Universidad Autónoma de Sinaloa

Facultad de Ciencias Químico BiológicasTema:ELISA, Western blot, Inmunohistoquimica,

Inmunofluorescencia.

Maestra: Dra. Elsa Maribel Aguilar Medina

Alumno: Tzamin Alfredo Ayala Felix(autor)

Grado: 4Grupo: 3

Materia: Inmunología aplicada

Culiacán, Sin., martes 10 de septiembre de 2013

ENSAYO DE INMUNOSORBENTE LIGADO A ENZIMA

ELISA

Fue desarrollada por Eva Engvall y Peter perlmann en 1971.

Es un método analítico que depende de la reacción Ag-Ab.

Determinación cualitativa y cuantitativa de Ag y Ab.

El inmunoensayo enzimático es una técnica en la cual uno de los reactantes, el Ab o el Ag, se fija a un soporte solido antes de su interacción con el reactante complementario.

Esta técnica es muy versátil y por esto hay diversas variantes de la misma dentro de las cuales las mas comunes son ELISA directo, indirecto y en sandwich.

Para la realización de esta prueba se utilizan diversas enzimas, como : peroxidasa de rábano, la fosfatasa alcalina y la beta-galactosidasa.

Para el revelado del sistema se utiliza el sustrato de la enzima; a veces se requiere del uso simultaneo de un cromógeno, en el caso de la peroxidasa de rábano el sustrato utilizado es peróxido de hidrogeno y el cromógeno utilizado es orto-fenilendiamina, en otras ocasiones el cromógeno forma parte del sustrato como para la fosfatasa alcalina es el p-nitrofenil fosfato.

También se utilizan soluciones para diluir los reactantes y lavado de los posos, la mas utilizada es el regulador de fosfatos 0.01M en solución salina .15M a un pH 7.4 (PBS), algunos recomiendan adicionar tween 20 al .05% (PBS-T)

Un paso que no se debe olvidar en las tecnicas de ELISA es el bloqueo de los posos con soluciones de proteínas ajenas al sistema Ag-Ab. Los bloqueadores mas utilizados son albumina, gelatina, caseína y leche descremada.

Pasos generales de un ELISA:1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo. 2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o

anticuerpos. 3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o

antígeno tapizado en el pocillo 4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o

anticuerpo no unido 5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima 6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo 7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida 8. Adición del substrato 9. Unión del substrato a la enzima 10. Desarrollo del color

ELISA Indirecto

ELISA en Sandwich

INMUNOELECTROTRANSFERENCIA

Western blot

Por este método es posible la identificación de una proteína específica en una mezcla compleja de proteínas.

En la Western blot, una mezcla de proteínas se separa por medios electroforéticos en un gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE).

Inmunohistoquimica

La inmunohistoquímica es una técnica esencial en el diagnóstico anatomopatológico de las enfermedades, fundamentalmente de las neoplásicas.

La inmunohistoquímica se puede realizar en tejidos de biopsia y de autopsia, generalmente fijados en formol e incluidos en parafina, así como en material de citología.

EtapasObtencion de las celulas o tejidos.FijacionUnion con anticuerpos Deteccion de la reaccion Ag-Ab

Tipos de muestrasCultivos celulares que crecen en un soporte

de vidrio ( tipo portaobjetos).Centrifugados de celulas en suspensión

colocadas en un portaobjetos.Frotis de tejidoCortes de tejidos.

Fijacion:Inmovilizar al Ag sin modificarlo, mantener la

estructura celular, permitir el acceso de los Ab.

Hay tres factores principales que determinan la facilidad de detección de un Ag.

1. Concentración local del Ag.2. Tipo de fijador y Ab usado3. Método de detección empleado.

Tipos de tecnicasDirecta : el marcador se acopla o conjuga

directamenteIndirecta: el marcador se acopla a un Ab

secundario.

Inmunofluorescencia

Fluorocromos:Isotiocianato de fluoresceina. (VERDE)RodaminaFicoeritrina.