Enzima Super Bueno

Hctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades

135

ENZIMAS 1) INTRODUCCION A LAS ENZIMAS 137 2)CARACTERISTICAS DE LAS REACCIONES QUE SE ENCUENTRAN BIOLOGICAMENTE CATALIZADAS EN EL METABOLISMO INTERMEDIARIO 139 3) CONSIDERACIONES ESTRUCTURALES 144 4) MECANISMOS PARA DISMINUIR LA BARRERA DE ENERGIA 145 5) CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA 147 6) RELACIONES ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCION 154 7) EFECTO DE LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LA SOLUBILIDAD

Y ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS 156 a) Efecto del pH 156 b) Efecto de la Temperatura 158 8) MECANISMOS ENZIMATICOS 159 9) CINETICA ENZIMATICA 161 10) INHIBICION COMPETITIVA 166 11) INHIBICION NO COMPETITIVA 169 12) INHIBICION ACOMPETITIVA 171 13) EMPLEO DE LAS ENZIMAS EN EL DIAGNOSTICO CLINICO 175 14) ENZIMAS ALOSTERICAS 178 15) COMPORTAMIENTO DE LA HEMOGLOBINA 179 16) EXPRESION DE HILL 181 17) MODULACION DE ENZIMAS ALOSTERICAS 185 18) PURIFICACION DE ENZIMAS 186


136

1) INTRODUCCION A LAS ENZIMAS.


137

Las enzimas son protenas que actan como catalizadores de las reacciones qumicas pertenecientes al metabolismo intermediario. Para ello cuentan con una o varias estructuras del tipo terciario, que mantienen el despliegue de uno o ms sitios activos. El sustrato a su vez, debe aproximarse a la enzima en una posicin espacial complementaria al sitio activo, para que mediante el contacto con este en al menos tres puntos sea reconocida su isomera. Posteriormente, una vez aceptado el sustrato este es modificado qumicamente por los residuos catalticos del sitio activo y transformado en producto. Este ltimo abandona el sitio activo. Entre las enzimas, en su mayora de naturaleza proteica se encuentran algunas excepciones como aquellas denominadas por el nombre de Ribozimas. Estas son molculas de RNA, conocido heteropolmero lineal que acta generalmente como portador de informacin. A pesar de ello se le ha encontrado una nueva facultad, al ser posible su plegamiento en una estructura tridimensional, capaz de catalizar la unin o polimerizacin de varios otros nucletidos. El mecanismo de las reacciones enzimticas se puede explicar en parte, al compararlo con aqul que ocurre en las reacciones qumicas ms simples. En ellas la velocidad de reaccin puede ser aumentada con la temperatura. Esta ltima, incrementa el movimiento, la vibracin o la energa cintica de las molculas de sustrato. Se aumenta el nmero de choques entre ellas y en este estado, son capaces de superar la barrera de energa produciendo las interacciones necesarias consistentes en formar nuevos enlaces o romper los antiguos para formar producto (Fig. 1a - 4). A diferencia de la temperatura, un catalizador biolgico no aumenta la excitacin de las molculas de sustrato, sino que se limita a reducir la barrera de energa. De esta forma a una misma temperatura, una fraccin mayor de molculas de sustrato logra pasar por el estado de transicin y se transforma en producto (Fig. 1b - 4). El incremento de la energa cintica inducido por la temperatura provocara en este caso, tanto la agitacin del sustrato como de la enzima, dificultando la interaccin entre ambos. Se hara ms difcil la formacin de un complejo enzima-sustrato entre ambos, aunque a una determinada temperatura denominada temperatura ptima, se favorezca cinticamente la conformacin de la enzima para lograr el encuentro con el sustrato. Al analizar lo que ocurre en el estado de transicin, se puede decir que este depender de la concentracin del intermediario de transicin X* (Fig. 1b - 4). Este ser capaz de pasar por la barrera de energa. Este compuesto es el ms inestable de todos entre sustratos y productos. La diferencia de energa entre el sustrato S y este intermediario inestable X*, formado en el complejo enzima-sustrato, constituye la energa del estado de transicin. Mientras ms alta la barrera de energa para el estado de transicin ms lenta ser la reaccin. Para entender este planteamiento, se puede hacer una aproximacin considerando que la reaccin entre sustrato S e intermediario X* es inestable o reversible. La constante de equilibrio de esta reaccin, debe estar dada por la ecuacin: K*= X* / S y al proceder a despejar X* tendremos que X* = K* S. Por otro lado, debemos asumir que la formacin del producto P depender de la velocidad con que se descompone el intermediario inestable X* o v = k X* y desde aqu sustituyendo en X* tenemos que finalmente v = k K* S (1). Por otro lado, al aplicar la antigua relacin termodinmica entre G* y la K* de equilibrio de esta reaccin parcial, tenemos que: G* es igual a - RT Ln K*. Lo que al reordenar con el exponente del logaritmo de base e y sustituir en la ecuacin (1), nos entrega la siguiente ecuacin de velocidad de reaccin:


138

v = k (e - G* / RT ) S De esta ecuacin se deduce que las enzimas, aumentan la velocidad de una reaccin si disminuyen G*. Adems, si la reaccin no se dirige nuevamente hacia el sustrato y se estabiliza en el complejo, la energa del estado de transicin disminuye. Por ello, la energa eliminada al unirse el sustrato a la enzima se puede emplear para aumentar la velocidad de reaccin. Esta aproximacin energtica permite explicar que el aumento de la velocidad de reaccin no se relaciona con el otro componente, denominado G(reaccin). = G(sustratos) - G(productos) = - RT Ln Keq(reaccin) (Fig. 1b 4). Este depende de la reaccin misma, es decir de la energa entre sustratos y productos por separado y no unidos a la enzima.

N DE M O L E C U L A S

ENERGIA

BAJA

ENERGIA

ALTA

ENERGIA

BARRERA DE ENERGIA

E N E R G I A

COORDENADA DE REACCIN

S

P G (S) : Energa del

Sustrato S

G (P) : Energia

del Producto P

Reaccin no

catalizada X*:intermediario inestable

Reaccin catalizada

T1 T2

temperatura T2 > T1

a ) Sin Enzima b ) Reaccin con enzima

Fraccin de molculas que pueden reaccionar a mayor temperatura

Los niveles de energa del sustrato G (S) y del

producto G (P) se mantienen igual

con o sin enzima

G*

G reaccin = G (S) - G (P)

G reaccin = - RT Ln Keq reaccin exergnica

X*

Energa G* del estado de transicin

Fig. 1a - 4. Aumento de la velocidad de reaccin por la Temperatura. Fig. 1b - 4. Aumento de la velocidad de reaccin por disminucin de la barrera de energa a temperatura constante . Se observa un poco de confusin cuando se emplea la misma ecuacin G= RTLn Keq para explicar tanto la barrera de energa como la naturaleza de la reaccin misma. Esta puede ser exergnica o endergnica, basndose en la energa que poseen sustratos y productos. En general, las Enzimas no hacen posible las reacciones qumicas. Tampoco convierten reacciones que toman energa en otras que liberan energa. Las enzimas no cambian los niveles energticos de las molculas de sustrato o producto. Las Enzimas solo se limitan a bajar la barrera de energa para aumentar la velocidad de reaccin en uno u otro sentido, que ha sido determinado previamente por la energa que poseen sustratos y productos. En sntesis, las enzimas


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no cambian la constante de equilibrio de una reaccin qumica. Esta llega al equilibrio en un ao sin la enzima o en un milisegundo con la enzima, pero siempre alcanzan la misma proporcin entre sustratos y productos. Volver al inicio 2) CARACTERISTICAS DE LAS REACCIONES QUE SE ENCUENTRAN

BIOLOGICAMENTE CATALIZADAS EN EL METABOLISMO INTERMEDIARIO. Algunos de las expresiones anteriores se detallan a continuacin al caracterizar algunas de las reacciones enzimticas pertenecientes al metabolismo intermediario: a) LA ENZIMA NO CAMBIA LA Keq DE UNA REACCION: Una reaccin qumica no enzimtica puede proceder hasta alcanzar el equilibrio sea este > 1, igual a 1 o < de 1. Esto no significa, que el equilibrio es necesariamente 50 % de Producto (P) y 50% de Sustrato (S), sino que puede ser 10% (S) / 90% (P), 30% (S) / 70% (P) u 80% (S) / 20% (P), etc. Es decir, cualquiera proporcin final entre sustrato S y producto P, despus que estos han tomado o liberado energa del medio. La constante de equilibrio de una reaccin no se altera por la presencia de un catalizador. La reaccin en presencia de la enzima debe alcanzar el mismo equilibrio, pero en mucho menos tiempo. Por ejemplo en una reaccin qumica: Concentracin de Sustrato [S] y Producto [P] Tiempo de la reaccin: t0 inicio [S] -------------> [P] " 100 mM 0 mM " 80 20 " 60 40 " 40 60 tx trmino 20 mM 80 mM Se puede partir de 100 mM de sustrato [S] y 0 mM de producto [P] o viceversa y se llega siempre a la misma constante de equilibrio: Keq = 4, ya sea con o sin enzima. La reaccin en este ltimo caso se har mucho ms rpida, ya que solo aumenta la velocidad con que se llega al equilibrio. b) LA ENZIMA NO CAMBIA LA ENERGIA DE FORMACION DEL SUSTRATO NI DEL

PRODUCTO: Cuando el contenido energtico del sustrato es superior al del producto (Fig. 2a - 4), la reaccin procede hacia el equilibrio qumico con o sin enzima. La nica diferencia como se


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dijo anteriormente, ser el tiempo que le tome alcanzar el equilibrio qumico. Este es mucho menor en presencia de un biocatalizador. Cuando el contenido energtico del sustrato es menor que el del producto (Fig. 2b - 4), la reaccin no ocurre con enzima o sin enzima. No importa si se le agrega ms enzima a esta reaccin, nunca ser posible a menos que otra fuente externa entregue la energa que le falta al sustrato para proceder a transformarse en producto. En este ltimo caso se demorar ms sin enzima que con enzima.

c) EL APORTE DE SUSTRATO Y REMOCION DE PRODUCTO IMPULSA A LAS REACCIONES TANTO ENZIMATICAS COMO NO ENZIMATICAS:

4

3

4

3

E n e r g a

Coordenada de Reaccin

E n e r g a


Proceso exergnico

Proceso endergnico

Reaccin Imposible

Reaccin Posible

K eq > 1

K eq < 1

+

+

Exergnica

Endergnica

++

REACCION ACOPLADA

REACCIONES INDIVIDUALES

Existe un intermediario en comn para ambas reacciones

SUMA ALGEBRAICA DE

AMBAS ENERGIAS

EXERGONICA

ENDERGONICA

a)

b)

c)


Representacin Grfica de las Reacciones

+ +

E n e r g a

Fig. 2a - 4. Reaccin que libera energa. Fig. 2b - 4. Reaccin que necesita energa del medio. Fig. 2c - 4. Reaccin acoplada.


141

Si la reaccin que ocurre de S a P es reversible, ya que cuenta con una Keq cercana a 1. El desplazamiento de la reaccin de izquierda a derecha se ver facilitado por el aporte de sustrato S, desde el precursor R y la remocin del producto P, a medida que este se transforme en Q. E R ----------> S P ------> Q Este efecto ocurrir en presencia o en ausencia de la enzima E y si el producto P se acumula por no pasar a Q, la reaccin se desplazar en reversa de P hacia S. De esta manera es posible explicar aquellas vas metablicas que son reversibles. Degradan sustratos de reserva en ayunas y lo reponen o sintetizan despus que el individuo se ha alimentado. La enzima no hace posible la reaccin en ambos sentidos, solo aumenta la velocidad en que ocurre. d) EL ACOPLAMIENTO CON OTRA REACCION QUE LIBERA ENERGIA Y PRESENTA

UN SUSTRATO EN COMUN, IMPULSA A LAS REACCIONES ENZIMATICAS Y NO ENZIMATICAS.

Aquellas reacciones endergnicas que necesitan energa para proceder de izquierda a derecha (fig. 2c - 5), sern capaces de proceder en ese sentido solo cuando estn acopladas con una reaccin exergnica, cuyo producto sea uno de los sustratos de la reaccin endergnica. Este fenmeno de acoplamiento tambin ocurrir con o sin enzima en la reaccin. e) LAS REACCIONES QUE LIBERAN DEMASIADA ENERGIA EN UN SOLO SENTIDO

NECESITARAN DE VARIOS PASOS ENZIMATICOS PARA INVERTIR LA REACCION EN EL SENTIDO OPUESTO.

Cuando una reaccin es demasiado exergnica en un sentido, ya no es reversible y puede emplear varias etapas catalizadas por otras enzimas para ganar en energa e invertir esta reaccin La reaccin principal catalizada por la enzima E s (fig. 3 4), es muy exergnica y requiere de tres reacciones, ms la energa de un ATP para volver a su estado inicial. Por otro lado en aquellas reacciones que no son demasiado exergnicas, encontramos a la misma enzima catalizando la reaccin inversa, dependiendo de los niveles de sustrato y producto que se acumulen en uno u otro sentido.

Fig. 3 4. Se requiere de 4 reacciones y ATP para remontar esta reaccin.

S P

QR

A XE

E

E

E

ATPADP + P

1

2

3

E Ea s p


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f) LA ENZIMA PROPORCIONA AL SUSTRATO TODOS LOS EFECTOS CATALTICOS INDIVIDUALES QUE PUEDEN OCURRIR EN SOLUCIN, CON LA DIFERENCIA QUE LO LLEVA A CABO AL MISMO TIEMPO Y EN EL MISMO LUGAR.

Al observar la figura 4 - 4 y comparar los casos a), b) y c), encontramos que la hidrlisis del ster a) aumenta de velocidad en ambos casos, ya sea por la catlisis cida o la bsica b), mientras que durante la catlisis enzimtica c), el sitio activo aporta un residuo de aminocido que acta entregando un protn, como ocurre en la catlisis cida y a la vez otro residuo de aminocido remueve un protn del agua para dejar libre un hidroxilo en el lugar adecuado, es decir como ocurre durante la catlisis bsica. Por lo tanto ambas catlisis son aplicadas aqu simultneamente y producirn un desmesurado incremento en la velocidad de reaccin. g) Todas las reacciones biolgicas conocidas hasta ahora pueden ser catalizadas por las siguientes enzimas:

1) OXIDOREDUCTASAS :Actan donando o removiendo tomos de Hidrgeno sobre grupos qumicos

A - 1 + B ------------------ A + B - 1

Fig. 4a - 4. El ster se hidroliza solo con agua. Fig. 4b - 4. Hidrlisis por catlisis cida o bsica. Fig. 4c - 4. Hidrlisis enzimtica. Baja la energa del estado de transicin.

C O O

CO

O HO

HC H

C H

2

2 R1

R2 R1 R2

CO

O HO

HC H

2R1 R2+

+

H

O H

[ ]

[ ]

C O O C H

2 R1

R2 CO

O HO

HCH

2R1 R2+

H O H

HIDROLISIS DE UN ESTER COMO EJEMPLO DE CATALISIS ENZIMATICA

C O O C H

2 R1

R2 CO

O HO

HCH

2R1 R2+

SITIO ACTIVO DE UNA ENZIMA ( ESTERASA )

Residuo Cataltico

Residuo Cataltico

La catlisis ocurre por la presencia de dos residuos del sitio activo de la enzima que se encuentran

posicionados para entregar H+ y OH- al mismo tiempo

+

+

AGUA

C O O

H +

+

+ E N E R G I A

COORDENADA DE REACCIN

BAJA LA BARRERA POR CATLISIS

CIDA O

BSICA

a )

b)

c)

CATLISIS CIDA

CATLISIS BSICA

NH3+

OH -

Reaccin normal sin catlisis

Reaccin con catlisis qumica


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2) TRANSFERASAS: Transfieren grupos funcionales entre molculas aceptoras o donadoras.

A B + C -------------------- A + B - C

3) HIDROLASAS: Donan agua a un enlace hidrolizndolo A - B + H2O ------------------------- A - H + B - H

4) LIASAS: Agregan agua, amonio, o dixido de carbono a los dobles enlaces o extraen estos mismos compuestos dejando dobles enlaces

X Y I I A - B ------------------------------ A = B + X - Y

5) ISOMERASAS: Cambian grupos qumicos de la Configuracin L a la D o bien cambian grupos de su posicin en una molcula

X Y Y X I I I I A - B ------------------------------ A - B 6) LIGASAS: Catalizan reacciones de unin o ligacin entre uno y otro grupo qumico empleando la energa del ATP. A + B ------------------------------ A - B Volver al inicio 3) CONSIDERACIONES ESTRUCTURALES. Importancia de la estructura tridimensional de la enzima: a) Todas las enzimas enfrentan al sustrato en el sitio activo desde al menos tres puntos en el

espacio al mismo tiempo. De esta manera la enzima, puede distinguir la configuracin L o D del sustrato. (Fig. 5 - 4) . Este efecto primario de posicionamiento del sustrato y su posterior catlisis en el sitio activo, hace necesaria una cadena polipeptdica lo suficientemente larga. Solo de esta manera contar la enzima con los pliegues espaciales suficientes, para formar una estructura terciaria adecuada que le permita entrar en contacto con al menos tres residuos catalticos en las coordenadas espaciales X, Y, Z para interactuar con el sustrato (Fig. 5 - 4).


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En el caso contrario, si los tres aminocidos catalticos estuvieran, unidos por enlace peptdico uno a continuacin del otro. No se lograra la posicin tridimensional adecuada durante la etapa de reconocimiento junto al posicionamiento adecuado del sustrato. De esta manera unos pocos aminocidos unidos covalentemente o tan solo una estructura secundaria del tipo secundaria o fibrilar no son suficientes para lograr la conformacin espacial necesaria. A consecuencias de los requerimientos espaciales anteriores, al enfrentar al sustrato la estructura primaria de una protena debe tener un largo mnimo para alcanzar a plegarse y enfrentar en tres dimensiones al sustrato. De esta manera, el sitio activo contar con la disposicin espacial adecuada entregando afinidad y especificidad durante la catlisis. Como es lgico suponer, el andamiaje de la enzima no es rgido y es capaz de sufrir ajustes y desajustes, para as controlar la afinidad por el sustrato y por ende la actividad qumica con que se lleva a cabo la reaccin.

b) Otro factor que depende del tamao de la estructura terciaria de una enzima radica en la

posibilidad de que el sustrato se contacte al azar con la enzima en lugares ajenos al sitio activo. Sin embargo, es posible que desde estos lugares el sustrato sea orientado y guiado hacia el sitio activo por medio de interacciones dbiles. Estas ltimas se encuentran ubicadas en la superficie de la enzima. La estructura enzimtica actuara como un embudo virtual canalizando las molculas de sustrato hacia el sitio activo.

c) Los aminocidos de la superficie de la enzima son adems capaces de ayudar a ubicar a

la enzima en la clula y se emplean tambin durante la interaccin y reconocimiento con otras enzimas u otras estructuras.

d) El tamao promedio de las protenas individuales en E.Coli (Procarionte) es de 25 kD

mientras que en la lnea de clulas HeLa (clulas de una lnea cancergena que se cultivan in vitro) es de 31,7 kD. Las protenas pequeas < 20 kD en Eucariontes son

Y

ZX

x

y

z

C

SITIO ACTIVO

USUBSTRATO

Fig. 5 - 4. Los tres puntos de unin por parte del sitio activo permiten a la enzima distinguir la quiralidad del substrato.


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hormonas o proteasas extracelulares y las grandes > 80 kD son generalmente protenas estructurales o enzimas multifuncionales. Aquellas enzimas que cuentan con varias subunidades, son generalmente regulatorias del metabolismo intermediario y requieren de un complejo ajuste entre las subunidades del tipo regulatorio y las del tipo cataltico

e) Uno de los factores que rige el tamao de las enzimas con varias subunidades, es el rea

mnima de interaccin con otra subunidad. Esta rea alcanza a los 1000 A2 (A= Angstrom) cuando se trata de una interaccin inica dbil en la superficie de una protena esfrica . Por otro lado, en el caso de protenas con PM 10 kD, el rea alcanza a los 1500 A2, lo que es an poco. Sin embargo, en una enzima regulatoria el rea no es lo suficiente para transmitir cambios conformacionales de una estructura proteica individual a otra y debe extender su cadena polipeptdica hasta al menos los 50kD obteniendo con ello una superficie de 7500 A2. Esta superficie sera el mnimo necesario para mantener las interacciones incluyendo una coordinacin de las actividades con aquellas otras subunidades adyacentes en el caso de una enzima multimrica (varias subunidades).

Otro factor a considerar consiste en que a mayor tamao de la subunidad enzimtica se incrementa la masa respecto a la superficie. Este factor puede limitar el tamao y peso de cada subunidad en una enzima multimrica del tipo regulatorio.

Volver al inicio 4) MECANISMOS EMPLEADOS POR LAS ENZIMAS PARA DISMINUIR LA BARRERA

DE ENERGIA. Como en los sistemas biolgicos no se puede aumentar la presin o la temperatura para catalizar una reaccin, se recurre a bajar la barrera de energa mediante los siguientes mecanismos: Primero, las reacciones ocurren en espacios confinados donde el choque entre las molculas de sustrato y enzima es ms probable. A menor volumen mayor es la concentracin. Segundo, existen muchas copias de una enzima para aumentar la posibilidad de un encuentro con el sustrato. En algunos casos las enzimas se encuentran particuladas, formando parte de membranas. Estas ltimas actan como un embudo canalizador de sustrato, mientras que otras enzimas pertenecen a un complejo multimolecular, donde el producto de una reaccin pasa fcilmente a la enzima siguiente y as sucesivamente. Todos estos mecanismos estn destinados a facilitar la interaccin. Tercero, los residuos de la enzima permiten la orientacin adecuada del sustrato para encajar en los residuos catalticos del sitio activo. Este efecto se conoce como Proximidad y Orientacin. Cuarto, la cercana del sustrato a la enzima puede provocar un cambio conformacional en el sitio activo o bien en el sustrato mismo, para aumentar la superficie de interaccin entre ambos. Quinto, el sitio activo es relativamente hidrofbico lo cual impide que el agua se interponga entre las cargas del sustrato y la enzima. Mientras que otras enzimas con sustratos hidrofbicos emplean la contribucin del agua para atraerlo hacia este. Sexto, la catlisis por los residuos del sitio activo puede ser cida General, donde los residuos de aminocidos cidos como Glutmico y Asprtico entregan protones o Bsica General, donde los residuos de aminocidos bsicos como Lisina e Histidina toman protones del agua dejando iones hidroxilos.


146

Sptimo, la catlisis por los residuos de aminocidos puede ser Electroflica, donde un metal (Me+2) complejado a la enzima atrapa electrones o Neutroflica, en que los residuos con grupos (-OH, -SH, -NH2) entregan electrones al sustrato. En la actualidad an no se conocen o comprenden bien, todos los mecanismos existentes por los cuales una enzima disminuye la barrera de energa o aquella energa necesaria para alcanzar el estado de transicin. Volver al inicio 5) CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA. Las enzimas pueden regular su actividad para coordinar el metabolismo sin que existan normalmente acumulaciones de sustratos o productos entre las etapas de sntesis y degradacin. La regulacin de la actividad enzimtica es llevada a cabo por algunos de los mecanismos ilustrados en la Figura 6 - 4: a) Aporte de sustrato y remocin de producto ( Fig. 6a 4). Este tipo de regulacin es el ms comn y se pueden encontrar varios ejemplos a lo largo de cualquiera va metablica. Las reacciones son generalmente reversibles y cuando el flujo de izquierda a derecha se ve alterado por acumulacin del intermediario X, la reaccin se invierte de P a S:


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E1 E2 E3 ASP [ X ] En este tipo de enzimas, al graficar Velocidad de reaccin versus concentracin de sustrato se observa una curva cintica del tipo Hiperblico, la que ser analizada ms adelante. b) Retroalimentacin positiva y negativa en enzimas alostricas ( Fig. 6b 4). Las enzimas alostricas, son aquellas que poseen un sitio extra distinto al sito activo y que se denomina sitio alostrico. En este lugar ubicado en la superficie de la enzima, se pueden unir sin sufrir transformacin qumica tanto el sustrato como el producto de la reaccin, as como cualquiera otro intermediario de la va metablica a la cual pertenece la enzima. En este sitio alostrico la unin de la molcula mediante interacciones dbiles, provoca cambios conformacionales que son transmitidos por la estructura y a su vez afectan ajustando o desajustando la posicin espacial de los residuos del sitio activo o su actividad qumica. Es decir, se modifica la actividad cataltica sobre el sustrato.

Las molculas de sustrato o producto que se unen al sitio alostrico se denominan moduladores. Por lo tanto un modulador es considerado positivo cuando aumenta la actividad de la enzima en el sitio activo. Con ello se incrementa la velocidad con que es

ENZIMA

SITIO ACTIVO

SUSTRATO

SITIO ALOSTERICO

SITIO ACTIVO

ENZIMA

SITIO MODIFICADO COVALENTEMENTE

SITIO ACTIVO

MODIFICADOR QUE SE UNE DE FORMA

COVALENTE

ENZIMA

b) Enzima presente al inicio de una va metablica

c) Enzima modificada covalentemente por la unin de un grupo y que como

resultado puede ser activada o inhibida

a) Esta Enzima puede catalizar una reaccin reversible

S

S S

d) A mayor nmero de copias mayor posibilidad de encontrarse con el

sustrato

P

SUSTRATO

Fig. 6a 4. Aporte de sustrato y remocin de producto Fig. 6b 4. Enzima regulada por sitio alostrico Fig. 6c 4. Enzima regulada por modificacin covalente Fig. 6d 4. Enzima regulada por el nmero de copias


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transformado el sustrato en producto. En algunos casos la primera enzima de una va metablica es la modulada positivamente, por su mismo sustrato e inhibida o modulada negativamente por el producto final de la va metablica (fig.7 4). De esta manera es posible mantener la concentracin constante de los intermediarios, como se observa en el ejemplo al pi de la pgina. Las enzimas no regulables que se encuentran en el medio de esta va funcionan solo por aporte de sustrato y remocin de producto. En estas enzimas ocurre que si el producto tiene mayor concentracin, catalizan la reaccin inversa de producto a sustrato y por eso es

necesario mantener el control del gradiente con el sustrato inicial o bien el producto al final de la va. La enzima final de una va metablica es tambin susceptible de regulacin especialmente cuando el producto final sufre una bifurcacin hacia dos o ms vas distintas. Las enzimas regulatorias cuentan con varias subunidades y algunas pueden ser del tipo cataltica al contener el sitio activo y otras del tipo regulatorio, al contener el sitio alostrico. La cintica de las enzimas alostricas es del estilo Sigmoideo, ya que al graficar 1/Velocidad vs 1/Concentracin (dobles recprocos) no producen una recta, pero s una curva. Esta cintica se explica tanto por los modelos de tipo simtrico como los de conformacin inducida que sern vistos ms adelante. c) Enzimas modificadas covalentemente (Fig. 6c 4). La primera enzima al inicio de una va metablica, puede ser la reguladora de la degradacin de un polmero complejo que se emplea como almacenador de energa. Este puede ser Glicgeno o un depsito de Tracilgliceroles. La enzima encargada de la degradacin debe responder a seales externas a la clula o bien a seales provenientes del metabolismo interno de la clula. As puede aumentar o disminuir su actividad segn sea la necesidad de energa. Por ejemplo, la descarga de epinefrina en la sangre a causa de un estmulo repentino, produce un cambio metablico en la clula sin entrar en ella. Esto se logra mediante una cadena de reacciones desde un receptor celular donde se une la epinefrina, hasta la modificacin covalente de la enzima que regula la degradacin del Glicgeno.

A B C DQ

PE1 E2 E3

E4

E5

+

Fig 7 4. Retroalimentacin negativa y activacin


149

El mecanismo ocurre al ser gatillado por la epinefrina que acta sobre un receptor ubicado en la superficie de un miocito. Este ltimo mediante un cambio conformacional activa a un transductor conocido como Protena G. Esta protena navega por la cara interna de la bicapa para entrar en contacto con la enzima Adenil Ciclasa. Esta ltima al ser activada, produce AMP cclico a partir de ATP. Esta molcula conocida como segundo mensajero (AMPc) acta a su vez sobre una enzima denominada Protena Quinasa, que es capaz de fosforilar, activando o inhibiendo a una enzima efectora. De esta manera se regula y amplifica la degradacin de la macromolcula Glicgeno. Bajo este mecanismo se liberan unidades de Glucosa fosforilada, que posteriormente donarn su energa formando el ATP necesario para la contraccin muscular. En este caso fuera de hacer posible esta va por activacin, mediante la modificacin covalente, se procede tambin a amplificar en cascada para liberar muchas molculas de Glucosa desde el Glicgeno a partir de una sola molcula de Epinefrina. d) Enzimas que regulan su nmero de copias (Fig. 6d 4). Los mecanismos vistos anteriormente tenan respuestas que duraban solo milisegundos, en este nuevo mecanismo que afecta al nmero de copias, la respuesta es en horas.


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A B C DQ

PE1 E2 E3

E4

E5

A

A

RNA pol

E1 E1 E1

[ ]

+

GEN E1

PROMOTOR

ReceptorInhibidor

Fig. 8- 4. Induccin o represin de la expresin de un gen en una enzima Este caso se puede ilustrar con la administracin de una dieta pobre en un determinado sustrato A. Como consecuencias de ello los niveles de las enzimas que procesan al sustrato A disminuyen, por la falta de expresin de uno o ms genes que codifican a las enzimas necesarias para esta va metablica. Este efecto ocurre debido a la presencia de una protena receptora del sustrato A, ubicada en el ncleo como se puede observar en el ejemplo (Fig. 8 - 4). Cuando este receptor especfico del sustrato A, se encuentra por si solo ejerce un efecto inhibitorio de la expresin del gen. Para ello, desencadena un mecanismo en que se bloquea la unin de la RNA pol a la regin promotora e impide la transcripcin del gen. Por otro lado, al producirse una acumulacin de A, la protena receptora se une al sustrato A y ahora no puede unirse al sitio del promotor compitiendo con la RNA pol. De esta manera se produce la transcripcin del gen y un aumento del nmero de copias de la enzima que procesa a este sustrato. La protena que interacciona con el sustrato A puede ser un factor de transcripcin que interviene en la preparacin de la doble hebra de DNA para la unin de la RNA pol. e) Zimgenos o enzimas que se activan al eliminar parte de su secuencia (Fig. 9 4). Algunas enzimas se activan al eliminar parte de su secuencia y este mecanismo se puede ilustrar ampliamente al observar la accin de las enzimas digestivas tanto en el estmago como en el intestino.


151

Para empezar tenemos que la hormona Gastrina estimula, no solo la salida del HCl desde las clulas parietales en el estmago, sino que tambin la salida de Pepsingeno formado por una cadena polipeptdica de 40kD. Este Zimgeno o proenzima, al ser escindido en un polipptido de 42 aminocidos desde su regin Amino terminal, se activa y pasa a llamarse ahora Pepsina de 33kD. La pepsina hidroliza enlaces peptdicos en las protenas de la dieta donde el aminocido del lado amino terminal es Phe, Tyr o Trp.

Posteriormente, al pasar el contenido al Duodeno, se neutraliza por la secrecin de bicarbonato desde el pncreas, que ha sido estimulado por la hormona secretina. Esta se encuentra en la sangre y es liberada por el bajo pH proveniente del estmago. Por otra parte, la presencia del contenido estomacal en el duodeno estimula tambin la secrecin de Colecistokinina. Esta hormona, a su vez estimula la secrecin pancretica de Tripsingeno, Quimotripsingeno y Procarboxipeptidasa desde el Pncreas, junto a una secrecin de carcter alcalino, ya que posee Bicarbonato. El Tripsingeno es convertido luego a Tripsina por la Enteropeptidasa de las clulas intestinales (Fig. 9 4). En el caso de la Tripsina, se produce la hidrlisis de pptidos de la dieta cuando los aminocidos del lado Ct (carboxi - terminal) son Lys y Arg. El paso de Quimotripsingeno a Quimotripsina y de Procarboxipeptidasa a Carboxipeptidasa es tambin catalizado por la Tripsina. La Quimotripsina a su vez hidroliza enlaces peptdicos cuando el lado Ct de estos, presenta alguno de los aminocidos como son Phe, Tyr o Trp. La Carboxipeptidasa por su lado remueve sucesivamente residuos en el extremo Ct de polipptidos cortos. El mecanismo implicado en los Zimgenos o proenzimas evita la autodestruccin del pncreas durante la sntesis de estas enzimas. De esa manera las enzimas digestivas se hacen activas tan solo en el lugar adecuado que incluye el lumen intestinal y frente a los polipptidos de la dieta.

Fig. 9 - 4. La Quimotripsina se desprende de dos dipptidos para alcanzar su conformacin activa.

245

1 15 16 1 245

1 13 16 146 149 245Ile Tyr Ala

Ser - Arg Thr - Asn14 15 147 148

Arg Ile

Leu

y

Quimotripsingeno

Quimotripsina activa

Quimotripsina activa

- S S - - S S -

- S S -

- S S - - S S -

- S S -

- S S -S - S

- S S -S - S

- S S -S - SLos polipptidos que forman la enzima activa quedan unidos

por puentes disulfuro

Activacin de un ZIMOGENO


152

f) Aquellas enzimas que catalizan la misma reaccin, pero con distinta afinidad y velocidad son conocidas por el nombre de Isoenzimas y/o Aloenzimas.

Estas enzimas tienen distinta estructura molecular lo que se traduce en una distinta Kaf (afinidad) y Vmx (saturacin). Ambas son las constantes que definen a las enzimas (Fig. 10a 4). En este caso se observa como el metabolismo se adapta a los distintos niveles de sustrato, ya que existirn isoenzimas adaptadas para los perodos de ayuno o de baja concentracin de sustrato. Para ello presentan una alta afinidad, mientras que otras enzimas presentan una baja afinidad para los perodos de exceso de sustrato. Una de las isoenzimas ms conocidas es Lactato Deshidrogenasa, que cataliza el paso de Piruvato a Lactato y que se encuentra presente en grandes cantidades en el msculo esqueltico. Posee 4 subunidades H (Heart), tpicas del corazn y 4 subunidades M (Muscle), tpicas del msculo esqueltico. En el resto del organismo hay combinaciones de H y M como son H3M, H2M2, HM3 ms las originales H4 y M4. El PM aproximado de cada subunidad es de 33,5kD. Los diferentes parmetros de afinidad (Kaf) y grado de saturacin (Vmx) conque se cataliza el paso de piruvato a lactato, se ajustan a las particularidades aerbicas o anaerbicas de cada tejido. Estas isoenzimas aparecen en la sangre en el caso de lesiones musculares. Otra enzima ampliamente conocida es la Creatina Kinasa, que cataliza la formacin de ATP a partir de Creatina-Fosfato. Constituye el medio ms rpido de obtener energa durante la contraccin muscular, an antes de entrar a funcionar el metabolismo anaerbico seguido posteriormente por el aerbico. Esta isoenzima posee subunidades M y B junto a combinaciones de M2, MB, B2.

S P

E1

E2

E3

K m V m K m V m K m V m

10 mM 1 mmol/min1 mM

10 mmol/min

10 mM 10 mmol/min

= = = = = =

AT M T D H E R K R T E

ATM TD HE R K R T E

P T A

P T A

S H

C Y S

C Y S

S H H S

H S

AT : Acetil Transferasa MT : Malonil Transferasa EC : Enz. Condensante PTA : Prot. Transport. de Acilo KR : Cetoacil reductasa DH : Deshidrogenasa ER : Enoil reductasa TE : Tio esterasa

E C

E C

Enzimas del complejo multienzimtico

ACIDO GRASO SINTASA

ISOENZIMAS CON DISTINTA Vmx y Km

a )

b )

Fig. 10a - 4.De las tres isoenzimas habr mayor formacin de producto en E2 que tiene menor Km o mayor afinidad y a su vez mayor velocidad. E1 y E2 catalizarn solo con mayor concentracin de sustrato. Fig. 10b 4. Complejo de la cido Graso Sintasa


153

Las Aloenzimas se caracterizan por catalizar la misma reaccin, pero con distinta velocidad o afinidad y provienen de alelos distintos por ejemplo uno paterno y otro materno. Pueden variar su afinidad y nivel de saturacin con el sustrato. g) Complejos Multienzimticos. Existen varios complejos multienzimticos como el de la Piruvato Deshidrogenasa, la Alfa-Cetoglutarato Deshidrogenasa y la cido Graso Sintasa (Fig. 10b - 4). Los dos primeros emplean un cido graso de 8 carbones conocido como c. Lipoico que posee dos grupos SH y sirve para trasladar al sustrato de una enzima a otra en el complejo. El complejo de la cido Graso Sintasa emplea con este mismo fin una coenzima de cerca de 77 aminocidos conocida como Protena Transportadora de Acilos que posee tan solo un grupo SH en su extremo para unirse al sustrato. La ventaja de un complejo multienzimtico es obvia, ya que consiste en tomar al sustrato y pasarlo por las distintas enzimas, hasta que despus de sucesivas modificaciones qumicas se convierte en el producto final que es liberado nuevamente al medio. De esta manera se evitan las perdidas por difusin de los intermediarios. h) Enzimas unidas a membrana. Las enzimas unidas a membrana actan acopladas a algn sistema de transporte que facilita el paso de un sustrato a algn compartimiento en especial. Su funcin en algunos casos es activar al sustrato para su unin al transportador o modificar al sustrato para que no difunda hacia fuera del compartimiento una vez que ha entrado. En otros casos las membranas sirven de embudos para canalizar el sustrato hacia la enzima. Volver al inicio


154

6) RELACIONES ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCION. La conformacin o forma espacial de una protena esta ntimamente ligada a su funcin. De esta manera, basta un pequeo cambio en el acomodo de los residuos en la estructura, para que los tres puntos de contacto con el sustrato se vean alterados. En este caso no solo el reconocimiento y la eficiencia de la unin sern afectados sino que tambin la eficiencia de la catlisis misma (Fig. 11 - 4). En consecuencia la alteracin de la Conformacin se emplea para regular la actividad

cataltica de las enzimas alostricas y de esta manera controlar a las vas metablicas. Una enzima expuesta a ambos sustratos L y D, elegir aquel que corresponda a una menor barrera de energa durante el proceso de unin, lo que ocurrir en algunos casos con el ismero L o con el ismero D. La estructura tridimensional de la enzima posee ciertos aminocidos crticos para interaccionar con el sustrato y un cierto nmero de otros aminocidos en posiciones espaciales muy determinadas. Estos ltimos sern necesarios para mantener una conformacin destinada a catalizar una reaccin especfica. Aquellos lugares crticos en la estructura hacen el papel de bisagras para amplios sectores de la protena. Cuyo resto puede estar formado por aminocidos susceptibles de ser reemplazados de una especie a otra, sin mayores cambios en la catlisis. Por otro lado, aquellos sitios especficos para la catlisis no experimentan cambios adaptativos, ya que se han agrupado evolutivamente como los mejores aminocidos para llevar a cabo una determinada reaccin qumica y no es necesario cambiarlos posteriormente. Podemos tomar como ejemplo de lo anterior, a la enzima Superxido Dismutasa (Tabla 1 - 4) que tiene un rol crtico al disminuir el riesgo de la presencia de Superxidos durante el metabolismo aerbico. En ella existen ciertos residuos de aminocidos que son imperturbables, a pesar de pertenecer a 6 especies distintas. Los residuos conservados son

Fig. 11 - 4. No todos los residuos de una enzima tienen igual importancia para la funcin de esta.

Residuos que posicionan al sustrato

Residuos necesarios

entre ambas subunidades

Residuos destinados a mantener la ubicacin de los residuos catalticos

En una enzima los residuos de aminocidos tienen distinta importancia. Algunos estarn destinados a mantener la conformacin. Otros estarn destinados al posicionamiento del sustrato y otros sern necesarios para la actividad cataltica

para mantener la conformacin


155

de preferencia los de carcter cataltico y estn formados por 4 His en el sitio activo, ms 40 residuos en otras posiciones claves de la estructura. Estos ltimos se encuentran destinados a la aproximacin y orientacin del sustrato Superxido sobre el sitio activo. Si este sustrato toca alguna parte extra de la enzima, es capaz de denaturarla por su condicin de fuerte Reductor y Oxidante. Otros residuos de la estructura tienen cierta variacin de especie en especie y son cerca de 100. Entre ellos se puede cambiar de naturaleza sin perder la conformacin original de la enzima y solo ayudan adaptarla a los distintos medios internos de cada especie.

TABLA 1 - 4 Regiones de homologa encontradas en las secuencias alineadas de la enzima Superxido Dismutasa perteneciente a 5 especies distintas HUMANO CABALLO PEZ ESPADA LEVADURA BACTERIA BOVINO 140

138 123 94 42

HUMANO 133 116 94 39 CABALLO

117 98 42

PEZ ESPADA

95 44

LEVADURA

40

Volver al inicio


156

7) EFECTO DE LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LA SOLUBILIDAD Y ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS.

a) EFECTO DEL pH. Existen enzimas que expresan su actividad fuera del rango normal de pH, como lo es entre 4 y 8. Algunas tienen catlisis ptima a pH 1,8 como en el caso de la Pepsina. esto se debe a que cuentan con un gran nmero de grupos carboxilos hacia el exterior (Fig. 12 - 4). Otras tienen un pH ptimo de 9 (Tripsina) por el predominio de los grupos amino hacia el exterior.

En general, el pH interviene al controlar en una enzima: a) las interacciones con el sustrato b) las interacciones con sus moduladores c) los pasos catalticos de la secuencia de reacciones destinadas a formar

producto d) las transiciones estructurales que acompaan la modulacin de la enzima

y su catlisis. Una enzima soluble presenta residuos al exterior con cargas y/o residuos polares sin carga neta. Estos ltimos poseen diferenciales de carga y son capaces de formar enlaces hidrgeno con el agua. Por otro lado, aquellos grupos con carga, son titulables y podrn aceptar o donar protones cambiando la carga neta de la protena y por consecuencia se afectar la conformacin y solubilidad de esta. Tambin los residuos del sitio activo sern capaces de aceptar o donar protones, o de cambiar su disposicin espacial por el mismo efecto. Esto a su vez se traducir en un cambio de Km (la constante de Michaelis), que es aproximadamente el valor recproco de la constante de afinidad y/o un cambio en el nmero total de molculas activas o viables, lo que afectar a la actividad o Velocidad mxima de la reaccin. Por tanto las enzimas tendrn una actividad que depender del pH (Fig. 13 4). La enzima Lctico Deshidrogenasa en el msculo, necesita tener protonado al menos el 50% de su His 159. Esta ltima es necesaria para la unin al sitio activo del Piruvato. Sin embargo, la misma His 159 debe estar sin el protn para unirse al Lactato. En otras palabras debe encontrarse a pH bsico en el msculo, durante la modalidad aerbica y a pH cido o protonada, lista para unirse al Piruvato durante la modalidad anaerbica del metabolismo.

Fig.12 - 4.Efecto del pH sobre algunas proteasas.

Pepsina Tripsina

2 4 6 8 10 pH

A c t i v i d a d


157

Msculo aerbico LDH Lactato + NADH + H+----------->Piruvato + NAD Msculo anaerbico LDH Piruvato + NAD ------------->NADH + H+ Lctico De esta manera se llevar a cabo la catlisis a un pH ptimo donde la enzima se encontrar en la mejor condicin posible para adoptar una conformacin espacial que permita el subsecuente posicionamiento y protonacin (unin de protones). Este efecto entregar la carga correspondiente a los residuos catalticos. Fuera de este pH ptimo, la catlisis no se encontrar con la disposicin espacial adecuada y disminuir la velocidad de reaccin o la afinidad por el sustrato.

Volver al inicio b) EFECTO DE LA TEMPERATURA.

Cofactor

Piruvato

NADH

H

N H

N H C H C

C

O O

H H

N N H H

C

N H

O

A r g 171

H i s 195

SITIO ACTIVO DE LA LACTATO

DESHIDROGENASA

+

3

+

Se requiere de bajo pHpara que la His 195 se

encuentre siempre protonada.

Su grupo Imidazol debe tener carga ( + ),

para que se una al Carbono del Pirtuvato

Para unirse al Lactato se

requiere de un pH elevado y que la

His 195 se encuentre sin

protn

Fig. 13 - 4. La enzima Lctico Deshidrogenasa necesita estar 50% protonada para unir Piruvato y 50% deprotonada para unir Lactato.


158

La temperatura ptima de una enzima es aquella que le permite llevar a cabo la catlisis en las mejores condiciones de afinidad y velocidad de reaccin con el sustrato. La temperatura ptima permite a la enzima adquirir su mejor conformacin para desarrollar la actividad mxima. Existen varias curvas cinticas (Fig. 14 - 4), que describen los distintos procesos que tienen lugar al aumentar la temperatura de una reaccin enzimtica. Todas estas curvas se combinan para dar una velocidad nica que se puede explicar de la siguiente manera: Caso a) Sin considerar la enzima, el aumento de la velocidad de reaccin (Fig. 14 - 4), depender en parte del aumento de energa o agitacin molecular del sustrato mismo, la que se alcanza a una mayor temperatura. Esta energa de activacin le permitir alcanzar el estado de transicin, que se encuentra en la cspide de la barrera de energa. Segn la ecuacin de Arrhenius a mayor temperatura y menor energa del estado de transicin ( G* /RT: energa necesaria para pasar la barrera a temperatura T) mayor ser la velocidad de una reaccin. Ahora, cuando la enzima se encuentra presente se alcanza la conformacin ptima y ms all de esta se denatura por la agitacin trmica. Por otro lado, mientras ms se agite el sustrato por el aumento de temperatura, mayor ser la afinidad que la enzima necesite para unirse a este. Por esta misma razn, no ser posible un mayor incremento en la velocidad de reaccin a causa de que a la enzima le costar a su vez ms energa desprenderse del producto, al final de la catlisis. Caso b) La cintica de denaturacin trmica de la enzima (Fig. 14 - 4), se manifiesta como

perdida de la afinidad de la enzima por el sustrato. La estructura enzimtica empieza a sufrir una alteracin de su conformacin a causa de la elevada agitacin del medio en que se encuentra inmersa. De esta manera se provoca una paulatina degradacin de la enzima por el nmero de choques con el medio. En el caso de aquellas enzimas que se adaptan a la baja temperatura, como sucede en los peces rticos. Se ha producido en ellos un aumento del valor de la Km (fig. 15 - 4), es decir ha disminuido su afinidad por el sustrato, ya que este

Fig. 14 - 4. La V combinada aumenta hasta que la Enzima se denatura

V e l o c i d a d

T

Caso b: Reaccin con Enzima. Cintica de la Denaturacin

Trmica de la Enzima

Caso a: Aumento de velocidad sin enzima

Arrhenius:

- G*/RT V = k e


159

se agita menos. Por otro lado en los animales adaptados al clima tropical, donde el sustrato se agita ms. La Km ha disminuido aumentado la afinidad por el sustrato. A baja temperatura el sustrato se agita poco y la enzima no requiere de una gran interaccin para atraerlo y retenerlo en el sitio activo, al contrario de lo que sucede a alta temperatura. Por otro lado, al liberar el producto costar menos a baja temperatura y bastante ms en alta. En el primer caso se rebaja la barrera de energa y en el segundo se aumenta. En el caso de las iguanas, una vez que han alcanzado su temperatura de actividad corporal, ocurre que el sustrato se agitar ms y deber ser retenido de forma ms intensa por la enzima. A causa de este efecto, la barrera de energa sube y la enzima es menos eficiente (fig. 15 - 4).

Fig. 15 4. Variacin de la Km con la temperatura en distintas especies.

Volver al inicio 8) MECANISMOS ENZIMATICOS. Uno de los mecanismos enzimticos mejor conocido es la participacin de la enzima Quimotripsina durante la hidrlisis de enlaces peptdicos. Esta es una enzima de 25 kD, que se encuentra formada por tres polipptidos conectados por puentes disulfuro. Se observan en su estructura regiones tipo Beta antiparalela y Alfa-Hlice. Su papel, es hidrolizar enlaces peptdicos en sustratos proteicos, donde el lado Carbonilo del enlace pertenece a un aminocido aromtico como Fenilalanina, Tirosina o Triptfano. En algunos casos tambin puede ser Metionina. Los aminocidos crticos del sitio activo son la Ser 195 y la His 57, como se puede observar en la figura 13 - 4. Cuando el sitio activo esta vaco (fig. 16a - 4), existe un puente hidrgeno entre el Asp 102, la His 57 y la Ser 195. Cuando el sustrato entra al sitio activo se transfiere un protn desde la Ser 195 a la His 57, producindose una interaccin electrosttica entre la His y el Glu (fig. 16b-4). Enseguida se desarrolla el ataque del grupo hidroxilo de la Ser 195 sobre el carbonilo del enlace peptdico y a consecuencias de esto se forma el enlace. Por otro lado, la unin Carbono - Oxgeno queda reducida a solo el enlace Sigma (se pierde el enlace P), quedando el Oxgeno con carga negativa. A continuacin se forma un arreglo

K m

TC 0 45

peces rticos

iguanas

Disminuyen las K ms

mamferos


160

tetradrico de transicin mantenido por los residuos 195 y 193 de la cadena polipeptdica de la enzima. El enlace peptdico se rompe y se forma el intermediario Acil-enzima, como se observa en la figura 16c - 4, quedando el lado Imino unido al hidrgeno de la His 57. En la seccin d) de la Figura 17 - 4, el lado amino del polipptido, empleado como sustrato ha difundido fuera del sitio activo y entra una molcula de agua para deacilar la enzima. La

Fig. 17d - 4. Entrada de molcula de agua y salida de lado amino del polipptido Fig. 17e - 4. La molcula de agua se rompe y el OH es tomado por el acilo Fig. 17f - 4. Salida del extremo carboxilo del polipptido molcula de agua se rompe y el OH es tomado por el acilo en un nuevo estado de transicin tetradrico de la figura 17e - 4, que es mantenido por otros residuos de la enzima como lo son el 195 y 193. Enseguida se rompe la unin con la Ser 195, quedando el lado acilo del

Fig. 16a - 4.Mecanismo de accin de la Quimotripsina con aminocidos Asp 102, His 57 y Ser 195. Fig. 16b - 4.Interaccin con residuos Ser 195 y Glicina 193 Fig. 16c - 4.Ruptura enlace peptdico y formacin del Intermediario Acil-Enzima

C O

O C

H N C H

N

C H C H O

2 Asp 102 His 57 Ser 195

C O R

2 H

O H

C

O

O

C

H NC H

N

C HC H

O

2Asp 102

His 57 Ser 195

CO

R2

H

HO

C O

O C

H N C H

N C H C H

O

2Asp 102

His 57 Ser 195

COR

2H

HO

+

d) e)

f )

N

N

H

H

195

193

cadena de la

enzima

C O

O C

H N C H

N C H C H

O 2Asp 102

R N H

C O

R1 2

C

O

O

C

H NC H

N

C H C H

OH

2Asp 102

His 57 Ser 195

R N

H

CO

R1

2 +

C O

O C

H N C H

N

C H C H

OH

2Asp 102

His 57 Ser 195

R

N CO

R1

2H

a) b)

c)

N H N H

195

193

cadena de la enzima

Ser 195

H


161

polipptido sustrato libre, para que finalmente la Ser 195 interaccione nuevamente con la His 57 alcanzando el estado de reposo (fig. 17f 4). Volver al inicio 9) CINETICA ENZIMATICA. El anlisis de la cintica enzimtica fue llevado a cabo por Leonor Michaelis y Maud Menten. Estas personas relacionaron la concentracin de sustrato con la velocidad de reaccin bajo los siguientes principios: Estado k1 activado k3 E + S [ES] --------------> E + P k2 La enzima se une al sustrato para formar un complejo que alcance el estado activado y luego puede descomponerse para formar nuevamente sustrato ms enzima sin cambio alguno o bien puede descomponerse para formar enzima y producto. La enzima queda finalmente inalterada ya que es solo un catalizador. Los principios del anlisis de Michaelis-Menten son los siguientes: 1) La velocidad con que se forma el complejo ES es igual a la velocidad con que se destruye. v1 = v2 + v3 k1 [E]l [S] = k2 [ES] + k3 [ES] ( 1 ) 2) La enzima total [E]t ser igual a la enzima libre [E]l, ms la unida al complejo enzima substrato [ES]. [E]t = [E]l + [ES] ( 2 ) 3) La velocidad de la reaccin inicial depender de la concentracin del complejo ES. A

medida que este se descompone se formar producto o sustrato nuevamente. v1 = k3 [ES] ( 3 ) 4) La velocidad mxima (Vmx) de la reaccin se obtendr cuando la concentracin del

complejo [ES] sea igual a la concentracin total de la enzima E. Vmx = k3 [E]t cuando [E]t = [ES] ( 4 ) 5) La Constante de Michaelis ser la relacin que exista entre las constantes de la velocidad

de la reaccin en uno y otro sentido. k2 + k3 ( 5 )


162

Km = --------- k1 Si k3 es muy pequeo, la Km ser inversa a la constante de afinidad (Kaf) por el substrato. A mayor Km entonces menor afinidad por el sustrato. Al reemplazar las ecuaciones 2, 3, 4 y 5 en 1 se obtiene la ecuacin general de Michaelis-Menten que relaciona la velocidad de reaccin con la concentracin de substrato: Vmx [S] v = ------------ Km + S El significado de Vmx y Km es el siguiente. La Km cuando v = 1/2 Vmx, es la concentracin de substrato para saturar el 50% de los sitios activos presentes (uno por molcula de enzima) y se relaciona como se dijo anteriormente con la afinidad de la enzima por el substrato. A mayor afinidad menor Km y a menor afinidad mayor Km. La Vmx se relaciona con el nmero de molculas de enzima activas o la concentracin total de la enzima viable bajo 100% de saturacin con el sustrato, ya que pueden existir molculas de enzima no activa o inhibidas de actuar. La Vmx depender no solo de la concentracin de enzima, sino que del nmero de recambio conocido como el nmero de molculas de substrato que pasarn por el sitio activo transformndose en producto. Al graficar la ecuacin de Michaelis-Menten, encontramos que la curva formada, es una hiprbole que consta de tres partes. La primera indica que la reaccin es de orden 1 o proporcional a la concentracin de sustrato (Figs. 18a - 4, 18b 4 y 18c - 4), donde la enzima aumentar la velocidad de reaccin a medida que llegue ms substrato al sitio activo: v = k1 [S] o dS/dt = k1 [S] o S = S0 e-kt donde k es la constante de la velocidad, luego: Log S0/S = kt/2.303 Con ello se puede calcular el tiempo medio en que ocurre una reaccin de primer orden, el cual es independiente a la concentracin de substrato: t /2 = 0.693/k


163

El tiempo medio es independiente de la concentracin inicial de sustrato.

Fig. 19 - 4.Ambos grficos representan la velocidad respecto a la concentracin de sustrato.

S P S P

S P S P

S P

S PS P

S P S P S P

a) b)

c) d)

E E E E

EEEE

E E E E

E E E E

Fig.18 - 4. En a) una molcula de substrato por cuatro de enzima, en b) dos molculas y en c) tres molculas, para estar finalmente saturada con cuatro molculas en d).

V

s

v

( )

v v = K

s( )

s( )

v = max

V

v =

max

Km

v = 1 2

V max


164

La segunda parte est representada por la zona curva y es de orden indeterminado ni 0, ni 1 y la tercera parte se encuentra representada por la recta horizontal que es de orden 0, donde se alcanza la velocidad mxima en forma independiente a la concentracin de substrato y la velocidad en este momento solo depender de la concentracin de Enzima o el nmero de molculas de enzima activas (Fig. 18d - 5): a) v = Vmx si [ES] = [E]t b) Vmx = k3 [ Et ] De la ecuacin b) se puede calcular el Nmero de Recambio que es el nmero de moles de substrato convertidos a producto por minuto por mol de enzima. En este momento la Velocidad solo depender de la concentracin de enzima solamente, la velocidad ser mxima si el substrato est saturante. Por lo tanto la Ecuacin de Michaelis-Menten est formada por dos rectas (Fig. 19 - 4) donde la velocidad es proporcional a la concentracin de substrato y la otra en que la velocidad es independiente de la concentracin de sustrato durante la saturacin total de la enzima. Debido a que la ecuacin de Michaelis - Menten representa una curva, el clculo de Km y Vm para cada enzima se hace complejo y se necesitan muchos puntos para determinar los valores con exactitud. De esta manera se hizo un arreglo matemtico por la dupla Lineweaver-Burk para convertir la curva en una recta, que solo puede ser definida por al menos 2 puntos (Fig. 20b - 4), comparada a la Michaelis-Menten (Fig. 20a-4) que necesita muchos puntos de definicin. De esta manera se cambi la expresin, pero no el anlisis y se hizo mucho ms fcil la determinacin grfica de Km y Vmx.

Fig. 20 - 4.Tres formas distintas de expresar el mismo planteamiento central de a) Michaelis-Menten, b) Lineweaver-Burk y c) Eadie-Hofstee.

Km

Vm

v

= V m S

Km + S [ ][ ]

1/v

- 1/K m

1/V mKm/Vm

1v =

K mV m [ S ]

1 + 1 V m

..

1/[ s ]

S[ ]v

/

=

=v

- K m[ S ]

+ V m v

V m v - K m

Michaelis-Menten Lineweaver-Burk

Eadie -

Hofstee

a ) b )

c )

1 2 Vm


165

Expresin de Lineweaver-Burk: 1 Km 1 1 --- = ------ ----- + ------ v Vmx [S] Vmx puede ser homologada con la ecuacin de la lnea recta: y = m x + n Al graficar 1/v vs 1/S se obtiene la pendiente m = Km/V y el intercepto en el lado positivo del eje 1/v es n = 1/Vmx, mientras que el intercepto en el lado negativo del eje 1/S es -1/Km (Fig. 20b - 4). Otra forma de expresar el anlisis de Michaelis-Menten en una recta, fue ideado por la dupla Eadie-Hofstee (Fig. 20c - 4) donde: v v = - Km --- + Vmx [S] La ecuacin puede ser homologada a la recta de pendiente negativa: y = - m x + n La grfica corresponde aqu a v versus v/S y se obtiene una recta de pendiente negativa m = - Km y un intercepto n = Vmx en el eje v. La descripcin de Michaelis-Menten es una de las ms simples, pero la interaccin entre una enzima y un sustrato puede presentar algunas otras variantes que se describirn a continuacin. Primero, cuando existen molculas similares, pero no idnticas al substrato que compiten por el sitio activo junto a este. Segundo, cuando existen molculas que se pueden unir a la superficie de la enzima libre y tambin al complejo ES inhibiendo su actividad. Tercero, cuando una molcula que no es el substrato se une exclusivamente al complejo ES. Estos tres casos son sucesivamente conocidos como, inhibicin competitiva, inhibicin no competitiva e inhibicin acompetitiva respectivamente y pueden ocurrir en el metabolismo intermediario. Tambin estos mecanismos se emplean en el dominio de la farmacologa para controlar algunas vas metablicas o la sntesis y secrecin de neurotransmisores. Muchas drogas han sido diseadas para interactuar con receptores o enzimas provocando alteraciones como las aqu sealadas en el transcurso de su accin. Volver al inicio


166

10) INHIBICION COMPETITIVA. La inhibicin competitiva puede ocurrir cuando existe una competencia entre una molcula estructuralmente similar al sustrato denominada inhibidor y el sustrato por el sitio activo (Fig. 21 - 4):

La constante de disociacin del inhibidor I es la siguiente:

Kd = k2/k1 = [E] [I] / [EI] = Ki cte. del inhibidor

y 1/Km = Kd, mientras que Km = [E] [S] / [ES]

en Km / [S] = [E0] / [ES] - [ES] / [ES] -[EI] / [ES]

Km / [S] = [E0] / [ES] - 1 - [E] [I] / Ki Km / [E] [S]

donde:

[Eo] / [ES] = Km / [S} + 1 + Km[I][E] / [E]Ki[e] Si:

E

S S

E S

E I

I

+

+

I

+

P

I nhibicin Competitiva .

E

E+ S E S E+ P+I

E I

Fig. 21 - 4. El substrato y el inhibidor son similares y pueden entrar al sitio activo.


167

[Eo] / [ES] = Vm / v Vm / v = Km / [S] + Km [I] / [S] Ki + 1 Al multiplicar por [S]: Vm[S] / v = Km (1+ [I] / Ki) + [S]) donde: v = Vm [S] / Km( 1 + [I] / Ki) + [S] o en la forma Michaelis-Menten: Vmx [S] v = ---------------------- Km ( 1 + [I] ) + [S] --- Ki o en la forma Lineweaver-Burk: 1 "Km aparente" 1 1 --- = ----------- --- + --- v Vmx [S] Vmx 1 Km [I] 1 1 --- = ---- (1 + ----) --- + --- v Vmx Ki [S] Vmx La Km que se obtiene en presencia del Inhibidor se denomina "Km aparente" y su valor aumenta con la concentracin del inhibidor. Kmaparente = Km ( 1 + [I] / Ki) Los siguientes puntos son de consideracin: 1) El grado de inhibicin causado por un inhibidor competitivo depender de [S], [I], la Km y la Ki. 2) Cuando la concentracin de sustrato aumenta a [I] constante, la inhibicin disminuye. 3) Cuando la concentracin de inhibidor aumenta a [S] constante, el grado de inhibicin aumenta. 4) A menor concentracin de [S] y a mayor Ki, mayor ser la inhibicin. 5) Cuando la [S] sea mayor o igual a 100 veces la Km aparente, se tendr que v = Vm. En este caso la Km por el sustrato original S, aumenta al incrementar la concentracin del inhibidor I. Por ejemplo si la enzima Flico Reductasa produce la forma activa del c. Flico denominada c. Tetrahidroflico y se la pone en contacto con los compuestos anlogos Aminopterina o Metopterina (Fig. 22 - 4). Ocurre que se produce una inhibicin de tipo competitivo donde la Km por el c. Flico aumenta disminuyendo la afinidad por el sustrato natural a medida que aumenta la concentracin del compuesto anlogo inhibidor, Ejemplo:


168

Km Vm c. Flico 10 uM 50 um/min c. Flico + Aminopterina 15 50 c. Flico + 2[Aminopterina] 20 50 c. Flico + 3[Aminopterina] 30 50 Igual cosa sucede con las Sulfonamidas, en los Streptococus Fecalis. Estos se pueden reproducir cada 20 minutos, ya que pueden sintetizar el c. Flico de novo o a partir de 0, sin embargo la enzima que une el c. p-aminobenzoico, puede equivocarse y tomar a las Sulfonamidas que tienen similar estructura para ensamblar el c. Flico, por lo que se producir una inhibicin competitiva.

Volver al inicio 11) INHIBICION NO COMPETITIVA.

O HN

H N

C O O HN

N

C H

N

C

O

NH

CH

C O O HC H C HN

H

2

2 2

2 - A m i n o - 4 - H i d r o x i

6 - M e t i l P t e r i n a.A c . P a r a - A m i n oB e n z o i c o A c . G l u t a m i c o .

2

N

H N

C O O HN

N

C H

N

C

O

NH

CH

C O O HC H C HN

H

2

2 22

N

H N

C O O HN

N

C H

N

CO

NH

CH

C O O HC H C HN

2

2 22

H N2

H N2 C H3

M E T O P T E R I N A

A M I N O P T E R I N A

A c. F O L I C O

NH O

S

O

HN RH

S U L F O N A M I D A

E structuras Similares Provocan Inhibicin Competitiva .

N

N

NH 2

CO

N H2

OC N H

N I C O T I N A M I D A

I S O N I A Z I D A

Empleados en

Quimioterapia

desinfectante

tratamiento de latuberculosis

Fig. 22 - 4. Los anlogos del c. Flico actan inhibiendo la sntesis de cs. Nucleicos en humanos, mientras que las Sulfas inhiben la sntesis de cs. Nucleicos en las bacterias del intestino al igual que los antibiticos y la coenzima NAD.


169

Ocurre cuando el Inhibidor se une tanto a la superficie de la Enzima libre como a la Enzima unida al sustrato (Fig. 23 - 4) y las siguientes consideraciones deben ser tomadas en cuenta para este tipo de inhibicin: 1) El grado de inhibicin en presencia de un inhibidor no competitivo depende solamente de [I] y KY. 2) En presencia de un inhibidor no competitivo pareciera existir menos enzima de la

que se encuentra presente. 3) La Velocidad aparente es siempre una fraccin constante de la Vmx, independiente de [S] y de Km. De lo anterior se deduce que: E + ES + I = EI + ESI si E + I = EI

simplificando: EI + ESI = EI Luego: Ki = [E] [ I ] / [EI] = ( [E] + [ES] ) [ I ] / [EI] (a) La enzima se encuentra durante esta inhibicin de 3 formas:

E

S S

E S

E I

S

I

I

Inhibicin No Competitiva .

+

+

I

I+

S+

E I S

+

P

+

I

+

E I

I

E I S+ S

E + S E S E +

E

P

Fig. 23 - 4. El substrato y el inhibidor no se relacionan estructuralmente. El inh. se une solo a la superficie de la enzima.


170

[Eo] =[E] + [ES]+[EI] sustituyendo: [E] + [ES] en a, tenemos que: Ki [EI] = [E0] [ I ] - [EI] [ I ] Ki [EI] + [EI] [ I ] = [E0] [ I ] Luego, despejando [EI]: [EI] = [E0] [ I ] / Ki + [ I ] Como Vmx = k [E0] y v en presencia de substrato e inhibidor no competitivo es v = k([E0 - [EI]) Vmx/v = [E0] / [E0-[EI] Vmx/v = [E0] / [E0-[E0] [ I ] / [E0] - [E0] [ I ] / Ki + [ I ] finalmente: v = Vmx ( Ki / Ki + [I] ) y "Vaparente" = Vmx / (1 +[ I ] / Ki) y la ecuacin final estar dada al estilo Lineweaver-Burk por: 1 Km [ I ] 1 1 [ I ] --- = --- ( 1 + --- ) --- + --- ( 1 + --- ) v Vmx Ki [S] Vmx Ki En este caso la Km permanece igual ya que no se afecta el sitio activo, pero la Vmx disminuye, ya que el nmero de molculas totales de enzima activa decrece a causa de la unin con el Inhibidor. Un ejemplo de este tipo de inhibicin son los excesos de metales pesados, como el Cobre, Hierro, Plomo y Mercurio, este ltimo es de reconocida toxicidad y se le emplea en algunas preparaciones desinfectantes. Estos metales se unen a los grupos tioles de las Cistenas que se asoman al exterior en la superficie de las enzimas. La unin a ellos paraliza a la enzima que puede estar libre o unida al sustrato, de esta manera algunas molculas de enzima no catalizarn la reaccin disminuyendo la Vmx. Volver al inicio 12) INHIBICION ACOMPETITIVA (Fig. 25 4).


171

En este caso el Inhibidor se une solo al complejo ES, a diferencia de la inhibicin NO COMPETITIVA donde tambin se une a la enzima libre. Su efecto se puede analizar de la siguiente manera: ES + I === EIS I: Inhibidor [ES] [ I ] Si Ki = ----------- [EIS] Consideraciones Generales. 1) En los grficos de Lineweaver-Burk se observan en este caso rectas paralelas a concentraciones crecientes del inhibidor 2) En presencia del inhibidor disminuye Km y Vm 3) La Ki pude ser calculada grficamente.

En la Figura 26 - 4, se pueden observar las expresiones de Michaelis-Menten y Lineweaver-Burk para los tres tipos de inhibiciones. Durante la Inhibicin Competitiva la Km disminuye y la Vmx contina igual, ya que las molculas de inhibidor entran al sitio activo de la enzima desplazando al substrato debido a su similaridad estructural. En la Inhibicin No Competitiva, la Km permanece inalterada y la Vmx disminuye debido a que el inhibidor elimina molculas de enzima libre o unida al substrato durante la reaccin, mientras que en

S S

E S

S

I

+

I+

E I S

+

P

Inhibicin Acompetitiva .E E

+I

E I S

E + S E S E + P

Fig. 25 - 4. El inhibidor I se une solo al complejo Enzima-Substrato.


172

la Inhibicin Acompetitiva ambos parmetros disminuyen Km y Vmx, debido a que el Inhibidor solo se une al complejo Enzima-Substrato. En la figura 27- 4, estn representadas grficamente las inhibiciones en el estilo de Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee. En los tres tipos de grficos la concentracin del inhibidor aumenta desde la letra a hasta la letra c. Los grficos representados por rectas parecen ser los ms precisos para clasificar el tipo de inhibicin y calcular los valores de Km y Vmx, adems cualquier comportamiento anormal de las rectas podr ser interpretado como la presencia de una enzima modificada alostricamente por el inhibidor o el substrato y su cintica deber expresarse mediante otro tratamiento como es la expresin de Hill.

.

IINHIBICION COMPETITIVA

IINHIBICION NO COMPETITIVA

v = V mx [ S ]

Km 1 + [ I ]

K i

+

[ S ] = +

1

V mx

1

v

Km

V mx 1 +

[ I ]

K i

v = V mx [S ]

(Km + [ S ] ) 1 + [ I ]

K i

v = V mx [ S ]

Km 1 + [ I ]

K i + [ S ]

= + 1

V mx

1

v

Km

V mx 1 +

[ I ]

K i 1 +

[ I ]

K i

1

[ S ]

1

Km V mx

V mx Km

Km V mx

SIN

CAMBIO AUMENTA

DISMINUYE SIN

CAMBIO

DISMINUYE DISMINUYE INHIBICION ACOMPETITIVA

= 1

v

Km

V mx [ S ]

1 +

1

V mx 1 +

[ I ]

K i

[ S ]

Fig. 26 - 4. En el lado izquierdo aparece la expresin para Michaelis-Menten y en el derecho para Lineweaver-Burk.


173

M i c h a e l i s - M e n t e n L i n e w e a v e r- B u r k E a d i e - H o f s t e e

v

s

1/v

1/s

v

v/s

v

s

v

s

1/v

1/s

1/v

1/s

v

v/s

v

v/s

a b c

a

bc

a b c

a b c

ab

ca

bc

a b c

abc a

Inhibicin Competitiva

Inhibicin Nocompetitiva

Inhibicin Acompetitiva

Km ap.

Km ap. Km=

Km ap.

bc

a = Sin Inhibidor b = Con Inhibidor c = Con 2 x inhibidor

Km

Vm CTE

Km CTE Vm

Km

Vm

Fig. 27 - 4. Se puede observar aqu los tres tipos de inhibiciones expresadas en los grficos estilo Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee.


174

RESUMEN DE LAS CARACTERISTICAS GENERALES DE LAS ENZIMAS 1) Son en su mayora protenas que bajan la barrera de energa actuando como

catalizadores. 2) No afectan la constante de equilibrio de una reaccin, solo las velocidades con

que estas ocurren. 3) Presentan dependencia de la concentracin ya que en pequeas cantidades

producen grandes cambios de velocidad de una reaccin. 4) Forman complejos reversibles con el sustrato. 5) No se consumen o modifican en la reaccin, es decir se pueden emplear varias

veces. 6) Muestran especificidad de reaccin esa decir enzimas distintas para distintos

sustratos. 7) Son engaadas por los inhibidores, en especial aquellos usados en la

quimioterapia. 8) Cada enzima muestra una actividad ptima que depende de temperatura, pH,

fuerza inica, etc. 9) Muchas requieren de cofactores como las vitaminas... 10) Existen de 2000 a 3000 diferentes en cada clula y cada clula de un tejido tiene un

conjunto distinto de enzimas. 11) Se involucran en los mltiples pasos del metabolismo intermediario. 12) Se pueden regular por retroalimentacin y algunos otros mecanismos. 13) La produccin es controlada por los genes. 14) Las enfermedades genticas son el resultado de la falla de una o ms enzimas de

una va metablica. Volver al inicio


175

13) EMPLEO DE LAS ENZIMAS EN EL DIAGNOSTICO CLINICO. Las enzimas Lctico Deshidrogenasa (LDH), Glutamato Piruvato Transaminasa (GTP), Glutamato Oxaloacetato Transaminasa (GOT), Creatina Kinasa (CK), son ampliamente utilizadas en el diagnostico clnico (Fig. 28 - 4). En un suero normal no se encuentran presentes estas enzimas, sin embargo la actividad enzimtica medida aparece como producto de algunas patologas como son las Lesiones musculares, Infarto al miocardio y otras patologas hepticas o musculares. En general las enzimas aparecen en la circulacin como producto de un aumento indiscriminado en su sntesis o una determinada proliferacin celular, un aumento de la permeabilidad de las membranas y por necrosis celular o lisis como se indica en el esquema.

Por otro lado la actividad enzimtica en el plasma, puede ser alterada por factores de activacin como algunos metabolitos o frmacos y de inactivacin, como es su inhibicin o degradacin. Entre las enzimas ms comunes en el plasma tenemos a: LDH Lesin Muscular CK Oclusin Coronaria, primera en aparecer GOT Oclusin Coronaria, a las 12 hrs. GPT Oclusin Coronaria, a las 24 hrs. GOT Lesiones Hepticas, intoxicacin con lquidos GPT orgnicos, Hepatitis, Traumas. Para su determinacin se emplean sustratos sintticos que producen color al reaccionar a concentraciones saturnales y se determina su actividad mediante grficas de Absorbancia (Densidad ptica) versus tiempo. De la pendiente de estas curvas se obtiene la velocidad de reaccin en DO/t o micromoles de Producto/t. Posteriormente estos datos s grafican versus las alcuotas de enzima o la concentracin de la enzima y el resultado pueden ser

Proliferacin Celular

Aumento de la Permeabilidad

de la membrana

celular Actividad

enzimtica medida

Aumento de la Sntesis

Necrosis celular y Lisis

Excrecin Urinaria Remocin

metablica o catabolismo

Inactivacin y degradacin

Activacin Enzimtica

Inhibicin Enzimtica


176

expresados en Unidades Enzimticas (UE). Una UE es la cantidad de enzima que forma un micromol de producto en un minuto a 25oC. De esta manera se obtienen las Unidades de actividad enzimtica en la alcuota en que se hizo la determinacin. La isoenzima que se encuentra en el Corazn es la Creatina Kinasa - Msculo, Cerebro o CK-MB, mientras que la que se encuentra en el msculo esqueltico es la CK-MM y la que se encuentra en el cerebro CK-BB. A pesar de que aumenta cerca de un 90% despus de un infarto ( 4 a 6 hrs.) llega a un mximo a las 24 hrs. y vuelve a valores normales a los 3 o 4 das, tambin aumenta ante algn trauma muscular (CK-MM), ejercicio fsico, estado postoperativo, cuando hay convulsiones y delirio. LDH tambin se encuentra en Corazn, pero es menos especfica ya que est presente en msculo esqueltico, hgado, eritrocitos, rin y algunos neoplasmas. Tambin puede aumentar por enfermedades a cualquiera de los rganos mencionados y hemlisis. Aumenta a las 24 hrs despus del infarto, llega a un mximo a los 3 das y baja a niveles normales en 8 a 9 das.

Isoenzimas: LDH1 presente en Corazn, eritrocitos y corteza renal LDH2 en sistema Retculo Endotelial LDH3 presente en pulmones LDH4 presente en placenta, rin y pncreas LDH5 en msculo esqueltico e hgado ltimamente se ha recurrido a detectar la presencia de Troponina I, una protena contrctil de la miofibrilla que no es una enzima. La isoforma cardaca es muy especfica

Fig. 28 - 4. Variacin de los niveles enzimticos durante un infarto al miocardio.

X 2

X 3

X 5

X 6 X 7

X 4

1 2 3 4 5

HBDH

LDH

CK GOT

N o

Normal

de veces que aumenta

das

CK: Creatina Kinasa

CK MB: Creatina Kinasa isoenzima mixta miocardio - cerebro

LDH: Lctico Deshidrogenasa

HBDH: Deshidrogenasa hidroxibutrica

Curso de las enzimas indicadores despus de un infarto

CK - MB

Troponina

GOT: Glutmico Oxaloactico Transaminasa


177

Aumenta de 4 a 6 hrs. despus del dao, al mximo en 12 a 16hrs y permanece elevada por al menos 10 das. Volver al inicio 14 ) ENZIMAS ALOSTERICAS.


178

Estas enzimas son moduladas mediante el control de su Km o Vmx por medio de algn compuesto que se encuentra al inicio o al final de la va metablica como lo son las molculas efectoras que cambian de concentracin segn el estado del metabolismo (CO2, 2,3 DPG). Al tener varias subunidades la cintica de interaccin con el sustrato es regida por una curva sigmodea que se puede explicar tanto por el modelo Simtrico o el Secuencial que se observa a continuacin. El MODELO SECUENCIAL (Fig. 29 - 4) indica que la enzima de varias subunidades al unirse progresivamente a distintas molculas de substrato, cambia su conformacin paulatinamente haciendo que las nuevas molculas de substrato entren cada vez ms fcilmente hasta saturarla. La primera molcula de sustrato entra lentamente, la segunda ms fcil y as sucesivamente hasta ocupar todos los sitios activos de la enzima. El MODELO SIMETRICO (Fig. 29 - 4) supone la existencia de dos conformaciones en la enzima, una tensa T con poca afinidad por el sustrato y la otra relajada R de alta afinidad por el sustrato. A medida que el sustrato se une a la forma relajada R que se encuentra en baja concentracin, el equilibrio se desplaza hacia esta fo

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