- 1. Gelime raporu Mustafa Kemal SOYLU 1Atatrk Bahe Kltrleri
Merkez Aratrma Enstits
2. Proje ekibi 1. M.Kemal SOYLU 2. Mustafa ztrk 3. Ethem Emre
zko 4. Dr. Mehmet zdemir 5. Orhan nc 6. Gkhan Yldrml 7. Ahmet Yiit
8. Fahrettin Doan 9. Mustafa Yein 10.Prof.Dr.Kaya BOZTOK Proje
yararlancs: Yalova Orman letme mdrl Proje ortaklar: Atatrk Bahe
Kltrleri Merkez Aratrma Enstits Ege niversitesi Bahe Bitkileri Blm
Proje sresi: 12 ay (ekim 2011-ekim 2012) 2Atatrk Bahe Kltrleri
Merkez Aratrma Enstits 3. Genel Amalar Blgemiz mantarclk sektrnn
ulusal ve uluslar aras rekabet gcn arttrmak Mantar rn eitliliini
arttrmak Tarmsal kalknmay salamak Krsal alanlarda yeni i ve
ististam olanaklar salanarak kyden kente g azaltmak ve isizlii
nlemek Blge plan uygulanarak model ormancln geliimine katkda
bulunmak 3Atatrk Bahe Kltrleri Merkez Aratrma Enstits 4. zel Amalar
Yabani kulack mantarlarnn (Pleurotus eryngii kompleks trleri)
molekler karakterizasyonunu yaparak farkl rk ve varyetelerini
belirlemek Yeni kulack mantar eit ve/veya eit adaylarn slah etmek
Kulack mantarnn yetitiriciliini gelitirmek 4Atatrk Bahe Kltrleri
Merkez Aratrma Enstits 5. Temel Faaliyetler 5Atatrk Bahe Kltrleri
Merkez Aratrma Enstits No Faaliyet Sre Uygulama birimi Grevliler 1.
P. eryngii kompleks trlerinin molekler karekterizasyonu 1-6. ay PSU
Mustafa Kemal SOYLU Prof. Dr. Daniel ROYSE 2. Kulack mantarnn
seleksiyon slah 7-9.ay ABKMAE Mustafa Kemal SOYLU Prof. Dr. Kaya
BOZTOK 3. Kulack mantarnn yetitiriciliinin demonstrasyonu ve eitimi
10- 12.ay YOM Dr. Mehmet zdemir Mustafa ztrk Orhan nc Gkhan Yldrml
6. Faaliyet 1. Pleurotus eryngii kompleks trlerinin molekler
karakterizasyonu 1.1. Kltr koullar ve DNAnn izolasyonu Pleurotus
eryngii kompleks trleri izolatlar, steril Patates dekstroz broth
(PDB) ieren 125 mllk erlenlerde gelitirilecektir. Broth ve
miselyum, miracloth (Calbiochem) dan geirilerek filtre edilecektir.
Miselyum steril suyla alkalanacak ve iki kez suyu sklacaktr. 2
mllik epandorf tplere yerletirilerek liyofilize edilecek ve oda
scaklnda bir cam desikatrde depolanacaktr. Liyofilize miselyum elle
1.5 ml epandorf tp iinde bir mikro havaneli ile tlecektir. DNA
ekstraksiyonu DNeasy bitki kiti (Qiagen) kullanlarak, retici
firmann protokolne gre yaplacaktr. DNA konsantrasyonu, agoroz jelde
ve spektrometrede hesaplanacaktr. DNA stok solsyonlar 20 g/lye
steril distile su ile ayarlanacak ve kullanlncaya kadar -20 OCde
saklanacaktr (Rodriguez ve ark. 2010). 6Atatrk Bahe Kltrleri Merkez
Aratrma Enstits 7. 1.2. Kullanlacak gen blgeleri ve primerler
almada EF-1 ve RPB2 gen blgelerinin kullanlmas planlanmaktadr. EF-1
gen blgesi iin kullanlacak primerler: EF160R (5CCGATCTTGTAGACGTCCTG
3) ve EF595F (5 CGTGACTTCATCAAGAAGATG 3) primerleri, 4-6 ekzonlar
hedefleyen ve 4 ve 5 intronlarn uzatan EF1 geninin bir ksmn oaltmak
iin kullanlacaktr. RPB2 gen blgesini oaltmak iin: fRPB2 5F (5
GAYGAYMGWGATCAYTTGG) ve bRPB2 7.1R (5 CCCATRGCYTGYTTMCCCAT AGC 3)
primerleri kullanlacaktr PCR karm hazrlanrken toplam PCR reaksiyonu
25 l olacak ekilde, her primerden 10 M ve 60 ng DNA kullanlacaktr.
PCR koullar, Rodriguez ve ark. 2010nn belirttii ekilde yaplacaktr:
EF1 amplikasyon iin 94 OC/4 dk; 36 dng 94 OC/1 dk, 55 OC/1 dk, 72
OC/1 dk ve son uzama basama 72 OC/10 dkdr. RPB2 geninin
amplikasyonu iin PCR koullar; 94 OC/5 dk; 35 dng 94 OC/1 dk, 57
OC/1 dk, 72 OC/90s ve son uzama basama 72 OC/10 dkdr. PCR rnleri
ethidium bromide (0.16 l/ml) ile boyanarak %1 lik agaroz jel iinde
elektroforez ile grntlenecektir. DNA ykleme buffer (5x, 2 l/ml) + 5
l PCR rn jele yklenerek ve 2.3 3.3 v/jel ile yaklak 30 dakika
elektroforezlenecektir. 7Atatrk Bahe Kltrleri Merkez Aratrma
Enstits 8. 1.3. DNA Sekans Analizi PCR rnleri, saflatrma kitiyle,
temin edilecei retici firmann talimatlarna gre saflatrlacaktr.
Sekans analizi iin saflatrlm rnek, DNAnn 40 ng/ lye ayarlanmas iin
(SPD1010 SpeedVac system ile) younlatrlacak veya seyreltilecektir.
EF-1 (EF595 F) iin forward primer ve RPB2 (b11R1 ve bRPB2 7.1 R)
iin reverse primerleri sekans analizlerinde (1 M her biri)
kullanlacaktr. Birok rnekle ayn anda alabilmesi iin sekans
analizleri iin tasarlanm 96lk plateler kullanlacaktr. Sekans
analizi, Beckman CEQ 8800 marka DNA sekans analiz cihaznda
yaplacaktr. 1.4.Sekans Veri Analizleri Sekans kromotogramlar,
Sequencer version 4.10 (Gene Codes, Ann Arbor, MI) yazlm ile
grntlenecek ve incelenecektir. Sekans dizilimleri, istatistik
analizleri ve dendogramlarn hazrlanmas PAUP 4.0b10 (Swofford, 2002)
programnda yaplacaktr. 8Atatrk Bahe Kltrleri Merkez Aratrma Enstits
9. Faaliyet 2.Kulack mantarnn seleksiyon slah 2.1 Farkl scaklklarda
geliebilen stn performansl izolatlarn seimi Elde edilen ve molekler
karekterizasyon sonucunda seilen izolatlar ve standart eit (M
2600), PDA ortamnda, drt farkl scaklkta (15, 20, 25, 30 OC) kltre
alnarak farkl scaklklarda geliebilen, misel geliim hz yksek olan
stn performansl izolatlar seilecektir. Deneme tesadf parselleri
deneme deseninde 3 tekerrrl olarak kurulacaktr. 9Atatrk Bahe
Kltrleri Merkez Aratrma Enstits 10. 2.2. Farkl scaklklarda mantar
oluturabilen P. eryngii kompleks trleri izolatlarnn belirlenmesi
Daha nceki aamalarda seilen izolatlardan tohumluk miseller elde
edilecektir. P. eryngii kompleks trleri mantarnn tohumluk misel
retiminde buday tanesi kullanlacaktr. Misel sardrma materyalinin
nem oranlar % 60-70 civarna ayarlandktan sonra, al ve kirele pHlar
6.5 civarna ayarlanarak kavanozlara 2/3 oranlarnda ya da otoklav
ssna dayankl plastik torbalara doldurulacaktr. Otoklavda 121oCde
1.2 atm basnta bir saat tutularak sterilize edilecektir. Alama
odasnda misellerden her bir kavanoza ya da plastik torbaya 2 para
ilave edilecektir. Misellerin optimasyonu aamasnda belirlenecek
olan en uygun scaklkta tohumluk misel geliimleri salanacaktr. %48
tala, %22 pamuk iidi kspesi, %25 Buday kepei, %3 msr kspesi, %1
eker, %1 al ieren standart bir yetitirme ortam %70 nem iermesi
salandktan sonra 1 kglk otoklava dayankl plastik torbalara
doldurularak 121 oCde 1 saat sterilize edilecektir (Royse 2003). P.
eryngii kompleks trleri mantarlarna ait tohumluk miseller sterilize
edilmi olan yetitirme ortamna % 5 orannda inokle edilecek ve 25 OC
ve %90 neme ayarlanan inkbasyon odasnda misel geliimleri
salanacaktr. Misel geliimi tamamlandktan sonra; primordiyum ve
mantar oluum aamasnda ise drt farkl scaklkta (15-20-25 ve 30 OC)
farkl kulack mantar izolatlar yetitirilecektir. Dier iklim
zellikleri (Ik: 750 lux, nem:% 90, havalandrma: 4-5 kez/s) sabit
tutulacaktr. Yaplacak olan verim ve kalite zelliklerine gre daha
stn nitelikli izolatlar eit aday olarak seilecektir. Deneme tesadf
bloklarnda blnm parsellerde 3 tekerrrl olarak kurulacaktr. Ana
parseller, Scaklklar; alt parseller ise farkl izolatlar olacaktr.
10Atatrk Bahe Kltrleri Merkez Aratrma Enstits 11. Denemede
incelenecek gzlem ve analizler Misel geliimi ile ilgili lmler 1.
Kltrlerin gelimeye balama sreleri (gn) 2. Kltrlerin gelime hz (mm),
tipi ve formu 3. Kltrlerin geliim sreleri (gn) 11Atatrk Bahe
Kltrleri Merkez Aratrma Enstits 12. Yetitirme ortamnda incelenecek
analiz ve gzlemler 1. Toplam Azot Analizi 2. Kl Analizi 3. Karbon
Hesaplamas 4. C:N Orannn Hesaplanmas 5. Fosfor Analizi 6. Dier
Mineral Madde Analizleri 7. pH Analizi 8. Nem erii 12Atatrk Bahe
Kltrleri Merkez Aratrma Enstits 13. Verim ile ilgili lmler Ortamda
misel geliim sresi (gn) Primordium oluum sresi (gn) Primordium says
Mantar says ve oran Toplam Verim Biyolojik etkinlik Atatrk Bahe
Kltrleri Merkez Aratrma Enstits 13 14. Mantarlarn kalitesi ile
ilgili yaplacak analizler ve lmler 1. Mantar Arl 2. apka ap 3. Sap
ap 4. Sap Uzunluu 5. Protein ierii 6. Renk 7. Toplam Kuru madde 8.
Kl tayini 9. Askorbik asit 10. pH 11. Antioksidan Aktivitesinin
Tayini 12. Toplam Fenolik Madde Miktar 14Atatrk Bahe Kltrleri
Merkez Aratrma Enstits 15. Faaliyet 3. Kulack mantarnn
yetitiriciliinin demonstrasyonu ve eitimi Kulack mantar
yetitiricilii iin Orman ve Krsal alandaki kylerden birinde
demostrasyon amal kulack mantar retimi gerekletirilecektir. Mantarn
retilecei tohum ve yetitirme ortam Atatrk Bahe Kltrleri Merkez
Aratrma Enstitsnde yaplacaktr. Tohumluk misel ekili torbalar
demostrasyon alanndaki odaya yerletirilecektir. Odann
iklimlendirmesi yaplarak retim iin gerekli sulama ve bakm ileri
Orman letme Mdrlnce yrtlecektir. Ayrca Hedef gruplara Kulack mantar
yetitiricilii ile ilgili eitim verilecektir. Eitim srasnda
Penisylvanya State niveristesinden Prof.Dr. Daniel Royse seminer
verecektir. Uygulamal bir eitim verilecektir. Eitim iin ifti bror,
kitapk ve afi hazrlanacaktr. Bror ve Kitapklar eitime katlan hedef
gruba datlacaktr. Afiler ise Tarm ve Orman tekilatlarna ve konu ile
ilgili sivil toplum rgtlerine ve Mantar iletmelerine datlarak
buralarda aslacaktr. 15Atatrk Bahe Kltrleri Merkez Aratrma Enstits
16. BEKLENEN SONULAR P.eryngii kompleks trlerinin filogenetik
analizi yaplarak Trkiyede farkl rk ve varyeteler belirlenecektir.
Bu mantar kompleks trlerinin bir rk (var. nebrodensis) IUCNin tr ok
tehlikede olan krmz listesindedir. lkemizde de P.eryngii kompleks
trleri bulunduu doal alanlarda yok olma tehlikesi ile ba baa kald
grlmtr. Bu proje ile bu mantar trnn gen kayna olarak saklanmas
salanm olacaktr. Ayrca bu alma ile, farkl scaklklarda mantar
oluturabilen eit veya eit adaylar da elde edilebilecektir.
Trkiyenin yaklak 25 bin ton kltr mantar retimi vardr. Bu mantar
retiminde kullanlan tohumluk misel eitleri yabanc eitlerdir. Henz
yerli bir eidimiz yoktur. P. eryngii kompleks trleri, farkl
scaklklarda da gelitirilebildiinden (15-20-25-30 OC) enerji
maliyeti de byk lde dm olacaktr. 16Atatrk Bahe Kltrleri Merkez
Aratrma Enstits 17. BTE 17Atatrk Bahe Kltrleri Merkez Aratrma
Enstits Bte Miktar (TL) Oran Ajanstan talep edilen bte 210.000 % 70
E-finansman 90.000 % 30 Toplam bte 300.000 % 100 18. TEEKKRLER
Atatrk Bahe Kltrleri Merkez Aratrma Enstits 18
