RNA INTERFERENCE: TECNICHE E APPLICAZIONI

Catia Giovannini

U.O. Medicina Interna

Prof. L. Bolondi

Scoperta dell’RNA interference

La scoperta dell’RNAi avvene nel tentativo di aumentare l’attività del

gene della calcone sintasi (un enzima coinvolto nella produzione di

specifici pigmenti) in petunia. Inaspettatamente la pigmentazione non

aumentò, si ebbe una variegazione del colore e, in alcuni casi la

toatale perdita dello stesso.

Questo fenomeno fu definito

co-soppressione, intendendo

la soppressione sia del gene

introdotto che di quello endogeno.

RNA interference (RNAi)

• RNAi compreso solo dopo gli esperimenti di Fire e Mello (Fire et al., Nature

1998).

• RNA a singolo filamento agisce come inibitore poco efficiente.

• L’RNA a doppia elica (dsRNA) è un inibitore potente.

• Alterazioni fenotipiche possono essere indotte, in C. Elegans,

solo con sequenze complementari a regioni esoniche

suggerendo un silenziamento post-trascrizionale.

RNA interference

• L’RNAi è un processo mediante il quale RNA doppio-strand silenzia, in modo sequenza-specifico, l’espressionegenica attraverso l’appaiamento con l’ mRNA bersaglioseguito dalla sua degradazione, quindi: SILENZIAMENTOPOST-TRASCRIZIONALE.

• Meccanismo biochimico altamente conservato checoinvolge più di 10 geni e set di proteine correlate.

RNA interference

• Funzioni biologiche:

Resistenza ai virus (piante,insetti): il dsRNA si forma grazie adappaiamenti intramolecolari dell’RNA virale.

Silenziamento dei trasposoni (dimostrata dall’osservazione chel’innattivazione dei geni coinvolti nell’RNAi nei nematodi causal’attivazione di molti trasposoni nella linea germinale).

Regolazione dell’espressione genica.

Meccanismo base dell’RNAi

Il modello funzionale dell’RNAi consta di tre fasi fondamentali:

Fase di “iniziazione”:taglio del dsRNA in siRNA (21-23nt)

Fase “effettrice”:il siRNA viene incorporato in un

complesso proteico definito RISC “ RNA-induced silencing complex”

Fase di “amplificazione”: sintesi di nuovo dsRNA da parte di una RNA-polimerasi RNA-dipendente

Meccanismo

DICER

siRNA

ATP

ADP + Pi

Enzima ribonucleasico dellasuperfamiglia delle RNAsi III.Genera siRNA di 21-23 paiadi basi

FASE DI INIZIAZIONE

FASE EFFETTRICE

RISC RISC ATTIVATOATTIVAZIONE

ATP ADP + Pi

Target mRNA

Costituito da due RNA binding proteins eda una nucleasi chiamata Slicer

RNA polimerasi-RNA dipendente: un sistema diamplificazione

• Sono stati identificati due meccanismi di amplificazione entrambioperati da una RNA polimerasi-RNA dipendente (RdRP).

• Le amlificazioni aumentano il substrato per il Dicer o per il RISC, inentrambi i casi il RISC avrà la possibilità di effettuare un maggiornumero di tagli.

Amplificazione dell’mRNA aberrante

RdRP

Serve come substrato per il Dicer nella fasedi iniziazione

Amplificazione del singolo filamento di RNA generato dalRISC

Attivazione

Taglio dell’ mRNAtarget

RISC

RdRp

RNAi in cellule di mammifero

• In cellule di mammifero sono state riscontrate più difficoltà nell’indurreRNAi utilizzando lunghi dsRNA. Questo perché a seguito dell’introduzionedi dsRNA, spesso a rispondere non è un silenziamento sequenza specifico,ma un sistema che inibisce tutta l’espressione proteica cellulare. Il dsRNAintrodotto in una cellula di mammifero interagisce con una proteinachinasica (PKR) che scatena la risposta immunitaria dell’interferonebloccando globalmente la trascrizione.

• La risposta interferonica non viene scatenata se vengono introdotti nellacellula direttamente siRNA o shRNA.

siRNA

Il crescente interesse per questa metodologia di silenziamentogenico ha permesso lo sviluppo di software che, attraverso algoritmispecifici, generano i possibili siRNA applicabili ad un determinatomRNA target. La potenzialità di questi software, abbinata allapossibilità di allineare, attraverso BLAST, tutte le sequenze presentinelle banche dati permette di individuare geni che potrebberoessere silenziati contemporaneamente per omologia di sequenza.

siRNA

• Numerose collezioni di siRNAs, sintetizzati chimicamente, sono oggidisponibili in commercio, per i diversi mRNA delle diverse specie.

• Non vengono fornite informazioni sulla sequenza dei siRNA, talvoltaè indicato l’esone contenente la sequenza di appaiamento con ilsiRNA.

• Solitamente testati in alcune linee cellulari.

I piccoli RNA sintetizzati chimicamente (siRNA) sono facilmente

transfettabili. Una volta introdotti in una cellula, non devono essere

processati da Dicer e vengono direttamente incorporati nel RISC

guidando la degradazione dell’mRNA. Massimo knockdown dopo 2-3

giorni dalla trasfezione.

Progettare i siRNA

Progettare i siRNA

siRNA “potenzialmente” funzionale:

• La regione target deve essere a valle del codone di inizio, ad unadistanaza che varia da 50 a 100bp.

• Lunghezza compresa fra 19-22 bp.

• Contenuto in GC fra il 35-55%

2-nt 3´ overhangs di residui di uridina

5´-phosphate and 3´-hydroxyl group.

Scelta dei siRNA

Confrontare i siRNAs forniti da almeno tre ditte diverse per unostesso messaggero.

4806-4826CGAGGGTGATCGGCTCGGTAGTAAT

3538-3560GGGGTGCTCTGCGAGATTAATGA

3536-3558TGGGGGTGCTCTGCGAGATTAAT

3495-3514TTGACCTCGTGGCCCGCTATCTCT

3366-3386ATGGGGGGACCTGCCGTGGCTATAT

1006-1028GGTGAGCTGCAGTCAGAATATCGATGA

1005-1027GTGAGAGCTGCAGTCAGAATATCGATG

42.862032AGGGCCCCTTTGTAACGTGGAGATC

52.384805CCCGAGGTGATCGGCTCGGTAGTAA

42.863546TGCTCTGCGAGATTAATGAGGATGA

101042.11 %AGCTGCAGTCAGAATATCGATGA

480847.37 %GAGGTGATCGGCTCGGTAGTAAT

437852.63 %GTGCTGGCGCCTCTTCAACAACA

354242.11 %GGGGTGCTCTGCGAGATTAATGA

334552.63 %GGCCGTACTGGTAGCCACTGTGA

142947.37 %CATAGGCCAGTTCACCTGTATCT

115852.63 %CCTGCCACGAGGATGCTATCTGT

Scelta dei siRNA

RISC

RISC incorpora il filamento con la minor stabilità interna al 5’

G

-13.0

-12.5

-12.0

-11.5

-11.0

-10.5

-10.0

-9.5

-9.0

-8.5

-8.0

-7.5

-7.0

-6.5

-6.0

-5.5

-5.0

1 10 20 G

-13.0

-12.5

-12.0

-11.5

-11.0

-10.5

-10.0

-9.5

-9.0

-8.5

-8.0

-7.5

-7.0

-6.5

-6.0

-5.5

-5.0

1 10 20

Effect off-target

Testare sempre più siRNA per trovarne almeno due che abbiano lostesso effetto a livello cellulare. In questo modo si esclude lapossibilità che i siRNAs utilizzati silenzino geni diversi dal target(effect off target).

Il silenziamento aspecifico può essere causato anche dall’elica senso

(identica all’mRNA bersaglio).

Vettori plasmidici

RNA polymerase IIIpromoter

• U6 promoter

• H1 promoter

Non necessitano di sequenze indispensabili per la trascrizione a valle del

promotore.

shRNA

Vettori virali

= PCR primers for

DNA sequencing

and pENTR/D-Topo

> Gateway cloning

H1= HI Pol III promoter

Pgk= Phosphoglycerol kinase Pol II promoter

Ts = 5 X Tter Pol III termination signal

pSuper.retro puro original (pSR); and

Blast and GFP derivatives (pSB & pSG): Moloney retroviral vectors harboring

H1 Pol III promoter driven shRNAs

ori

Pgk

AMP

shOligocloning site

Bgl 2

Blast

XhoI orHdIII

3’SIN

LTR

RI

H1

Puro

GFP

MSCV

LTR Ts

Fattori determinanti l’efficienza di silenziamento

• Incorporazione e stabilità all’interno del complesso RISC dei siRNA

• Frequenza di traduzione dell’ mRNA target

• Abbondanza ed emivita dell’ mRNA target

• Struttura secondaria e terziaria dell’mRNA

• Quantità di polisomi ancorati all’mRNA in traduzione

• Proliferazione cellulare

Technology

Steps del silenziamento genico:

1. Sintesi di siRNAs e/o scelta del vettore plasmidico.

2. Ottimizzare la trasfezione del siRNA o del vettore plasmidico.

3. Valutare l’efficenza del silenziamento mediante PCR e westen blot.Un siRNA è efficente se il silenziamento genico è superiore al 70%

Applicazioni in vivo

Applicazioni in vivo

I siRNAs in circolo vengono rapidamente degradati dalleribonucleasi del siero. Sono state, recentemente,sviluppate modificazioni chimiche che proteggono lemolecole di siRNA dalla degradazione e che potrebbero

indirizzare i siRNA in tessuti specifici.

Applicazioni

Antitumor activity of small interfering RNA/cationic liposomecomplex in mouse models of cancer. (Yano J. Clin Cancer Res.2004)

Cholesteryl Oligoengine delivering vascular endothelial growth factorsiRNA effectively inhibits tumor growth in colon adenocarcinoma.

(Kim W. J. Mol. Ther. 2006)

Efficient delivery of small interfering RNA to bone-metastatic tumorsby using atelocollagen in vivo. (Takeshita F., Proc Natl Acad Sci,2005)

miRNA

RNA a singolo filamento, lunghi 19-25nt, funzionano come repressori

nella regolazione genica in eucarioti.

Alcuni miRNA possiedono un proprio locus, altri sono contenuti all’interno

di regioni introniche di sequenze codificanti

Regolano l’espressione di geni target a livello della traduzione bloccando

il legame del ribosoma. Omologia non completa con l’RNA target a livello

del 3’UTR. Mediano la degradazione dell’RNA bersaglio solo nelle piante.

miRNA

• Circa la metà dei miRNA conosciuti si trova in prossimitàdi altri miRNA. Questi cluster di miRNA vengono trascrittida propri promotori a partire da una singola unità ditrascrizione policistronica generando un trascrittoprimario policistronico (pri-miRNA)

• La trascrizione dei geni del miRNA viene

effettuata dalla RNA polimerasi II (polII)

Il MicroProcessor protein complex

(che include la RNAsi III Drosha)

Taglia il pri-miRNA a pre-miRNA.

Ida Adriansson

RNAi nel nucleo

Nelle piante i miRNA maturipossono rientrare nel nucleo eappaiarsi all’mRNA target che stafinendo di trascriversi dal suoDNA codificante. Il DNA vienecosì metilato a valle dellesequenze di legame con il miRNA.

RdDM (RNA-directed DNA methylation)

Nelle piante si è osservato che dsRNA contenenti sequenze omologhe

a promotori possono determinare la metilazione degli

stessi generando un silenziamento trascrizionale del gene a valle.

L’RdDM attua una metilazione de novo delle citosine presenti in

qualsiasi contesto di sequenza, non solo in presenza dei dinucleotidi

GC, considerati il tipico target della metilazione.

Grazie per l’attenzione