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7/26/2019 Aula 2 - Enzima de Restrio
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Enzimas de Restrio
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Enzimas de restrio
1970 Purifica-se a primeira enzima de
restrio tipo II: o Hind II (Smith & Wilcox).
1972 Primeiras experincias com DNA
recombinante.
1978 Isolamento e caracterizao de mais de200 enzimas de restrio.
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As enzimas restrio ou endonucleases de restrio, so enzimasque cortam a molcula de DNA atravs do reconhecimento desequncias nucleotdicas especficas.
So enzimas bacterianas que funcionam como tesoura molecularreconhecendo sequncias especficas do DNA.
So altamente especficas.
Estas enzimas funcionam nas clulas bacterianas como parte deum mecanismo de proteo ao ataque de bacterifagos.
Enzimas de restrio
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O uso das enzimas de restrio permite aobteno dos fragmentos de DNA in vitro.
A explorao de sua atividade ecomercializao permitiu um avano naEngenharia Gentica.
Stio normalmente uma palndrome (mesma
sequncia de nucleotdeos com polaridadeinvertida). Ex: osso, anilina.
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Hidrlise Enzimtica
As enzimas de
restrio atuam sobresequncias especficas
do DNA, catalisando a
destruio da ligao
fosfodister entre
nucleotdeos.
Produtos da hidrliseresultam em
extremidades 3-OH e
5-P
5
3
5
3
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Enzimas de restrio Podem ser de 3 tipos: I, II e III.
Reconhecem seqncias de 4 a 8 pares de bases.
Cortes com extremidades abruptas ou coesivas.
Pode-se recombinar DNA humano com qualquer outraespcie.
Fragmentos separados por eletroforese.
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Nomenclatura das enzimas
Primeira letra maiscula gneroe as duas outrasminsculas so espcies.Por exemplo a enzima EcoRI.
E Escherichia (gnero)
co coli (espcie)
R RY13 (estirpe)
IPrimeira
identificada
(ordem de identificao da
bactria)
5N-N-N-G-A-A-T-T-C-N-N-N 33N-N-N-C-T-T-A-A-G-N-N-N 5
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Extremidades abruptas X coesivas
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Extremidades Coesivas
Extremidades Cegas
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ENZIMAS DE RESTRIO E O DNA RECOMBINANTE
Endonucleases que conferem proteo sbactrias contra vrus invasores.
Stios de restrio: seqncias
palndrmicas
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Quando se separa o DNA cortado pela
EcoRI obtemos extremidades coesivas ou
adesivas (corte assimtrico) porque se
podem sobrepor novamente.
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Nem todas as enzimas de restrio produzemextremidades coesivas. Algumas fazem cortessimtricos resultando extremidadesdenominadas abruptas ou retas.
A sequncia a seguir apresentada asequncia de reconhecimento da SmaI,endonuclease de restrio isolada a partirda Serratia marcescens.
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Resultado:
Em concluso, da especificidade dasequncia de determinada molcula deDNA, cada enzima de restrio gera umconjunto nico de fragmentos.
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Quais as enzimas que produzem:a) Extremidades abruptas?
b) Extremidades coesivas?
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IzoesquizmerosDiferentes enzimas de restrio que possuem a
mesma sequncia de reconhecimento
Diferem nas condies timas de reao, naestabilidade
Enzimas derestrio Sequncia dereconhecimento
SacIGAGCTC
CTCGAG
SstI
GAGCTC
CTCGAG
Exemplo:
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Fatores que influenciam a atividade das enzimas de
restrio:Composio do tampo
! Diferem na fora inica (concentrao de sal)
! Diferem no ction principal (Na+ou K+)
! Soluo: Manter o pH da reao (geralmente em 8.0)
Temperatura de incubao!
A maioria das enzimas cliva melhor a 37C
!Excees: Bactrias termoflicas clivam melhor entre 50 a 60C.
Enzimas com tempo de meia vida pequeno a 37C, recomenda-se a
incubao a 20C.
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Restrio enzimtica
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