RAF = rat sarcoma-rapidly accelerated fibrosarcoma WT = wild-type
10
BRAFWTmdashINACTIVE326
BRAFWTmdashACTIVATED by addition of negatively charged phosphates25
BRAFV600EmdashCONSTITUTIVELY ACTIVATED by negatively charged glutamate (E)24
Mutaciones BRAF en Melanoma
No formacioacuten de nidos
Formacioacuten de nidos extensivos
Grading of cellular morphological features Examples indicate the extent of nesting cell shape and pigmentation (adapted from Viros A et al)21
Improving melanoma classification by integrating genetic and morphologic features Viros A et al PLoS Med 2008 Jun 35(6)e120
Improving melanoma classification by integrating genetic and morphologic features Viros A et al PLoS Med 2008 Jun 35(6)e120
Improving melanoma classification by integrating genetic and morphologic features Viros A et al PLoS Med 2008 Jun 35(6)e120
Teacutecnicas Moleculares
PCR Polymerase Chain Reaction PCR-RFLPRestriction Fragment Length
Polymorphism LCR Ligase Chain Reaction TMA Transcription-mediated amplification NASBA Nucleic acid sequence-based
amplification
PCR
Karan K Sra MDa Gisela Torres MD Molecular diagnosis of infectious diseases in dermatology Journal of American Academy of Dermatology NOVEMBER 2005-749765
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
La prueba se basa en dos procesos baacutesicos
bullPreparacioacuten manual de las muestras para obtener ADN genoacutemico a partir de FFPET y
bullAmplificacioacuten y deteccioacuten del ADN objetivo mediante PCR y pares de cebadores (primers) complementarios y sondas oligonucleoacutetidas con marcadores fluorescentes
Test de mutacioacuten BRAF-V600E
Biopsia escisional incisional o punch
Fijado con formalina al 10 tamponada miacutenimo 24 horas maacuteximo 48 horas Embebido en parafina (biopsia del tumor)
Seccionado para su revisioacuten histoloacutegica y coloracioacuten con HE
El patoacutelogo revisa la seccioacuten del tumor en busca de tejido patoloacutegico y emite su diagnoacutestico
La muestra analizada es enviada al laboratorio para la extraccioacuten del ADN y realizacioacuten del PCR
Manejo del especien quiruacutergico
Establecer normas baacutesicas para el enviacuteo de muestras al laboratorio de patologiacutea
Requisitos del espeacutecimen Fijacioacuten tisular Macroscopiacutea
Fijacioacuten tisular
Interrumpe los fenoacutemenos degradativos
En histotecnologiacutea cualquier defecto o error puede ser subsanado excepto los cometidos durante el proceso de fijacioacuten
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Fijador Formol tamponado al 10
-Formaldehiacutedo al 37 ndash 40100cc -Agua destiladahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip900cc -Fosfato de sodio dibaacutesico anhidrohellip65 g -Fosfato de sodio monobaacutesico monohidratadohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 g
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Frascos de plaacutestico con boca ancha y tapa hermeacutetica
Voluacutemen de formol Tiempo de exposicioacuten de la muestra al medio
ambiente (sin fijador) Muestra hemorraacutegica lavar con solucioacuten
salina Tiempo de fijacioacuten
Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
Coleccioacuten y Almacenamiento de la muestra
Resumen de las Caracteriacutesticas de la muestra
bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
HERRAMIENTA AUXILIAR QUE UTILIZA EL PATOLOGO PARA Diagnoacutestico PronoacutesticoTratamiento
MORFOLOGIA CLINICA iexcliexclUNA FIJACION ADECUADA Y UN
BUEN PROCESAMIENTO TECNICO
GRACIAS
RAS-RAF Pathway in Melanoma
ERKERK
BRAF
RAS activado
Normal cell proliferation and survival
MEK
P
Transduccioacuten de sentildealesOncogen BRAF
Transduccioacuten de sentildealesRAS-RAF normal
-Sentildeal decrecimiento
RTK
MutatedBRAF
Excessive cell proliferation and survival
MEK
RAS-GTP
bull Activacioacuten constitutiva es independiente a los
bull Factores extracelulares
bull No responde a la sentildeales de regulacioacuten normales
P
P P
BRAF = rapidly accelerated fibrosarcoma isoform B ERK = extracellular signal―regulated kinase GTP = guanosine triphosphate MEK = mitogen-activated protein kinase (MAPK) or ERK kinase P = phosphate RTK = receptor tyrosine kinase
8
Mutaciones del BRAF afectanla actividad quinasa
Estructura terciaria del BRAF quinasa
Posicioacuten 600
Segmento de activacioacuten
Sitio de unioacuten al ATP
adapted from Garnett MJ et al)
Todas las mutaciones analizadas en el V600 se clasifican como mutantes de alta actividad en comparacioacuten con BRAF nativo
D Aspaacutertico E Glutaacutemico K Lisina R Arginina
Sustitucioacuten de valina por glutamato
T1796A (Codon 600 Exon 15)
BRAFV600E
BRAF = rapidly accelerated fibrosarcoma isoform B E = glutamate UV = ultraviolet RAS-RAF = rat sarcoma-rapidly accelerated fibrosarcoma WT = wild-type
10
BRAFWTmdashINACTIVE326
BRAFWTmdashACTIVATED by addition of negatively charged phosphates25
BRAFV600EmdashCONSTITUTIVELY ACTIVATED by negatively charged glutamate (E)24
Mutaciones BRAF en Melanoma
No formacioacuten de nidos
Formacioacuten de nidos extensivos
Grading of cellular morphological features Examples indicate the extent of nesting cell shape and pigmentation (adapted from Viros A et al)21
Improving melanoma classification by integrating genetic and morphologic features Viros A et al PLoS Med 2008 Jun 35(6)e120
Improving melanoma classification by integrating genetic and morphologic features Viros A et al PLoS Med 2008 Jun 35(6)e120
Improving melanoma classification by integrating genetic and morphologic features Viros A et al PLoS Med 2008 Jun 35(6)e120
Teacutecnicas Moleculares
PCR Polymerase Chain Reaction PCR-RFLPRestriction Fragment Length
Polymorphism LCR Ligase Chain Reaction TMA Transcription-mediated amplification NASBA Nucleic acid sequence-based
amplification
PCR
Karan K Sra MDa Gisela Torres MD Molecular diagnosis of infectious diseases in dermatology Journal of American Academy of Dermatology NOVEMBER 2005-749765
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
La prueba se basa en dos procesos baacutesicos
bullPreparacioacuten manual de las muestras para obtener ADN genoacutemico a partir de FFPET y
bullAmplificacioacuten y deteccioacuten del ADN objetivo mediante PCR y pares de cebadores (primers) complementarios y sondas oligonucleoacutetidas con marcadores fluorescentes
Test de mutacioacuten BRAF-V600E
Biopsia escisional incisional o punch
Fijado con formalina al 10 tamponada miacutenimo 24 horas maacuteximo 48 horas Embebido en parafina (biopsia del tumor)
Seccionado para su revisioacuten histoloacutegica y coloracioacuten con HE
El patoacutelogo revisa la seccioacuten del tumor en busca de tejido patoloacutegico y emite su diagnoacutestico
La muestra analizada es enviada al laboratorio para la extraccioacuten del ADN y realizacioacuten del PCR
Manejo del especien quiruacutergico
Establecer normas baacutesicas para el enviacuteo de muestras al laboratorio de patologiacutea
Requisitos del espeacutecimen Fijacioacuten tisular Macroscopiacutea
Fijacioacuten tisular
Interrumpe los fenoacutemenos degradativos
En histotecnologiacutea cualquier defecto o error puede ser subsanado excepto los cometidos durante el proceso de fijacioacuten
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Fijador Formol tamponado al 10
-Formaldehiacutedo al 37 ndash 40100cc -Agua destiladahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip900cc -Fosfato de sodio dibaacutesico anhidrohellip65 g -Fosfato de sodio monobaacutesico monohidratadohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 g
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Frascos de plaacutestico con boca ancha y tapa hermeacutetica
Voluacutemen de formol Tiempo de exposicioacuten de la muestra al medio
ambiente (sin fijador) Muestra hemorraacutegica lavar con solucioacuten
salina Tiempo de fijacioacuten
Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
Coleccioacuten y Almacenamiento de la muestra
Resumen de las Caracteriacutesticas de la muestra
bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
HERRAMIENTA AUXILIAR QUE UTILIZA EL PATOLOGO PARA Diagnoacutestico PronoacutesticoTratamiento
MORFOLOGIA CLINICA iexcliexclUNA FIJACION ADECUADA Y UN
BUEN PROCESAMIENTO TECNICO
GRACIAS
Mutaciones del BRAF afectanla actividad quinasa
Estructura terciaria del BRAF quinasa
Posicioacuten 600
Segmento de activacioacuten
Sitio de unioacuten al ATP
adapted from Garnett MJ et al)
Todas las mutaciones analizadas en el V600 se clasifican como mutantes de alta actividad en comparacioacuten con BRAF nativo
D Aspaacutertico E Glutaacutemico K Lisina R Arginina
Sustitucioacuten de valina por glutamato
T1796A (Codon 600 Exon 15)
BRAFV600E
BRAF = rapidly accelerated fibrosarcoma isoform B E = glutamate UV = ultraviolet RAS-RAF = rat sarcoma-rapidly accelerated fibrosarcoma WT = wild-type
10
BRAFWTmdashINACTIVE326
BRAFWTmdashACTIVATED by addition of negatively charged phosphates25
BRAFV600EmdashCONSTITUTIVELY ACTIVATED by negatively charged glutamate (E)24
Mutaciones BRAF en Melanoma
No formacioacuten de nidos
Formacioacuten de nidos extensivos
Grading of cellular morphological features Examples indicate the extent of nesting cell shape and pigmentation (adapted from Viros A et al)21
Improving melanoma classification by integrating genetic and morphologic features Viros A et al PLoS Med 2008 Jun 35(6)e120
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Teacutecnicas Moleculares
PCR Polymerase Chain Reaction PCR-RFLPRestriction Fragment Length
Polymorphism LCR Ligase Chain Reaction TMA Transcription-mediated amplification NASBA Nucleic acid sequence-based
amplification
PCR
Karan K Sra MDa Gisela Torres MD Molecular diagnosis of infectious diseases in dermatology Journal of American Academy of Dermatology NOVEMBER 2005-749765
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
La prueba se basa en dos procesos baacutesicos
bullPreparacioacuten manual de las muestras para obtener ADN genoacutemico a partir de FFPET y
bullAmplificacioacuten y deteccioacuten del ADN objetivo mediante PCR y pares de cebadores (primers) complementarios y sondas oligonucleoacutetidas con marcadores fluorescentes
Test de mutacioacuten BRAF-V600E
Biopsia escisional incisional o punch
Fijado con formalina al 10 tamponada miacutenimo 24 horas maacuteximo 48 horas Embebido en parafina (biopsia del tumor)
Seccionado para su revisioacuten histoloacutegica y coloracioacuten con HE
El patoacutelogo revisa la seccioacuten del tumor en busca de tejido patoloacutegico y emite su diagnoacutestico
La muestra analizada es enviada al laboratorio para la extraccioacuten del ADN y realizacioacuten del PCR
Manejo del especien quiruacutergico
Establecer normas baacutesicas para el enviacuteo de muestras al laboratorio de patologiacutea
Requisitos del espeacutecimen Fijacioacuten tisular Macroscopiacutea
Fijacioacuten tisular
Interrumpe los fenoacutemenos degradativos
En histotecnologiacutea cualquier defecto o error puede ser subsanado excepto los cometidos durante el proceso de fijacioacuten
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Fijador Formol tamponado al 10
-Formaldehiacutedo al 37 ndash 40100cc -Agua destiladahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip900cc -Fosfato de sodio dibaacutesico anhidrohellip65 g -Fosfato de sodio monobaacutesico monohidratadohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 g
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Frascos de plaacutestico con boca ancha y tapa hermeacutetica
Voluacutemen de formol Tiempo de exposicioacuten de la muestra al medio
ambiente (sin fijador) Muestra hemorraacutegica lavar con solucioacuten
salina Tiempo de fijacioacuten
Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
Coleccioacuten y Almacenamiento de la muestra
Resumen de las Caracteriacutesticas de la muestra
bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
HERRAMIENTA AUXILIAR QUE UTILIZA EL PATOLOGO PARA Diagnoacutestico PronoacutesticoTratamiento
MORFOLOGIA CLINICA iexcliexclUNA FIJACION ADECUADA Y UN
BUEN PROCESAMIENTO TECNICO
GRACIAS
Sustitucioacuten de valina por glutamato
T1796A (Codon 600 Exon 15)
BRAFV600E
BRAF = rapidly accelerated fibrosarcoma isoform B E = glutamate UV = ultraviolet RAS-RAF = rat sarcoma-rapidly accelerated fibrosarcoma WT = wild-type
10
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BRAFWTmdashACTIVATED by addition of negatively charged phosphates25
BRAFV600EmdashCONSTITUTIVELY ACTIVATED by negatively charged glutamate (E)24
Mutaciones BRAF en Melanoma
No formacioacuten de nidos
Formacioacuten de nidos extensivos
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Teacutecnicas Moleculares
PCR Polymerase Chain Reaction PCR-RFLPRestriction Fragment Length
Polymorphism LCR Ligase Chain Reaction TMA Transcription-mediated amplification NASBA Nucleic acid sequence-based
amplification
PCR
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Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
La prueba se basa en dos procesos baacutesicos
bullPreparacioacuten manual de las muestras para obtener ADN genoacutemico a partir de FFPET y
bullAmplificacioacuten y deteccioacuten del ADN objetivo mediante PCR y pares de cebadores (primers) complementarios y sondas oligonucleoacutetidas con marcadores fluorescentes
Test de mutacioacuten BRAF-V600E
Biopsia escisional incisional o punch
Fijado con formalina al 10 tamponada miacutenimo 24 horas maacuteximo 48 horas Embebido en parafina (biopsia del tumor)
Seccionado para su revisioacuten histoloacutegica y coloracioacuten con HE
El patoacutelogo revisa la seccioacuten del tumor en busca de tejido patoloacutegico y emite su diagnoacutestico
La muestra analizada es enviada al laboratorio para la extraccioacuten del ADN y realizacioacuten del PCR
Manejo del especien quiruacutergico
Establecer normas baacutesicas para el enviacuteo de muestras al laboratorio de patologiacutea
Requisitos del espeacutecimen Fijacioacuten tisular Macroscopiacutea
Fijacioacuten tisular
Interrumpe los fenoacutemenos degradativos
En histotecnologiacutea cualquier defecto o error puede ser subsanado excepto los cometidos durante el proceso de fijacioacuten
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Fijador Formol tamponado al 10
-Formaldehiacutedo al 37 ndash 40100cc -Agua destiladahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip900cc -Fosfato de sodio dibaacutesico anhidrohellip65 g -Fosfato de sodio monobaacutesico monohidratadohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 g
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Frascos de plaacutestico con boca ancha y tapa hermeacutetica
Voluacutemen de formol Tiempo de exposicioacuten de la muestra al medio
ambiente (sin fijador) Muestra hemorraacutegica lavar con solucioacuten
salina Tiempo de fijacioacuten
Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
Coleccioacuten y Almacenamiento de la muestra
Resumen de las Caracteriacutesticas de la muestra
bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
HERRAMIENTA AUXILIAR QUE UTILIZA EL PATOLOGO PARA Diagnoacutestico PronoacutesticoTratamiento
MORFOLOGIA CLINICA iexcliexclUNA FIJACION ADECUADA Y UN
BUEN PROCESAMIENTO TECNICO
GRACIAS
Mutaciones BRAF en Melanoma
No formacioacuten de nidos
Formacioacuten de nidos extensivos
Grading of cellular morphological features Examples indicate the extent of nesting cell shape and pigmentation (adapted from Viros A et al)21
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Teacutecnicas Moleculares
PCR Polymerase Chain Reaction PCR-RFLPRestriction Fragment Length
Polymorphism LCR Ligase Chain Reaction TMA Transcription-mediated amplification NASBA Nucleic acid sequence-based
amplification
PCR
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Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
La prueba se basa en dos procesos baacutesicos
bullPreparacioacuten manual de las muestras para obtener ADN genoacutemico a partir de FFPET y
bullAmplificacioacuten y deteccioacuten del ADN objetivo mediante PCR y pares de cebadores (primers) complementarios y sondas oligonucleoacutetidas con marcadores fluorescentes
Test de mutacioacuten BRAF-V600E
Biopsia escisional incisional o punch
Fijado con formalina al 10 tamponada miacutenimo 24 horas maacuteximo 48 horas Embebido en parafina (biopsia del tumor)
Seccionado para su revisioacuten histoloacutegica y coloracioacuten con HE
El patoacutelogo revisa la seccioacuten del tumor en busca de tejido patoloacutegico y emite su diagnoacutestico
La muestra analizada es enviada al laboratorio para la extraccioacuten del ADN y realizacioacuten del PCR
Manejo del especien quiruacutergico
Establecer normas baacutesicas para el enviacuteo de muestras al laboratorio de patologiacutea
Requisitos del espeacutecimen Fijacioacuten tisular Macroscopiacutea
Fijacioacuten tisular
Interrumpe los fenoacutemenos degradativos
En histotecnologiacutea cualquier defecto o error puede ser subsanado excepto los cometidos durante el proceso de fijacioacuten
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Fijador Formol tamponado al 10
-Formaldehiacutedo al 37 ndash 40100cc -Agua destiladahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip900cc -Fosfato de sodio dibaacutesico anhidrohellip65 g -Fosfato de sodio monobaacutesico monohidratadohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 g
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Frascos de plaacutestico con boca ancha y tapa hermeacutetica
Voluacutemen de formol Tiempo de exposicioacuten de la muestra al medio
ambiente (sin fijador) Muestra hemorraacutegica lavar con solucioacuten
salina Tiempo de fijacioacuten
Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
Coleccioacuten y Almacenamiento de la muestra
Resumen de las Caracteriacutesticas de la muestra
bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
HERRAMIENTA AUXILIAR QUE UTILIZA EL PATOLOGO PARA Diagnoacutestico PronoacutesticoTratamiento
MORFOLOGIA CLINICA iexcliexclUNA FIJACION ADECUADA Y UN
BUEN PROCESAMIENTO TECNICO
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Teacutecnicas Moleculares
PCR Polymerase Chain Reaction PCR-RFLPRestriction Fragment Length
Polymorphism LCR Ligase Chain Reaction TMA Transcription-mediated amplification NASBA Nucleic acid sequence-based
amplification
PCR
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Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
La prueba se basa en dos procesos baacutesicos
bullPreparacioacuten manual de las muestras para obtener ADN genoacutemico a partir de FFPET y
bullAmplificacioacuten y deteccioacuten del ADN objetivo mediante PCR y pares de cebadores (primers) complementarios y sondas oligonucleoacutetidas con marcadores fluorescentes
Test de mutacioacuten BRAF-V600E
Biopsia escisional incisional o punch
Fijado con formalina al 10 tamponada miacutenimo 24 horas maacuteximo 48 horas Embebido en parafina (biopsia del tumor)
Seccionado para su revisioacuten histoloacutegica y coloracioacuten con HE
El patoacutelogo revisa la seccioacuten del tumor en busca de tejido patoloacutegico y emite su diagnoacutestico
La muestra analizada es enviada al laboratorio para la extraccioacuten del ADN y realizacioacuten del PCR
Manejo del especien quiruacutergico
Establecer normas baacutesicas para el enviacuteo de muestras al laboratorio de patologiacutea
Requisitos del espeacutecimen Fijacioacuten tisular Macroscopiacutea
Fijacioacuten tisular
Interrumpe los fenoacutemenos degradativos
En histotecnologiacutea cualquier defecto o error puede ser subsanado excepto los cometidos durante el proceso de fijacioacuten
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Fijador Formol tamponado al 10
-Formaldehiacutedo al 37 ndash 40100cc -Agua destiladahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip900cc -Fosfato de sodio dibaacutesico anhidrohellip65 g -Fosfato de sodio monobaacutesico monohidratadohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 g
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Frascos de plaacutestico con boca ancha y tapa hermeacutetica
Voluacutemen de formol Tiempo de exposicioacuten de la muestra al medio
ambiente (sin fijador) Muestra hemorraacutegica lavar con solucioacuten
salina Tiempo de fijacioacuten
Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
Coleccioacuten y Almacenamiento de la muestra
Resumen de las Caracteriacutesticas de la muestra
bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
HERRAMIENTA AUXILIAR QUE UTILIZA EL PATOLOGO PARA Diagnoacutestico PronoacutesticoTratamiento
MORFOLOGIA CLINICA iexcliexclUNA FIJACION ADECUADA Y UN
BUEN PROCESAMIENTO TECNICO
GRACIAS
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Teacutecnicas Moleculares
PCR Polymerase Chain Reaction PCR-RFLPRestriction Fragment Length
Polymorphism LCR Ligase Chain Reaction TMA Transcription-mediated amplification NASBA Nucleic acid sequence-based
amplification
PCR
Karan K Sra MDa Gisela Torres MD Molecular diagnosis of infectious diseases in dermatology Journal of American Academy of Dermatology NOVEMBER 2005-749765
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
La prueba se basa en dos procesos baacutesicos
bullPreparacioacuten manual de las muestras para obtener ADN genoacutemico a partir de FFPET y
bullAmplificacioacuten y deteccioacuten del ADN objetivo mediante PCR y pares de cebadores (primers) complementarios y sondas oligonucleoacutetidas con marcadores fluorescentes
Test de mutacioacuten BRAF-V600E
Biopsia escisional incisional o punch
Fijado con formalina al 10 tamponada miacutenimo 24 horas maacuteximo 48 horas Embebido en parafina (biopsia del tumor)
Seccionado para su revisioacuten histoloacutegica y coloracioacuten con HE
El patoacutelogo revisa la seccioacuten del tumor en busca de tejido patoloacutegico y emite su diagnoacutestico
La muestra analizada es enviada al laboratorio para la extraccioacuten del ADN y realizacioacuten del PCR
Manejo del especien quiruacutergico
Establecer normas baacutesicas para el enviacuteo de muestras al laboratorio de patologiacutea
Requisitos del espeacutecimen Fijacioacuten tisular Macroscopiacutea
Fijacioacuten tisular
Interrumpe los fenoacutemenos degradativos
En histotecnologiacutea cualquier defecto o error puede ser subsanado excepto los cometidos durante el proceso de fijacioacuten
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Fijador Formol tamponado al 10
-Formaldehiacutedo al 37 ndash 40100cc -Agua destiladahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip900cc -Fosfato de sodio dibaacutesico anhidrohellip65 g -Fosfato de sodio monobaacutesico monohidratadohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 g
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Frascos de plaacutestico con boca ancha y tapa hermeacutetica
Voluacutemen de formol Tiempo de exposicioacuten de la muestra al medio
ambiente (sin fijador) Muestra hemorraacutegica lavar con solucioacuten
salina Tiempo de fijacioacuten
Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
Coleccioacuten y Almacenamiento de la muestra
Resumen de las Caracteriacutesticas de la muestra
bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
HERRAMIENTA AUXILIAR QUE UTILIZA EL PATOLOGO PARA Diagnoacutestico PronoacutesticoTratamiento
MORFOLOGIA CLINICA iexcliexclUNA FIJACION ADECUADA Y UN
BUEN PROCESAMIENTO TECNICO
GRACIAS
Teacutecnicas Moleculares
PCR Polymerase Chain Reaction PCR-RFLPRestriction Fragment Length
Polymorphism LCR Ligase Chain Reaction TMA Transcription-mediated amplification NASBA Nucleic acid sequence-based
amplification
PCR
Karan K Sra MDa Gisela Torres MD Molecular diagnosis of infectious diseases in dermatology Journal of American Academy of Dermatology NOVEMBER 2005-749765
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
La prueba se basa en dos procesos baacutesicos
bullPreparacioacuten manual de las muestras para obtener ADN genoacutemico a partir de FFPET y
bullAmplificacioacuten y deteccioacuten del ADN objetivo mediante PCR y pares de cebadores (primers) complementarios y sondas oligonucleoacutetidas con marcadores fluorescentes
Test de mutacioacuten BRAF-V600E
Biopsia escisional incisional o punch
Fijado con formalina al 10 tamponada miacutenimo 24 horas maacuteximo 48 horas Embebido en parafina (biopsia del tumor)
Seccionado para su revisioacuten histoloacutegica y coloracioacuten con HE
El patoacutelogo revisa la seccioacuten del tumor en busca de tejido patoloacutegico y emite su diagnoacutestico
La muestra analizada es enviada al laboratorio para la extraccioacuten del ADN y realizacioacuten del PCR
Manejo del especien quiruacutergico
Establecer normas baacutesicas para el enviacuteo de muestras al laboratorio de patologiacutea
Requisitos del espeacutecimen Fijacioacuten tisular Macroscopiacutea
Fijacioacuten tisular
Interrumpe los fenoacutemenos degradativos
En histotecnologiacutea cualquier defecto o error puede ser subsanado excepto los cometidos durante el proceso de fijacioacuten
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Fijador Formol tamponado al 10
-Formaldehiacutedo al 37 ndash 40100cc -Agua destiladahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip900cc -Fosfato de sodio dibaacutesico anhidrohellip65 g -Fosfato de sodio monobaacutesico monohidratadohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 g
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Frascos de plaacutestico con boca ancha y tapa hermeacutetica
Voluacutemen de formol Tiempo de exposicioacuten de la muestra al medio
ambiente (sin fijador) Muestra hemorraacutegica lavar con solucioacuten
salina Tiempo de fijacioacuten
Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
Coleccioacuten y Almacenamiento de la muestra
Resumen de las Caracteriacutesticas de la muestra
bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
HERRAMIENTA AUXILIAR QUE UTILIZA EL PATOLOGO PARA Diagnoacutestico PronoacutesticoTratamiento
MORFOLOGIA CLINICA iexcliexclUNA FIJACION ADECUADA Y UN
BUEN PROCESAMIENTO TECNICO
GRACIAS
PCR
Karan K Sra MDa Gisela Torres MD Molecular diagnosis of infectious diseases in dermatology Journal of American Academy of Dermatology NOVEMBER 2005-749765
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
La prueba se basa en dos procesos baacutesicos
bullPreparacioacuten manual de las muestras para obtener ADN genoacutemico a partir de FFPET y
bullAmplificacioacuten y deteccioacuten del ADN objetivo mediante PCR y pares de cebadores (primers) complementarios y sondas oligonucleoacutetidas con marcadores fluorescentes
Test de mutacioacuten BRAF-V600E
Biopsia escisional incisional o punch
Fijado con formalina al 10 tamponada miacutenimo 24 horas maacuteximo 48 horas Embebido en parafina (biopsia del tumor)
Seccionado para su revisioacuten histoloacutegica y coloracioacuten con HE
El patoacutelogo revisa la seccioacuten del tumor en busca de tejido patoloacutegico y emite su diagnoacutestico
La muestra analizada es enviada al laboratorio para la extraccioacuten del ADN y realizacioacuten del PCR
Manejo del especien quiruacutergico
Establecer normas baacutesicas para el enviacuteo de muestras al laboratorio de patologiacutea
Requisitos del espeacutecimen Fijacioacuten tisular Macroscopiacutea
Fijacioacuten tisular
Interrumpe los fenoacutemenos degradativos
En histotecnologiacutea cualquier defecto o error puede ser subsanado excepto los cometidos durante el proceso de fijacioacuten
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Fijador Formol tamponado al 10
-Formaldehiacutedo al 37 ndash 40100cc -Agua destiladahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip900cc -Fosfato de sodio dibaacutesico anhidrohellip65 g -Fosfato de sodio monobaacutesico monohidratadohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 g
Requisitos para la fijacioacuten tisular
Frascos de plaacutestico con boca ancha y tapa hermeacutetica
Voluacutemen de formol Tiempo de exposicioacuten de la muestra al medio
ambiente (sin fijador) Muestra hemorraacutegica lavar con solucioacuten
salina Tiempo de fijacioacuten
Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
Coleccioacuten y Almacenamiento de la muestra
Resumen de las Caracteriacutesticas de la muestra
bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
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Biopsia escisional incisional o punch
Fijado con formalina al 10 tamponada miacutenimo 24 horas maacuteximo 48 horas Embebido en parafina (biopsia del tumor)
Seccionado para su revisioacuten histoloacutegica y coloracioacuten con HE
El patoacutelogo revisa la seccioacuten del tumor en busca de tejido patoloacutegico y emite su diagnoacutestico
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Requisitos del espeacutecimen Fijacioacuten tisular Macroscopiacutea
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En histotecnologiacutea cualquier defecto o error puede ser subsanado excepto los cometidos durante el proceso de fijacioacuten
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salina Tiempo de fijacioacuten
Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
Coleccioacuten y Almacenamiento de la muestra
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bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
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bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
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MORFOLOGIA CLINICA iexcliexclUNA FIJACION ADECUADA Y UN
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Fijado con formalina al 10 tamponada miacutenimo 24 horas maacuteximo 48 horas Embebido en parafina (biopsia del tumor)
Seccionado para su revisioacuten histoloacutegica y coloracioacuten con HE
El patoacutelogo revisa la seccioacuten del tumor en busca de tejido patoloacutegico y emite su diagnoacutestico
La muestra analizada es enviada al laboratorio para la extraccioacuten del ADN y realizacioacuten del PCR
Manejo del especien quiruacutergico
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Requisitos del espeacutecimen Fijacioacuten tisular Macroscopiacutea
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En histotecnologiacutea cualquier defecto o error puede ser subsanado excepto los cometidos durante el proceso de fijacioacuten
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-Formaldehiacutedo al 37 ndash 40100cc -Agua destiladahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip900cc -Fosfato de sodio dibaacutesico anhidrohellip65 g -Fosfato de sodio monobaacutesico monohidratadohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 g
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Frascos de plaacutestico con boca ancha y tapa hermeacutetica
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salina Tiempo de fijacioacuten
Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
Coleccioacuten y Almacenamiento de la muestra
Resumen de las Caracteriacutesticas de la muestra
bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
HERRAMIENTA AUXILIAR QUE UTILIZA EL PATOLOGO PARA Diagnoacutestico PronoacutesticoTratamiento
MORFOLOGIA CLINICA iexcliexclUNA FIJACION ADECUADA Y UN
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Establecer normas baacutesicas para el enviacuteo de muestras al laboratorio de patologiacutea
Requisitos del espeacutecimen Fijacioacuten tisular Macroscopiacutea
Fijacioacuten tisular
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En histotecnologiacutea cualquier defecto o error puede ser subsanado excepto los cometidos durante el proceso de fijacioacuten
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Fijador Formol tamponado al 10
-Formaldehiacutedo al 37 ndash 40100cc -Agua destiladahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip900cc -Fosfato de sodio dibaacutesico anhidrohellip65 g -Fosfato de sodio monobaacutesico monohidratadohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 g
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Voluacutemen de formol Tiempo de exposicioacuten de la muestra al medio
ambiente (sin fijador) Muestra hemorraacutegica lavar con solucioacuten
salina Tiempo de fijacioacuten
Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
Coleccioacuten y Almacenamiento de la muestra
Resumen de las Caracteriacutesticas de la muestra
bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
HERRAMIENTA AUXILIAR QUE UTILIZA EL PATOLOGO PARA Diagnoacutestico PronoacutesticoTratamiento
MORFOLOGIA CLINICA iexcliexclUNA FIJACION ADECUADA Y UN
BUEN PROCESAMIENTO TECNICO
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Fijacioacuten tisular
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En histotecnologiacutea cualquier defecto o error puede ser subsanado excepto los cometidos durante el proceso de fijacioacuten
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Fijador Formol tamponado al 10
-Formaldehiacutedo al 37 ndash 40100cc -Agua destiladahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip900cc -Fosfato de sodio dibaacutesico anhidrohellip65 g -Fosfato de sodio monobaacutesico monohidratadohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 g
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Frascos de plaacutestico con boca ancha y tapa hermeacutetica
Voluacutemen de formol Tiempo de exposicioacuten de la muestra al medio
ambiente (sin fijador) Muestra hemorraacutegica lavar con solucioacuten
salina Tiempo de fijacioacuten
Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
Coleccioacuten y Almacenamiento de la muestra
Resumen de las Caracteriacutesticas de la muestra
bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
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Fijador Formol tamponado al 10
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Frascos de plaacutestico con boca ancha y tapa hermeacutetica
Voluacutemen de formol Tiempo de exposicioacuten de la muestra al medio
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salina Tiempo de fijacioacuten
Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
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Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
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bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
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Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
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MORFOLOGIA CLINICA iexcliexclUNA FIJACION ADECUADA Y UN
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Voluacutemen de formol Tiempo de exposicioacuten de la muestra al medio
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Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
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bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
HERRAMIENTA AUXILIAR QUE UTILIZA EL PATOLOGO PARA Diagnoacutestico PronoacutesticoTratamiento
MORFOLOGIA CLINICA iexcliexclUNA FIJACION ADECUADA Y UN
BUEN PROCESAMIENTO TECNICO
GRACIAS
Tiempo de fijacioacuten
Biopsia que mide hasta 05 cm tiempo miacutenimo de 4 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Biopsia gt 05 cm y piezas operatorias pequentildeas miacutenimo 24 horas y no debe sobrepasar las 48 horas
Cilindro oacuteseo de meacutedula oacutesea 24 horas no sobrepasar las 48 horas
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
Coleccioacuten y Almacenamiento de la muestra
Resumen de las Caracteriacutesticas de la muestra
bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
Principios del procedimiento Cobasreg BRAF-V600E
HERRAMIENTA AUXILIAR QUE UTILIZA EL PATOLOGO PARA Diagnoacutestico PronoacutesticoTratamiento
MORFOLOGIA CLINICA iexcliexclUNA FIJACION ADECUADA Y UN
BUEN PROCESAMIENTO TECNICO
GRACIAS
Reporte patoloacutegico Diagnoacutestico descriptivo Tamantildeo de la muestra La dimensioacuten mayor ______mm Porcentaje de tumor viable_____ PIGMENTACION _ Presente _ Escasa _ Moderada _ Abundante _ Ausente Comentario
Consideracioacutenes de las muestras
Heterogenicidad de la muestra
Tipo de Muestra
Coleccioacuten y Almacenamiento de la muestra
Resumen de las Caracteriacutesticas de la muestra
bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
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bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
bull El tejido obtenido debe ser fijado por 8 ndash 24 horas en formol neutro
Respecto a la seleccioacuten de tejido para BRAF lo que hacemos es chequear que haya tejido tumoral en HampE y encerrar en un circulo el tumor anotando el porcentaje de tumor Si hay menos de 20 de tumor en el aacuterea encerrada en el circulo las posibilidades de tener muestra insuficiente son muy altas Si el tumor es muy escaso (no tenemos un punto de corte especifico) como si solo hay pocas ceacutelulas dispersas o el deposito tumoral es muy pequentildeo le comentamos al laboratorio molecular que hay muy poco tejido y que la muestra es inadecuada Generalmente cortamos 1 HampE y 10 cortes en blanco de 5 micras lo cual generalmente es mas que suficiente (dependiendo por supuesto del tamantildeo del tumor)
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bull Tamantildeo ideal 4 x 4 mm Tamantildeo miacutenimo 3 x 3 mm
bull Al menos 20 del tejido deberaacute ser tumor
bull La muestra de tejido metastaacutesico es vaacutelida para estudio excepto muestras de tejido oacuteseo
bull No es posible analizar muestras de tejido descalcificado o degradado
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