Utilisation du modèle de co-culture cellules endothéliales/Plasmodium falciparum pour l’étude de la

pathogénicité des isolats plasmodiaux

CIRMF & INSERM 511

Fousseyni Touré-Ndouo, A Siau, O Oukem, U Bisvigou, O Moussa, S Bisser, D Mazier

Interactions hôte-Plasmodium falciparum

Cellules endothéliales vasculaires

Foie

Lars Hvid et al. 2005 (modifié)

Hématie

Pf

Cytoadhérence, Séquestration

Séquestration au cours du neuropaludisme

2

Blocage mécaniquedes capillaires

Rosette

Autoagglutinationdes HP

cytokines proinflammatoires (1), toxines (2).

1

Flux sanguin

Cytoadhérence des HP

1

Modèle Lékana-Douki et al. 2003

Apoptose

P. falciparum 3D7 (souche de laboratoire) induit l’apoptose de la cellule endothéliale pulmonaire humaine par contact physique (cytoadhérence)

Pino et al. 2003

Objectif général

Analyser le rôle des molécules de transduction du signal dans la pathogenèse du paludisme

Objectifs spécifiques

• Analyser la capacité des isolats plasmodiaux à cytoadhérer et à induire des modifications (apoptoseetc.) de la cellule endothéliale

• Etablir une corrélation entre ces modifications et l’état clinique des patients

• Identifier les ligands et récepteurs impliqués dans la pathogénicité pour la perspective vaccinale et/ou thérapeutique

Matériels et méthodes

� Recrutement de patients, collecte de données cliniques et d’ isolats plasmodiaux

� Culture de cellules endothéliales pulmonaires humaines (HLEC)

� Maturation des isolats P.f

� Co-cultures HLEC-Isolats P.f

� Réalisation des tests (cytoadhérence, ELISA apoptose, préparation des ARNm, DNA microarray ou Biopuce)

Collection des isolats plasmodiaux et formes sanguines

680.000 anneaux /µl de sang

Goutte épaisse A Goutte épaisse B

250.000 trophozoïtes /µl de sang

Maturation ex vivo (24 – 48 h)

12% Schizontes

Enrichissement en schizontes

80%

Co-culture: HLEC/ isolats Pf

Suspension de schizontes

HLEC HLEC HLEC

1 2 3

Cytoadhérence (1h) Apoptose (4 h) Contact (4h) collection ARNm

Cytoadhérence

5.619 PRBC/mm2 HLEC

Cytoadhérence

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

PR

BC

/mm

2 H

LE

C

D1 F17 F28 F3 F31 F33 F36 F39 F43 F45 F48 F50 F54 F59 F62 F64 F69 F37 F5 F52 F61

Isolats Pf

La cytoadhérence n’est pas associée à la charge parasitaire

216

937

1686

5619

197

1561

592

437

5

230

4881

23760

27324

26080

26730

13365

26730

3960

18810

4703

F3

F31

F69

F32

F37

F42

F53

F62

F60

F26

Cytoadhérence

PRBC/mm2HLEC

Nombre de schizontes

x 103

Isolats Pf

ELISA apoptose (1)

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

1,600

1,800

2,000

2,200

2,400

D1 F1 F4 F7 F9 F16 F18 F21 F26 F30 F31 F33 F36 F38 F49 F51 F54 F55 F56 F59 F61 F63 F67 F69

DO échantillons

DO GRS

*

*

*

*

*

**

*

*

*

*

*

*

ELISA apoptose (2)

Uncomplicated malaria 35 10

5

N = 45 P.f

Paludisme simple 35 Paludisme sévère 10

5 apoptotiques 4 apoptotiques

20% d’isolats apoptotiques

L’apoptose n’est pas associée à la gravité du paludisme (p=0,11)

Les isolats apoptotiques se rencontrent aussi bien dans les cas simples que dans les cas sévères

L’apoptose est associée aux signes neurologiquesFisher exact test p= 0,02

Prostration

Prostration

Coma

Hyperparasitémie

Hyperparasitémie

Hyperparasitémie

Hyperparasitémie

Prostration

Hyperparasitémie

Anémie

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

F3

F31

F69

F32

F37

F42

F53

F62

F63

F26

Critères de sévérité

(OMS 2000)

ApoptoseIsolats Pf

Hypothèse

L’apoptose pourrait être impliquée dans les dommages causés à la barrière hématoméningée au cours du

neuropaludisme

Apoptose CE et barrière hématoméningée

Modèle Bisser et al. 2006

Relation entre cytoadhérence et apoptose

0

5

10

15

20

25

1 10 100 1000 10000

Cytoadhérence PRBC

HL

EC

ap

op

tose

▲ Paludisme sévère avec signes neurologiques (prostration ou coma);

���� Paludisme sévère sans signes neurologiques (anémie et hyperparasitémie)���� Paludisme simple

Transcriptome associé à l’induction de l’apoptose

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

Recherche PlasmoDB

Ces gènes codent en grande majorité pour des antigènes de surface dont certains sont impliqués dans la

cytoadhérence

Résumé

• Environ 20% des isolats plasmodiaux de Franceville (Gabon) induisent l’apoptose de la cellule endothéliale

• L’apoptose est associée aux signes neurologiques

• 23 gènes associés à la pathogénicité des isolats plasmodiaux ont été identifiés

Perspectives

• Expression d’antigènes recombinants correspondant à certains de ces gènes

• Analyses immunologiques (recherche de candidats vaccins potentiels)

• Co-culture cellules endothéliales cérébrales/P. falciparum

Remerciements (1)

• Patients et leurs parents

• Hôpital AMISSA BONGO

• CIRMF

• INSERM 511

Remerciements (2)

• Directeur de l’Institut Pasteur de Madagascar

• Initiateurs et organisateurs de l’Atelier Paludisme

• Peuple Malgache

Merci