Clase 7, Genetica bacteriana

GENETICA BACTERIANA

PROCARIOTAS

Fáciles y rápidos de crecer

Rápida expansión clonal

PROCARIOTAS

PROCARIOTAS

PROCARIOTAS

Genética mas simple que eucariotas

Genomas haploides compactos.

La información genética puede encontrarse en el genoma o plásmidos

No hay intrones

No hay poliadenilación de mensajeros

Muchas genes que pertenecen a una misma vía están organizados enoperones

Gran plasticidad para “mover” y/o adquirir material genético

ALGUNOS TERMINOS

Genotipo

Fenotipo

Resistencia antibiótica

Mutante

Clon

Auxótrofa

UN POCO DE HISTORIA…….

EXPERIMENTO DE LURIA-DELBRUCK

Origen de las mutaciones: previo a la adición del agenteinactivante o posterior a el (adaptativa)?

PLASMIDOS

Unidades genéticas autónomas que se encuentran presentesen casi todas las bacterias

Escenciales en la capacidad adaptativa o evolutiva de lasbacterias

PLASMIDOS

Replicación Theta: primer de ARN (Uni oBidireccional)

Círculo rodante: Nick en el ADN quefunciona como primer

EN TODOS LOS CASOS LA REPLICACION SEINICIA EN EL ORI (ORIGEN DE REPLICACION)

PLASMIDOS: replicación

PLASMIDOS

Propiedades: Rango de huésped

Número de copias

Capacidad de movilización

Rango de huésped Amplio

Acotado

PLASMIDOS

Número de copias: es el número de unidades deplásmido por célula

Altamente regulado Regulación por ARN antisentido

Regulación por ARN antisentidoy proteína

Regulación por iterones

PLASMIDOS

Regulación por ARN antisentido

RNAII: inicia la síntesisdel ADN

RNAI: es complemenarioa RNAII

Duplex RNAI-RNAII esdegradado

PLASMIDOSRegulación por ARN antisentido y proteína

CopB: reprime a PrebA. Ocurreinicialmente luego de lo cual RepA

se sintetiza desde el transcriptocopB-repA

RepA: proteína de replicación

CopA: ARN antisentido que afectala estabilidad del transcripto

copA-repA

RNAseIII cliva el duplex copA-repA

Incompatibilidad de plásmidos

Dos plásmidos pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad (Inc)cuando uno interfiere con la replicación o la partición del otro

Si coexiste Diferentes grupos de incompatibilidad

Si no puedencoexistir

Mismo grupo de incompatibilidad

Incompatibilidad de plásmidos

Diferente grupo Inc

Mismo grupo Inc

INTRODUCCION DE MATERIAL GENETICO ENBACTERIAS

CONJUGACION

TRANSFORMACION

TRANSDUCCION

CONJUGACION

Capacidad para intercambiar material genético(en general plásmidos) entre bacterias

SEXO

DADOR Y ACEPTOR

TRANSCONJUGANTE

CONJUGACION

Pilus: producido porel dador

CONJUGACION

Plásmidos Movilizables: no codifican todas lasfunciones

Transmisibles per ser: codificanpara todas las funciones

CONJUGACION

oriT: origen detransferencia

Región de clivajedel ADN

El ADN que setransfiere es simple

cadena

CONJUGACION

citoplasma

Espacio extracelular

} pilus: polímero de lapilina que estacodificada en un únicogen

CONJUGACION

Genes de transferencia: encargados del transporte de ADN

Helicasas

Primasas

Endonucleasas} Encargadas de cortar,

desenrrollar y transportar elADN

CONJUGACION

Plásmidos transferibles: codifican para la sintesis del pilus y detodas las proteínas necesarias para la transferencia

Plásmidos movilizables: no codifican para la sintesis del pilus y porlo tanto deben usar el pilus sintetizado por otro plásmido. Enprincipio solo necesitan el oriT. Naturalemente no existen plásmidosque solo contengan el oriT, los plasmidos movilizables contienen losgenes mob encargados de la transferencia y similares a los genes tra

CONJUGACION

Plásmido F: transferible

Capaz de integrarse alcromosoma por

recombinación homólogaen las regiones IS

Que ocurre si un plásmido F integrado al cromosomaintenta transferirse?

CEPA Hfr

Cepas Hfr

Movilizan el cromosoma

Si no hayrecombinación la

informacióngenética no se

hereda

UTILIZACION DE CEPAS HFR EN LA DETERMINACIONDEL MAPA DEL GENOMA DE E. COLI

Conjugación de:

Hfr a+ b+ c+ d+ e+ Strs

X

F- a- b- c- d- e- Strr

Producto de conjugación(Se corta la conjugacion a distintos tiemposPor agitación)

Plaqueo en medio con estreptomicinay todos los aa menos:

a b c d e

CONJUGACION

Biparental: en la misma intervienen dos cepas

Que ocurre si, ni la cepa dadora del plásmido ni el plásmido,poseen las funciones tra?

Triparental: en la misma intervienen tres cepas

CONJUGACION TRIPARENTAL

Una cepa actúa como“helper” o ayudante

TRANSFORMACION

Proceso por el cual el ADN libre se incorpora en una célulareceptora y lleva a cabo un cambio genético heredable

Para ello las bacterias deben ser competentes

Naturalmente transformable: bacterias naturalmentecompetentes capaces de tomar ADN del ambiente (Bacillus

subtilis, Haemophilus influenza, Streptococcus pneumoniae)

En el proceso de transformación natural intervienen proteínas demembrana que asocian ADN, autolisinas de pared celular y

nucleasas

TRANSFORMACION

Experimento de Griffith: descubrimiento de la transformación

Presencia de la cápsula para patogenicidad: R vs S

TRANSFORMACION

Si la bacteria no es naturalmente competente se puede inducirel estado de competencia

Competencia por cloruro de calcio o electrocompetencia porejemplo

Herramientas de la biología molecular

Eficiencia de = número de coloniasTransformación µg ADN

Transformación conplásmidos

Replicativo

No replicativo (suicida) RecombinaciónComplementación

Mutación

Complementación

TRANSFORMACION

Aunque el evento sea debaja eficiencia la selección

es muy poderosa(antibióticos)

BACTERIOFAGOS

Virus de bacterias(especie específicos)

Parásitos que explotan lamaquinaria replicativa del

huésped

Placas de lisis

BACTERIOFAGOSVienen en muchos colores y tamaños

BACTERIOFAGO T4

Ciclo de vida: lítico vs lisogénico

lítico lisogénico

Equilibrio que se altera porfactores ambientales

Determinado por lacompetencia entre el

activador CII y la proteína Cro

CII CI (represorde Cro)

Activa

CroActiva Genes

cascada lítica

Ciclo de multiplicación

Genes tempranos:sintetizados por la ARN pol

bacteriana (ARNpolimerasa, primasas,

ligasas y helicasas)

Acumulación de genomasdel fago

Genes tardíos: proteínasestructurales del fago

Empaquetamiento delgenoma, ensamble del fago

y lisis

Transducción

Movimiento de material genético através de un fago

Transducción generalizada: se transfiere cualquier región delcromosoma

Transducción especializada: se transfieren las regiones cercanas alsitio de integración en los fagos lisogénicos

Transducción generalizada

Una baja proporción de losfagos “se llevan” información

de la bacteria

SELECCION

Transducción especializada

Profagos lisogénicos

Transducción especializada

Utilización de fagos en estudios de genética bacteriana

Resistencia a Km

Cepa no motil

Avirulenta

Cepa motil

Virulenta

Estudio sobre la función de un determinadogen en virulencia

Obtenida en unestudio sobremetabolismo

Cepa utilizadaen estudios de

virulencia

Como se hace en el laboratorio?

Cepa A: dadora

Cepa B: receptora

infección conel fago centrífuga

A

B

Infección delcultivo aceptor

Plaqueo enmedio conkanamicina

Aislamientode la mutante

Regulación de la expresión génica

COMO Y BAJO QUE CONDICIONES LOS GENES SEEXPRESAN O NO

Regulación transcripcional

Regulación post-transcripcional

Bacterias: sistemas simples que han servido de marco para elestudio de regulación en eucariotas superiores

A nivel del inicio de latranscripción

Estabilidad del mensajero oregulación de la traducción

Estructura canónica de un promotor bacteriano

Sitio de union aribosoma o shine-

dalgarno

Factores sigma

Son factores de iniciación de la transcripción de procariotas

Le aportan la especificidad de promotor a la ARN polimerasa

Los diferentes factores sigma se activan en respuesta adiferentes condiciones ambientales

Factores sigma

Escherichia coli σ70: housekeeping

σ54: limitación de nitrógeno

σ38: fase estacionaria

σ32: heat shock

σ28: sistema flagelar

σ24: extracitoplasmática, temperaturas extremas

σ19: transporte de hierro

Operon

Genes de una misma vía metabólica que se encuentran en unmismo policistrón

Regulación positiva y negativa

Regulación positiva y negativa

Operón catabólico: degradación de componentes

Operón anabólico: síntesis de compuestos escenciales

Operón lactosa

Jacob y Monod (1950): estudio sobre la utilización delactosa por Escherichia coli

Curva de crecimiento conglucosa y lactosa

Regulación negativa

glucosa lactosa

Jerarquía deutilización

Operón lactosa

lacZ: β-galactosidase

lacY: permease

lacA: acetylase

lacI: represor

Represión catabólica

AMPc: AMP cíclico esuna señal de “hambre”

En presencia de glucosael operón está

“apagado”

Operón biosintético

Regulación negativa

Operón triptofano

Otros niveles de regulación Autoregulación del represor

Atenuación

Autoregulación negativa del represor

El represor TrpR regula negativamante la expresión de supropio transcripto

Mayor velocidad de represión cuando aparece eltriptofano

Atenuación

Mutantes en trpR aún regulan la transcripcióndel operón en respuesta a triptofano

Nivel extra de regulación

Atenuación

Operón arabinosa

Operón de degradación de la arabinosa

Regulación positiva por un activador

Arabinosa Xilulosa-5-fosfato

Activador

AraC

Operón arabinosa

AraC funciona como un activador y un anti-activadordependiendo si tiene arabinosa unida o no

P1

AraC

P2

AraCAraC AraC

arabinosa

Anti-activador Activador

Operón arabinosa

El sistema le otorga un alto nivel de regulación. Haymuy baja expresión basal

Posee, al igual que el operón lac, represión catabólica.La ausencia de glucosa potencia la expresión

Operón galactosa

Operón que se reprime en ausencia de galactosa

En presencia de galactosa se desreprime el operón

Las zonas regulatorias se encuentran duplicadas

Otros operones

Operón maltosa: adquisicion de maltodextrinas y maltosa y suutilización

Operón histidina: síntesis de histidina

Operón tol: degradación de compuestos hidrocarbonadoscíclicos

Riboswitches

Mecanismo de regulación de la expresión génicaevolutivamente ancestral

Utiliza la estructura secundaria del ARN

Mecanismo post-transcripcional

Riboswitches

Dos tipos De terminación de la transcripción

De inicio de la traducción

Existen diferentes y muy variados tipos de riboswitches

Como hace una bacteria para responder a una señalambiental?

Señal ambiental

bacteria

Respuesta adaptativa

Falta de nutrientes

Cambios de temperatura

Presencia de un posible huésped{

Sistemas de dos componentes

Componente de detección: proteína de membrana que detectael estímulo y fosforila al componente de respuesta

Componente de respuesta: proteína citoplamática que activa oreprime la actividad transcripcional de los genes de respuesta

Sistemas ampliamente distribuidos en bacteriasque median la respuesta transcripcional a factores

o cambios ambientales

Sistemas de dos componentes