Amersham ECL Gel 水平型電気泳動システム …2...

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Data file 電気泳動製品

Amersham ECL Gel 水平型電気泳動システム

Amersham ECL Gelおよび Amersham ECL Gel Boxは、タンパク質用の水平型ミニゲル電気泳動システムです。ゲルは標準 Laemmli （Tris-Glycine） バッファーとの併用が可能で、品質保証期間が製造より 12ヵ月と長くなっています。Amersham ECL Gelはサンプルを、再現性よく分離し、標準的なタンパク質検出プロトコールで十分な機能を発揮します。タンパク質をこのゲルから高い効率で転写できるため、Amersham ECLウェスタンブロッティングのワークフローに組み込むと便利です。

• 組み立て不要な水平型電気泳動システム

• ゲルの均一性が高いため、再現性のある結果の取得に

• 製造後 12ヶ月も安定なのでストックが可能

• ゲルは壊れにくく、電気泳動後の検出ステップでの取扱いに便利

• Amersham ECL Gelカセットにはゲルの取り出しとカットに必要なものが全て含まれます

Amersham ECL Gel システム （図 1） は使いやすい設計になっています。水平型なのでサンプルを添加しやすく、バッファーは少量ですみ、バッファーチャンバー間の漏れリスクがありません。自作ゲルとは異なり、Amersham ECL Gelは再現性が高く、調製に必要な時間が短く、有毒なアクリルアミドへの曝露を避けられます。

Amersham ECL Gelには、15、10、2ウェル型のホモジニアスゲル（10%、12%） とグラジエント Gel （4～12%、8～16%、4～20%） があります。SDS-PAGE用の10倍濃縮泳動バッファーのほか、ウェスタンブロッティングに使用するプレカットした Hybondメンブレンもご用意しています。

ゲルにはドデシル硫酸ナトリウム （SDS） が含まれていないため Native-PAGE、SDS-PAGEの両方に対応可能です。

図 1　Amersham ECL Gel システム：ポリアクリルアミドゲル電気泳動 （PAGE） 用のプレキャストゲル、ゲルボックスおよびプレミックス泳動バッファー使用の水平型システム。

71-3487-11

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サンプルの適用とゲルの取り扱いが容易Amersham ECL Gel システムは、アガロースゲル DNA電気泳動と同等の使いやすさで PAGEを行える設計となっています （図 2）。

縦型電気泳動システムとは異なり、水平型のシステムはゲル表面が見やすく、電気泳動の全体像や添加後のサンプルの観察が容易です。

図 2A　Amersham ECL Gelはプラスチックカセットにしっかりと梱包してお届けします。カセットをAmersham ECL Gel Boxにセットします。ウェル上のコームを外してサンプルを添加できるようにします。

図 2B　水平型なので、サンプル添加操作を無理なく効率的に行え、また電気泳動の全体像を把握できます。

図 2C　カセットを開けるツールとしてコームを使用できます。他のツールは必要ありません。

図 2D　流動後カセットの上端を使用して余分なゲルを取り除きます。

電気泳動後の処理を行うために、ゲルをゲルカセットから簡単に取り外せます。Amersham ECL Gelの厚さは他の多くのプレキャストゲルや自作ゲルよりも若干厚い1.4 mmですので、取り扱いが簡単で、ゲルが壊れるリスクが低く、流動後の処理に便利です。このゲル厚により、予備電気泳動で添加できるサンプル量も増え、2ウェルゲルではウェル当たり最大 100 μlです。

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ゲルの性能：高い品質保証期間Amersham ECL Gelは、製造から 12ヵ月間品質を維持しています。図 3に示すように、保存期間にかかわらず一貫した結果が得られます。

図 3　同じロットの 4～ 12% Amersham ECL Gel 2枚を使用し、時期を変えて電気泳動を行いました。 A＝ 製造直後のゲルを使用した結果。 B＝ 12ヵ月間保管した同じロットのゲルを使用した結果。

A B

A B

ゲルの性能：分離能と感度PAGE後、ゲルの全タンパク質染色を行うことでタンパク質を検出できます。もっとも広く使用されている染色色素はクーマシーブルー色素ですが Deep Purple Total Protein Stainなどの蛍光染料試薬を用いると感度が向上します。

以下に示す例では、HeLa細胞の全可溶化液と精製トランスフェリンについて SDS-PAGEを実施しました。 電気泳動後、Deep Purple Total Protein Stainおよびクーマシーブルーでゲルを染色しました （図 4）。どちらの染色でもタンパク質サンプルに対する高い分離能があることが分かり、Amersham ECL Gelはウェスタンブロッティングや純度分析などの分析手法に適していることがわかります。

図 4　未精製サンプルと精製サンプルを Amersham ECL GelによるSDS-PAGE後に （A） Deep Purpleまたは （B） クーマシーブルーで染色。

Gel type: Amersham ECL Gel 12%, 10 wellsSample: Two-fold dilution series of HeLa cell lysate (Deep Purple from 500 ng, Coomassie Blue from 1 µg) and transferrin (Deep Purple from 500 ng, Coomassie Blue from 1 µg) Detection: (A) Deep Purple, (B) Coomassie BlueImaging: (A) Typhoon* FLA 9000, (B) ImageScanner* IIIAnalysis: ImageQuant* TL 7.0

500 ng 250 ng 125 ng 62.5 ng 500 ng 250 ng 125 ng 62.5 ng

Cell lysate Transferrin

1 µg 500 ng 250 ng 125 ng 1 µg 500 ng 250 ng 125 ng

Cell lysate Transferrin

B

A

ゲルの種類： 12%Amersham ECLゲル、10ウェルサンプル： HeLa細胞可溶化液およびトランスフェリン溶液の 2倍段階希釈液

（両サンプルとも、500 ngを起点とする希釈液をディープパープル染色、1 µgを起点とする希釈液をクーマシーブルー染色）

検出： （A）ディープパープル、（B）クーマシーブルーイメージング： （A）Typhoon FLA 9000、（B）ImageScanner III解析： ImageQuant TL 7.0

500 ng 250 ng 125 ng 62.5 ng 500 ng 250 ng 125 ng 62.5 ng

1 µg 500 ng 250 ng 125 ng 1 µg 500 ng 250 ng 125 ng

細胞可溶化液 トランスフェリン

B

A

細胞可溶化液 トランスフェリン

ゲルの種類： 12% Amersham ECL Gel、10 ウェルサンプル： HeLa 細胞可溶化液およびトランスフェリン溶液の 2倍段階希釈液

（両サンプルとも、500 ng を起点とする希釈液を Deep Purple染色、1 μg を起点とする希釈液をクーマシーブルー染色）

検出： （A）Deep Purple、（B）クーマシーブルーイメージング： （A）Typhoon FLA 9000、（B）ImageScanner III解析： ImageQuant TL 7.0

4

図 5　相対的なバンド移動パターン。この図は、特定の分子量を持つタンパク質が Amersham ECL Gel中で移動して到達すると予測される相対的位置を、ゲルの濃度別に示しています。Amersham ECL Gelの一般的な分離時間は 1時間です。

図 6　IgG精製工程の血漿画分を Deep Purple Total Protein Stainで染色したもの。IgGの濃縮と精製の過程を、供給源の血漿プール （レーン1） から精製 IgG （レーン 14） まで追うことができます。レーン 7と 11で泳動させた画分は、それぞれアルブミンとトランスフェリンがどこで IgGと分離されるかを示しています。

図 7 GST-GFP-Hisのカラム内切断後溶出画分の SDS-PAGE。 矢印は GFPの位置を示します。

レーン 1：出発物質 （GST-GFP-His）。 レーン 2～ 4：プロテアーゼ Aによる切断後の溶出液。 レーン 5：LMW-SDS Marker Kit。 レーン 6～ 8：プロテアーゼ Bによる切断後の溶出液。 レーン 9：プロテアーゼ A使用時の GST SpinTrapからのフロースルー。 レーン 10：プロテアーゼ B使用時のGST SpinTrapからのフロースルー。

カラム内切断効率の評価この実験では、2種類のプロテアーゼの活性と切断効率を比較しました。green fluorescent proteinと結合させた Glutathione S-transferase （GST-GFP） をサンプルとして使用しました。GST-GFPを GST SpinTrapに結合させ、数回洗浄した後、プロテアーゼ Aまたはプロテアーゼ Bを加えました。

溶出した純粋なタグのない GFPの全体的な収率はどちらのプロテアーゼでも約 60%で、Amersham ECL Gelを用いた SDS-PAGEでの移動パターンも同等でした （図 7）。

手法に合ったゲルの選択Amersham ECL Gelは、SDSを含まないプレキャストゲルです。そのため、泳動バッファーとサンプル溶解バッファーの組成を選択することで、ユーザが分離条件を選択することができます。

高分子量のタンパク質を PAGEで分離するにはポリアクリルアミド密度が低いゲルが必要ですが、分子量が比 較的小さいタンパク質の分離にはポリアクリルアミド密度が高いゲルが必要です。分子量が広範囲にわたる複数のタンパク質を分離するには、グラジエントゲルが適しています。Amersham ECL Gelにはさまざまな濃度のものがありますので、サンプル中のタンパク質の予測サイズに従って最適なゲルを選択します （図 5）。

ヒト血漿から得た IgGの純度の評価液体クロマトグラフィーシステム ÄKTApilotを用いたヒト血漿由来 IgG精製工程の各段階のサンプルで SDS-PAGE を行いました （図 6）。PAGE 後、ゲルを Deep Purple Total Protein Stainで染色しました。液体クロマトグラフィーのフラクショネーション後のタンパク質純度分析に Amersham ECL Gelが十分な分離能をもっていることが分かりました。

ゲルの種類： 4～ 20%Amersham ECLゲル、15ウェル サンプル： IgG精製工程の血漿画分

全タンパク質量 500 ng検出： ディープパープル全タンパク質染色イメージング： Typhoon FLA 9000解析： ImageQuant TL 7.0

1 2 3 4 5 6 7 8 19 411 12 1310

IgG

トランスフェリン

画分

アルブミン

Gel type: Amersham ECL Gel 4-20%, 15 wells Sample: Plasma fractions from an IgG purification process, 500 ng total proteinDetection: Deep Purple Total Protein StainImaging: Typhoon FLA 9000Analysis: ImageQuant TL 7.0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1411 12 1310

IgG

Transferrin

Fraction

Albumin

Gel type: Amersham ECL Gel 8-16%, 10 wells Sample: GST-GFP-His, 1 to 2 µg/wellDetection: Deep Purple Total Protein StainImaging: Typhoon FLA 9000Analysis: ImageQuant TL 7.0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Fraction

GFP

ゲルの種類： 8～ 16%Amersham ECLゲル、10ウェル サンプル： GST-GFP-His、1～ 2 µg/ウェル検出： ディープパープル全タンパク質染色イメージング： Typhoon FLA 9000解析： ImageQuant TL 7.0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

画分

ゲルの種類： 4 ～ 20% Amersham ECL Gel、15 ウェルサンプル： IgG 精製工程の血漿画分 全タンパク質量 500 ng染色： Deep Purple Total Protein Stainイメージング： Typhoon FLA 9000解析： ImageQuant TL 7.0

ゲルの種類： 8 ～ 16% Amersham ECL Gel、10 ウェルサンプル： GST-GFP-His、1 ～ 2 μg / ウェル検出： Deep Purple Total Protein Stainイメージング： Typhoon FLA 9000解析： ImageQuant TL 7.0

10% 12% 4-12% 8-16% 4-20% gradient gradient gradient Gel concentration 10% 12% 4-12% 8-16% 4-20%

勾配 勾配 勾配ゲル濃度

グラジエントホモジニアス

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図 8　LMW-SDS Marker Kitに含まれている 2種のタンパク質の PVDFメンブレン上の量 （セミドライ式転写後） と Amersham ECL Gel中の量 （セミドライ式転写の前後）。タンパク質はメンブレンに効率的に転写し、ゲルに残るタンパク質は少量です。

図9　HEK 293T細胞をTGF-βで刺激した後のp38とpp38の定量的ウェスタンブロッティング分析。データは、スウェーデン、ウメオ大学のMarene Landström教授のご厚意によります。

ウェスタンブロッティングと Amersham ECL GelSDS-PAGEはウェスタンブロッティング前にタンパク質を分離する方法としてもっとも広く使用されています。Amersham ECL Gelからの転写は効率が高く、一般にタンパク質量の 95%程度をメンブレンに転写できます （図8）。Amersham ECL Gelを使用することで高感度のウェスタンブロッティングに適した条件が得られ、またこのゲルは Amersham ECL Primeおよび ImageQuant LAS 4000イメージャーの使用に合わせて至適化されています。

0

50

100

150

200

250

シグナル強度の変化（

%）

転移前のゲル中のシグナル強度

転移後のゲル中のシグナル強度

転移後のメンブレン上のシグナル強度

全タンパク質量 43.3 ng 66 kDaのタンパク質 30 kDaのタンパク質

転移効率

ウェスタンブロッティング： 翻訳後修飾を定量するp38は細胞の分化とアポトーシスに関与するマイトジェン活性化タンパク質キナーゼで、リン酸化による調節 を受けます。ここで、HEK 293T細胞を形質転換増殖因子 -β（TGF-β） に曝露した例を示します。Amersham ECL Gelで細胞可溶化液の PAGEを行った後、ウェスタンブロッティングを行って p38とリン酸化 p38 （pp38） の濃度を経時的に評価しました （図 9）。ハウスキーピングタンパク質 GAPDHの濃度で標準化した後、pp38の相対的定量を行いました。

p38は TGF-βによる刺激に対して 30分後に反応しリン酸化しました。電気泳動の結果より pp38のシグナルのピークが 120分後にあるように見えます。しかし、GAPDHシグナルに対し標準化した結果は、pp38量のピークは 120分後ではなく 30分後にあることを示しています。その後、TGF-βの存在下で pp38はリン酸化された状態を保っています。

ここに示したウェスタンブロッティングの結果は、Amersham ECL Gelを使用することでタンパク質の転写と分析に最適な条件が得られ、タンパク質発現のわずかな変化や翻訳後修飾を精密に定量できることを示しています。

Gel type: Amersham ECL Gel 4-20%, 10 wellsSample: Lysate from HEK 293T cells stimulated with TGF-β for 0, 30 and 120 min. Equal volumes of each sample were loaded in duplicate on one gelMembrane: Amersham Hybond-P (PVDF)Blocker: 5% BSA in PBS-TweenPrimary Abs: Mouse polyclonal anti-human p38 (1: 5000) Mouse monoclonal anti-human pp38 (1: 5000) Mouse monoclonal anti-GAPDH (1: 2500)Secondary Ab: Polyclonal HRP-conjugated anti-mouse IgG (1: 50 000)Detection: Amersham ECL Prime Imaging: ImageQuant LAS 4000 miniAnalysis: ImageQuant TL 7.0

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 min 30 min 120 min

0 min 30 min 120 min

pp38

GAPDH

p38

Relative quantitation of pp38

Phosphorylation of p38 after TGF-β stimulation

ゲルの種類： 4 ～ 20% Amersham ECL ゲル、10 ウェルサンプル： TGF- β による刺激時間が 0、3、120 分の HEK 293T 細胞可溶化液。

1 枚のゲルに各サンプルを同量、2 回ずつ添加。メンブレン： Amersham Hybond-P（PVDF）ブロッカー： PBS-T（Tween）に溶解した 5% の BSA一時抗体： 一次抗体： マウスポリクローナル抗ヒト p38 抗体（1：5000） マウスモノクローナル抗ヒト pp38 抗体（1：5000） マウスモノクローナル抗 GAPDH 抗体（1：2500）二次抗体： ポリクローナル HRP 標識抗マウス IgG 抗体（1：50,000）検出： Amersham ECL Primeイメージング： ImageQuant LAS 4000mini解析： ImageQuant TL 7.0

転写効率 ■ 転写前のゲル中のシグナル強度 ■ 転写後のゲル中のシグナル強度 ■ 転写後のメンブレン上のシグナル強度

ゲルの種類： 4～ 20%Amersham ECLゲル、10ウェルサンプル： TGF- による刺激時間が 0、3、120分の

HEK 293T細胞可溶化液。1枚のゲルに各サンプルを同量、2回ずつ負荷。

メンブレン： Amersham ハイボンド- P（PVDF）ブロッカー： PBS -トゥイーン（Tween）に溶解した 5%の BSA一次抗体： マウスポリクローナル抗ヒト p38抗体（1：5000）

マウスモノクローナル抗ヒト pp38抗体（1：5000）マウスモノクローナル抗 GAPDH抗体（1：2500）

二次抗体： ポリクローナル HRP抱合抗マウス IgG抗体（1：50,000）検出： Amersham ECLプライムイメージング： ImageQuant LAS 4000ミニ解析： ImageQuant TL 7.0

pp38の相対的定量

TGF- 刺激後の p38のリン酸化

（GAPDHシグナルに対し標準化した値）

Ordering information 2 wells 10 wells 15 wells (10 gel pack) (10 or 2 gel pack) (10 gel pack)

Product Code no. Code no. Code no.

Amersham ECL 28-9901-60 28-9898-04 28-9898-04 Gel 10% 28-9898-08＊

Amersham ECL 28-9901-61 28-9898-05 28-9901-56 Gel 12% 28-9898-09＊

Amersham ECL 28-9901-62 28-9898-06 28-9901-57 Gel 4-12% 28-9901-51＊

Amersham ECL 28-9901-63 28-9898-07 28-9901-58 Gel 8-16% 28-9901-52＊

Amersham ECL 28-9901-64 28-9901-54 28-9901-59 Gel 4-20% 28-9901-53＊

＊ 2 gel pack

Product Code no.

Amersham ECL Gel Box 28-9906-08

Amersham ECL Gel Running buffer, 250 ml 28-9902-52

Related products Code no.

Hybond-P (8 � 7.5 cm), 10 units 28-9909-83

Hybond-LFP (8 � 7.5 cm), 10 units 28-9909-84

Hybond ECL (8 � 7.5 cm), 10 units RPN7.58D

Protran BA83, 0.2 μm Blotting sandwich (8 � 7.5 cm), 10 units 10-4853-85

Protran BA85, 0.45 μm Blotting sandwich (8 � 7.5 cm), 10 units 10-4853-92

Amersham ECL Prime Western Blotting RPN2232 Detection Reagent, for 1000 cm2 membrane

EPS 301 Power Supply 18-1130-01

Full-Range Rainbow Molecular RPN800E Weight Markers, 250 μl

Bromophenol Blue, 10 g 17-1329-01

Deep Purple Total Protein Stain, 5 ml RPN6305

Amersham ECL Gel specifications

品質保証期間 製造より 12ヶ月　冷蔵保存

ゲルサイズ 80 � 75 � 1.4 mm

ウェル数（容量） 15 (20 μl), 10 (35 μl), or 2 (100 μl) wells

スタッキングゲル 4%

ゲルバッファー Tris-HCl

ランニングバッファー Native-PAGE: 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 SDS-PAGE: 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3

サンプルバッファー Tris-HCl ± SDS or other buffer suitable for the application

Amersham ECL Gel Box specifications

サイズ 167 � 148 � 43.5 mm (W � H � D)

最大電圧 200 V

最大電力 20 W

推弊パワーサプライ EPS 301

使用温度 4 to 40 ℃

必要バッファー量 190 ml / gel

泳動時間 1 h

掲載されている製品は試験研究用以外には使用しないでください。

掲載されている内容は予告なく変更される場合がありますのであらかじめご了承ください。掲載されている社名や製品名は、各社の商標または登録商標です。

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