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海洋微藻在海洋生态系统中的位置
•海洋植物的主要组成,生活在200m以内的水层中•光合作用产生的能量,启动了海洋生态系统•自身的生理活动、新陈代谢和与环境之间的物质交换,对其周围环境产生重大影响•胞内两种氨基酸N15含量数字化定位海洋生物食物链:海洋藻类1.0,食物链底层
1.0
2.5
3
3.3
4.8
1.9
主要内容
如何获得一株纯种海洋微藻? 范例1 厦门白城-鼓浪屿东海原甲藻赤潮 [2014/05/06-2014/05/10] 范例2 2014年福建海域米氏凯伦藻赤潮 [2012/06-2012/07]
微藻的培养 纯化培养(小体积) 普通培养(几升-数十升) 批量培养(百升以上) 批量半连续培养(千升以上) 粗放型大批量培养(3000L及以上,挖坑即可培养) 藻类如何收集?
藻种室常用藻类 藻种室概况 使用频率最高的藻类及图谱 精美图片
一. 如何获得一株纯种藻株?
藻种分离技术
形态鉴定
分子鉴定
细胞培养
批量培养
普通培养
纯化培养
浓缩/筛选 单细胞分离 藻种纯化 藻株鉴定 藻类保藏新鲜水样
样品采集
批量半连续培养
粗放大批量培养
富营养孵化
沉积物 孢囊挑取淘洗/浓缩
藻类培养技术
1. 前期准备• 近岸采集:矿泉水瓶(水样)、密实袋(泥样)• 海上采集:打水桶/采水器、筛绢、培养基、96孔板、琼脂平板、采泥器、
光照培养箱
2. 样品采集• 水样:海湾、码头等;滩涂、养殖场、盐场的小水洼;赤潮现场;• 水样体积:200-2000毫升。(须保留原位海水)• 现场参数:测定水样的温度和盐度,供分离、培养时参考。
大亚湾养殖区 深圳湾 南通紫菜筏架区 退潮水洼 白城硅藻赤潮2011-04 2012-04 2012-05 2012-06 2014-07-06
东海原甲藻 三角褐指藻
3. 样品初步处理:浓缩、筛选
Sargassum
5μm ~ 200μm
NoctilucaSamples
Φ200μm
Φ5μm
Φ20μm
Φ10μm
√√ ×
DIY Tools
•近岸样品:48H内尽快处理•海上样品:水样:梯度分级浓缩、平板涂布、96孔板梯度稀释、甲醛固定、单细胞分离泥样:4 ℃避光保存
微吸管分离法
玻璃管在酒精灯上拉成直径0.08-0.16毫米的微管
平板分离法(海上分离硅藻、蓝藻等)
合适的培养液,加入1-1.5%的琼脂 ,倒平板,划线培养。
水滴分离法
藻液稀释 ,分成若干小水滴,显微镜筛选单细胞水滴
稀释分离法(海上鞭毛藻初步分离)
用过滤后原位海水稀释,细胞分布均匀,直接用10μL移液枪挑取到单细胞,水滴清洗。
4. 单细胞分离
微吸管 平板 0.22微米注射器滤头
难点
1.海上样品只能初步处理,不能尽善尽美。
2.细胞个体小,脆弱易损伤,很难挑取完全洁净、健康的细胞。
3.大细胞上吸附的杂藻。
4.有些藻株不可实验室培养或者非常难培养。如鳍藻/夜光藻
5. …
B. 分子鉴定
现代分子技术能够快速,便捷的判断种类的范围,是传统形态学分类的重要补充。
目前主要用于藻类分类的有: 核糖体 SSU rDNA, LSU rDNA,ITS1+5.8s+ITS2.
对于特定的种类某些基因有其特别的分类意义。如mitochondrial cytochrome b, 和chloroplast 23S 在共生藻属B系群种类区分上的重要意义。
近年ITS2二级结构在藻类分类上的运用成为一个新的热点
SSU具有很好的保守性,通常用于属和属的分类单元。
LSU各个区间的保守性不同,有些区间保守性好(如D1区)有些区间变异性高(如D2区),通常用于属间和种间区分。
ITS变异性高,通常用于种间和种内分类单元的区分。
ITS2二级结构保守性很好,可用于大范围的分类单元。
范例1 厦门白城-鼓浪屿东海原甲藻赤潮 [2014/05/06-2014/05/10]
•水样搅动有荧光,里面有少量夜光藻。•细胞密度:东海原甲藻约7000 cells/mL,夜光藻约80 cells/mL。•光镜和电镜分析,细胞分离,尝试分离出纯种藻株(赤潮藻和夜光藻)
Prorocentrum donghaiense
Noctiluca
鼓浪屿 白城
形态分析
•东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)赤潮,单细胞或连接成链状,细胞宽长椭圆形,尾部呈锥状。•细胞长16-23μm宽9-13μm。壳面几乎被中空阔棘覆盖,细胞顶部鞭毛孔伸出2条鞭毛
(flagellates)可见。
单细胞 链状细胞
电镜分析
SEM by 高越、罗肇河
范例2 2012年福建海域米氏凯伦藻赤潮 [2012/06-2012/07]
赤潮监测海域地理位置
• 采样位置:黄岐半岛鲍鱼养殖区
• 水样:渔排附近海水
• 水样体积:2 L 。
• 原位海水 10L(培养用)
• 现场参数:温度26-28℃,盐度28‰
• 实验室分析
• 群落构成及密度(cells/m L):米氏凯伦藻/东海原甲藻/红色裸甲藻/叉角藻
B. 普通培养
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Time(Day)
Cell
den
sity
(Cel
ls/m
L)
Alexandrium sp. 不同生长期 同步化后一个细胞周期
起始期
指数期
平稳期消散期
四、藻种室常用藻类
藻种室概况
• 海洋藻类保种中心(Center for Collections of Marine Algae,CCMA)创建于2005年,藻种
库现保存有蓝、绿、硅、甲、裸、隐、金、黄等藻类,主要以蓝、甲、硅、绿赤潮藻为主,共计410株系(60株硅藻未定种)。• 每年从台湾海峡、南海、东海及厦门港、极地分离新的株系,并运用分子生物学及扫描电镜等技术进行鉴定。
特殊种保藏室
藻种培养室
无菌保种室 藻类筛选系统
藻株海区分布
甲藻:Alexandrium (亚历山大属), Prorocentrum (原甲藻属), Karenia (凯伦藻属), Gymnodinium (裸甲藻属),哈卡藻属(Akashiwo),前沟藻属(Amphidinium)
硅藻:Thalassiosira (海链藻属), Nitzschia (菱形藻属), Skeletonema (骨条藻属), Phaeodactylum (褐指藻属), Coscinodiscus (圆筛藻属),角毛藻属(Chaetoceros)
绿藻:微绿球藻 (Nannochloropsis oceanica), Platymonas sp.(扁藻), Chlorella sp.(小球藻), Dunaliella Salinā (盐藻)
蓝藻:Trichodesmium (束毛藻), Synechococcus (聚球藻)
金藻:Prymnesium parvum (小定鞭金藻), Isochrysis galbana (球等鞭金藻 ), Dierateria zhanjiangensis (湛江叉鞭金藻), Chrysophyta.sp (金藻sp.).
其他海洋卡盾藻(Chattonella marina),球形棕囊藻(Phaeocystis globosa),赤潮异弯藻 (Heterosigma akashiwo)
使用频率最高的藻类:
海洋微藻BBS: http://www.icmpb.com
MEL种质中心http://mel.xmu.edu.cn/gomap/ccma
谢 谢 大 家 !
千人群:145506174,欢迎加入!
生命微观上的随机无序与宏观个体表现出来有序
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