Industrijska proizvodnja enzimaIndustrijska proizvodnja enzima Oko 400 kompanija uključene su u proizvodnju enzima od kojih se samo 16 smatraju osnovnim proizvođačima (60% zemlje zapadne Evrope, 15% SAD i zemlje Južne Amerike, 15% Japan i 10% ostali)

Oko 85% proizvedenih enzima su hidrolaze i to 60% proteaze, sledeća najveća grupa industrijskih enzima su amilaze

Povećanju industrijske proizvodnje enzima doprineo je razvoj u oblasti genetičkog i proteinskog inženjerstva kao i razvoj metoda za prečišćavanje enzima. Zahvaljujući progresu u mikrobiologiji i genetici, procesi proizvodnje enzima postaju sve jeftiniji tako što se sve više dobijaju mikrobnim fermentacijama umesto izolacijom iz biljnih i životinjskih tkiva.

Enzimi koji se koriste u prehrambenoj industriji su danas najmanje za 20-35% jeftiniji u odnosu na 1970. godinu

U industrijskim enzimskim procesima koristi se realtivno mali broj enzima (oko 50 od nekoliko hiljada), dok se enzimi koji se koriste u analitičke, dijagnostičke i terapeutske svrhe još uvek ne mogu proizvesti u dovoljnim količinama

Kompanije koje se bave osnovnom proizvodnjom enzima

Kompanije koje se bave osnovnom proizvodnjom enzima

Amano Pharmaceutical Co., JapanBiocatalysts Ltd, WalesEnzyme Development Corp., USADanisco Cultor, FinlandDSM-Gist, The NetherlandsMeito Sankyo Co., JapanNagase Biochemicals, JapanNovo Nordisk, DenmarkRhone-Poulenc, EnglandRohm GmbH, GermanySankyo Co., JapanShin Nihon Chemical Co., JapanSolvay Enzymes GmbH, GermanyYakult Biochemical Co., Japan

Načini dobijanja enzima:Načini dobijanja enzima:• Mikrobiološkim ferementacijama 90%

• Izolacijom iz biljnih tkiva 4%

• Izolacijom iz životinjskih tkiva 6%

• Mikrobiološkim ferementacijama 90%

• Izolacijom iz biljnih tkiva 4%

• Izolacijom iz životinjskih tkiva 6% Porast produkcije mikrobnih enzima od sredine 1950. godine uglavnom je posledica sledećih faktora:

Porast produkcije mikrobnih enzima od sredine 1950. godine uglavnom je posledica sledećih faktora:progres u biotehnologiji posle II svetskog rata,

činjenica da se veliki broj industrijskih enzima može proizvesti pomoću mikroorganizama u neograničenim količinama,odvijanje procesa u kontrolisanim uslovima usled čega se dobija proizvod ustaljenog kvaliteta i prinosa,veća ekonomičnost procesa usled kratkih fermentacionih ciklusa i jeftinih hranjivih podloga,biljna i životinjska tkiva sadrže više toksičnih supstanci od mikroorganizama (fenoli, inhibitori enzima, proteaze)produkcija se može povećati izborom soja, korišćenjem mutantnih mikroorganizama, optimizovanjem procesa kultivacije i tehnologijom rekombinantne DNK.

Enzimi dobijeni iz biljakaEnzimi dobijeni iz biljaka• Neustaljen prinos i kvalitetNeustaljen prinos i kvalitet

• Mogu se proizvesti ograničene količine enzimaMogu se proizvesti ograničene količine enzima

• Neki enzimi se još uvek isključivo tako proizvodeNeki enzimi se još uvek isključivo tako proizvode

Pregled enzima koji se dobijaju iz biljaka

-zrenje mesa, bistrenje piva, u kozmetici, terapeutski enzim

-u pekarstvu i pivarstvu, kozmetici, terapeutski enzim

-za dobijanje važnih farmaceutika-u dijagnostici, antioksidans, zaštitna uloga

-antioksidans u prehrambenoj industriji, zaštitna uloga

-zrenje mesa

-u pekarstvu i dobijanje maltoznih sirupa

Pregled enzima koji se dobijaju iz životinja

Enzimi dobijeni iz životinjaEnzimi dobijeni iz životinja• Tkiva životinja nisu dostupna u dovoljnim Tkiva životinja nisu dostupna u dovoljnim

količinamakoličinama

• Mali prinos, visoke ceneMali prinos, visoke cene

• Zaštita životinjaZaštita životinja citohrom P450 monooksigenaza sisara (farmakokinetičke studije pri razvoju novih lekova Lizozim iz jajeta Urokinaza iz humanog urina

Renin (himozin)

Pepsin i tripsin

Amilaza, esteraza, pankreasna lipaza, pepsin, tripsin, fitaza, fosfolipaze iz stomaka mladih preživara (stereospecifična hidroliza i sinteza za dobijanje važnih farmaceutika) Ipak, neki specifični enzimi koji bi mogli otvoriti

perspektive novim enzimskim procesima, nalaze se samo u višim eukariotama. Iako je veliki broj ovih procesa u fazi istraživanja, rezultati dobijeni u oglednim postrojenjima su veoma obećavajući za proizvodnju finih hemikalija i lekova

Ipak, neki specifični enzimi koji bi mogli otvoriti perspektive novim enzimskim procesima, nalaze se samo u višim eukariotama. Iako je veliki broj ovih procesa u fazi istraživanja, rezultati dobijeni u oglednim postrojenjima su veoma obećavajući za proizvodnju finih hemikalija i lekova

Pregled industrijskih enzima i njihovih izvoraPregled industrijskih enzima i njihovih izvora

• Proizvodni proces zavisi od • Proizvodni proces zavisi od Potrebnog kvaliteta

Primene

Mikrobiološka proizvodnja enzimaMikrobiološka proizvodnja enzima

• Industrijski enzimi se dele na:• Industrijski enzimi se dele na:

Tehničke enzime (>10000 t god-1, 0,1% enzima, 3-25 US dolara kg-1)

Analitički i terapeutski enzimi (100000 Us dolara kg-1)

Količine koju je potrebno proizvesti

Cene koštanja

• Prema mestu izlučivanja enzimi se dele na:• Prema mestu izlučivanja enzimi se dele na:

Ekstracelularne (amilaze i proteaze iz Bacillus sp., pektinaza i lipaza iz Aspergillus sp., celulaza iz Trichoderma sp.)

Periplazmatične (penicilin-amidaza iz E. coli)

Intracelularni (glukozo-izomeraza i asparaginaza pomoću bakterija i streptomiceta)

• Važna podela enzima sa aspekta njihove proizvodnje

na:

• Važna podela enzima sa aspekta njihove proizvodnje

na: Induktivne

Delimično induktivne

Mikrobiološka proizvodnja enzimaMikrobiološka proizvodnja enzima

• Skoro svi industrijski enzimi su induktivni (amilaze,

pektinaze, laktaza, lipaza, glukozo-izomeraza, penicilin-

amidaza i drugi)

• Skoro svi industrijski enzimi su induktivni (amilaze,

pektinaze, laktaza, lipaza, glukozo-izomeraza, penicilin-

amidaza i drugi)

Konsekutivne

• U proizvodnji enzima primenjuju se dve tehnike gajenja

mikroorganizma

• U proizvodnji enzima primenjuju se dve tehnike gajenja

mikroorganizma tehnika gajenja na čvrstim podlogama

tehnika submerznog gajenja u tečnim podlogama

- diskontinualna - polukontinualna (dolivni postupak)

- kontinualna

• Najvažniji faktori koji utiču na proizvodnju

enzima

• Najvažniji faktori koji utiču na proizvodnju

enzima izbor mikroorganizma

sastav hranljive podloge

Mikrobiološka proizvodnja enzimaMikrobiološka proizvodnja enzima

uslovi kultivacije

regulatorni mehanizmi

• Tehnološki proces proizvodnje sastoji se od tri faze:• Tehnološki proces proizvodnje sastoji se od tri faze:

priprema inokuluma

kultivacija MO u cilju biosinteza enzima

izolacija i prečišćavanje enzima iz čvrste ili tečne profermentisane podloge

• Specifičnosti proizvodnje enzima:• Specifičnosti proizvodnje enzima: veliki broj industrijskih enzima je induktivan

biosinteza enzima suzbija se kataboličkom represijom

prinos i aktivnost enzima zavise od post-translacionih modifikacija

BIOSINTEZA ENZIMABIOSINTEZA ENZIMA Proces biosinteze enzima sastoji se od:

Transkripcije

Translacije i

Post-translacionih modifikacija

U procesima transkripcije i translacije u ćeliji nastaje sirovi pre-proenzim. Ovakav enzim je obično neaktivan ili slabo aktivan i da bi se formirao aktivan oblik obično su posle biosinteze polipeptidnog niza potrebne post-translacione modifikacije.

Nekovalentno vezivanje kofaktora (metalnog jona, biotina, prirodoksal-fosfata itd),

Kovalentno vezivanje kofaktora i drugih molekula (mono- i oligosaharida, fosfatnih grupa, hema itd.) i

Proteolitička hidroliza pojedinih sekvenci polipeptidnog lanca pre-proenzima

BIOSINTEZA ENZIMABIOSINTEZA ENZIMA

BIOSINTEZA ENZIMABIOSINTEZA ENZIMA Procesi hemijskog vezivanja šećerne komponente za proteinski deo molekula pri čemu nastaju glikozilovani enzimi vrše se samo kod ekstracelularnih enzima u eukariotskim organizmima procesi aktivacije pre-proenzima proteolitičkom hidrolizom određenih segmenata su važni samo za ekstracelularne i periplazmatične enzime Enzimi se prema mestu nastanka, izlučivanja i delovanja dele na:

Ekstracelularne

Intracelularne

Periplazmatične

Nakupljaju se unutar ćelije, postoji razlika: pravi intracelularni enzimi se nakupljaju u citoplazmi, a drugi u periplazmatičnom prostoru.

Izbacuju se u izvanćelijski prostor u proenzimskom obliku i aktiviraju se tek u spoljašnjoj sredini

UTICAJ NA REGULATORNE MEHANIZMEUTICAJ NA REGULATORNE MEHANIZME Kod velikog broja industrijskih enzima, dolazi do značajnog povećanja prinosa nakon dodatka određene supstance-INDUKTORA

REGULATORNI MEHANIZAM NA NIVOU TRANSKRIPCIJE-odgovorni geni za sintezu enzima se uključuju i isključuju u zavisnosti od potrebe

Veliki broj kataboličkih enzima je induktivan, pa je potrebno dodati:

SAHAROZU

SKROB ILI DEKSTRIN

GALAKTOZU

Za proizvodnju -AMILAZE

Za proizvodnju INVERTAZE

Za proizvodnju -GLAKTOZIDAZE

Kontrola proizvodnje enzima koji su nestabilni pod procesnim uslovima pomoću dodatka induktora

Induktori-skupe supstance, konstruišu se konstitutivni mutanti

UTICAJ NA REGULATORNE MEHANIZMEUTICAJ NA REGULATORNE MEHANIZME Proizvodnja industrijskih enzima je često podložna KATABOLIČKOJ REPRESIJI-isključenje ekspresije strukturnog gena u prisustvu lako iskoristivih izvora ugljenika

KATABOLIČKA REPRESIJA GLUKOZOM

Glukoza suzbja sintezu proteaza iz B. megaterium

Glukoza, skrob, glicerol suzbijaju produkciju celulaza iz Trichoderma viride

PRIMERI:

Sinteza enzima je kontrolisana REPRESIJOM POVRATNOM SPREGOM (feedback represion) ili REPRESIJOM KONAČNIM PROIZVODOM

primeri kod anaboličkih enzima, ali se može sresti i kod kataboličkih u retkim slučajevima

Specifičnosti u proizvodnji enzimaSpecifičnosti u proizvodnji enzima proizvodnja enzima ima određenu specifičnost u poređenju sa drugim mikrobiološkim procesima:

veliki broj industrijskih enzima je induktivno, pa je neophodno to imati u vidu pri sasatavljanju hranljive podloge

biosinteza velikog broja enzima suzbija se kataboličkom represijom

proizvodnja enzima nije završena sintezom polipeptidnog lanca u ćeliji, već proces proizvodnje i aktivnost proizvedenog enzima u velikoj meri zavise od post-translacionih modifikacija i

kod ekstracelularnih enzima proces proizvodnje zavisi i od transporta enzima kroz membranu u vanćelijski prostor

NAČINI POVEĆANJA PRINOSA ENZIMANAČINI POVEĆANJA PRINOSA ENZIMA

IZBOROM PRIRODNOG SOJA PROIZVODNOG MIKRO-ORGANIZMA

OPLEMENJIVANJEM PRIRODNOG SOJA KLASIČNIM POSTUPCIMA SELEKCIJE MIKROORGANIZMA

OPTIMIZACIJOM HRANLJIVE PODLOGE I USLOVA KULTIVACIJE

UTICAJEM NA REGULATORNE MEHANIZME

PRIMENOM GENETIČKOG INŽENJERSTVA

Izbor producentaIzbor producenta Većina industrijskih enzima se proizvodi isključivo iz mikroorganizama: pektinaze, celulaze i hemicelulaze, laktaze, glukozoizomeraza, penicilinacilaza, invertaza, fitaza, aspartaza i drugi

Iako se najviše industrijskih enzima proizvodi mikrobiološkim fermentacijama, postoji relativno mali broj mikroorganizama koji se koriste za industrijsku proizvodnju enzima, i to dominiraju sojevi iz Aspergillus, Bacillus i Kluyveromyces (Saccharomyces)

Veliki broj ovih MO već se koriste čitav niz godina u prehrambenoj industriji ili su dobijeni novi sojevi iz ovih sojeva selekcijom i genetičkim manipulacijama. Produkovani enzimi mogu biti intracelularni, što je tipičan slučaj kod onih produkovanih iz E. coli, ili ekstracelularni, kao kod Bacillus sojeva.

Komercijalni sojevi nekih bakterija i plesni mogu da produkuju enzime i do 20 kg m-3.

Enzimi dobijeni iz ovih sojeva smatraju se da imaju GRAS status (na engl. generally recognized as safe).

Izbor producentaIzbor producenta Ukoliko se koriste novi mikroorganizmi za produkciju enzima, ili su dobijeni novi sojevi iz industrijski starih sojeva selekcijom i genetičkim manipulacijama, potrebne su zvanične dozvole i atesti za proizvodnju enzima primenom ovih mikroorganizama, koje se dobijaju nakon dugotrajnih i skupih procedura i ispitivanja.

Proizvodni mikroorganizmi se mogu dobiti izolovanjem iz prirodnih staništa ili se mogu kupiti ili dobiti na poklon od institucija koje imaju zbirke sojeva visoko produktivnih mikroorganizama. Prvi postupak obuhvata izolovanje i prečišćavanje datog mikroorganizma, odabir, oplemenjivanje i testiranje. Naime, sojevi izolovani iz prirodnih staništa obično sintetišu enzime u malom prinosu tako da se oni oplemenjuju odabirom aktivnijih i produktivnijih sojeva i genetičkim manipulacijama.

Izbor producentaIzbor producenta Veoma složen zadatak. Proizvodni mikroorganizam treba da zadovolji puno zahteva:

velika produktivnost

rast na jeftinijim podlogama i adaptiranost na procesne uslove, genetička stabilnost, brz i obilan rast u željenom morfološkom

obliku,

da nije patogen i da ne produkuje toksične suspstance.

da se dobijaju enzimi željenih svojstava i u velikom prinosu (enzimska aktivnost po jedinici zapremine) bez stvaranja sporednih proizvoda, drugih enzima i toksičnih supstanci,

da je omogućeno kasnije jednostavno i lako izdvajanje i prečišćavanje željenog enzima iz fermentacionog medijuma.

Kriterijumi za izbor soja su produkovana enzimska aktivnost, svojstva dobijenih enzima i složenost procedura neophodnih za dobijanje konačnog proizvoda.

Izbor producentaIzbor producenta Enzime sa svojstvima od značaja za industrijsku primenu (termostabilni, pH-stabilni, stabilni u organskim rastvaračima u industrijskim enzimskim reaktorima) produkuju ekstremofilni mikroorganizmi.

Primer:

termostabilna DNA-polimeraza koja se koristi u PCR tehnikama (Taq DNA-polimeraza, Pfu DNA-polimeraza) producenti: Thermus aquaticus i Pyrococcus

Planski se radi na sakupljanju mikroorganizama-*potencijalnih producenata iz celog sveta. Formira se BIBLIOTEKA METAGENOMA (genomi svih mikroorganizama prisutni u uzorku nekog staništa)

Izbor producentaIzbor producenta

Odabir početnog mikroorganizma za proizvodnju lipaza

PRIPREMA INOKULUMAPRIPREMA INOKULUMA Inokulum može biti pripremljen na čvrstoj ili tečnoj podlozi pri čemu može biti u obliku spora ili u vegatativnom obliku. Postupak pripreme inokuluma sastoji se iz reaktivacije osnovne kulture i penošenja tako oživljene kulture na čvrste i u tečne hranljive podloge u nekoliko stupnjeva, prelazeći iz manjih u veće razmere.

Za pripremu inokuluma treba podesiti takve uslove kultivisanja koji će omogućiti dobijanje što veće količine dobro razvijene one forme mikroorganizma (spore ili vegetativni oblik) kojom će se inokulirati proizvodna podloga. Isto tako, oni treba da obezbede bujan rast proizvodnog mikroorganizma u svakom stupnju kao i dobijanje standardnog inokuluma konzistentne veličine i aktivnosti.

Optimizacija u predfermentoruOptimizacija u predfermentoru

• Procesni parametri

Koncentracija šećera

pH

Temperatura

Fermentaciono vreme

Mešanje

Biomasa

Enzim

Dodaju se nutrijenti. Povremeno se odvodi profermentisana podloga kontinualno ili šaržno. U toku semikontinualne fermentacije, održava se faza rasta u kojoj je produkcija enzima optimalna u toku određenog vremena. Ovakav način vođenja procesa može da dovede do produženja ferementacione faze ekspresije željenog enzima. Međutim, veći je rizik od kontaminacije.

Tehnika površinskog gajenja MO na čvrstoj podloziTehnika površinskog gajenja MO na čvrstoj podlozi• Ova tehnika podrazumeva rast mikroorganizma na Ova tehnika podrazumeva rast mikroorganizma na

čvrstoj podlozi bez slobodne vodečvrstoj podlozi bez slobodne vode

• Uglavnom se primenjuje za gajenje kvasaca i plesniUglavnom se primenjuje za gajenje kvasaca i plesni

Jednostavna tehnologija

mala investiciona ulaganja (po nekim procenama za 78% pri proizvodnji lipaze iz Penicillium sp.)

mogućnost korišćenja jeftinih prirodnih materijala, često otpadnih naročito podesan postupak za dobijanje termolabilnih supstanci-enzima olakšana separacija i prečišćavanje enzima-sirovi proizvod fermentacije može se koristiti direktno kao enzimski preparat Smanjen rizik od kontaminacije bakterijama

Prednosti tehnike gajenja na čvrstoj podlozi

Tehnika površinskog gajenja MO na čvrstoj podlozi

Tehnika površinskog gajenja MO na čvrstoj podlozi

Tehnika površinskog gajenja MO na čvrstoj podlozi

Tehnika površinskog gajenja MO na čvrstoj podlozi

• Važni faktori za proizvodnju enzima:Važni faktori za proizvodnju enzima:

Veličina čestica podloge

Sadržaj vlage u podlozi

količina inokuluma

kontrola temperature i drugih parametara procesa

efikasnost prenosa kiseonika

odvodjenje CO2

Tehnika površinskog gajenja MO na čvrstoj podloziTehnika površinskog gajenja MO na čvrstoj podlozi• Postoje dva načina površinskog postupkaPostoje dva načina površinskog postupka

kultivacija proizvodnog MO i biosinteza enzima u tacni, najstariji način koriste se tacne četvrtastog oblika od cinka P=0,25-0,5 m2.

(600 x 800 x 30)debljna sloja hranljive podloge 20-25 mm tacne se stavljaju u komore sa policama povezane sa dva

hodnikaMane: puno ručnog rada, skupo, nema mešanja, hranljiva

podloga se ne meša.

kultivacija proizvodnog MO i biosintezom enzima u bubnjevima

Horizontalni rotirajući bubnjevi Uspravno postavljeni bubnjevi sa rešetkom na dnu

Šema dobijanja enzimskih preparata tehnikom Šema dobijanja enzimskih preparata tehnikom površinskog gajenja površinskog gajenja

1-elevator; 2, 20-vage; 3-bunker; 4-sud za sterilnu vodu; 5-sterilizator; 6-pult za raspodelu hranljive podloge; 7-police; 8-komore; 9-kondicioner; 10-drobilica; 11-dezintegrator; 12, 16-ventili; 13-kalorifer; 14-sušnica; 15-sudopera za kivete; 17-spiralni transporter; 18-sterilizator kiveta; 19-ciklon

KONFIGURACIJE BIOREAKTORA SA ČVRSTOM KONFIGURACIJE BIOREAKTORA SA ČVRSTOM PODLOGOMPODLOGOM

Horizontalni rotirajući bubanj

Reaktor sa napakovanim slojem

Ova tehnika ima najveći značaj za proizvodnju industrijskih enzima, naročito kada je proizvodni mikroorganizam plesan

Koriste se bioreaktori različitih konstrukcija sa mehaničkim mešanjem, moguće mešanje aeracijom ili reaktori sa cirkulacijom tečnosti pomoću pumpe

Faktori koji utiču na prinos enzima:

Producent

Sastav hranljive podloge

Uslovi kultivacije ( aeracija, temperatura pH dodatak PAM)

Stadijum ciklusa rasta

Regulatorni mehanizmi

Tehnika submerznog gajenja MO u tečnoj podlozi

Tehnika submerznog gajenja MO u tečnoj podlozi

Biosinteza se obično izvodi u šaržnim fermentorima sa inten-zivnim mešanjem čija zapremi-na je u intervalu od 10-500 m3 sa automatskom regulacijom parametara procesa koji su prethodno optimizovani: tempe-ratura, pH, pritisak, zapremina tečnosti, brzina mešanja, protok vazduha, prisustvo pene, nivo rastvorenih gasova i jonskih vrsta. Postoje tri načina za odvijanje fermentacije: šaržni, semikontinualni i kontinualni

Tipična šaržna fermentacija traje 18-180 h. Dužina procesa je određena biosintezom enzima

Dodaju se nutrijenti. Povremeno se odvodi profermentisana podloga kontinualno ili šaržno. U toku semikontinualne fermentacije, održava se faza rasta u kojoj je produkcija enzima optimalna u toku određenog vremena. Ovakav način vođenja procesa može da dovede do produženja ferementacione faze ekspresije željenog enzima. Međutim, veći je rizik od kontaminacije.

SEMIKONTINUALNI POSTUPAK

KONTINUALNI POSTUPAK

Fermentor se kontinualno puni svežom podlogom pri čemu se ista zapremina fermentisane tečnosti kontinualno izvodi

Postupak ima ograničenu primenu zbog kontaminacije kao i zbog manjeg prinosa enzima

Podsticajan pri kultivaciji sojeva koji imaju veliku specifičnu brzinu rasta

Optimizacija sastava hranljive podlogeOptimizacija sastava hranljive podloge Sastav podloge zavisi od radnog MO, njegovih fizioloških svojstava, načina kultivacije i od enzima koji se želi proizvesti

Podloga treba da omogući dobar razvoj MO i dobar prinos enzima

U submerznom načinu kultiviranja podloga je tečna (10% S.M.) za razliku od površinskog načina gde se koriste čvrste podloge (55-70%)

Kao izvori ugljenika koriste se skrob, melasa, različiti šećeri

Kao izvoro azota koriste se neorganske azotove soli, mekinje, kazein, hidrolizati proteina, soja, sačme itd. Brašno može biti i izvor C i izvor N

Kao izvori vitamina koriste se kvaščev i kukuruzni ekstrakt

Prikazati na primeru produkcije proteaze iz Aspergillus terricola kako utiče koncentracija izvora N u podlozi na prinos enzima

Sastav hranljive podlogeSastav hranljive podloge

Izvor ugljenikaIzvor ugljenika

PektinPektinSkrobSkrobInulinInulin

LaktozaLaktozaSaharozaSaharozaGlukozaGlukoza

Micelijum Micelijum gg//100ml100ml

0.3320.3320.2100.2100.2800.2800.0200.0200.2700.2700.2250.225

Aktivnost enzimaAktivnost enzimaJediniceJedinice//100 ml100 ml

12601260350350160160

00310310

00

Uticaj izvora ugljenika na prinos pektinaza plesni Uticaj izvora ugljenika na prinos pektinaza plesni Aspargillus nigerAspargillus niger

Izvori ugljenika i azota kao i njihov međusbni odnos variraju za različite mikroorganizme, pa i za različite enzime, pa čak i ako su produkti jednos istog mikroorganizma

Produkcija lipaze iz Candida rugosa još uvek zavisi od optimaizacije uslova kultivacije iako su identifikovani 7 gena koji su kodirani kao odgovorni za produkciju različitih lipaza.

Optimizacija uslova kultivacijeOptimizacija uslova kultivacije

Cilj ferementacije je da se dobije maksimalan prinos enzima pri čemu je koncentracija drugih proteina-kontaminanata minimalna. Optimalni parametri treba da budu utvrđeni eksperimentalno.

Aeracija Proizvodnja velikog broja industrijski važnih enzima je izrazito aeroban proces tako da je neophodna aeracija podloge u toku rasta radnih MO i produkcije enzima.

Kod submerznog načina vazduh se dovodi samo za snabdevanje MO kiseonikom, dok kod površinskog postupka on dovodi i za uklanjanje nastalog CO2 i za odvođenje toplote.

Temperatura Većina plesni su mezofilni MO (22-32 oC), bakterije su često termofilni MO (35-55 oC), a ima i onih koji preferiraju još više temperature

Termofili su značajniji jer su manji problemi sa odvođenjem toplote, kontaminacije su ređe, proizvedeni enzimi su termostabilniji

Optimizacija uslova kultivacijeOptimizacija uslova kultivacije

Optimalna temperatura za rast MO ne mora se poklapati sa optimalnom temperaturom biosinteze enzima. U slučaju kad MO proizvodi više enzima, optimalna temperatura za produkciju nije ista za sve te enzime

Optimizacija uslova kultivacijeOptimizacija uslova kultivacije pH. Početni pH podloge može znatno uticati na biosintezu enzima. U slučaju produkcije nekih enzima taj optimalni pH može biti baš u uskom intervalu, dok kod nekih drugih taj interval je dosta širi.

Uticaj početne pH podloge na produkciju lipaze iz Uticaj početne pH podloge na produkciju lipaze iz PseudomonasPseudomonas, , rast biomase i na finalni pHrast biomase i na finalni pH

Utvrđeno je da dodatak PAM često stimuliše proizvodnju enzima pomoću mikroorganizama. Naročito je veliki efekat kod producenata čija je produktivnost niža.

EnzimEnzim

CelulazaCelulazaInvertazaInvertazaAmilazaAmilaza

IzvorIzvor

Mnoge plesniMnoge plesniMnoge plesniMnoge plesniMnoge plesniMnoge plesni

Odnos prinosa:Odnos prinosa:Podloga sa PAMPodloga sa PAM//podloga podloga

bez PAMbez PAM2020161644

Regulatorni mehanizmiRegulatorni mehanizmi INDUKCIJA

Enzimi se dele na induktivne i konstitutivne. Za amilazu induktori su skrob i dekstrini, za invertazu saharoza, za lipazu masne kiseline, za -galaktozidazu galaktozidi. Sinteza poligalakturonaza i pektinesteraza sintetizovane gljivicom Aspergillus niger indukovana je galakturonskom ili poligalakturonskom kiselinom koje deluju na nivou transkripcije.

INDUKCIJA

Enzimi se dele na induktivne i konstitutivne. Za amilazu induktori su skrob i dekstrini, za invertazu saharoza, za lipazu masne kiseline, za -galaktozidazu galaktozidi. Sinteza poligalakturonaza i pektinesteraza sintetizovane gljivicom Aspergillus niger indukovana je galakturonskom ili poligalakturonskom kiselinom koje deluju na nivou transkripcije.

REPRESIJA POVRATNOM SPREGOM

Biosinteza enzima se usporava nastalim proizvodima. Enzim podložan ovoj represiji-REPRESIVNI ENZIMREPRESIVNI ENZIM. Neposredna i udaljena. Primer: aminokiseline reprimiraju biosintezu bakterijske proteaze. Uklanjanje represora dereprimira biosintezu enzima

REPRESIJA POVRATNOM SPREGOM

Biosinteza enzima se usporava nastalim proizvodima. Enzim podložan ovoj represiji-REPRESIVNI ENZIMREPRESIVNI ENZIM. Neposredna i udaljena. Primer: aminokiseline reprimiraju biosintezu bakterijske proteaze. Uklanjanje represora dereprimira biosintezu enzima

Moguće je dobiti mutante kod kojih je biosinteza enzima nezavisna od prisustva induktora.

KATABOLIČKA REPRESIJA

Biosinteza nekih enzima može biti usporena kada MO raste na lako iskoristivim ugljenikovim supstratima. Mnogu industrijski važni enzimi podvrgnuti su ovom tipu represije. Glukoza reprimira produkciju proteinaza pomoću B. megaterium dok glicerol, skrob, glukoza reprimiraju biosintezu celulaze pomou Trichoderma viride. Biosinteza poligalakturonaze je represirana glukozom u toku transkripcije i translacije, isti slučaj i za lipaze. Male porcije. Mutanti.

KATABOLIČKA REPRESIJA

Biosinteza nekih enzima može biti usporena kada MO raste na lako iskoristivim ugljenikovim supstratima. Mnogu industrijski važni enzimi podvrgnuti su ovom tipu represije. Glukoza reprimira produkciju proteinaza pomoću B. megaterium dok glicerol, skrob, glukoza reprimiraju biosintezu celulaze pomou Trichoderma viride. Biosinteza poligalakturonaze je represirana glukozom u toku transkripcije i translacije, isti slučaj i za lipaze. Male porcije. Mutanti.

DOZIRANJE GENANeki mutanti proizvode značajno više enzima nego što se može očekivati od blokiranja nastajanja represora ili sprečavanja njihovog delovanja. To je zbog uvećanog broja kopija gena odgovornog za proizvodnju određenog enzima. Sada se to reguliše genetskim inženjerstvom.

DOZIRANJE GENANeki mutanti proizvode značajno više enzima nego što se može očekivati od blokiranja nastajanja represora ili sprečavanja njihovog delovanja. To je zbog uvećanog broja kopija gena odgovornog za proizvodnju određenog enzima. Sada se to reguliše genetskim inženjerstvom. Primer: produkcija enzimskog kompleksa pektinaza Kritični parametri su sastav hranljive podloge, proizvodni soj MO, i uslovi kultivacije. Generalno, medijum je smeša ugljenih hidrata (glukoza, melasa, saharoza), izvora N (amonijum soli, ekstrat kvasca, natrijumnitrat, itd.) i neorganskih soli. Većina komercijalno dobijenih pektinaza, najčešće iz sojeva Aspergillus i Rhizopus su induktivni enzimi i pektin se mora dodati u kultivacioni medijum. Pektin se može zameniti primenom otpadnog materijala iz poljoprivrednih kompleksa i nekih prehrambenih procesa koje su bogate u pektinskim supstancama kao što su rezanca šećerne repe, kore citrusa ili jabukovo pire. Međutim, iako se pektinaze proizvode na industrijskom nivou, malo se zna o faktorima koji kontrolišu njihovu biosintezu.

Primer: produkcija enzimskog kompleksa pektinaza Kritični parametri su sastav hranljive podloge, proizvodni soj MO, i uslovi kultivacije. Generalno, medijum je smeša ugljenih hidrata (glukoza, melasa, saharoza), izvora N (amonijum soli, ekstrat kvasca, natrijumnitrat, itd.) i neorganskih soli. Većina komercijalno dobijenih pektinaza, najčešće iz sojeva Aspergillus i Rhizopus su induktivni enzimi i pektin se mora dodati u kultivacioni medijum. Pektin se može zameniti primenom otpadnog materijala iz poljoprivrednih kompleksa i nekih prehrambenih procesa koje su bogate u pektinskim supstancama kao što su rezanca šećerne repe, kore citrusa ili jabukovo pire. Međutim, iako se pektinaze proizvode na industrijskom nivou, malo se zna o faktorima koji kontrolišu njihovu biosintezu.

Za potrebe industrije skroba proizvode se velike količine termostabilne -amilaze iz Bacillusa u uslovima submerzne fermentacije na podlogama sa skrobom, sojinim brašnom ili kukuruznim ekstraktom sa oko 20% suve materije, pri 40 oC i neutralnom pH u uslovima intenzivne aeracije. Stvara se 1-3% ekstracelularnog enzima u toku 5 dana. Preparat se prodaje u tečnom ili suvom obliku.

Glukozo-izomeraza se produkuje ekstracelularno iz bakterija (Bacillus, Microbacterium, Athrobacter) i mikromiceta (Streptomyces, Actinoplanes) u podlogama sa ksilozom ili hemicelulozom (pH neutralan, 30 oC, 2-3 dana submerzna kultivacije. Enzim se stabilizuje imobilizacijom ili jonima kobalta i magnezijuma

Penicilin-acilaza se proizvodi iz E. coli kao periplazmatičan enzim. Veći prinosi se mogu postići stabilizacijom mRNA i primenom metoda genetičkog inženjerstva ili povišenjem temperature. PAŽLJIVA OPTIMIZACIJA TEMPERATURE JE IMPERATIV ZA USPEŠNU PROIZVODNJU, ODRŽAVANJE NISKE KONCENTRACIJE GLUKOZE U HRANLJIVOJ PODLOZI I DODATAK Ca2+

PROIZVODNJA PENICILIN-ACILAZE POMOĆU E. coli

PROIZVODNJA PENICILIN-ACILAZE POMOĆU E. coli

Uticaj koncentracije jona Ca2+ na proizvodnju penicilin-acilaze iz E. coli

Lang et al. su objavili ekspresiju Aspergillus niger poligalakturonaze u kvascu S. cerevisiae. Ovaj kvasac je atraktivan domaćin za proizvodnju food-grade enzima. Pre svega nije patogen i ne sadrži niti produkuje toksine. Rekombinantni protein je najčešće glavna komponenta jer ovaj MO ne produkuje homologe proteine.

Za potrebe industrije skroba proizvode se velike količine termostabilne -amilaze iz Bacillusa u uslovima submerzne fermentacije na podlogama sa skrobom, sojinim brašnom ili kukuruznim ekstraktom sa oko 20% suve materije, pri 40 oC i neutralnom pH u uslovima intenzivne aeracije. Stvara se 1-3% ekstracelularnog enzima u toku 5 dana. Preparat se prodaje u tečnom ili suvom obliku.

Glukoizomeraze se produkuje intraracelularno iz bakterija (Bacillus, Microbacterium, Athrobacter) i mikromiceta (Streptomyces, Actinoplanes) u podlogama sa ksilozom ili hemicelulozom (pH neutralan, 30 oC, 2-3 dana submerzna kultivacije. Enzim se stabilizuje imobilizacijom ili jonima kobalta i magnezijuma

Glukoamilazu produkuju sojevi rodova Aspergillus i Rhizopus. Enzim je aktivan na 55 oC i pH 4,0-5,5. Tečni preparat sadrži 5% aktivnog enzima.

za dobijanje enzima koji se u prirodi nalaze u malim količinama

za dobijanje enzima posebnih svojstava pomoću ekstremofila

PRIMENA GENETIČKOG INŽENJERSTVA PRIMENA GENETIČKOG INŽENJERSTVA

• Važni primeri rekombinantnih enzimaVažni primeri rekombinantnih enzima

E. coli K-12 proizvodi himozin (želuci teladi)

Bacillus subtilis, B. licheniformis proizvodi alkalne proteaze za primenu u deterdžentima (iz Bacillus sp)

Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis proizvodi amilaze za industriju skroba (Bacillus sp.)

Rekombinantne pululanaze, lipaze, ksilanaze itd.

• Homologa proizvodnja enzimaHomologa proizvodnja enzima

• Heterologa proizvodnja enzimaHeterologa proizvodnja enzima

REKOMBINANTNI NASUPROT NEREKOMBINANTNIH ENZIMA REKOMBINANTNI NASUPROT NEREKOMBINANTNIH ENZIMA

• Proizvodnja rekombinantnih enzima ima

određenih prednosti

• Proizvodnja rekombinantnih enzima ima

određenih prednosti

Veliki prinos enzima (povećanjem afiniteta RNA-polimeraze prema promotoru ili povećanjem broja kopija gena)

Smanjeno stvaranje sporednih proizvoda i drugih enzima, proteaza

Mogućnost primene GRAS mikroorganizama

Mogućnost promene svojstava proizvedenog enzima

Dobijanje aktivnijeg enzima

Veliki prinos enzima (povećanjem afiniteta RNA-polimeraze prema promotoru ili povećanjem broja kopija gena)

Smanjeno stvaranje sporednih proizvoda i drugih enzima, proteaza

Mogućnost primene GRAS mikroorganizama

Mogućnost promene svojstava proizvedenog enzima

Dobijanje aktivnijeg enzima

REKOMBINANTNI NASUPROT NEREKOMBINANTNIH ENZIMA REKOMBINANTNI NASUPROT NEREKOMBINANTNIH ENZIMA

IZBOR MIKROORGANIZMA-DOMAĆINA IZBOR MIKROORGANIZMA-DOMAĆINA

• Organizam-domaćin treba da:• Organizam-domaćin treba da:

pripada klasi I organizama (GRAS status)

da se uzgaja lako i na jeftinim podlogama

da ne produkuje proteaze i ostale enzime u velikim

količinama

da izlučuje enzime u periplazmu ili van ćelije

da je pogodan za druge tehnološke operacije u cilju izolovanja i prečišćavanja enzima

pripada klasi I organizama (GRAS status)

da se uzgaja lako i na jeftinim podlogama

da ne produkuje proteaze i ostale enzime u velikim

količinama

da izlučuje enzime u periplazmu ili van ćelije

da je pogodan za druge tehnološke operacije u cilju izolovanja i prečišćavanja enzima

IZBOR MIKROORGANIZMA-DOMAĆINA IZBOR MIKROORGANIZMA-DOMAĆINA

• Organizam-domaćin:• Organizam-domaćin:

E. coli K-12-prvi rekombinantni goveđi himozin

Bacillus subtilis i Bacillus licheniformis

Aspergillus niger

Ostali

Generalno: najbolje je odabrati organizam koji je filagenetski najsrodniji, za proizvodnju bakterijskih enzima treba birati bakterije, za fungalne enzime plesni itd.

E. coli K-12-prvi rekombinantni goveđi himozin

Bacillus subtilis i Bacillus licheniformis

Aspergillus niger

Ostali

Generalno: najbolje je odabrati organizam koji je filagenetski najsrodniji, za proizvodnju bakterijskih enzima treba birati bakterije, za fungalne enzime plesni itd.

EKSPRESIONI VEKTORI EKSPRESIONI VEKTORI• Delovi vektora:• Delovi vektora: Selekcioni marker

Snažan promoter

Gen koji kodira enzim

Terminator

Ostalo (gen odgovoran za rezistentnost na antibiotik)

Selekcioni marker

Snažan promoter

Gen koji kodira enzim

Terminator

Ostalo (gen odgovoran za rezistentnost na antibiotik)

• Izbor promotera je od velikog značaja:• Izbor promotera je od velikog značaja:

Od njega zavisi učestalost transkripcije, tj. prinos enzima

Treba da ima veliki afinitet prema RNA-polimerazi

Ima odabrani kodon koji omogućava da se ciljno aktiviraju u prisustvu neke određene supstance (TAC-kodon)

Od njega zavisi učestalost transkripcije, tj. prinos enzima

Treba da ima veliki afinitet prema RNA-polimerazi

Ima odabrani kodon koji omogućava da se ciljno aktiviraju u prisustvu neke određene supstance (TAC-kodon)

EKSPRESIONI VEKTORI EKSPRESIONI VEKTORI

• Primer: proizvodnja enzima pomoću E. coli• Primer: proizvodnja enzima pomoću E. coli TAC kodon-indukuje se u prisustvu laktoze

Podloga: glukoza (2%), izvor N (1%), fosfat (1%), antibiotik

TAC kodon-indukuje se u prisustvu laktoze

Podloga: glukoza (2%), izvor N (1%), fosfat (1%), antibiotik