View
217
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA
V NITRE
FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA
DIZERTAČNÁ PRÁCA
Nitra 2006 Ing. Peter Zajác
SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE
FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA
Dekan: prof. Ing. Jozef Bulla, DrSc.
OPTIMALIZÁCIA REFERENČNEJ METÓDY STANOVENIA POČTU
SOMATICKÝCH BUNIEK V SUROVOM KRAVSKOM MLIEKU
DIZERTAČNÁ PRÁCA
Katedra hygieny a bezpečnosti potravín
Vedúci katedry: doc. Ing. Jozef Golian, Dr.
Školiteľ dizertačnej práce: prof. MVDr. Jozef Sokol, DrSc.
Školiteľ špecialista: doc. Ing. Jozef Golian, Dr.
Dizertačnú prácu predkladá: Ing. Peter Zajác
NITRA 2006
ABSTRAKT
Mastitída patrí medzi najdôležitejšie ochorenia hovädzieho dobytka. Hlavným
indikátorom a diagnostickým štandardom pri zisťovaní mastitídy sú somatické bunky.
V súčasnosti sa na hodnotenie počtu somatických buniek v bežnej praxi používa metóda,
podľa STN EN ISO 13366-3 (2001) Fluorescenčná optická elektronická metóda. Ako
referenčná metóda sa používa metóda podľa STN EN ISO 13366-1 (2001) Mikroskopická
metóda za použitia farbiva metylénovej modrej alebo etídium bromidu.
V experimente 1 sme overili možnosť využitia referenčnej metódy s použitím etídium
bromidu. Metódu sme porovnali s ďalšou mikroskopickou metódou, ktorej farbenie bolo
založené na princípe farbenia používanom u prístrojov typu Fossomatic. Pri farbení sa použil
etídium bromid, farbiaci roztok sa pridával priamo do vzorky mlieka a teplota počas farbenia
bola modifikovaná na 100 °C. Štatisticky zistený rozdiel medzi metódami bol
21 000 SB . ml-1. Z empirických poznatkov vyplýva, že metódy majú viaceré nedostatky,
predovšetkým metodika počítania jadier somatických buniek a výpočet môžu výrazne
ovplyvniť výsledok analýzy.
V nadväznosti na experiment 1 sme vykonali experiment 2, v ktorom sme sa zamerali
na vývoj sekundárneho referenčného materiálu s presným počtom somatických buniek.
Referenčný materiál bol skúšaný v troch laboratóriách. Referenčný materiál s nízkym počtom
somatických buniek (233 500 SB . ml-1) bol stabilný počas celého experimentu. Pri skúšaní
referenčného materiálu s vysokým počtom somatických buniek (454 625 SB . ml-1) bol
zaznamenaný mierny vzostup počtu somatických buniek v laboratóriu č. 1 a v laboratóriu č. 2.
V laboratóriu č. 3 bol zaznamenaný pokles počtu somatických buniek.
V experimente 3 sme navzájom porovnali výsledky piatich mikroskopických metód
stanovenia počtu somatických buniek a inštrumentálnej metódy. Zistili sme, že výsledky
metód sa v priemere významne líšia. Výsledky stanovené modifikovaným pracovným
postupom návrhu normy ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 pri použití etídium bromidu a farbení
pri 100 °C boli o 50 000 SB . ml-1 nižšie v porovnaní s výsledkami stanovenými pri farbení
metylénovou modrou. Výsledky stanovené pracovným postupom návrhu normy ISO/WD
13366-1 IDF 148-1 pri použití etídium bromidu a farbení pri 50 °C boli o 130 000 SB . ml-1
nižšie v porovnaní s výsledkami stanovenými pri farbení metylénovou modrou.
Kľúčové slová: somatické bunky, etídium bromid, mikroskopická metóda, mlieko,
epifluorescencia
ABSTRACT
Mastitis is one of the most important diseases of dairy cattle. Somatic cells are the
main indicator and diagnostic standard for determination of mastitis disease. In the praxes, for
routine determination of somatic cell count an instrumental fluoro-opto-electronic method
according to EN ISO 13366-3 (2001) is used. The reference method is standard ISO 13366-1
(2001) Milk – Enumeration of somatic cells – part 1: Microscopic method, staining with
methylene blue or ethidium bromide.
In the experiment no. 1 we have verified the above mentioned reference method with
ethidium bromide staining. We compared this method with other microscopic method which
principle of staining copied the principle of staining in Fossomatic instruments. Staining was
performed with ethidium bromide, staining solution was directly added to the milk sample
and the temperature during staining was modified to 100 °C. The statistical difference
between methods was 21 000 SC . ml-1. Both methods have several limitations, mostly that
the methodology of somatic cells nuclei counting and calculation can affect the results
markedly.
Consecutively to the experiment no. 1 we performed the experiment no. 2, where we
focused on the development of the secondary reference material with accurate somatic cells
counts. The reference material was analysed at three laboratories. Reference material with low
level of somatic cells (233 500 SC . ml-1) was stable during the whole period of experiment.
Results from the laboratory no. 1 and laboratory no. 2 prove that the reference material with
high level of somatic cells (454 625 SC . ml-1) show an increase of somatic cells, while the
results from laboratory no. 3 indicates a decrease of somatic cells count.
During the experiment no. 3 we compared the results of five different microscopic
methods for somatic cells counting and an instrumental method. We experienced a big
difference between those methods. The results determined by modified working procedure of
the ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 draft with ethidium bromide staining and the temperature
of staining 100 °C were lower by approx. 50 000 SC . ml-1 in comparison with results
determined by methylene blue staining. The results determined by working procedure of
ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 draft with ethidium bromide staining and the temperature of
staining 50 °C, were lower by approximately 130 000 SC . ml-1 while compared to the results
determined by methylene blue staining.
Key words: somatic cells, ethidium bromide, direct microscopic method, milk,
DMSCC, epifluorescence
ČESTNÉ PREHLÁSENIE
Podpísaný Ing. Peter Zajác prehlasujem, že som dizertačnú prácu na tému
„Optimalizácia referenčnej metódy stanovenia počtu somatických buniek v surovom
kravskom mlieku“ vypracoval samostatne s použitím uvedenej literatúry.
Som si vedomý zákonných dôsledkov v prípade, že hore uvedené údaje nie sú
pravdivé.
V Nitre 15. novembra 2006 .........................................................
POĎAKOVANIE
Moja vďaka patrí rodine, priateľom, profesorom, docentom, oponentom a kolegom,
ktorí ma podporovali v mojom úsilí pracovať na realizácii téz tejto práce.
Osobitné poďakovanie patrí Erike Balážovej.
Poďakovanie ďalej patrí: Ing. Renate Novákovej; Ing. Radovanovi Filovi; doc. Ing.
Jozefovi Golianovi Dr.; prof. MVDr. Jozefovi Sokolovi, DrSc; doc. RNDr. Marte Vrábelovej,
CSc.; MVDr. Stanislave Zubrickej; Ing. Zuzane Vácziovej; Dr. Silvii Orlandini a MVDr.
Pavelovi Popelkovi.
Financovanie
Poďakovanie patrí všetkým subjektom, ktoré sa podieľali na financovaní tejto práce.
Práca bola realizovaná z finančných prostriedkov a pomocou technického
a materiálneho vybavenia Štátneho veterinárneho a potravinového ústavu v Nitre na
pracovisku Národného referenčného laboratória pre mlieko a mliečne výrobky v Nitre.
Spolupráca
Poďakovanie patrí všetkým subjektom, ktoré sa podieľali na realizácii tejto práce.
Katedra hygieny a bezpečností potravín, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre
Roľnícke družstvo Rumanová
Milex – Progres a.s.- centrálne skúšobné laboratórium Bratislava
Skúšobné laboratórium EXAMINALA, a.s. Žilina
Sponzorstvo
Poďakovanie patrí všetkým subjektom, ktoré sa podieľali na sponzorovaní tejto práce.
Združenie HACCP Consulting
ZOZNAM POUŽITÝCH SKRATIEK A POJMOV
A.I.A.-L.S.L. Rím A.I.A. Laboratorio Standard Latte, Via dell`Industria 24, 000 57 Maccarese, Rím, Taliansko
CSL Centrálne skúšobné laboratórium
Cv Variačný koeficient
DICC Diferenciálne počítanie zápalových buniek (diagnostická laboratórna metóda)
EtBr Etídium bromid
GSH-Px Glutatión peroxidáza
ICAR International Committee for Animal Recording
IDF International Dairy Federation – Medzinárodná mliekarenská federácia
ISO International Standard Organisation – Medzinárodná organizácia pre štandardizáciu
IUPUI Indiana University-Purdue University Indianapolis
KTJ Kolóniotvorné jednotky. Počet živých buniek, resp. zhlukov buniek, schopných po prenesení na vhodné živné médium tvoriť kolónie
MAF NZ Ministry of Agriculture and Forestry New Zealand
NMC National Mastitis Council, A global organisation for mastitis control and milk quality
NRLM Nitra Národné referenčné laboratórium pre mlieko a mliečne výrobky Nitra
NZFSA New Zealand Food Safety Authority
PMN Polymorfonukleárne neutrofilné leukocyty
PSB Počet somatických buniek
SB Somatické bunky
SNAS Slovenský národný akreditačný systém
ŠVPS SR Štátna veterinárna a potravinová správa Slovenskej republiky
ŠVPÚ Nitra Štátny veterinárny a potravinový ústav Nitra
UHT Ultra vysoko tepelný záhrev mlieka
USDA United States Department of Agriculture „interný limit“ (medzná hodnota)
Teoretický interval, v ktorom by sa mali nachádzať výsledky stanovené v NRLM pri skúšaní referenčnej vzorky
„externý limit“ (medzná hodnota)
Teoretický interval v ktorom by sa mali nachádzať výsledky stanovené laboratóriami pri skúšaní referenčnej vzorky
OBSAH
ÚVOD ..................................................................................................................................................... 12 1 PREHĽAD LITERATÚRY ........................................................................................................................ 14 1.1 MASTITÍDA .................................................................................................................................................... 14 1.1.1 VPLYVY VYVOLÁVAJÚCE MASTITÍDU ............................................................................................................. 14 1.1.1.1 MAKROORGANIZMUS DOJNICE ....................................................................................................................... 14 1.1.1.2 VONKAJŠIE PROSTREDIE ................................................................................................................................. 15 1.1.1.3 INFEKČNÝ ČINITEĽ.......................................................................................................................................... 16 1.1.2 MIKROORGANIZMY VYVOLÁVAJÚCE MASTITÍDU............................................................................................ 17 1.1.3 DIAGNOSTIKOVANÉ FORMY MASTITÍD............................................................................................................ 20 1.1.4 ZÁPAL MLIEČNEJ ŽĽAZY ................................................................................................................................. 22 1.1.5 TERAPIA MASTITÍD ......................................................................................................................................... 24 1.1.6 PREVENCIA MASTITÍD..................................................................................................................................... 29 1.1.6.1 DEZINFEKCIA CECKOV A LIEČBA V OBDOBÍ STÁTIA NA SUCHO....................................................................... 29 1.1.6.2 DODRŽIAVANIE HYGIENICKÝCH ZÁSAD V PRIEBEHU DOJENIA ........................................................................ 31 1.1.6.3 VYRADENIE CHRONICKY CHORÝCH DOJNÍC .................................................................................................... 37 1.1.6.4 SEGREGÁCIA DOJNÍC ...................................................................................................................................... 37 1.1.6.5 VAKCINÁCIA DOJNÍC ...................................................................................................................................... 37 1.1.6.6 LIEČBA KLINICKEJ MASTITÍDY POČAS LAKTÁCIE ............................................................................................ 38 1.2 VPLYV MASTITÍDY NA PRODUKCIU, ZLOŽENIE A TECHNOLOGICKÚ KVALITU
MLIEKA A MLIEČNYCH VÝROBKOV ................................................................................................ 39 1.3 NEBEZPEČENSTVO ASOCIOVANÉ S KONZUMÁCIOU MASTITÍDNEHO MLIEKA ................ 43 1.4 ÚLOHA NÁRODNÉHO REFERENČNÉHO LABORATÓRIA PRE MLIEKO A MLIEČNE
VÝROBKY VO VZŤAHU K SOMATICKÝM BUNKÁM, SYSTÉM KONTROLY........................... 46 1.5 PRÁVNE NORMY A POČET SOMATICKÝCH BUNIEK ................................................................... 48 1.6 CHARAKTERISTIKA SOMATICKÝCH BUNIEK ............................................................................... 50 1.6.1 BUNKY POCHÁDZAJÚCE Z KRVI ...................................................................................................................... 50 1.6.1.1 BUNKY BIELEHO KRVNÉHO OBRAZU............................................................................................................... 50 1.6.1.2 BUNKY ČERVENÉHO KRVNÉHO OBRAZU ......................................................................................................... 53 1.6.2 BUNKY POCHÁDZAJÚCE Z MLIEČNEJ ŽĽAZY................................................................................................... 53 1.6.3 NEBUNKOVÉ ÚTVARY Z MLIEKA..................................................................................................................... 54 1.7 VŠEOBECNÝ VÝZNAM SKÚŠANIA SUROVÉHO KRAVSKÉHO MLIEKA ................................... 55 1.8 STANOVENIE SOMATICKÝCH BUNIEK V SUROVOM KRAVSKOM MLIEKU ......................... 57 1.8.1 STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK RÝCHLYMI METÓDAMI (TESTAMI) ............................................. 58 1.8.1.1 STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK NK-TESTOM .............................................................................. 58 1.8.1.2 STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK CALIFORNIA MASTITIS TESTOM ................................................. 59 1.8.2 LABORATÓRNE METÓDY, PREVÁDZKOVÉ METÓDY ......................................................................................... 60 1.8.2.1 STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK CYTOMETRIOU TUHOU FÁZOU ................................................... 60 1.8.2.2 STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK NIR SPEKTROSKOPIOU .............................................................. 61
1.8.2.3 STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK VIDEO MIKROSKOPIOU............................................................... 61 1.8.2.4 STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK PRIETOKOVOU CYTOMETRIOU (PRÍSTROJOM FOSSOMATIC) ....... 62 1.8.2.5 STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK DISKOVOU CYTOMETRIOU
(PRÍSTROJOM FOSSOMATIC 90) .................................................................................................................. 64 1.8.2.6 STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK METÓDOU ELEKTRONICKÉHO POČÍTANIA ČASTÍC
(COULTER COUNTER)............................................................................................................................... 64 1.8.3 REFERENČNÁ METÓDA STANOVENIA POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK .............................................................. 64 1.8.4 METÓDY NA DIFERENCIÁCIU SOMATICKÝCH BUNIEK ..................................................................................... 65 1.9 BEZPEČNOSTNÁ SMERNICA PRE PRÁCU S ETÍDIUM BROMIDOM........................................... 68 1.9.1 CHARAKTERISTIKA ETÍDIUM BROMIDU........................................................................................................... 68 1.9.2 ŠKODLIVÉ ÚČINKY NA ĽUDSKÝ ORGANIZMUS................................................................................................. 68 1.9.3 SPÔSOBY PRENIKNUTIA DO ĽUDSKÉHO ORGANIZMU....................................................................................... 69 1.9.4 FYZIKÁLNE NEBEZPEČENSTVO ASOCIOVANÉ S CHEMIKÁLIOU ........................................................................ 69 1.9.5 URČENÉ OBLASTI POUŽÍVANIA ....................................................................................................................... 69 1.9.6 AUTORIZOVANÉ OSOBY.................................................................................................................................. 69 1.9.7 POŽIADAVKY NA TRÉNING PERSONÁLU .......................................................................................................... 70 1.9.8 USKLADNENIE A POŽIADAVKY NA MANIPULÁCIU........................................................................................... 70 1.9.9 TECHNICKÉ POŽIADAVKY ............................................................................................................................... 70 1.9.10 OSOBNÁ OCHRANA ......................................................................................................................................... 70 1.9.11 POKYNY PRE PRÁCU S ETÍDIUM BROMIDOM.................................................................................................... 71 1.9.12 PRVÁ POMOC .................................................................................................................................................. 71 1.9.13 LIKVIDÁCIA ROZLIATEHO ROZTOKU ETÍDIUM BROMIDU ................................................................................. 71 1.9.14 LIKVIDÁCIA NEBEZPEČNÉHO ODPADU (STARÝCH PRACOVNÝCH ROZTOKOV) ................................................. 72 1.9.15 DEAKTIVÁCIA ROZTOKOV ETÍDIUM BROMIDU............................................................................................... 72 1.10 MANAŽMENT KVALITY LABORATÓRNEJ PRÁCE PRE PRIAMU MIKROSKOPICKÚ
METÓDU POČÍTANIA SOMATICKÝCH BUNIEK ............................................................................. 75 1.11 PRÍPRAVA REFERENČNÝCH VZORIEK S PRESNÝM POČTOM SOMATICKÝCH
BUNIEK ..................................................................................................................................................... 79 2 CIEĽ PRÁCE............................................................................................................................................... 85 2.1 CIEĽ EXPERIMENTU 1 - STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK V SUROVOM KRAVSKOM MLIEKU
REFERENČNOU METÓDOU. ............................................................................................................................ 85 2.1.1 OČAKÁVANÉ VÝSLEDKY................................................................................................................................. 85 2.2 CIEĽ EXPERIMENTU 2 - PRÍPRAVA SEKUNDÁRNYCH REFERENČNÝCH MATERIÁLOV ................................. 85 2.2.1 OČAKÁVANÉ VÝSLEDKY................................................................................................................................. 86 2.3 CIEĽ EXPERIMENTU 3 - POROVNANIE VÝSLEDKOV MIKROSKOPICKÝCH METÓD ....................................... 86 2.3.1 OČAKÁVANÉ VÝSLEDKY................................................................................................................................. 88 3 MATERIÁL A METODIKA ...................................................................................................................... 89 3.1 EXPERIMENT 1 – STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK V SUROVOM KRAVSKOM MLIEKU
REFERENČNOU METÓDOU ............................................................................................................................. 89 3.1.1 MATERIÁL ..................................................................................................................................................... 89
3.1.2 LOKALITA ..................................................................................................................................................... 89 3.1.3 ČASOVÝ HARMONOGRAM A ROZSAH EXPERIMENTU....................................................................................... 89 3.1.4 POUŽITÉ METÓDY ........................................................................................................................................... 90 3.1.4.1 PRÍSTROJE, POMÔCKY, CHEMIKÁLIE A PRÍPRAVA ROZTOKOV PRE METÓDY A A B, PRÍPRAVA PODLOŽNÝCH
SKLÍČOK ..................................................................................................................................................... 90 3.1.4.2 METÓDA A ..................................................................................................................................................... 95 3.1.4.3 METÓDA B ..................................................................................................................................................... 97 3.1.4.4 METÓDA C ................................................................................................................................................... 100 3.1.5 ŠTATISTICKÉ VYHODNOTENIE EXPERIMENTU 1 - STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK V SUROVOM
KRAVSKOM MLIEKU REFERENČNOU METÓDOU ............................................................................................. 101 3.1.5.1 VÝPOČET NEISTÔT MERANIA METÓDY A A B ............................................................................................... 101 3.2 EXPERIMENT 2 – PRÍPRAVA SEKUNDÁRNYCH REFERENČNÝCH MATERIÁLOV.......................................... 103 3.2.1 MATERIÁL ................................................................................................................................................... 103 3.2.2 LOKALITA ................................................................................................................................................... 103 3.2.3 ČASOVÝ HARMONOGRAM A ROZSAH EXPERIMENTU..................................................................................... 103 3.2.4 PRÍSTROJE, POMÔCKY A CHEMIKÁLIE ........................................................................................................... 104 3.2.5 PRACOVNÝ POSTUP PRÍPRAVY REFERENČNÝCH VZORIEK ............................................................................. 104 3.2.6 SKÚŠANIE KVALITY PRIPRAVENÝCH REFERENČNÝCH VZORIEK .................................................................... 107 3.2.7 ŠTATISTICKÉ VYHODNOTENIE EXPERIMENTU 2 – PRÍPRAVA SEKUNDÁRNYCH REFERENČNÝCH
MATERIÁLOV ................................................................................................................................................ 107 3.3 EXPERIMENT 3 – POROVNANIE VÝSLEDKOV MIKROSKOPICKÝCH METÓD ............................................... 109 3.3.1 MATERIÁL ................................................................................................................................................... 109 3.3.2 ANALÝZA VZORIEK ...................................................................................................................................... 109 3.3.3 ČASOVÝ HARMONOGRAM A ROZSAH EXPERIMENTU..................................................................................... 110 3.3.4 PRACOVNÝ POSTUP....................................................................................................................................... 110 3.3.5 ŠTATISTICKÉ VYHODNOTENIE EXPERIMENTU 3 - POROVNANIE VÝSLEDKOV MIKROSKOPICKÝCH METÓD ..... 112 4 VÝSLEDKY ............................................................................................................................................... 113 4.1 VYHODNOTENIE EXPERIMENTU 1 - STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK V SUROVOM
KRAVSKOM MLIEKU REFERENČNOU METÓDOU ......................................................................................... 113 4.1.1 ZHRNUTIE VÝSLEDKOV EXPERIMENTU 1 - STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK V SUROVOM
KRAVSKOM MLIEKU REFERENČNOU METÓDOU ............................................................................................. 122 4.2 VYHODNOTENIE EXPERIMENTU 2 – PRÍPRAVA SEKUNDÁRNYCH REFERENČNÝCH MATERIÁLOV ............ 123 4.2.1 ZHRNUTIE VÝSLEDKOV EXPERIMENTU 2....................................................................................................... 135 4.3 VYHODNOTENIE EXPERIMENTU 3 – POROVNANIE VÝSLEDKOV MIKROSKOPICKÝCH METÓD .................. 139 4.3.1 VÝSLEDKY KOLABORATÍVNEJ ŠTÚDIE .......................................................................................................... 145 4.3.2 ZHRNUTIE VÝSLEDKOV EXPERIMENTU 3....................................................................................................... 149 5 DISKUSIA .................................................................................................................................................. 151 6 NÁVRH NA VYUŽITIE ZISTENÝCH POZNATKOV ........................................................................ 162 7 ZÁVER ................................................................................................................................................... 164 8 ZOZNAM POUŽITEJ LITERATÚRY ................................................................................................... 167
9 PRÍLOHY................................................................................................................................................... 182 PRÍLOHA 1 – PRAVIDLÁ PRE IDENTIFIKÁCIU A POČÍTANIE SOMATICKÝCH BUNIEK V SUROVOM KRAVSKOM MLIEKU PRÍLOHA 2 – CALIFORNIA MASTITIS TEST PRÍLOHA 3 – MIKROSKOP OLYMPUS BX51 PRÍLOHA 4 – SPEKTRÁLNA CHARAKTERISTIKA POUŽITÉHO SVETELNÉHO ZDROJA – ORTUŤOVEJ LAMPY PRÍLOHA 5 – ZOZNAM FLUOROCHRÓMOV, VÝBER FLUOROCHRÓMOV, CHARAKTERISTIKA VLNOVÝCH DĹŽOK
POUŽITÝCH ZRKADLOVÝCH JEDNOTIEK S EXCITAČNÝM A EMISNÝM FILTROM A DICHROICKÝM
ZRKADLOM, INTERKALÁCIA ETÍDIUM BROMIDU DO MOLEKULY DNA PRÍLOHA 6 – PRÍSTROJ FOSSOMATIC 5000 PRÍLOHA 7 – FOTODOKUMENTÁCIA PRACOVNÉHO POSTUPU PODĽA NORMY STN EN ISO 13366-1 (2001) PRÍLOHA 8 – FOTODOKUMENTÁCIA PRACOVNÉHO POSTUPU PRÍPRAVY PREPARÁTU PODĽA MODIFIKOVANEJ
METÓDY PUBLIKOVANEJ VERMUNTOM ET AL. (1995) PRÍLOHA 9 – FOTODOKUMENTÁCIA, OBRÁZKY MIKROSKOPICKÝCH PREPARÁTOV METÓDY A A METÓDY B PRÍLOHA 10 – FAKTORY MIKROSKOPU PRE OBJEKTÍV 60 X, PRE METÓDU A PRÍLOHA 11 – FAKTORY MIKROSKOPU PRE OBJEKTÍV 60 X, PRE METÓDU B PRÍLOHA 12 – PRÍKLAD VÝPOČTU POMERU RIEDENIA MLIEKA PRI PRÍPRAVE REFERENČNÝCH VZORIEK PRÍLOHA 13 – NAVÁŽKA K2CR2O7 PRE PRÍPRAVU REFERENČNEJ VZORKY PRÍLOHA 14 – PRÍKLAD VALIDAČNÉHO PROTOKOLU PRÍLOHA 15 – BIELE KRVINKY (LEUKOCYTY) PRÍLOHA 16 – KRV HOVÄDZIEHO DOBYTKA PRÍLOHA 17 – VYPOČÍTANÉ KORELAČNÉ KOEFICIENTY PRE MIKROSKOPICKÉ METÓDY STANOVENIA POČTU
SOMATICKÝCH BUNIEK V EXPERIMENTE 1 A EXPERIMENTE 3
12
ÚVOD
Mastitída patrí medzi najdôležitejšie ochorenia hovädzieho dobytka. Ovplyvňuje
ekonomiku výroby mlieka, znižuje jeho kvalitu a technologickú využiteľnosť. S mastitídou
stúpa riziko prítomnosti patogénnych mikroorganizmov a rezíduí antibiotík v mlieku.
Na znižovanie výskytu mastitídy by sa mali využívať komplexné proti mastitídne
programy ako starostlivosť o prostredie, správne postupy dojenia, aplikácia dezinfekčných
prípravkov pred a po dojení, vhodná preventívna liečba v období státia na sucho, liečba
akútnych ochorení, separácia a segregácia chorých dojníc a využívanie laboratórnych metód
v rámci preventívneho zisťovania mastitídy.
Hlavným indikátorom a diagnostickým štandardom pri zisťovaní mastitídy sú
somatické bunky. Somatické bunky pozostávajú z viacerých typov buniek zahŕňajúc
polymorfonukleárne leukocyty, makrofágy, lymfocyty a epitelové bunky.
Počet somatických buniek v mlieku sa prudko zvyšuje v počiatočných fázach zápalu
vemena a znižuje sa až postupným liečením. Somatické bunky, predovšetkým neutrofilné
leukocyty hrajú dôležitú obrannú úlohu voči infekcii vemena. Ich hlavnou úlohou je
fagocytovať a zničiť infekčné agens. Ceckový kanálik tvorí prvú bariéru voči bakteriálnej
infekcii. Baktérie prestupujúce cez túto bariéru sa v ceckovej cisterne stretávajú s druhou
bariérou, ktorú tvoria fagocytujúce leukocyty. Po spustení zápalovej reakcie sa zvyšuje počet
neutrofilných leukocytov v mieste infekcie. Zvýšenie počtu somatických buniek je normálnou
fyziologickou reakciou organizmu voči infekcii. Fyziologicky normálne množstvo
somatických buniek v mlieku nadojenom zo zdravého vemena je približne od 20 000 do
200 000 v 1 ml. Podľa Medzinárodnej mliekarenskej federácie má mlieko zdravej štvrťky
mliečnej žľazy obsahovať menej ako 250 000 somatických buniek v 1 ml.
V súčasnosti sa na hodnotenie počtu somatických buniek v bežnej praxi používa
metóda, podľa STN EN ISO 13366-3 (2001) Mlieko, Stanovenie počtu somatických buniek,
Časť 3: Fluorescenčná optická elektronická metóda. V Slovenskej republike však nikto
nepraktizuje používanie mikroskopickej referenčnej metódy. Presnosť prístrojov typu
Fossomatic pre vyššie spomenutú metódu sa overuje pomocou dovezených referenčných
vzoriek zo zahraničia, pričom presnosť prevádzkovej metódy sa kontroluje
medzilaboratórnymi porovnávaniami.
Na základe autorizácie Štátnou veterinárnou a potravinovou správou SR je Národné
referenčné laboratórium pre mlieko a mliečne výrobky ŠVPÚ Nitra povinné zavádzať
najpresnejšie a najmodernejšie laboratórne metódy. Laboratórium je poverené viacerými
13
úlohami. Jednou z úloh je zabezpečovanie referenčných vzoriek a organizovanie
medzilaboratórnych porovnávaní pre metódu stanovenia počtu somatických buniek v surovom
kravskom mlieku za účelom kontroly súčasného systému hodnotenia kvality mlieka
v Slovenskej republike.
Z uvedeného vyplýva potreba zaviesť a praktizovať u nás predpísanú referenčnú
metódu STN EN ISO 13366-1 (2001) Mlieko, Stanovenie počtu somatických buniek, Časť 1:
Mikroskopická metóda, alebo navrhnúť a preskúmať možnosti používania inej metódy u nás
zatiaľ nepublikovanej ako referenčnej metódy v tejto oblasti.
14
1 PREHĽAD LITERATÚRY
1.1 Mastitída
Drahošová a Drončovský (2004) uvádzajú, že mastitída je zápalové ochorenie
mliečnej žľazy, ktoré je charakterizované fyzikálnymi, chemickými a mikrobiálnymi
zmenami, ako aj vzostupom počtu somatických buniek a ďalšími zmenami v zložení mlieka.
Patrí medzi ekonomicky najzávažnejšie ochorenia hospodárskych zvierat.
Mastitída je zápalové ochorenie mliečnej žľazy a somatické bunky sú vo všeobecnosti
štandardom pri jej diagnostikovaní (Pyörärlä, 2003).
1.1.1 Vplyvy vyvolávajúce mastitídu
Podľa Drahošoveej a Drončovského (2004) mastitídu môžu vyvolať neinfekčné alebo
infekčné vplyvy. Za neinfekčné vplyvy sa považujú traumatické, mechanické, chemické,
toxické a fyzikálne vplyvy. Infekčné vplyvy sú mikrobiálneho pôvodu a v praxi sa s nimi
stretávame najčastejšie.
Infekčná mastitída patrí k polyfaktoriálnym ochoreniam, na vznik a šírení ktorého sa
zúčastňujú tri biosystémy (Burdová et al., 1999; Drahošová a Drončovský, 2004; Kováč et
al., 2001).
1.1.1.1 Makroorganizmus dojnice
Kováč et al. (2001) uvádzajú, že vnímavosť dojnice je závislá od geneticky
podmienených faktorov, anatomického, morfologického, funkčného a biochemického stavu
dojnice ako aj faktorov laktácie (veku, štádia laktácie, dojnosti). Individuálnu vnímavosť
určuje najmä imunologická a cytologická reaktivita mliečnej žľazy.
Medzi činitele vrodenej nešpecifickej odolnosti dojnice patria: stav kože a slizníc,
anatomická stavba cecka, ceckového kanálika a ústia ceckového kanálika, funkcia ceckového
kanálika, nevyrovnanosť kapacity jednotlivých štvrtiek, bakteriostatická aktivita laktoferínu
v epitelových bunkách a neutrofilných granulocytoch, laktoperoxidázo-thiokyanát-
hydroxidový systém potláčajúci rozmnožovanie mikroorganizmov, komplement sekrétu
mliečnej žľazy s bakteriocídnymi vlastnosťami, lyzozým pôsobiaci proti fagocytovaným
15
hlavne Gram pozitívnym mikroorganizmom, fagocytóza – pôsobenie defenzínov
s antibakteriálnymi cytotoxickými účinkami v polymorfonukleárnych leukocytoch
v zápalovom ložisku a iné.
Medzi činitele špecifickej odolnosti dojnice patria: imunoglobulíny, ktoré sa
v sekrétoch mliečnej žľazy syntetizujú lokálne alebo sú transportované zo séra. Obranu
mliečnej žľazy pred baktériami zabezpečujú IgG1, IgG2, IgA a IgM. Opsonizácia (stav keď
niektoré lymfocyty produkujú IgG a IgM), neutralizácia bakteriálnych toxínov (závisí na
reakcii s protilátkami), imunita sprostredkovaná v mliečnej žľaze bunkami (proti
mikroorganizmom prežívajúcim fagocytózu), lokálna imunita sprostredkovaná sekrečným
IgA, ktorý je transportovaný do sekrétu mliečnej žľazy.
Medzi špecifické a nešpecifické činitele patria cytokíny, ktoré hrajú dôležitú úlohu
v hostiteľskej obrane regulovaním aktivity buniek.
1.1.1.2 Vonkajšie prostredie
Kováč et al. (2001) ďalej uvádzajú, že medzi faktory vonkajšieho prostredia patria
ustajnenie, klimatické podmienky, kŕmenie, hygienické a technologické podmienky spojené
s prvovýrobou mlieka a ľudský činiteľ (dojič, ošetrovateľ). Špecifický význam majú faktory
súvisiace so strojovým dojením. Mnohé z týchto vplyvov sú považované za predispozičné.
Z hľadiska hygieny ustajnenia môže na dojnicu negatívne vplývať úzke a krátke státie,
stav ležoviska a podstielky, klimatické podmienky v maštali ako nadmerné prúdenie
studeného vzduchu, chlad, vlhkosť, vysoké teploty vonkajšieho prostredia, zvýšená
koncentrácia plynov NH3, H2S, CO2, zvýšená prašnosť a hlučnosť.
Neplnohodnotná kŕmna dávka z hľadiska kvalitatívneho a kvantitatívneho, nedostatok
v príjme tekutín, nedostatok mikroprvkov (napr. meď, zinok, selén) a vitamínov ako (napr.
vitamín E, vitamín A, β–karotén) vplývajú na zdravotný stav dojnice, ovplyvňujú
metabolizmus (acidózy, alkalózy), znižujú odolnosť voči infekčným činiteľom a ovplyvňujú
imunitné mechanizmy v mliečnej žľaze. Nedostatočná výživa má za následok zvýšenie počtu
somatických buniek v mlieku.
Nešetrnosť, násilná manipulácia, predojovanie a stres dojníc vedú v potláčanie ejekcie
mlieka a k zadržovaniu mlieka. Dojacie zariadenia môžu počas dojenia spôsobiť mikro
a makro traumatizačné poranenia a prenos patogénnej mikroflóry. Nepriaznivý vplyv majú
poškodené, opotrebované ceckové násadce, vysoký podtlak, vysoká a nízka frekvencia
pulzov.
16
Vplyvom vonkajších faktorov prostredia môže dochádzať k poraneniam mliečnej
žľazy a ceckov a následne k mastitíde (Kováč et al., 2001).
1.1.1.3 Infekčný činiteľ
Infekčný činiteľ ovplyvňuje vznik a priebeh mastitídy svojou prítomnosťou,
početnosťou, patogenitou, virulenciou a antigenicitou. Infekčná mastitída vzniká dôsledkom
infekcie mliečnej žľazy, ktorá je exogénneho pôvodu. Infekcia mliečnej žľazy je podmienená
jej expozíciou patogénmi, penetráciou patogénov ceckovým kanálikom, kolonizáciou
mliečnej žľazy patogénnymi mikroorganizmami, ktoré sa tu množia, dráždia a poškodzujú
tkanivo mliečnej žľazy (Kováč et al., 2001).
Znázornenie vzájomných vzťahov troch systémov (dojnica, mikroorganizmy,
prostredie) pri riziku vzniku intramamárnej infekcie je uvedené na Obrázku 1.
17
Obrázok 1. Znázornenie vzájomných vzťahov troch systémov (dojnica, mikroorganizmy,
prostredie) pri riziku vzniku intramamárnej infekcie. Obrázok je modifikovaná schéma podľa
Kováča (Kováč et al., 2001).
1.1.2 Mikroorganizmy vyvolávajúce mastitídu
Baktérie spôsobujúce mastitídu sa môžu zaradiť do dvoch kategórií: ako majoritné
alebo minoritné (Harmon, 1994).
Medzi majoritné patogénne mikroorganizmy patria Staphylococcus aureus,
Streptococcus agalactiae.
18
Medzi minoritné patogénne mikroorganizmy patria streptokoky (Streptococcus uberis,
Streptococcus dysgalactiae, streptokoky skupiny C, G a L, enterokoky), koliformné baktérie
(Escherichia coli, Bacillus spp., Proteus spp.), koagulázovo-negatívne mikrokoky
(Staphylococcus sp., Micrococcus sp., Corynebacterium bovis), Actinomyces sp. (Actinomyces
pyogenes), menej častý pôvodcovia (Mycoplasma spp., Leptospira spp., Listeria spp.,
Klebsiella sp., Moraxella sp. Acholeplazma sp., Candida sp., kvasinky, Mucor sp.), špecifickí
pôvodcovia (Mycobacterium sp., Brucella sp.) (Burdová, 1998; Drahošová a Drončovský,
2004; Elečko, 1995; Harmon, 1994; Kováč et al., 2001; Murphy a Boor, 1999; Vasiľ,
1998; De Haas, 2003).
Mastitídy vyvolané majoritnými patogénnymi mikroorganizmami sa prejavujú väčšími
zmenami v zložení mlieka, dochádza pri nich k výraznému vzostupu počtu somatických
buniek a spôsobujú výrazné ekonomické straty. Mastitídy vyvolané minoritnými patogénnymi
mikroorganizmami sa prejavujú miernym zápalom a miernym zvýšením počtu somatických
buniek. Počet somatických buniek sa zvýši oproti normálnemu stavu iba dvoj až trojnásobne.
Minoritné patogénne infekcie sú zriedkavo asociované s klinickou mastitídou, výraznými
zmenami v zložení mlieka a dramatickým poklesom produkcie mlieka (Harmon, 1994).
Infekčné mastitídy sú vyvolané vysoko kontagióznymi patogénnymi baktériami,
predovšetkým Staphylococcus aureus a Streptococcus agalactiae. Hlavným rezervoárom
týchto patogénnych mikroorganizmov je infikované vemeno a infekcia sa šíri medzi
jednotlivými dojnicami alebo medzi štvrťkami vemena takmer výhradne v priebehu procesu
dojenia kontaminovaným dojacím zariadením, rukami dojiča, handrami alebo špongiami na
umývanie a osušenie vemena. Infekcia má tendenciu byť chronická, dlhotrvajúca
a subklinická s periodickými klinickými epizódami. Následkom infekčnej mastitídy sú pokles
produkcie mlieka a zvýšenie počtu somatických buniek v bazénovom mlieku (Harmon,
1996).
Aj napriek tomu, že Streptococcus agalactiae nenapadá glandulárnu časť tkaniva
mliečnej žľazy a nevyvoláva fibrózu ani abscesy (ako je to pri infekciách Staphylococcus
aureus) pri kolonizácii povrchu epitelu spôsobuje subklinické mastitídy alebo ich
intermitentné klinické symptómy. Staphylococcus aureus je pravdepodobne najnebezpečnejší
z kontagióznych baktérií. Ním vyvolané chronické mastitídy sa lokalizujú v najhlbších
19
častiach tkaniva mliečnej žľazy. Naviac tieto infekcie sa veľmi ťažko liečia (Kováč et al.,
2001).
Podľa Harmona (1996) Streptococcus dysgalactiae sa vo všeobecnosti považuje za
enviromentálny patogénny mikroorganizmus, ale môže mať charakter kontagiózneho
mikroorganizmu a môže vyvolávať infekčné mastitídy a šíriť sa z dojnice na dojnicu.
Aj napriek tomu, že je tento patogén citlivý na dezinfekciu ceckov a terapiu počas zasušenia,
v stádach sa často objavujú nové infekcie Corynebacterium bovis sa považuje za minoritný
patogénny mikroorganizmus. Hlavným rezervoárom je infikované vemeno alebo ceckový
kanál. Tento mikroorganizmus sa rýchlo šíry z dojnice na dojnicu ak sa neaplikuje
dezinfekcia ceckov pred dojením. Infekcia Corynebacterium bovis spôsobuje iba mierny zápal
vemena a počet somatických buniek v mlieku sa zvyšuje dvoj až trojnásobne. Len zriedkavo
je táto infekcia príčinou zvýšeného počtu somatických buniek v bazénovom mlieku, klinickej
mastitídy, výrazných zmien v zložení mlieka alebo dramatického poklesu produkcie mlieka.
Mycoplasma sp. sú kontagiózne patogénne mikroorganizmy, ktoré sa v niektorých
oblastiach vyskytujú zriedkavo ale v iných pomerne často. Mycoplasma bovis je najčastejšie
sa vyskytujúci druh, ktorý spôsobuje v chovoch vážne problémy, pretože priebeh infekcie je
neočakávaný, infekcia sa rýchlo šíri medzi dojnicami a dochádza k výraznému poklesu
produkcie mlieka.
Výskyt nových infekcií kontagióznymi baktériami môžeme najčastejšie badať u dojníc
na druhej laktácii. Keďže poväčšine vyvolávajú mastitídu so subklinickým priebehom,
spôsobujú nemalé problémy tak chovateľovi, ako aj samotnému veterinárnemu lekárovi, a to
najmä z hľadiska produkcie mlieka (Kováč et al., 2001).
Medzi enviromentálne patogénne baktérie vyvolávajúce mastitídy dojníc zaraďujeme:
mikroorganizmy Escherichia coli, Klebiella sp., (Klebsiella pneumoniae), Enterobacter sp.,
(Enterobacter aerogenes), Citrobacter sp. Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis,
Streptococcus bovis, Enterococcus faecium a Enterococcus faecalis a ďalšie známe
enviromentálne streptokoky a enterokoky, Seratia sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., a iné
Gramnegatívne baktérie, koagulázo-negatívne druhy rodu Staphylococcus, Rickettsia burneti,
kvasinky a mikroskopické vláknité huby, vírusy, druhy rodu Prototheca, Aktinomyces
pyogenes, parazity. Zdrojom enviromentálnych patogénnych baktérií je okolie dojnice,
ležovisko, hnoj, pôda. Po invázii do mliečnej žľazy enviromentálne patogénne baktérie
vyvolávajú mastitídy s perakútnym, resp. akútnym priebehom. Niektoré z nich sa však môžu
20
stabilizovať ako chronické infekcie mliečnej žľazy. Čistota budov a ustajnenia, obmedzenie
vlhkosti prostredia, zamedzenie hromadenia hnoja, ošetrovanie vemena, insekticídna kontrola
a zníženie poškodzovania koncov ceckov a ceckového kanálika sú dôležité opatrenia pre
elimináciu enviromentálnych patogénnych baktérií (Hogan a Smith, 1987, 1997; Hogan et
al., 1990; Kristula et al., 2005; Kováč et al., 2001; Schukken et al., 1991; Smith et al.,
1985; Todhunter et al., 1995; Zadoks et al., 2001; Zdanowicz et al., 2004).
1.1.3 Diagnostikované formy mastitíd
Kováč et al. (2001) uvádzajú, že na základe klinického, cytologického
a bakteriologického vyšetrenia rozoznávame nasledovné formy mastitíd:
1. Klinicky zjavné formy mastitíd:
- subakútne: na mliečnej žľaze nepozorujeme klinické príznaky zápalu, ale v prvých
strekoch mlieka sa nachádzajú biele vločky,
- akútne: výrazné príznaky zápalu ako teplo, bolestivosť, opuch, často je zhoršený
celkový zdravotný stav, mlieko býva už pri makroskopickom posúdení zmenené.
Akútna mastitída sa môže vyskytovať v dvoch formách – katarálnej
a parenchymatóznej.
- chronické: príznaky dlhotrvajúceho zápalu, postihnutá časť vemena často atrofuje.
Pri klinických formách mastitíd sa obyčajne zisťujú v mlieku postihnutých dojníc
zvýšené počty somatických buniek (nad 500 000 . ml-1) a prítomnosť patogénnych
mikroorganizmov.
2. Subklinické mastitídy, pri ktorých sa nezisťujú typické príznaky, pri zvýšenom počte
somatických buniek sú však z mlieka izolované patogénne mikroorganizmy.
3. Latentné mastitídy, neprejavujú sa klinickými príznakmi, v mlieku s normálnym
počtom somatických buniek sú však prítomné patogénne mikroorganizmy.
4. Abakteriálne (nešpecifické alebo aseptické) mastitídy: tvoria 20 – 30 % všetkých
mastitíd. Neizolujú sa pri nich z mlieka patogénne mikroorganizmy, ostatné
symptómy sú buď subklinického alebo klinického charakteru.
21
Z hľadiska rýchlosti šírenia sa mastitídy dojníc rozdeľujú na infekčné a neinfekčné.
V prvom prípade ide o mastitídy vyvolané skupinou vysoko kontagióznych patogénnych
baktérií, ktoré kolonizujú priamo mliečnu žľazu pri kontaminácii dojacieho zariadenia a rúk
dojičov. V druhom prípade sú to mastitídy vyvolané patogénnymi baktériami, ktoré normálne
nieinfikujú mliečnu žľazu a k infekcii dochádza keď je im z okolia umožnený prístup do
cisterny mliečnej žľazy. Možno ich označiť ako enviromentálne patogénne agensy infikujúce
mliečnu žľazu (Kováč et al., 2001).
Burdová et al. (1999) uvádzajú, že pre značnú neprehľadnosť mastitíd odporučila
Svetová zdravotnícka organizácia (WHO), Organizácia pre poľnohospodárstvo a výživu
(FAO) a Medzinárodná mliekarská federácia (IDF) skĺbiť aspekty klinické a hygienické,
a rôzne stavy mliečnej žľazy porovnávať s tzv. normálnym vemenom. Na základe týchto
aspektov IDF definuje:
1. Normálne vemeno – nevykazuje zjavné príznaky patologických zmien, mlieko
neobsahuje patogénne mikroorganizmy, nevyskytuje sa zvýšený počet somatických
buniek, sekrét senzoricky nie je zmenený, rovnako aj obsah tuku, bielkovín a laktózy,
fyzikálne a chemické vlastnosti sú vo fyziologickom rozpätí.
2. Latentná infekcia – vyznačuje sa prítomnosťou patogénnej mikroflóry, obsah
somatických buniek je v norme, sekrét nie je zmyslovo zmenený, fyzikálne
a chemické vlastnosti sú v norme.
3. Subklinická mastitída – chýbajú makroskopické symptómy zápalu, obsah somatických
buniek je zvýšený. Znížená je dojivosť postihnutej štvrťky, sekrét je bez
makroskopických zmien, zmeny sú v chemickom zložení a vlastnostiach mlieka.
Zvýšené je pH, chloridy, elektrická vodivosť, prítomná je patogénna mikroflóra.
4. Klinická mastitída – vyznačuje sa akútnym, subakútnym, perakútnym, resp.
chronickým priebehom, postihuje rôzne časti tkanív mliečnej žľazy, s rôznym
charakterom zápalu, s rôzne výraznými zmenami senzorických, fyzikálno-chemických
vlastností sekrétu, prítomná je patogénna mikroflóra.
5. Akútna mastitída – na vemene sú viditeľné symptómy zápalu. Mlieko je
makroskopicky zmenené. Príznaky zápalu sú zreteľné, vyniká začervenanie až
cyanotické sfarbenie, bolestivý opuch, zväčšenie štvrtiek, tuhšia konzistencia, zmeny
triasu, zvýšená teplota, poruchy celkového zdravotného stavu. Patogénna mikroflóra je
prítomná.
22
6. Subakútna mastitída – na vemene chýbajú zreteľné zmeny. V mlieku, zvlášť v prvých
strekoch sú prítomné vločky. Množstvo mlieka je znížené, fyzikálno-chemické
vlastnosti mlieka sú zmenené. Prítomnosť patogénnej mikroflóry je striedavá.
7. Chronická mastitída – prejavuje sa zmenami na mliečnej žľaze a mlieku rôznej
intenzity. Niektoré symptómy môžu chýbať. Postihnutá štvrťka je zväčšená,
postihnutý parenchým je nahradený spojivovým tkanivom. Palpáciou sú hmatateľné
väzivové uzly a povrazce. Produkcia mlieka je výrazne znížená, sekrét je zmenený od
vločiek v prvých strekoch po serózny až purulentný. Nález patogénnej mikroflóry
môže byť pozitívny aj negatívny.
8. Nešpecifické – aseptické mastitídy – označované aj ako iritačné sú tie, keď nie je
dokázaná infekcia, ale sú zrejmé subklinické alebo klinické symptómy, výnimočne sa
môžu vyskytnúť vločky v prvom nádoji, zmeny sú vo fyzikálnych a chemických
vlastnostiach mlieka, zreteľne zvýšená je elektrická vodivosť.
1.1.4 Zápal mliečnej žľazy
Harmon (1994) popisuje mechanizmus zápalu mliečnej žľazy nasledovne: zápalová
odpoveď sa inicializuje po tom, ako baktérie vstúpia do mliečnej žľazy cez ceckový kanálik
a pomnožia sa. Bakteriálne toxíny, enzýmy a komponenty bunkových stien baktérií môžu
priamo vplývať na funkciu žľazového epitelu a môžu stimulovať produkciu mnohých
zápalových mediátorov pomocou zápalových buniek (neutrofily, monocyty, makrofágy, T-
lymfocyty, prípadne ďalšie zápalové bunky). Zápalové bunky zohrávajú dôležitú úlohu v
patogenéze ochorenia.
Harmon (1994) ďalej uvádza, že medzi mediátory zápalu patria napríklad fragmenty
komplementu, prostaglandíny, leukotriény, histamín, serotonín, interleukíny, tumor
nekrózový faktor, interferón, cytokíny a ďalšie.
Klasické symptómy zápalu zahŕňajú zvýšenú vaskulárnu permeabilitu, vazodilatáciu,
edémy, zvýšenie prietoku krvi, zvýšenie počtu polymorfonukleárnych neutrofilných
leukocytov, zvýšenú migráciu polymorfonukleárnych neutrofilných leukocytov, pokles
v syntetickej aktivite mliečnej žľazy, bolesť a horúčku.
V klinických modeloch mastitídy bolo pozorované zvýšenie sérového kortizolu
a pokles plazmového železa a zinku. Prejavom chronického zápalového ochorenia je značná
infiltrácia mononukleárnymi leukocytmi.
23
Jednou z iniciačných zložiek zápalovej odpovede je príliv polymorfonukleárnych
neutrofilných leukocytov (PMN) do tkaniva mliečnej žľazy. PMN tvoria základ obrany
mliečnej žľazy za normálnych fyziologických podmienok. PMN voľne pretekajú cez kapiláry
a iba veľmi málo sa adherujú na steny ciev. Počas infekcie a zápalu sa adhézia molekúl
zvyšuje a PMN sa držia pri okraji alebo adherujú na endotel menších ciev a prechádzajú
medzi bunkami ktoré tieto cievy obklopujú.
Chemické faktory uvoľnené z leukocytov prítomných v mlieku alebo uvoľnené
z poškodeného tkaniva priťahujú veľké množstvo PMN do mlieka. PMN vo veľkých
množstvách vystieľajú vonkajšiu stranu niektorých alveol. Súčasne môže dochádzať
k zjavnému poškodeniu syntetickej funkcie buniek, v ktorých sa tvorí mlieko a PMN môžu
prechádzať pomedzi bunky epitelu do lumenu alveol.
V konečnom dôsledku tento proces má za následok zvýšenie počtu somatických
buniek v mlieku dôsledkom zvýšenej migrácie PMN na miesto vzniknutej infekcie. PMN sa
taktiež infiltrujú medzi bunky okolo ceckov, ceckových cisterien a ceckových kanálikov.
Tieto časti vemena môžu byť hlavným miestom migrácie PMN počas počiatočnej odpovede
na inváziu zápalových činiteľov.
Funkciou PMN v mlieku je pohltiť a rozložiť invázne baktérie. Keď PMN vstupujú do
mlieka, obvykle pohltia aj iné častice ako tukové guľôčky a kazeín, v dôsledku čoho sa
znižuje efektívnosť týchto buniek v porovnaní s inými krvnými bunkami. Aj napriek tomuto
faktu PMN hrajú kľúčovú úlohu v obrannom mechanizme vemena.
Leukocyty prítomné v mlieku môžu uvoľňovať špecifické látky, ktoré menia
permeabilitu krvných kapilár a priťahujú väčšie množstvo leukocytov do oblasti s infekciou.
S perzistujúcou bakteriálnou infekciou sa množstvo leukocytov mení, ale vo všeobecnosti
zostáva abnormálne vysoké. Abnormálne množstvo somatických buniek pretrváva až do
eliminovania počtu prítomných baktérií. S postupujúcim procesom hojenia mliečnej žľazy sa
postupne znižuje množstvo somatických buniek.
Okrem zvýšenia počtu somatických buniek sa infekcia prejavuje viacerými príznakmi.
Predovšetkým môže dochádzať k zníženiu syntetickej aktivity mliečnej žľazy vplyvom
toxínov, enzýmov, mediátorov zápalovej reakcie a iných látok, ktoré poškodzujú tkanivo
produkujúce mlieko. Zmeny permeability krvných ciev a žľazového epitelu vedú k prestupu
zložiek krvi do mlieka a prestupu niektorých normálnych zložiek mlieka z lumenu alveol do
perivaskulárneho priestoru. Tkanivo vzniknuté agregáciou leukocytov a faktorov krvného
zrážania môže blokovať malé kanáliky a zabraňovať tým celkovému prestupu mlieka.
Poškodenie epitelových buniek a blokovanie malých kanálikov môže viesť v niektorých
24
prípadoch k zjazveniu tkaniva, jeho poškodeniu alebo až k permanentnej strate sekrečnej
funkcie. V lepších prípadoch sa po skončení zápalu tkanivo zotaví a jeho funkcia sa obnoví
ešte v prebiehajúcej alebo v nasledujúcej laktácii.
Hogan et al. (1993) skúmali úlohu vitamínu E a selénu v obrannom protimastitídnom
mechanizme. Autori uvádzajú, že v metabolizme neutrofilov vznikajú voľné kyslíkové
radikály, ktoré sú nevyhnutnou súčasťou obranného mechanizmu voči baktériam. Voľné
kyslíkové radikály, ale aj ďalšie reaktívne molekuly však môžu spôsobovať poškodenie
samotných neutrofilov ako aj okolitého tkaniva mliečnej žľazy. K poškodeniu tkaniva
dochádza prostredníctvom peroxidácie lipidov, ktoré sú súčasťou bunkových membrán,
inaktiváciou alebo denaturáciou bunkových enzýmov, poškodením DNA a poškodením
sacharidov sa môže zmeniť funkcia bunkových receptorov.
Vitamín E a enzým glutatión peroxidáza (GSH-Px) sú celulárne antioxidanty, ktoré
chránia voči cytotoxickému pôsobeniu metabolitov kyslíka.
Vitamín E je súčasťou membrán a GSH-Px je súčasťou cytozolu. GSH-Px konvertuje
peroxid vodíka na vodu a lipidové hydroxiperoxidy na príslušný alkohol.
Vitamín E inhibuje autooxidáciu polynenasýtených mastných kyselín v membránach
neutrofilov, nachádza sa v tesnej blízkosti oxidázozových enzýmov, ktoré iniciujú tvorbu
voľných radikálov.
Suplementácia výživy vitamínom E zvyšuje baktericídnu aktivitu neutrofilov
prítomných v krvi. Suplementácia výživy selénom, ktorý je súčasťou enzýmu GSH-Px vedie
v rýchlejšie vyplavenie neutrofilov do mlieka a zvyšuje intracelulárne zabíjanie pohltených
baktérií neutrofilmi. Selén zvyšuje aktivitu enzýmu GSH-Px.
Deficit selénu a vitamínu E vo výžive vedie k zvýšeniu incidencie mastitídy.
Suplementácia výživy dojníc selénom a vitamínom E znižuje frekvenciu a skracuje dĺžku
trvania mastitídy.
1.1.5 Terapia mastitíd
Vasiľ (1998) uvádza, že v chovoch hovädzieho dobytka sa bez liečby klinických
foriem mastitíd nezaobídeme, nakoľko v komplexe protimastitídnych opatrení zohráva
antimikrobiálna terapia významné postavenie.
25
Klinické formy mastitíd je potrebné liečiť, pričom platí zásada, že terapeutický zákrok
je potrebné realizovať hneď po zistení prvých symptómov zápalu, aby nedošlo k rozvinutiu
nenapraviteľných zmien v tkanive mliečnej žľazy, resp. aby sa proces nezmenil na chronický.
V priebehu obdobia laktácie sa používajú dva spôsoby terapie: parenterálna
a intramamárna.
Parenterálna terapia sa v súčasnej dobe v liečbe mastitíd používa málo, najčastejšie
však pri perakútnych a ťažkých akútnych stavoch ako doplnok intramamárnej liečby.
Hlavným dôvodom je nedostatočný prestup väčšiny antibiotík cez bariéru krv-mlieko.
Náročné kritériá definované pre túto formu aplikácie nespĺňa žiadne z dostupných antibiotík,
pričom relatívne dobre z krvi do mlieka difundujú penicilíny, spiramycín, linkomycín, tylozín
ale aj erytromycín.
Vývoj intramamárnych prípravkov v 70. a 80. rokoch pokročil tak ďaleko,
že v súčasnosti sa celosvetovo terapeuticky pri mastitídach dojníc používajú hlavne
antibiotické prípravky, ktoré sú určené k intramamárnej aplikácii.
Pri voľbe intramamárneho prípravku je potrebné vychádzať z dlhodobo sledovanej
citlivosti patogénnych mikroorganizmov v danom stáde, resp. teritóriu, pričom z času na čas
je potrebné výskyt rezistencie k antibiotikám retrospektívne prehodnotiť. Komplexný prístup
k prevencii a tlmeniu mastitíd s využitím antibiotickej liečby v priebehu laktácie a zasušenia
vedie k zlepšeniu kvalitatívnych a kvantitatívnych ukazovateľov produkovaného mlieka.
Owens et al. (2001) testovali účinnosť piatich rozdielnych intramamárnych antibiotík
(cefapirín, penicilín/streptomycín, penicilín/novobiocín, tilmicozin, cefalín). Do štúdie bolo
zapojených stotridsaťtri jalovíc. Autori zistili, že všetky antibiotiká boli účinné pri liečbe
experimentálnej mastitídy vyvolanej Staphylococcus aureus. Priebeh liečby bol v prípade
dojníc liečených antibiotikami výrazne kratší v porovnaní so spontánne sa uzdravujúcimi
neliečenými kontrolnými dojnicami.
Wilson et al. (1999) porovnali účinnosť siedmych intramamárnych antibiotík pri
liečbe mastitídy vyvolanej patogénnymi mikroorganizmami. Liečba antibiotikami bola
v porovnaní s neliečenými dojnicami účinnejšia v prípade amoxicilínu, erytromycínu,
kloxacilínu a pirlimycínu. V prípade cefapirínu, hetacilínu a penicilínu bola liečba rovnako
dlhá ako v prípade neliečených dojníc.
26
Bradley a Green (2001) uvádzajú, že výber vhodného intramamárneho prípravku
s výrazným gram negatívnym spektrom účinnosti môže znížiť výskyt klinických mastitíd
vyvolaných koliformnými mikroorganizmami v nasledujúcej laktácii.
Faktormi ovplyvňujúcimi dĺžku liečby a počtom somatických buniek po liečbe
subklinickej mastitídy pirlimycínom sa zaoberali Deluyker et al. (2005).
Borm et al. (2006) zisťovali vplyv intramamárnej antibiotickej liečby aplikovanej
pred otelením sa jalovíc na celkový zdravotný stav vemena, produkciu mlieka a reprodukčné
ukazovatele jalovíc. Autori zistili, že liečba znížila výskyt intramamárnych infekcií po otelení
sa avšak nevplývala na zvýšenie produkcie mlieka, zníženie počtu somatických buniek
a zlepšenie reprodukčných ukazovateľov počas prvých dvesto dní laktácie. Použitie
intramamárnej antibiotickej liečby za účelom zvýšenia produkcie mlieka v prípade dojníc na
prvej laktácii preto nemusí mať pozitívny efekt.
Rozhodnutie či liečiť postihnutú dojnicu je vo väčšine prípadov spájané
s ekonomickou hodnotou dojnice, ktorú určuje vek, konštitúcia, úžitkovosť a stav
reprodukčných ukazovateľov. Pri rozhodovaní sa musia zohľadniť aj náklady
a predpokladaný výsledok liečby, pravdepodobnosť liečebného neúspechu, tendencia recidívy
ochorenia a množstvo vyradeného mlieka. Zanedbať sa nesmú ani ukazovatele ako hodnota
dojnice v prípade vyradenia, možnosť jej znovu nahradenia, ale aj možnosti kontaminácie
mlieka, resp. mäsa v priebehu liečby (Vasiľ, 1998).
Drahošová a Drončovský (2004) uvádzajú, že terapia v období laktácie sa využíva
najmä pri klinicky zjavných formách a pri subklinických mastitídach. Včasná detekcia
klinických mastitíd je základom úspešnosti terapie. Dvadsaťštyri hodín po vzniku zápalu sa
šanca na kompletné uzdravenie znižuje na 50 %. Pri liečbe sa používajú semisyntetické
penicilíny a sulfonamidy. Výsledok terapie sa preveruje bakteriologickým vyšetrením sekrétu.
Táto liečba môže byť diskutabilná, najmä u subklinickej formy a nerentabilná vzhľadom
k nákladnosti liečby a stratám na mlieku v dôsledku ochrannej lehoty. Odporúča sa hlavne
u dojníc cenných pre vysokú úžitkovosť mlieka.
Liečenie v období státia na sucho môže priaznivo ovplyvniť situáciu vo výskyte
infekčných mastitíd len pri neselektívnom použití. Pri takomto druhu terapie je nevyhnutné
ošetriť všetky štvrťky všetkých dojníc v stáde pri zasušení. Cieľom terapie dojníc v období
27
státia na sucho je predovšetkým eliminácia perzistencie infekcie, t.j. liečba subklinických
mastitíd, ochrana vemena pred novou infekciou v najrizikovejšom období, čo sú prvé tri
týždne po zapustení dojnice (po tomto období vnímavosť mliečnej žľazy k zápalom klesá).
Hlavným cieľom antimikrobiálnej terapie v liečbe klinickej mastitídy je: obnovenie
normálnej produkcie mlieka a jeho zloženia, prevencia mortality v prípade perakútnych
stavov, eliminácia infekčných mikroorganizmov a eliminácia praktík vedúcich k prítomnosti
rezíduí liečiv vo finálnych produktoch. Z uvedeného vyplýva, že implementácia proti-
mastitídneho programu, rozvážneho používania antibiotík ako i ďalších liečiv a uplatňovanie
zásad systému HACCP sú nevyhnutné mechanizmy pre úspešné zvládnutie mastitídy v chove
dojníc (Nickerson, 1995).
Príklady aplikácie antibiotík v závislosti od prítomného mikroorganizmu
Tabuľka 1
Mikroorganizmus Liečba antibiotikami na základe vyšetrenia citlivosti
Staphylococcus sp.
Staphylococcus aureus
Kloxacilín, oxacilín, ampicilín, amoxicilín, nafcilín, cefapirín,
cefalexin, cefacetril, linkomycín, neomycín, novobiocín,
streptomycín, rifamycín, erytromycín
Streptococcus agalactiae Penicilín, kloxacilín, oxacilín, ampicilín, cefapirín,
erytromycín, linkomycín, neomycín, tetracyklíny
Streptococcus dysgalactiae Penicilín, kloxacilín, cefalosporín
Mycoplasma sp. Antibiotická liečba je neúčinná, sekundárne infekcie sa liečia
makrolidovými antibiotikami a tetracyklínmi
Actinomyces pyogenes Penicilín
E. coli,
Enterobacter aerogenes,
Klebsiella sp.
Liečba antibiotikami na základe vyšetrenia citlivosti
Pseudomonas sp. Liečba antibiotikami na základe vyšetrenia citlivosti
Kvasinkové mastitídy,
mastitídy vyvolané
mikroskopickými
vláknitými hubami
Antimykotiká, clotrimazol
(Kováč et al., 2001)
28
Citlivosť penicilínových antibiotík voči Gram pozitívnym a Gram negatívnym
mikroorganizmom
Tabuľka 2 Mikroorganizmy Penicilínové deriváty
Gram pozitívne mikroorganizmy
Penicilín/ Ampicilín
Amoxicilín +Kyselina
klavulónová
Oxacilín/Nafcilín
Karbocilín/Ticarcilín
Azlocilín
Staphylococcus sp. (lak neg.)
+ + +
+ + + + + +
Staphylococcus sp. (lak poz.)
- + + + + - -
Streptococcus pyogenes + + + + + + + +
Streptococcus pneumoniae + + + + + + + +
Enterococcus sp. + + + + - + + +
Bacteroides fragilis - + + - + +
Ostatné anaeróby + + + + - + +
Gram negatívne mikroorganizmy
Penicilín/ Ampicilín
Amoxicilín +Kyselina
klavulónová
Oxacilín/Nafcilín
Karbocilín/Ticarcilín
Azlocilín
Escherichia coli + + + + + + +
Klebsiella sp. - + + - - ± Proteus mirabilis + + + + + + + + + +
Proteus sp. - - + + +
Enterobacter sp. - - + + +
Pseudomonas aeruginosa
- - ± + + +
Pseudomonas sp. - - - - +
(Popelka, 2001) lak neg. – laktózo negatívny lak poz. – laktózo pozitívny + + veľmi aktívne pri nízkych koncentráciach + stredne aktívne proti väčšine kmeňov, alebo aktívne len pri vysokých koncentráciach - inaktívne proti väčšine kmeňov
Okrem antibiotík sa pri liečbe mastitídy môžu uplatniť alternatívne liečivá. Vplyv
účinku bakteriálnych proteínov, bakteriocínov na elimináciu pôvodcov mastitídy skúmalo
viacero autorov. Bakteriocíny sú bakteriálne bielkoviny, ktoré sú schopné rozrušiť bunkové
steny mikroorganizmov. Do tejto skupiny látok patrí napríklad nizín, lysostaphin, lacticin.
Úspešnosť liečby pomocou kombinácie bakteriocínov nizínu a lysostaphinu je
29
u Streptococcus uberis 100 %, u Streptococcus agalactiae 95 % a u Staphylococcus aureus
66 % (Miles et al., 1992; Rian et al., 1998; Twomey et al., 2000).
1.1.6 Prevencia mastitíd
Harmon (1996) uvádza, že prevencia je z hľadiska udržania mastitídy v chove
kľúčová. Cieľom prevencie je znížiť počet baktérií, ktorým je vemeno vystavené. Znižuje sa
tým prenos baktérií zo zvieraťa na zviera a tým aj počet mastitídnych zvierat. Liečba
mastitídy by sa mala aplikovať predovšetkým v klinických prípadoch, kedy sa zameriava na
elimináciu infekcie. Liečenie produkčných dojníc antibiotikami v priebehu laktácie je
ekonomicky veľmi náročné a neefektívne.
Medzi preventívne protimastitídne opatrenia patria: dezinfekcia ceckov a liečba dojníc
v období státia na sucho, dodržiavanie hygienických zásad v priebehu dojenia, brakovanie
chronicky mastitídnych dojníc, vakcinácia a izolácia mastitídnych dojníc.
Programy zamerané na prevenciu a tlmenie mastitíd by mali byť široko koncipované.
Tieto programy musia zabezpečiť redukciu výskytu mastitídy v danom chove. Program
prevencie a tlmenia by mal zahrňovať najmä hygienu v najširšom slova zmysle. Rozumie sa
pod ňou hygiena maštaľného prostredia a hygienu dojenia. Z hľadiska hygieny dojenia je
veľmi dôležité použiť funkčnú a dobre nastavenú dojaciu techniku, vykonávať dezinfekciu
dojacieho zariadenia a dezinfekciu ceckov. Prevencia zahŕňa aj ošetrenie mliečnej žľazy
dojníc v zasušení a liečbu klinicky zjavných mastitíd. Liečba by sa mala aplikovať v priebehu
laktácie, ale hlavne v období pred zasušením a po otelení, kedy je výskyt klinických mastitíd
najčastejší. Vyradenie terapii vzdorujúcich dojníc a dojníc chronicky chorých by malo byť
súčasťou proti mastitídneho programu (Vasiľ, 1988).
1.1.6.1 Dezinfekcia ceckov a liečba v období státia na sucho
Dezinfekcia ceckov a liečba v období státia na sucho sú základné preventívne proti
mastitídne opatrenia. Pred ukončením dojenia sa odporúča vydezinfikovať všetky cecky
vemena. Dezinfekciou ceckov sa eliminuje množstvo baktérií usadených na pokožke vemena
počas dojenia. Dezinfekcia je jednoduchá a veľmi efektívna metóda prevencie vzniku nových
infekcií vyvolaných patogénnymi mikroorganizmami. Samotná dezinfekcia redukuje počet
30
novo vzniknutých infekcií na 50 %. Pri dezinfekcii sa odporúča používať dezinfekčné
prípravky s obsahom jódu a chlóru (Harmon, 1996).
Pri prevencii mastitíd je dôležité dodržiavať prísnu hygienu v prvovýrobe mlieka.
Vykonávanie dezinfekcie ceckov pred a po dojení má význam z hľadiska tlmenia
stafylokokových infekcií, infekcií Streptococcus agalactiae a Streptococcus dysgalactiae.
Dezinfekciou ceckov po dojení sa inaktivuje až 90 % baktérií na povrchu vemena a zabráni sa
prieniku týchto baktérií do ceckového kanálika (Drahošová a Drončovský, 2004).
Oliver et al. (1989) na základe výsledkov svojej štúdie uvádzajú, že dezinfekciou
ceckov sa výrazne znížil počet intramamárnych infekcií.
Ak sa vykonala dezinfekcia ceckov ponorením do dezinfekčného prípravku s obsahom
chlóru pred a aj po dojení, úspešnosť prevencie vzniku intramamárnych infekcií bola
preukázateľne vyššia ako keď sa dezinfekcia vykonala len po dojení. Počet nových prípadov
intramamárnej infekcie vyvolanej Streptococcus uberis a Staphylococcus aureus bol výrazne
nižší v tom prípade ak sa u štvrtiek cecky dezinfikovali ponorením do roztoku dezinfekčného
prípravku pred a aj po dojení v porovnaní s dezinfekciou vykonanou len po dojení.
Dezinfekcia ceckov ponorením do dezinfekčného prípravku pred aj po dojení nebola
efektívnejšia v prípade Gramnegatívnych baktérií, koagulázovo-negatívnych druhov
Staphylococcus aureus a Corynebacterium bovis.
Boddie et al. (2002) vo svojej štúdii skúšali účinnosť rôznych dezinfekčných
prípravkov s obsahom chlóru, jódu, peroxidu vodíka a kvartérnych amóniových zlúčenín.
Na základe získaných údajov konštatujú, že testované dezinfekčné prípravky boli úspešné
voči bežným druhom Mycoplasma sp.
Harmon (1996) ďalej uvádza, že do dezinfekčného prostriedku by sa mala ponoriť
taká časť cecku, aká prišla do styku s dojacím zariadením. Namiesto ponárania ceckov do
dezinfekčného roztoku sa môže používať aj ošetrenie sprejovým prípravkom. Pri aplikácii
sprejového prípravku sa však zvyšuje možnosť zlej aplikácie. Z tohto dôvodu sa ponáranie
ceckov do dezinfekčných roztokov považuje za najlepšiu metódu aplikácie. Intramamárnu
liečbu všetkých štvrtiek všetkých dojníc sa odporúča vykonať pomocou antibiotických túb po
poslednom dojení pred ukončením laktácie a samotným zasušením dojníc.
31
Z hľadiska eliminácie existujúcich infekcií je terapia v období státia na sucho
efektívnejšia než terapia v priebehu laktácie. Pri terapii v období státia na sucho sa taktiež
znižuje počet nových infekcií a môžu sa použiť vyššie koncentrácie antibiotík bez obavy
z následkov z prekročenia limitov rezíduí antibiotík v mlieku. Po intramamárnej aplikácii
antibiotík sa odporúča vykonať dezinfekciu ceckov ponorením do dezinfekčného roztoku.
Pravidelná dezinfekcia a intramamárna liečba v období státia na sucho redukujú počet
mastitíd v chove. K preukázateľnému zlepšeniu stavu v chove dochádza po jedno až
trojročnom pravidelnom dodržiavaní preventívnych opatrení. V prípade zastavenia
preventívnych opatrení dochádza veľmi rýchlo k zvýšeniu počtu mastitíd v chove (Harmon,
1996).
Sumár vedeckých prác zameraných na dezinfekciu ceckov pred a po dojení,
realizovaných od roku 1980 je uvedený na web stránke NMC (National Mastitis Council,
A global organisation for mastitis control and milk quality) (www.nmconline.org, 2005).
1.1.6.2 Dodržiavanie hygienických zásad v priebehu dojenia
Striktné dodržiavanie hygienických zásad je veľmi dôležité z hľadiska redukcie šírenia
sa zápalových baktérií z dojnice na dojnicu a z hľadiska bakteriálnej kontaminácie
bazénového mlieka (Neave et al., 1996).
Ingawa et al. (1992) uvádzajú, že existuje veľa metód a postupov prípravy vemena na
dojenie. Medzi bežné postupy patrí ručné umytie ceckov vodou, poutieranie ceckov špongiou,
utierkou alebo jednorazovými utierkami a následné nasadenie dojacieho zariadenia. Tento
postup sa môže doplniť o dezinfekciu ceckov ponorením do dezinfekčného prípravku.
Harmon (1996) uvádza, že pred zapojením dojacieho zariadenia by sa vemeno malo
vyčistiť a poutierať. Odporúča sa používať utierky navlhčené germicídnou látkou.
Premývanie plátenných utierok alebo špongií v germicídnom roztoku neinaktivuje všetky na
nich priľnuté baktérie, pričom by mohlo dochádzať k prenosu baktérií z jednej dojnice na
druhú. Práve preto sa neodporúča použiť tú istú utierku alebo špongiu na očistenie
a vysušenie vemien všetkých dojníc. Odporúča sa radšej používať jednorazové papierové
utierky.
32
Dojič je často tým najdôležitejším faktorom v šírení mastítíd v stáde. Dojenie by mali
vykonávať iba zaškolení pracovníci (Tongeľ a Mihina, 2005).
Ingawa et al. (1992) uvádzajú, že príprava vemena pred dojením ovplyvňuje kvalitu
mlieka a zdravotný stav mliečnej žľazy. Pre zníženie počtu baktérií prítomných na koži
ceckov sa musia aplikovať účinné hygienické postupy, pretože nedostatočne umyté vemeno je
zdrojom baktérií.
Účinnosť hygieny ovplyvňujú najmä nasledovné faktory: suchosť a čistota ceckov,
typ použitej utierky, typ a koncentrácia dezinfekčného prostriedku a čas kontaktu ceckov
s dezinfekčným prostriedkom. Ako najdôležitejšie faktory sa javia suchosť ceckov a doba
počas ktorej sú cecky napojené na dojacie zariadenie. V prípade nedostatočného vysušenia
vemena môže dochádzať k stekaniu vody kontaminovanej baktériami po ceckoch do
dojacieho zariadenia a následne do mlieka, čím sa zhoršuje mikrobiálna kvalita mlieka.
Taktiež môže dochádzať k vzniku nových mastitídnych infekcií šírením sa mikroorganizmov
medzi jednotlivými dojnicami prostredníctvom dojacieho zariadenia. Vo všeobecnosti platí,
že uplatňovaním správnych hygienických postupov sa znižuje výskyt intramamárnych infekcií
v chove. Slabá úroveň hygieny je asociovaná so zvýšením počtu somatických
buniek, znížením kvality a produkcie mlieka. Znehodnotené mlieko, zhoršený zdravotný stav,
poškodenie tkaniva mliečnej žľazy a vyradenie chronicky chorých dojníc sú príčinou
ekonomických strát. Predchádzať ekonomickým stratám je možné uplatňovaním správnych
hygienických postupov pri ošetrovaní vemena pred dojením.
Dojacie zariadenie môže výrazným spôsobom ovplyvniť vznik nových mastitíd.
Funkčnosť a správne nastavenie dojacej techniky sú preto veľmi dôležité. Kolísanie vákua,
nevhodný podtlak, poruchy pulzácie, nevyhovujúci technický stav ceckových gúm ako aj
nesprávne vykonávanie dezinfekcie dojacieho zariadenia môžu mať za následok vznik nových
mastitíd.
Tančin et al. (2001) uvádzajú, že významné postavenie vo fyziológii vemena
zohrávajú aj funkčné parametre dojacej techniky. Obzvlášť úroveň podtlaku výrazne
ovplyvňuje rýchlosť dojenia. Avšak z hľadiska reakcie tkaniva ceckového zvierača nadmerne
vysoký podtlak poškodzuje toto tkanivo. Podľa platných smerníc ISO pre dojacie zariadenia
s dole umiestnenými mliekovodnými potrubiami by sa priemerné hodnoty podtlaku
v rozdeľovači počas maximálneho toku mlieka mali pohybovať v rozsahu od 32 do 40 kPa
a pre zariadenia s hore umiestnenými mliekovodnými potrubiami by mali hodnoty zostať na
33
48 kPa, za určitých špecifických podmienok je možné tolerovať aj 46 kPa. Poškodené
tkanivo na hrotoch ceckov sa javí ako významný faktor zvýšeného výskytu infekčného
ochorenia mliečnej žľazy a tým zhoršenej kvality mlieka.
Rovnako negatívne pôsobí aj nesprávne nastavená charakteristika pulzácie. Z hľadiska
možnosti traumatizovania tkanív cecku je dôležité poznať sily, ktoré pôsobia priamo na hrot
cecku. Dôležitá je nielen výška podtlaku pod ceckom počas taktu satia, ale aj odpovedajúci
rozdiel tlakov medzi komorami ceckovej nástrčky, ktorý by mal zabezpečiť dokonalé
obopnutie cecku ceckovou gumou počas taktu stláčania. Stláčanie zabezpečí, aby
nedochádzalo k nahromadeniu tekutiny v tkanive cecku v dôsledku pôsobenia podtlaku.
Nahromadenie tekutiny v cecku vytvára optimálne podmienky pre zvýšenú citlivosť na
mastitídu. Podtlak spôsobuje zhrubnutie cecku, čo je vlastne prekrvenie ceckového tkaniva.
Zadržaním krvi v krvnom riečisku cecku sa zníži prietok krvi, tým sa zníži prísun obranných
látok a teda má organizmus zníženú schopnosť brániť sa proti prenikajúcim baktériám.
Vzniká zvýšené riziko ochorenia vemena.
Hmotnosť dojacej súpravy ovplyvňuje stav vemena nasledovne. So zvyšovaním
hmotnosti dojacej súpravy dochádza k výraznejším zmenám pozorovaným na ceckovom
tkanive vplyvom väčšej možnosti dojenia na prázdno, taktiež hrozí riziko kontaminácie
súpravy vplyvom pádov na zem. Ľahšie dojacie súpravy významne redukujú padanie súprav
počas dojenia a tým ich kontamináciu.
Parametre pulzácie (frekvencia pulzov za minútu a pomer taktov pulzu vyjadrený
podielom taktu satia z celkového pulzu) môžu ovplyvniť stav ceckového tkaniva. Pri
frekvencii pulzácie väčšej ako 60 min-1 bol preukazne nižší výskyt akútnych mastitíd a nižší
počet somatických buniek v mlieku než pri frekvencii pulzácie menšej ako 53 min-1.
Kvalitu mlieka ovplyvňuje aj dodájanie. Nešetrné a nadmerne dlhé dodájanie zhoršuje
kvalitu mlieka. Okrem zníženia výkonnosti dojacieho zariadenia sa tiež predlžuje čas
pôsobenia podtlaku na relatívne prázdne vemeno. Vplyvom toho sa môže zvýšiť počet
somatických buniek v mlieku, vo väčšom rozsahu sa môžu objaviť edémy ceckovej steny
a môžu sa vyskytnúť poruchy zdravotného stavu vemena. Uplatňovanie automatizácie pri
ukončovaní dojenia je dôležité nielen z hľadiska pracovnej a strojovej náročnosti, ale aj
z hľadiska kvality mlieka.
Pôsobenie funkčných parametrov dojacích zariadení možno pozorovať jednak na
charakteristike priebehu dojenia, ale aj na stave ceckov na konci dojenia po stiahnutí
ceckových nástrčiek. Fyziologické a anatomické zmeny sú odrazom vhodnosti nastavenia
funkčných parametrov dojacieho zariadenia. Stav ceckov je jedným z rozhodujúcich faktorov,
34
ktorý poukazuje na úroveň zdravotného stavu dojníc a tým i na predpoklad technologickej
a hygienickej kvality mlieka. Zdravotný stav vemena je jedným z kritických vzťahov medzi
strojom a dojnicou. Dojacie zariadenie môže mať buď priamy alebo nepriamy vplyv na
zdravotný stav vemena. Prejavuje sa to predovšetkým tým, že: umožňuje kontamináciu
povrchu kože, vyvoláva zmeny stavu ceckov, umožňuje penetrovať baktériám cez ceckový
kanálik, umožňuje prenos baktérií medzi jednotlivými štvrťkami, ovplyvňuje stupeň
vydojenia vemena (Tančin et al., 2001).
Tieto faktory môžu byť znásobené nedostatočnou hygienou vemena. Následne môže
dochádzať k prenosu mikroorganizmov z dojnice na dojnicu prostredníctvom dojacieho
zariadenia (Ingawa et al., 1992).
Tongeľ a Mihina (2005) popisujú vznik mastitídy nasledovne: mastitída môže
vzniknúť iba tak, že baktérie preniknú do vemena. Do vemena sa však baktérie môžu dostať
výlučne (99.9 %) cez ceckový kanálik. Aby baktérie prenikli cez ceckový kanálik, musia byť
najskôr prítomné na povrchu cecku. Baktérie sa na povrch cecku môžu dostať z podstielky,
ale aj z ceckovej nástrčky dojacieho zariadenia. Je zrejmé, že nie je možné úplne zabrániť
tomu, aby sa baktérie na povrch cecku dostali, ale vhodnými opatreniami sa ich množstvo
môže znížiť. Ďalej je potrebné zabrániť prítomným baktériám preniknúť do vemena.
Najväčšiu šancu baktérie dostávajú počas dojenia, keď sa vyskytne takzvané mokré
dojenie v prípade nedostatočne osušených ceckov. V takom prípade sa cecková nástrčka
šmýka po cecku a vytvára turbulencie mlieka v blízkosti ceckového otvoru. Na konci dojenia
potom vznikajú spätné nárazy mlieka do ceckového kanálika, čo napomáha strhávaniu
baktérií z povrchu cecku a ceckovej nástrčky a následnému vtláčaniu mlieka do vemena. Už
päť životaschopných baktérií, ktorým sa podarí preniknúť do vemena dokáže vyvolať
mastitídu.
Druhý spôsob, ako sa môžu baktérie dostať do vemena, je tesne po dojení, keď je
ceckový kanálik čiastočne pootvorený. Pootvorenie ceckového kanálika trvá približne jednu
hodinu od dojenia. Baktérie, ktoré sa dostali do blízkosti ceckového otvoru z ceckovej gumy,
na ktorú sa dostali pri dojení chorej dojnice, majú mimoriadnu možnosť dostať sa do vemena.
Jedna chorá dojnica dokáže infikovať pomocou ceckových gúm až päť ďalších dojníc
dojených bezprostredne po nej. Z tohto dôvodu je potrebné robiť dôslednú dezinfekciu ceckov
po dojení. Nanesením dezinfekčného roztoku na povrch cecku sa baktérie zničia a v ústí
ceckového kanálika sa vytvorí kvapôčka, ktorá ho uzavrie. Často je kvapôčka vtiahnutá do
35
ceckového kanálika, čím sa tento vydezinfikuje. Takto je možné podstatne zabrániť prieniku
infekcie do vemena.
Veľkú pozornosť je treba venovať čistote celého dojacieho systému. Automatizovaný
preplachový systém efektívne sanituje dojacie zariadenie a redukuje šírenie sa patogénnych
mikroorganizmov (Hogan et al., 1984).
Po aplikácii sanitačných a dezinfekčných prostriedkov však vzniká riziko
kontaminácie mlieka ich rezíduami, preto treba vykonávať kontrolu správnosti ich aplikácie.
Výsledkom správnej aplikácie hygienických postupov má byť vysušené vemeno s nízkym
počtom mikroorganizmov a neprítomnými rezíduami čistiacich a dezinfekčných prostriedkov
(Ingawa et al., 1992).
Neave et al. (1996) vo svojej štúdii zisťovali vplyv čiastkovej hygieny a celkovej
hygieny na vzostup bakteriálnych infekcií. Za čiastkovú hygienu považovali používanie
rukavíc, očistenie vemena dezinfekčným roztokom, používanie jednorazových utierok
a ponorenie vemena do dezinfekčného roztoku. Za celkovú hygienu považovali čiastkovú
hygienu a pasterizáciu gumených násadcov dojacieho zariadenia počas 5 sekúnd pri teplote
85 °C. Aplikáciou čiastkovej hygieny sa znížil počet nových infekcií o 44 % v porovnaní so
zvieratami bez hygienického ošetrenia vemena. Aplikáciou celkovej hygieny sa znížil počet
nových infekcií o 58 % v porovnaní so zvieratami bez hygienického ošetrenia vemena.
Tančin et al. (2001) zhrnuli nasledovné požiadavky na proces dojenia.
Pri dojení je potrebné vytvárať optimálne podmienky prostredia a prísne dodržiavať
stereotyp pracovných postupov, minimalizovať vznik stresov a tým čo najviac využívať
ejekčný reflex dojníc.
Pre zmyslové posúdenie mlieka a odstránenie kontaminovaného mlieka sa musia
oddojiť najmenej dva až tri streky z každého cecku do špeciálnej nádoby s dvojitým dnom.
V žiadnom prípade nie je vhodné oddojovať mlieko na zem alebo na ruku, aby sa nevytvárali
podmienky pre prenos infekcie z dojnice na dojnicu.
Prvé streky mlieka sa musia oddojiť na začiatku prípravy vemena, aby sa počas
umývania kontaminované mlieko v ceckovom kanáliku a cisterne cecku nezmiešalo
s ostatným mliekom v ceckovej cisterne. Až potom je možné pristúpiť k čisteniu a masáži
vemena.
36
Pri zistených zmenách na mlieku je potrebné urobiť podrobnú kontrolu zdravotného
stavu vemena a mlieko od podozrivej dojnice vylúčiť z dodávky do mliekarne.
Pomocou dobre riešeného ustajnenia sa musí zabezpečiť, aby boli dojnice čo najmenej
znečistené a tým minimalizovať potrebu čistenia pred dojením.
Umývať by sa mali iba veľmi znečistené vemená. Po umytí je potrebné vemeno
utretím veľmi dôkladne osušiť, aby znečistená voda počas dojenia nebola nasávaná do
ceckových nástrčiek. Dôraz sa musí klásť predovšetkým na hygienu ceckov a ich hrotov.
Na čistenie vemena a ceckov by sa mali používať podľa možností len jednorazové
utierky. Z hľadiska prenosu možnej infekcie nie je vhodné používať jednu utierku pre viacej
dojníc. Pri utieraní sa vemeno musí masírovať a kontrolovať na prípadné poranenia
a vzniknuté zmeny.
V stádach s vyšším podielom mastitídnych dojníc je potrebné riadiť sa pri dojení
špeciálnym hygienickým programom stanoveným príslušným veterinárnym lekárom.
Poradie dojníc pri dojení upraviť tak, aby boli ako prvé dojené dojnice so zdravou
mliečnou žľazou a až potom dojnice infikované alebo liečené.
Po ukončení prípravy vemena pred dojením by sa mala nasadiť dojacia súprava na
vemeno najneskôr do 1 min. Dojič musí dbať o to, aby sa pri nasadzovaní súpravy na vemeno
zbytočne neprisával atmosferický vzduch a aby nedošlo k zbytočnému poraneniu vemena.
Po nasadení súpravy na vemeno sa kontroluje či dojnica spustila mlieko.
Sústavne sa kontroluje priebeh dojenia a vzniknuté nedostatky sa okamžite odstránia.
V žiadnom prípade nesmie dojič opustiť priestor dojenia, ak majú dojnice nasadené dojacie
súpravy.
Ak nie je k dispozícii zariadenie pre automatické ukončovanie dojenia, je potrebné
dojenie ukončiť čím skôr po zastavení toku mlieka. Prípadné dodájanie by sa malo urobiť
okamžite po zastavení toku mlieka, aby sa zabránilo tzv. dojeniu naprázdno.
Ceckové nástrčky sa musia sťahovať z ceckov vemena šetrne po zatvorení prívodu
podtlaku.
Po ukončení dojenia je nutné dezinfikovať hroty ceckov a upraviť systém kŕmenia tak,
aby dojnice v priestoroch ustajnenia v prvých dvoch hodinách zostali stáť.
Použité dezinfekčné prípravky musia byť riadne registrované a schválené.
Sústavne by sa mala sledovať stabilita funkčných parametrov dojacieho zariadenia
stanovených výrobcom. Akúkoľvek poruchu by mal odstrániť kvalifikovaný servis,
s pravidelnou obmenou gumových súčastí v intervaloch udávaných dodávateľom dojacej
techniky.
37
1.1.6.3 Vyradenie chronicky chorých dojníc
Vyradenie chronicky chorých dojníc je nevyhnutnou súčasťou proti mastitídnych
opatrení. Uplatňuje sa pri regulovaní mykoplazmovej mastitídy a mastitídy vyvolanej
Staphylococcus aureus. Vyradením chronicky chorých mastitídnych dojníc, ktoré sú bez
odozvy na aplikovanú liečbu sa eliminuje riziko prenosu infekcie medzi jednotlivými
dojnicami. Toto opatrenie pozitívne ovplyvňuje počet somatických buniek v bazénovej vzorke
(Harmon, 1996).
Brakovaním dojníc s nevyliečiteľnými zápalmi mliečnej žľazy znižujeme dobu trvania
infekcie v stáde a ďalšiu možnosť šírenia infekcie. Brakujeme dojnice s nízkou produkciou
mlieka s viac násobným výskytom mastitíd v priebehu laktácie (Drahošová a Drončovský,
2004).
1.1.6.4 Segregácia dojníc
V prípade chovov s výrazným problémom zamorenia infekciami Staphylococcus
aureus alebo Mycoplasma sp. môže byť osožnou segregácia infikovaných dojníc. Úspech
segregácie závisí od identifikácie infikovaných dojníc. Identifikácia infikovaných dojníc sa
obyčajne vykonáva na základe výsledkov mikrobiologického vyšetrenia alebo vyšetrenia
počtu somatických buniek (Harmon, 1996).
Segregáciou alebo separáciou dojníc pozitívnych na prítomnosť Staphylococcus
aureus sa znížila prevalencia tohto mikroorganizmu v chove a súčasne sa znížil počet
somatických buniek v bazénovom mlieku. Vystríhanie sa spoločného dojenia infikovaných
dojníc s neinfikovanými preukázateľne znižuje prevalenciu intramamárnych infekcií.
Infikované dojnice by sa mali dojiť oddelene alebo až ako posledné (Wilson et al., 1995).
1.1.6.5 Vakcinácia dojníc
Výsledkom vakcinácie je vo všeobecnosti redukcia klinických epizód a zvýšenie
spontánneho vyliečenia sa dojníc. Aj napriek pozitívnym výsledkom sa vakcináciou
nedosahujú rovnako úspešné výsledky ako pri ošetrovaní vemena dezinfekčnými
38
prostriedkami. Imunizácia je preto v súčasnosti považovaná iba za súčasť protimastitídnych
opatrení a postupov (Harmon, 1996).
Vakcíny určené na zvýšenie odolnosti dojníc voči mastitíde vyvolanej Staphylococcus
sp. majú limitovaný účinok. Môže to byť spôsobené zriedením imunitných zložiek vakcíny
(lymfocytov, imunglobulínov a fagocytov) v mlieku ako aj ich interakciami so zložkami
mlieka (Carter a Kerr, 2003).
1.1.6.6 Liečba klinickej mastitídy počas laktácie
Liečba antibiotikami počas laktácie je veľmi úspešná v prípade infekcií vyvolaných
Streptococcus agalactiae. V prípade infekcií vyvolaných Staphylococcus aureus je úspešnosť
liečby pomerne nízka, obyčajne sa vylieči menej než 50 % postihnutých dojníc. Liečenie
pomocou antibiotík v prípade klinických stavov môže zredukovať klinické symptómy, ale
prevalencia infekcie v stáde sa zlepší iba mierne. Veľké množstvo infekcií je subklinických,
pričom tieto infekcie často zostávajú neodhalené. Mykoplazmové infekcie nereagujú na liečbu
antibiotikami (Harmon, 1996).
39
1.2 VPLYV MASTITÍDY NA PRODUKCIU, ZLOŽENIE A TECHNOLOGICKÚ
KVALITU MLIEKA A MLIEČNYCH VÝROBKOV
Pokles produkcie mlieka u mastitídnych dojníc závisí od druhu prítomného
patogénneho mikroorganizmu. K poklesu dojivosti dochádza už niekoľko týždňov pred
diagnostikovaním klinickej mastitídy (Gröhn et al., 2004).
Existuje preukázateľná negatívna korelácia medzi produkciou mlieka a vysokým
počtom somatických buniek. Produkcia mlieka počas mastitídy klesá v dôsledku poškodenia
epitelu mliečnej žľazy (Marcus a Kehrli, 1994).
Odhad poklesu produkcie mlieka v závislosti od percenta infikovaných štvrtiek stáda
a počtu somatických buniek v bazénovom mlieku
Tabuľka 3
Počet somatických buniek v
bazénovom mlieku (.ml-1)
Infikované štvrťky stáda
(%)
Pokles produkcie mlieka
(%)
200 000 6 0
500 000 16 6
1 000 000 32 18
Pokles produkcie mlieka je vypočítaný ako percento z predpokladanej produkcie na úrovni
200 000 somatických buniek . ml-1. Údaje uvádza (Gerald, 2001) podľa (National Mastitis
Council. 1996. Current Concepts of Bovine Mastitis, 4th ed., Madison, WI).
Mastitída výrazne vplýva na zloženie mlieka, a tým na jeho technologickú kvalitu ako
aj kvalitu finálnych mliečnych výrobkov. Vplyvom mastitídy sa zvyšuje počet somatických
buniek v mlieku, menia sa zmyslové vlastnosti mlieka, jeho zloženie a fyzikálno – chemické
znaky kvality. V mastitídnom mlieku dochádza k výraznému zvýšeniu obsahu
imunoglobulínov. Dochádza k poklesu obsahu hlavných bielkovín mlieka, najmä obsahu
kazeínu. Podiel kazeínu v micelárnej forme sa znižuje z 95 % na 46 % a pomer micelárneho
a rozpustného kazeínu sa mení z pôvodnej hodnoty 16,48 až na 0,87. Súčasne sa zmenšuje
veľkosť kazeínových miciel. Pomer kazeínu a srvátkových bielkovín sa mení v prospech
srvátkových bielkovín, čo sa prejavuje v poklese kazeínového čísla pod hodnotu 77. Znižuje
sa obsah laktózy a zvyšuje sa obsah niektorých minerálnych látok, napr. sodíka, chlóru
40
(zmena chlór cukrového čísla mlieka), znižuje sa množstvo draslíka, vápnika, fosforu
a horčíka. Najzávažnejšou z týchto zmien je predovšetkým pokles obsahu vápnika vo vzťahu
k jeho pozitívnemu vplyvu na syriteľnosť mlieka. V mlieku dojníc so zápalmi mliečnej žľazy
dochádza k znižovaniu obsahu tuku a zvyšovaniu obsahu voľných mastných kyselín, a to až
na dvojnásobok. Stúpa tiež koncentrácia enzýmov kataláz a lipáz (Drahošová a Drončovský,
2004).
Zmeny v produkcii a zložení mlieka v dôsledku mastitídy
Tabuľka 4 Pokles Stupeň zmeny Vzostup Stupeň zmeny
Výťažnosť štvrtiek – (– –) Počet somatických buniek +++
Sušina – Srvátkové bielkoviny +++
Laktóza – Bovinný sérový albumín +
Tuk – Imunoglobulíny +++
Mastné kyseliny s dlhým reťazcom
– Mastné kyseliny s krátkym reťazcom
+
Celkový kazeín – – Proteázové peptóny ++
αS1-kazeín – – Voľné mastné kyseliny ++
β-kazeín – – – κ-kazeín +(+)
α-laktalbumín – Sodík ++
β-laktoglobulín – – – Chloridy ++
Vápnik – – – Mliečnany +++
Horčík – – – Enzýmová aktivita
Fosfor – – – Lipáza ++
Zinok – Lyzozým +++
Draslík – NAGáza +++
- β-glukuronidáza +++
- Plazmín +++
(Pyörärlä, 2003)
Drahošová a Drončovský (2004) ďalej uvádzajú, že najvýznamnejším z faktorov,
ktorý sa mení v priebehu mastitídy je počet somatických buniek. Tento ukazovateľ sa v praxi
používa pri zatrieďovaní mlieka do tried kvality. Zvýšený počet somatických buniek
negatívne ovplyvňuje ekonomiku výroby a výrazne vplýva na technologické vlastnosti
41
mlieka. So zvýšeným počtom somatických buniek, zmenami obsahu a štruktúry bielkovín
a vápnika dochádza k zhoršeniu syriteľnosti mlieka. Prejavuje sa to dlhším časom syrenia,
nedostatočnou tuhosťou syreniny, vyššími stratami sušiny, znížením výťažnosti, zvýšenou
spotrebou syridla a inými negatívnymi následkami pri výrobe.
Zhoršená kysacia schopnosť mastitídneho mlieka spôsobuje problémy pri výrobe
fermentovaných mliečnych výrobkov. Pri výrobe masla dochádza okrem zhoršenej ostrosti
odstredenia smotany k zvýšeniu podielu voľných mastných kyselín. Zvýšená činnosť lipáz
spôsobuje hydrolytické štiepenie mliečneho tuku a zvýšenie jeho kyslosti.
Vplyvom mastitídy sa zhoršuje termostabilita mlieka, čo je nevyhovujúce najmä pri
výrobe sušeného a kondenzovaného mlieka, ako aj pre UHT záhrev pri výrobe trvanlivých
mliekarenských výrobkov s vysokým ohrevom mlieka akým je napríklad trvanlivé mlieko.
Klei et al. (1998) zisťovali ako vplýva počet somatických buniek na kvalitu
a výťažnosť pri výrobe syra cottage cheese. Autori uvádzajú, že zvýšenie počtu somatických
buniek z 83 000 . ml-1 na 872 5000 . ml-1 ovplyvnilo zloženie mlieka a následne zloženie
a výťažnosť syru cottage chease. Mlieko s vysokým počtom somatických buniek malo
v porovnaní s mliekom s nízkym počtom somatických buniek zvýšený obsah bielkovín,
kazeínu, zvýšené pH a malo znížený obsah laktózy a kazeínu vyjadreného ako percento
celkových bielkovín. Zvýšený počet somatických buniek neovplyvnil obsah celkovej sušiny.
Odtučnená syrenina vyrobená z mlieka s vysokým počtom somatických buniek mala
vyšší obsah vody, ale nižší obsah celkových bielkovín v porovnaní so syreninou vyrobenou
z mlieka s nízkym počtom somatických buniek. Výťažok bielkovín bol nižší u odtučnenej
syreniny vyrobenej z mlieka s vyšším obsahom somatických buniek, celkový obsah sušiny
bol vyšší. Výťažok vyššieho percenta sušiny u odtučnenej syreniny vyrobenej z mlieka
s vyšším obsahom somatických buniek bol spôsobený nižším obsahom laktózy v mlieku.
Vyhodnocovanie výťažnosti len pomocou celkového obsahu sušiny by bola zavádzajúca.
Výťažnosť bola preukázateľne nižšia ak sa vyhodnocovala na hydrolýzu kazeínu a na obsah
sušiny prítomný vo vodnej fáze syreniny (101,5 % voči 97,16 %).
Vlastnosti mlieka ovplyvňujú jeho schopnosť zrážať sa. Pri výrobe syrov sa vyžaduje
aby mlieko malo dobré koagulačné vlastnosti, aby sa po pridaní zrážacieho enzýmu rýchlo
zrazilo a vytvorila sa tuhá syrenina. Zabezpečí sa tým vyššia výťažnosť finálneho produktu.
Koagulačné vlastnosti mlieka sa dajú ovplyvniť výberom mlieka s nízkym počtom
42
somatických buniek. Existuje možnosť genetického ovplyvnenia koagulačných vlastností
mlieka vhodnou selekciou dojníc (Ikonen et al., 2004).
Ma et al. (2000) zisťovali ako vplývajú somatické bunky na kvalitu a trvanlivosť
pasterizovaného mlieka. Mlieko s nízkym počtom somatických buniek si zachovalo vysokú
kvalitu a nemalo zmenené organoleptické vlastnosti ani po dobe skladovania 21 dní. Mlieko
s vyšším obsahom somatických buniek vykazovalo od štrnásteho dňa skladovania chyby
v organoleptických vlastnostiach. Mlieko bolo potuchnuté, zhorknuté a trpké. Tieto chyby
súviseli s vyšším stupňom lipolýzy a proteolýzy. Počas skladovania pasterizovaného mlieka
pri chladiarenských teplotách výrazne stúpol obsah voľných mastných kyselín a taktiež
hydrolýza celkového kazeínu bola vyššia u mlieka s vyšším počtom somatických buniek.
Z uvedeného vyplýva, že mastitídne mlieko výrazne ovplyvňuje kvalitu pasterizovaného
mlieka a skracuje dobu jeho trvanlivosti.
Santos et al. (2003) zistili, že ak sa na výrobu pasterizovaného mlieka použije mlieko
s nízkym počtom somatických buniek a súčasne sa dodržiava prísna hygiena v prevádzke
mliekarenského podniku, a skladovanie finálneho výrobku sa realizuje pri nízkych teplotách
(< 6 °C), je možné vyrobiť pasterizované mlieko, ktoré si udrží chuťové vlastnosti po dobu 61
dní.
43
1.3 NEBEZPEČENSTVO ASOCIOVANÉ S KONZUMÁCIOU MASTITÍDNEHO
MLIEKA
V súvislosti s mastitídou sa mení zloženie mlieka a dochádza k výraznému vzostupu
počtu somatických buniek (Gerald, 2001)
Zvýšený počet somatických buniek sám o sebe nie je rizikovým faktorom pre ľudské
zdravie, ale je nevyhnutné brať do úvahy tú skutočnosť, že v tomto ukazovateli sa odráža
celkový zdravotný stav dojnice (Smith, 1996).
Väčšina zápalov mliečnej žľazy je spôsobená prítomnosťou mikroorganizmov a teda
infekciou (Harmon, 1994).
Prítomnosť mikroorganizmov v surovom kravskom mlieku je sama o sebe riziková.
Riziko sa však stupňuje s prítomnosťou ich toxínov (Zajác et al., 2005).
Matthews et al. (1994) študovali vplyv bakteriálnych virulenčných faktorov na
štruktúru a funkciu epitelových buniek. Autori uvádzajú, že počas laktácie ako aj v období
mimo laktácie je mliečna žľaza vystavená širokému spektru baktérií, ktoré môžu produkovať
látky škodlivé pre dojnicu. Escherichia coli, Staphylococcus aureus a Streptococcus uberis
produkujú endotoxín, a-toxín a hyaluronidázu. Tieto látky pôsobia na tkanivo mliečnej žľazy
a spôsobujú jeho patologické zmeny, taktiež sa môžu dostávať do mlieka a spôsobovať
ochorenia z potravín.
Vybrané mastitídne mikroorganizmy a ich toxíny sú uvedené v Tabuľke 5 (Golian,
1998; Chamberlain, 2005).
44
Vybrané mastitídne mikroorganizmy a ich toxíny Tabuľka 5
Mikroorganizmus Toxín Príznaky
Staphylococcus aureus Enterotoxíny A, B, C, D, E Zvracanie, hnačka, horúčka
nebýva prítomná
Enterotoxigénne E. coli LT-1 a LT-2 toxín
ST-1 a ST-2 toxín
Hnačka, zvracanie, kŕče,
nevoľnosť, zvýšená teplota
počas 1-3 dní
Enterohemmorhagická E. coli
sérotyp O157:H7
Verotoxín VT-1 a VT-2 Krvavá hnačka a v niektorých
prípadoch hemolytický
uremický syndróm
(Golian, 1998; Chamberlain, 2005)
Pri liečbe mastitídy sa používa široké spektrum veterinárnych liečiv, predovšetkým
antibiotík. Rezíduá týchto látok predstavujú veľké riziko pre zdravie človeka. Pri vyššom
počte somatických buniek sa zvyšuje riziko z prítomnosti antibiotík v surovom kravskom
mlieku (Ruegg a Tabone, 2000).
Ruegg a Tabone (2000) ďalej uvádzajú, že v priebehu obdobia rokov 1995 až 1998
sledovali relatívne riziko z prítomnosti rezíduí antibiotík vo vzťahu k počtu somatických
buniek u 1000 dojníc (Tabuľka 6). Podľa priemerného ročného počtu somatických buniek
dojnice rozdelili do piatich tried a na základe výsledkov experimentu skupinám priradili
relatívne riziko z prítomnosti rezíduí antibiotík.
Relatívne riziko z prítomnosti rezíduí antibiotík
Tabuľka 6 Počet somatických buniek Relatívne riziko z prítomnosti rezíduí
antibiotík
≤ 250 000 1,00
251 000 – 400 000 1,43
401 000 – 550 000 2,38
551 000 – 700 000 2,78
> 700 000 7,10
(Ruegg a Tabone, 2000)
45
Autori záverom konštatujú, že s vyšším počtom somatických buniek sa preukazne
zvyšuje riziko prítomnosti rezíduí antibiotík. V tej istej súvislosti sa zvyšuje aj počet prípadov
subklinickej mastitídy vyvolanej prevažne majoritnými patogénnymi mikroorganizmami.
Podobnou štúdiou sa zaoberali Schaik et al. (2000), ktorí zistili pri priemernom počte
363 000 somatických buniek . ml-1 riziko na úrovni 3,9.
Smith (1996) uvádza, že Saville et al. zistili na troch rôznych hladinách počtu
somatických buniek: < 400 000 . ml-1, 400 000 až 750 000 . ml-1 a > 750 000 . ml-1 nasledovné
úrovne rizika: 1,0; 2,21; a 4,73. Počet somatických buniek bol jednoznačne asociovaný
s rizikom prítomnosti rezíduí antibiotík v surovom kravskom mlieku pričom 60 % prípadov sa
vyskytovalo pri počte somatických buniek > 400 000 . ml-1.
Vyššie uvedení autori analyzovali vzorky surového kravského mlieka na prítomnosť
rezíduí antibiotík, taktiež všetci uvádzajú, že sa zvýšila prítomnosť patogénnych
mikroorganizmov v surovom kravskom mlieku. Závislosť medzi počtom somatických buniek
v bazénovej vzorke a percentom infikovaných štvrtiek naznačuje, že surové kravské mlieko
s vyšším počtom somatických buniek bude obsahovať vyšší počet patogénnych
mikroorganizmov.
Mikroorganizmy, predovšetkým patogénne baktérie a ich toxické produkty ako aj
veterinárne liečivá predstavujú riziko, ktoré existuje v paralele so zvýšeným počtom
somatických buniek. Toto riziko môže nepriaznivo ovplyvniť ľudské zdravie (Zajác et al.,
2005).
46
1.4 ÚLOHA NÁRODNÉHO REFERENČNÉHO LABORATÓRIA PRE MLIEKO
A MLIEČNE VÝROBKY VO VZŤAHU K SOMATICKÝM BUNKÁM, SYSTÉM
KONTROLY
Národné referenčné laboratórium pre mlieko a mliečne výrobky je na základe
autorizácie zodpovedné za viacero úloh. Medzi tieto úlohy patria: koordinácia činnosti
laboratórií, ktorých úlohou je vykonávanie analýz na kontrolu chemických
a bakteriologických štandardov, pomoc orgánom veterinárnej správy pri organizovaní
systému kontroly mlieka a mliečnych výrobkov, periodické organizovanie porovnávacích
testov a ďalšie úlohy (ŠVPS SR, 2003).
Celoplošná kontrola počtu somatických buniek v surovom kravskom mlieku sa
v Slovenskej republike vykonáva v centrálnych skúšobných laboratóriách v Bratislave
a Žiline.
Vzorky na analýzu v centrálnych skúšobných laboratóriách odoberajú mliekarne
v pravidelných časových intervaloch (najmenej 1 krát za mesiac), jedná sa o vzorky určené na
vyšetrenie základných ukazovateľov mlieka v súvislosti s jeho speňažovaním. Centrálne
skúšobné laboratóriá informujú o výsledkoch skúšok mliekarenské závody. Počet
somatických buniek sa stanovuje výpočtom v mliekarenských závodoch ako kĺzavý
geometrický priemer za posledné 3 mesiace. Ak surové kravské mlieko obsahuje nadlimitný
počet somatických buniek, musí to mliekareň nahlásiť príslušnej regionálnej veterinárnej
a potravinovej správe a musí prijať opatrenia na nápravu tohto stavu.
Pokiaľ prevádzkovateľ mliekarne nevykoná nápravu situácie do troch mesiacov od
prvého oznámenia regionálnej veterinárnej a potravinovej správe o nedodržaní podmienok
s ohľadom na celkový počet mikroorganizmov a počet somatických buniek v mlieku,
dodávky surového mlieka z produkčného chovu sa pozastavia, alebo na základe osobitného
povolenia alebo všeobecných pokynov regionálnej veterinárnej a potravinovej správy –
podliehajú požiadavkám, ktoré sa týkajú jeho ošetrenia a použitia nevyhnutným na ochranu
zdravia ľudí. Toto pozastavenie alebo tieto požiadavky zostanú v platnosti, pokým mliekareň
nepreukáže, že mlieko opäť spĺňa uvedené kritériá (Nariadenie ES č. 1662/2006, Nariadenie
ES č. 853/ 2004; Nariadenie ES č. 854/ 2004).
47
Do 31. 12. 2005 platilo Nariadenie vlády Slovenskej republiky č. 312 (2003) v znení
Nariadenia vlády Slovenskej republiky č. 284 (2004), v ktorom sa uvádzalo, že obnoviť
dodávku surového mlieka na výrobu mlieka a mlieka na výrobu mliečnych výrobkov na
výživu ľudí možno len vtedy, ak aktuálne hodnoty dvoch bazénových vzoriek surového
mlieka, ktoré na základe písomnej žiadosti produkčného hospodárstva odobral úradný
veterinárny lekár a ktoré sa vyšetrili v akreditovanom laboratóriu autorizovanom Štátnou
veterinárnou a potravinovou správou v Bratislave (v Národnom referenčnom laboratóriu pre
mlieko a mliečne výrobky v Nitre), spĺňajú požiadavky celkového počtu mikroorganizmov
a počtu somatických buniek.
V súvislosti s vyššie uvedeným musí mať Národné referenčné laboratórium pre mlieko
a mliečne výrobky zavedenú čo najpresnejšiu a medzinárodne akceptovanú referenčnú
metódu pre stanovenie počtu somatických buniek. Výsledky stanovené pomocou referenčnej
metódy musia odzrkadľovať skutočný, správny obsah somatických buniek v skúšanej
laboratórnej vzorke mlieka. Všetky úradne odobraté vzorky sa musia skúšať referenčnou
metódou.
Národné referenčné laboratórium pre mlieko a mliečne výrobky kontroluje
a metodicky usmerňuje činnosť centrálnych skúšobných laboratórií. Kontrolu metódy
stanovenia počtu somatických buniek v centrálnych skúšobných laboratóriách vykonáva
prostredníctvom sekundárnych referenčných materiálov. Výsledky analýz sekundárnych
referenčných materiálov sa sumarizujú a štatisticky vyhodnocujú vo forme mesačných správ.
Národné referenčné laboratórium pre mlieko a mliečne výrobky zabezpečuje výrobu
a distribúciu sekundárnych referenčných materiálov s presným počtom somatických buniek.
Ďalším spôsobom kontroly je kontrola prostredníctvom medzilaboratórnych skúšok
spôsobilosti, ktoré sa vykonávajú pomocou referenčných vzoriek s rozdielnym počtom
somatických buniek pripravených v Národnom referenčnom laboratóriu pre mlieko a mliečne
výrobky.
Uvedené činnosti vyplývajú z úloh Národného referenčného laboratória a sú súčasťou
kontroly systému preplácania mlieka v Slovenskej republike.
48
1.5 PRÁVNE NORMY A POČET SOMATICKÝCH BUNIEK
Legislatíva Európskej únie upravuje počet somatických buniek prostredníctvom
Nariadenia Komisie (ES) č. 1662/2006 zo 6. novembra 2006, ktorým sa mení a dopĺňa
nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004 z 29. apríla 2004, ktoré
stanovuje špecifické hygienické pravidlá pre potraviny živočíšneho pôvodu (Smernica rady
92/46 EHS, 1992). Kritérium pre počet somatických buniek v surovom kravskom mlieku
v bazénovej vzorke je maximálne 400 000 somatických buniek v 1 ml. Stanovuje sa ako
kĺzavý geometrický priemer výsledkov z troch po sebe idúcich mesiacov. Stanovuje sa
minimálne 1 vzorka za mesiac, ak príslušný orgán neurčí inú metodiku kvôli zohľadneniu
sezónnych odchýlok v množstvách produkcie.
Počet somatických buniek v surovom kravskom mlieku v Slovenskej republike taktiež
upravuje norma STN 57 0529 (1999) Surové kravské mlieko na mliekarenské ošetrenie
a spracovanie (Tabuľka 7). Údaje uvedené v tejto norme môžu slúžiť ako pomôcka pri
uzatváraní zmlúv v rámci dodávateľsko-odberateľských vzťahov. Z legislatívneho hľadiska je
však dôležité riadiť sa požiadavkami vyššie uvedených nariadení Európskej únie. Podľa
normy STN 57 0529 musí surové kravské mlieko spĺňať viaceré požiadavky. Surové kravské
mlieko musí pochádzať od dojníc nevykazujúcich zjavné príznaky porúch celkového
zdravotného stavu a od dojníc bez príznakov zápalov a poranení mliečnej žľazy a kože
mliečnej žľazy. Počet somatických buniek v surovom kravskom mlieku musí byť nasledovný:
Počet somatických buniek podľa normy STN 57 0529 (1999)
Tabuľka 7
Trieda kvality mlieka
Q I
Najviac 300 000 Najviac 400 000
V jednotlivých krajinách sveta sú rozdielne limity pre počet somatických buniek
v surovom kravskom mlieku (Smith a Hogan, 1998).
Krajiny podieľajúce sa výrazným spôsobom na exporte mlieka ako Nový Zéland
(MAF NZ 1990; NZFSA, 1997), Austrália (Smith a Hogan, 1998) a Švajčiarsko (Smith
a Hogan, 1998) prijali ako maximálny limit pre tento ukazovateľ hranicu 400 000
somatických buniek . ml-1. Na Novom Zélande sa dokonca uvažuje o hranici 300 000
49
somatických buniek .ml-1. V Kanade je limitom hranica 500 000 somatických buniek .ml-1
(Milk Quality Regulation, 1986) a uvažuje sa o znížení tejto hranice na úroveň 400 000
somatických buniek .ml-1. V USA je limitom hranica 750 000 somatických buniek . ml-1
(USDA, 2002).
Z pohľadu medzinárodného obchodu krajiny, ktoré sprísnili kritériá v oblasti
somatických buniek vyvážajú väčšie množstvo mlieka (Smith, 1996).
50
1.6 CHARAKTERISTIKA SOMATICKÝCH BUNIEK
Grieger a Holec et al. (1990) uvádzajú, že pri mikroskopickom vyšetrení sa v mlieku
nachádzajú okrem mikroorganizmov taktiež bunkové útvary, ktoré majú význam pre
posúdenie zdravotného stavu mliečnej žľazy a kvality mlieka.
1.6.1 Bunky pochádzajúce z krvi
Sekrečný parenchým mliečnej žľazy je čiastočne priepustný pre bunky krvi. Táto
priepustnosť sa zvyšuje za nenormálnych podmienok sekrécie mlieka (Grieger a Holec et al.,
1990).
1.6.1.1 Bunky bieleho krvného obrazu
Bunky bieleho krvného obrazu popisuje Kováčik et al. (1996). Obrázky bielych
krviniek sú uvedené v Prílohe 15.
Biele krvinky (leukocyty) všetkých živočíšnych skupín stavovcov majú jadro počas
celého svojho života. Ich počet sa mení v závislosti od fyziologického stavu organizmu.
Leukocyty putujú medzi miestom ich tvorby (kostná dreň, týmus, lymfatické uzliny)
a rôznymi tkanivami. Podľa veľkosti, tvaru jadra a schopnosti farbenia sa možno u leukocytov
rozlíšiť monocyty (makrofágy), lymfocyty (lymfocyty T, lymfocyty B, nešpecializované
lymfocyty) a granulocyty (eozinofily, neutrofily, bazofily).
Monocyty
Monocyty nachádzajúce sa v krvi sa tvoria v rozličných častiach
retikulohistiocytárneho systému. Sú to bunky veľké 15 – 20 µm, s obličkovitým alebo
laločnatým jadrom, excentricky uloženým. Cytoplazma je sfarbená dymovo modro. Z krvi
monocyty prenikajú do rozličných tkanív, kde potom ako makrofágy majú relatívne dlhú
životnosť (50 – 70 dní). Majú ameboidný pohyb. Aktivované monocyty, prípadne makrofágy
majú vysokú aktivitu fagocytózy a pinocytózy. Po prijatí väčších cudzích teliesok (baktérie,
zvyšky buniek) sa tvoria resorpčné vakuoly, do ktorých sa uvoľňujú enzýmy z lyzozómov.
Okrem toho obsahujú aktivátor plazminogénu, kolagénu, elastázu a enzým, ktorý odbúrava
fibrín. V krvi zvierat sa ich nachádza 2 – 6 % z celkového obsahu leukocytov.
51
Lymfocyty
Lymfocyty vznikajú hlavne v slezine a v lymfatických uzlinách. Sú veľké 6 – 18 µm,
vyznačujú sa veľkým, guľatým, modro zafarbeným jadrom, vypĺňajúcim takmer celú bielu
krvinku. Cytoplazmy je málo a je svetlo modrá. Ich životnosť je asi 1 deň. U lymfocytov
možno rozlíšiť lymfocyty T, lymfocyty B a nešpecializované lymfocyty.
Lymfocyty T majú dôležitú úlohu pri podpore lymfocytov B (ako pomocné bunky),
pri odbúraní a deštrukcii nádorových buniek a pri tvorbe bunkovej imunity. Jeden z typov
lymfocytov T tlmí ochranné reakcie. Pri zvýšenej aktivite týchto buniek je znížená schopnosť
deštrukcie nádorových buniek.
Lymfocyty B sa špecializujú na rozlišovanie antigénov (bakteriálnych a vírusových
antigénov). Pri kontakte s určitým antigénom sa zvyšuje skupina imunokompetentných
buniek (klon) v priebehu 7 – 8 generácií a potom sa menia na plazmatické bunky s vysokou
schopnosťou syntézy imunoglobulínov. Z celkového obsahu leukocytov v krvi zvierat tvoria
lymfocyty 40 – 60 % podiel.
Granulocyty
Granulocyty sú bunky, ktoré majú v mladom štádiu tyčinkové jadro, na ktorom sa
neskôr objavujú zúženiny. Jadro sa starnutím rozpadá na 2 – 5 častí (segmentované). Veľkosť
granulocytov je 10 – 20 µm. V cytoplazme granulocytov sa nachádzajú granuly, ktoré sú
farbiteľné rôznymi farbivami. Týmto spôsobom možno rozlíšiť eozinofilné, neutrofilné
a bazofilné granulocyty.
Eozinofily s veľkými granulami, ktoré sa eozínom farbia jasne červene. Eozinofily sa
dožívajú 6 – 7 dní a v krvi ich je 3 – 6 % z celkového počtu leukocytov. Ich počty sa zvyšujú
pri alergii, pri napadnutí niektorými parazitmi a pri niektorých kožných chorobách. Záťaže
organizmu vyvolávajú prechodné zníženie ich celkového počtu. Množstvo eozinofilov záleží
tiež na činnosti kôry nadobličiek. Injekcia adenokortikotropného (ACTH) hormónu
z adenohypofýzy vyvoláva vyplavenie kortikoidov z nadobličiek s následným poklesom
eozinofilov v periférii krvi.
Neutrofily majú polymorfné jadro a na fialovo sa farbiace granuly. Veľkosť
neutrofilov je 10 – 15 µm, životnosť 4 – 5 dní. Neutrofilné granulocyty sú ameboidne
pohyblivé a prenikajú v oblasti kapilár v určitom rozsahu do tkaniva. Vzhľadom k tomu,
že majú schopnosť prijímať baktérie a iné partikuly (napr. nadbytočné spermie v pohlavných
cestách samice), neutrofily sa označujú aj ako mikrofágy. Predstavujú „zdravotnú službu“,
v boji proti mikroorganizmom uplatňujú enzýmové systémy (proteolytické, lipolytické,
52
glykolytické), pomocou ktorých rozkladajú cudzorodé látky. Sú priťahované
mikroorganizmami na princípe pozitívnej chemotaxie. Lymfou sa transportujú do
regionálnych lymfatických uzlín a tam sú odbúravané makrofágmi. V krvi je 30 – 35 %
neutrofilných granulocytov z celkového počtu bielych krviniek.
Bazofily sú bunky veľkosti 6 – 18 µm, majú nečlenené jadro, ich granuly sa farbia
zásaditými farbivami na modro. V granulách sa zistil heparín, histamín, kyselina hyalurónová
a serotonín. Tieto látky sa uvoľňujú do zápalovej oblasti. V celkovom počte leukocytov je ich
asi 1 %.
Jadrá niektorých granulocytov, najmä neutrofilných, majú prívesky kyjakovitého tvaru
alebo tvaru púčika. Vyskytujú sa len u žien, preto sa zaraďujú medzi pohlavné chromatíny –
sexchromatíny. Majú význam pri určovaní spornosti pohlavia.
Nakoľko leukocyty predstavujú z funkčného i morfologického hľadiska rôznorodú
skupinu krvných elementov a celkový počet leukocytov nedáva obraz o zastúpení
jednotlivých druhov v periférnej krvi, k hematologickému vyšetreniu sa robí diferenciálny
krvný obraz (leukogram). Leukogram udáva percentuálne zastúpenie jednotlivých druhov
leukocytov.
Počet leukocytov je druhovo špecifický. U cicavcov sa pohybuje v rozmedzí
8 – 14 g / l. Pomer leukocytov k erytrocytom u cicavcov je 1 : 1000. Za istých okolností sa
počet leukocytov v krvi mení. Zvýšenie celkového počtu leukocytov sa nazýva leukocytóza
a pokles pod rozmedzie základných hodnôt leukopénia. Leukocytóza sa objavuje po prijatí
potravy, pri intenzívnej svalovej činnosti, pri emočných stavoch, pri bolesti a gravidite, pri
infekčných zápaloch či septických stavoch. Leukopénia vzniká napríklad pri hladovaní a pri
dlhodobom podchladení organizmu.
Granulocyty sa tvoria v kostnej dreni z vetvených buniek sieťovitého väziva,
uloženého medzi tukovými bunkami. V lymfatickom tkanive (lymfatické uzliny, slezina,
týmus, mandle) sa tvoria lymfocyty. Monocyty sa tvoria v retikulohistiocytárnom systéme.
Centrom nervového riadenia tvorby bielych krviniek (leukopoézy) je hypotalamus.
Krvotvorné orgány sú inervované vegetatívnou nervovou sústavou. Sympatikus stimuluje
tvorbu krvi a parasympatikus ju tlmí. Na humorálnej regulácii sa podieľa humorálny faktor
leukopoetín.
53
Grieger a Holec et al. (1990) uvádzajú, že leukocyty sú významné z diagnostického
hľadiska. Leukocyty sa menia vekom a ich pôvodne oválne jadro nadobúda fazuľový, neskôr
až tyčinkový tvar, je rôzne poprehýbané a pozorovateľná je i segmentácia jadra. Granulocyty
sú v mlieku najviac zastúpené. Podľa farbenia ich rozdeľujeme na neutrofilné, eozinofilné
a bazofilné.
Neutrofilné leukocyty sa zo všetkých typov leukocytov v mlieku vyskytujú
najčastejšie. Stretávame sa s nimi v štádiu segmentovaných jadier, spravidla sú segmentované
na 2 až 3 diely. U týchto buniek je vyvinutá fagocytárna schopnosť. Vo zvýšenom množstve
sa objavujú v období sekrécie mledziva a v starodojnom mlieku pred zasušením. Ich výskyt
v mlieku je vysoký pri ochorení mliečnej žľazy, najmä bakteriálneho pôvodu.
Eozinofilné leukocyty tvoria v mlieku zdravých dojníc iba nepatrnú časť celkového
bunkového obsahu.
Bazofilné leukocyty sú veľmi vzácne a v cytológii mlieka nemajú prakticky žiadny
význam.
Lymfocyty sa v mlieku vyskytujú v podobe malých lymfocytov (6-8 µm) a v podobe
veľkých lymfocytov (do 15 µm). Majú charakteristický okrúhly tvar jadra. V mlieku zdravých
dojníc sú najbohatšie zastúpenou zložkou bieleho krvného obrazu.
Monocyty sú podobné veľkým lymfocytom. Majú fazuľovité až podkovovité jadro
niekedy i laločnatého tvaru. Vyznačujú sa fagocytárnou schopnosťou. Sú charakteristické pre
mledzivo vo forme tzv. malých kolostrálnych teliesok (lipofágov).
1.6.1.2 Bunky červeného krvného obrazu
Môžu byť v mlieku zastúpené iba erytrocytmi. Erytrocyty pri príprave preparátu za
použitia bežných farbív nedajú zistiť. Dajú sa zafarbiť špeciálnymi metódami a zisťujeme ich
pri ťažkých formách zápalu mliečnej žľazy, pri poranení mliečnej žľazy, najmä pri poranení
strukových vývodov. Taktiež ich môžeme nájsť v mledzive (Grieger a Holec et al., 1990).
1.6.2 Bunky pochádzajúce z mliečnej žľazy
Grieger a Holec et al. (1990) ďalej uvádzajú, že dlaždicový vrstevnatý epitel sa
nachádza na koži na povrchu vemena, struku a strukových vývodov. Do mlieka prechádza
vplyvom dráždenia v priebehu dojenia. Pri dojení dochádza k mechanickému odlupovaniu
zrohovatených epitélií. Bunky dlaždicového vrstevnatého epitelu majú tvar oválnych alebo
54
polygonálne zvrásnených útvarov s príležitostne sa vyskytujúcimi fragmentmi jadier. Tieto
bunky nie sú príznakom chorobného stavu mliečnej žľazy. Nešetrný spôsob dojenia (najmä
ručného) môže byť príčinou väčšieho množstva týchto útvarov v mlieku.
Cylindrický epitel pochádza z mliečnych cisterien a väčších mliekovodov.
Je dvojvrstvový a jeho bunky sú oválne až obdĺžnikovité, s excentricky uloženým jadrom.
Bunky sa do mlieka dostávajú jednotlivo alebo v zhlukoch, nachádzajú sa aj v mlieku
zdravých dojníc. Väčší výskyt v podobe zhlukov sa vyskytuje pri mikrobiálnom alebo
mechanickom podráždení strukovej a žľazovej cisterny.
Epitelové bunky pochádzajú z drobných mliekovodov a sekrečných alveol. Majú
guľovitý, až mierne oválny tvar a dobre sa farbiace excentricky uložené jadro. Protoplazma
týchto buniek je pri laktácii vyplnená tukovými kvapôčkami. Bunky nadobúdajú penovitú
štruktúru a často narastajú do značných rozmerov. Takéto bunky sa potom označujú ako
bunky penové alebo veľké kolostrálne telieska. Tieto bunky sú krehké a pri získavaní
sedimentu sa často poškodia, takže v zafarbenom preparáte sa potom dajú pozorovať len ich
fragmenty. Tieto bunky sa nachádzajú v značnom množstve na začiatku laktácie, v zrelom
mlieku sa nachádzajú len zriedka.
Dominujúcim typom buniek v mlieku pri plnej laktácii sú makrofágy, v kolostrálnom
mlieku prevládajú polymorfonukleárne leukocyty.
1.6.3 Nebunkové útvary z mlieka
Mliečna plazma sa pri mikroskopovaní náteru mlieka javí ako homogénny alebo
jemne sieťovaný povlak. Jeho prítomnosť môžeme pravidelne zistiť pri vyšetrení mledziva,
v mlieku starodojných dojníc a niekedy i v mlieku dojníc postihnutých zápalom mliečnej
žľazy.
Kazeín sa pri mikroskopovaní dá pozorovať v podobe jemne vyzrážaných vločiek
a veľmi dobre sa dá pozorovať pri vyšetrovaní nakysnutého mlieka.
Mliečne konkrementy sú okrúhle útvary najrôznejších veľkostí (1-200 µm)
s intenzívne zafarbeným centrom. Niekedy je dobre viditeľné koncentrické vrstvenie. Tvoria
sa v lumene mliečnej žľazy okolo vločky zrazeného kazeínu alebo rozpadnutej bunky.
Konkrementy sa vyskytujú často v kolostrálnom mlieku a v starodojnom mlieku (Grieger
a Holec et al., 1990).
55
1.7 VŠEOBECNÝ VÝZNAM SKÚŠANIA SUROVÉHO KRAVSKÉHO MLIEKA
Hanuš et al. (2004) uvádzajú, že skúšanie surového mlieka je významné pre:
- bezpečnosť mliečneho potravinového reťazca,
- kontrolu a preplácanie kvality mlieka,
- spracovanie mlieka,
- šľachtenie dobytka,
- kontrolu zdravotného stavu dojníc.
Výhody skúšania vzoriek surového kravského mlieka:
- vzorku mlieka je možné odobrať neinvazívnym spôsobom a na rozdiel od ostatných
telových tekutín ako moč alebo krv je vzorkovanie oveľa jednoduchšie a efektívnejšie
pretože nehrozí riziko stresu zvieraťa alebo infekcie,
- pravidelné skúšanie vzoriek bazénového mlieka je výhodné pre kontrolu
kvalitatívnych ale aj hygienických ukazovateľov mlieka,
- pravidelné skúšanie vzoriek mlieka individuálnych dojníc je výhodné pre kontrolu
úžitkovosti a zdravia dojníc,
- analýzy sú často automatizované, rýchle a ekonomicky nenáročné,
- získané výsledky je možné štatisticky spracovať, porovnávať a interpretovať pre účely
hodnotenia kvality a zdravotného stavu dojníc,
- údaje ako dojivosť, zloženie mlieka (tuk, bielkoviny, močovina, počet somatických
buniek), poradie a štádium laktácie sa môžu použiť pre účely šľachtenia, pre kontrolu
výživy a zdravotného stavu dojníc.
Výsledky skúšania bazénových vzoriek mlieka dávajú obraz o úrovni zamorenia
mastitídami v chove. Výsledky vzoriek mlieka individuálnych dojníc alebo štvrťkových
vzoriek dávajú obraz o zdravotnom stave dojnice a môžu slúžiť k presnej identifikácii
bakteriálnych pôvodcov mastitíd a stanoveniu ich citlivosti na antibiotiká.
Získané výsledky umožňujú sofistikované manažovanie mastitídy a aplikáciu účinnej
liečby.
56
Vo vzorkách mlieka sa odporúča analyzovať rutinné parametre ako počet somatických
buniek, zloženie (obsah laktózy, bielkovín, tuku, beztukovej sušiny), teplotu tuhnutia mlieka,
hustotu, celkový počet mikroorganizmov a počet koliforných baktérií.
Špeciálne vyšetrenia vzoriek mlieka sú cielené na prítomnosť patogénnych
mikroorganizmov a overenie ich citlivosti na antibiotiká.
Z ďalších vyšetrení je možné vykonať stanovenie vodivosti (konduktivity), stanovenie
obsahu chloridov, stanovenie močoviny, stanovenie prítomnosti rezíduí inhibičných látok,
viskozimetrické stanovenie mastitídy pomocou rýchlych testov (California mastitis test, NK
test).
57
1.8 STANOVENIE SOMATICKÝCH BUNIEK V SUROVOM KRAVSKOM MLIEKU
Podľa International Committee for Animal Recording, Working Group on Milk
Testing Laboratories (ICAR, 2005), sa pre stanovenie počtu somatických buniek môžu
používať nasledovné metódy:
Analytické laboratórne metódy na stanovenie počtu somatických buniek Tabuľka 8
Medzinárodná – referenčná metóda
Mikroskopické stanovenie počtu somatických buniek
ISO 13366-1 (IDF 148) STN EN ISO 13366-1
Štandardizované rutinné metódy
Metóda elektronického počítania častíc (Coulter Counter)*
*Po ukončení revízie normy ISO 13366 (IDF 148) bude táto metóda zrušená.
ISO 13366-2 (IDF 148), STN EN ISO 13366-2 (bola zrušená)
Fluoro-opto-elektronická metóda (Rotačné disky) ISO 13366-3 (IDF 148), STN EN ISO 13366-3 AOAC 978.26
Fluoro-opto-elektronická metóda (Prietoková cytometria)**
**Po ukončení revízie normy ISO 13366 (IDF 148) bude súčasťou tejto normy.
ISO 13366 (IDF 148) STN EN ISO 13366-3
Rutinné inštrumentálne metódy používané v členských krajinách ICAR
Rátanie častíc Coultronic (UK) Coulter counter Fluoro-opto-elektronická metóda založená na diskovej cytometrii.
Foss Electric (DK) Fossomatic 90, 180, 215, 250, 360, 400
Anadis (F) Somatic Cell Counter 300, 500 Bentley (USA) Somacount 150, 300, 500 Chemunex (D) Partec CA 11 Delta Instruments (NL) Somascope MKII Manual MKII
Auto 200 MKII Auto 400
Fluoro-opto-elektronická metóda založená na prietokovej cytometrii.
Foss Electric (DK) Fossomatic 5000, CombiFoss 5000, CombiFoss 6000 FC
(ICAR 2005)
Podľa Nariadenia Komisie (ES) č. 1664/2006 zo 6. novembra 2006 , ktorým sa mení a
dopĺňa nariadenie (ES) č. 2074/2005, sa na stanovenie počtu somatických buniek musí použiť
referenčná metóda ISO 13366-1. Je prípustné použiť aj iné metódy ak sú validované
referenčnou metódou a ak sú v súlade s normou ISO 8196 a keď sa vykonávajú v súlade
s ISO 13366-2.
58
1.8.1 Stanovenie počtu somatických buniek rýchlymi metódami (testami)
Z rýchlych diagnostických metód sa pri zisťovaní mastitídy v praxi používajú tzv.
rýchle maštaľné testy. Niektoré z nich umožňujú nepriamo stanoviť počet somatických buniek
v mlieku. Medzi najčastejšie používané rýchle maštaľné testy patria: California mastitis test,
Wisconsin mastitis test, u nás NK-test a ďalšie komerčné testy (Foltys a Kirchnerová, 2003;
Rice, 1981).
Suarez et al. (2002) zisťovali závislosť medzi počtom somatických buniek
a výsledkami California mastitis testu v závislosti od infekčného stavu štvrtiek vemena
u oviec. Autori zistili dobrú koreláciu medzi výsledkami California mastitis testu a počtom
somatických buniek.
Rýchle diagnostické testy ako California mastitis test alebo Wisconsin mastitis test sú
veľmi užitočné, avšak získané výsledky sú len orientačné. Presné výsledky počtu somatických
buniek sa môžu získať len prostredníctvom laboratórnych diagnostických metód (Rajah,
1993).
1.8.1.1 Stanovenie počtu somatických buniek NK-testom
Kováč et al. (2001) popisujú použitie u nás najčastejšie používaného rýchleho testu na
stanoveni mastitídy, NK-testu. NK-test je modifikáciou Calirofnia mastitis testu.
Diagnostická reagencia je červený priesvitný roztok (100,0 cm3 povrchovo aktívnych látok –
alkylarylsulfonáty a 0,2 g fenolovej červene ad 1000,0 cm3 destilovanej vody) s upravenou
koncentráciou vodíkových iónov. Skúška sa robí na miskách umiestnených na palete určenej
na posudzovanie. Dva mililitre čerstvo nadojeného mlieka sa zmiešajú s 2 ml diagnostickej
reagencie a pri nakláňaní palety sa posudzuje reakcia, ktorá prebehne spravidla do 30 sekúnd.
Pozitívna reakcia sa prejavuje výraznou tvorbou vločiek a zmenou konzistencie vo forme
gelifikácie až koagulácie. Pôsobenie rozdielneho pH na farebný indikátor zapríčiňuje súčasne
farebnú reakciu.
Posúdenie výslednej reakcie NK-testu:
Zmeny v konzistencii sú dôležitejšie ako zmeny farebné. Mlieko sa posúdi najskôr bez
pridania reagencie. Naklonením palety o 45° sa upraví množstvo mlieka po označenie (t.j.
59
2 ml). Potom sa pridá rovnaké množstvo reagencie pre NK-test. Kruhovým pohybom sa
mlieko s diagnostickou reagenciou zmieša a posúdi sa výsledná reakcia.
a; negatívna reakcia: mlieko nemení konzistenciu ani sfarbenie, približný počet somatických
buniek je od 0 – 200 000 . ml-1.
b; dubiózna reakcia: mierne zahustenie až vytvorenie sa slizu, na dne misky sa po čase vytvorí
jemný zvlnený film, ktorý svojím ružovkastým sfarbením poukazuje na približný obsah
150 000 – 500 000 ( v priemere 360 000) somatických buniek . ml-1 mlieka.
c; pozitívna reakcia, +1: hlienovitá konzistencia najmä v strede misky, pri naklonení sa táto
pohybuje, závojový film na dne misky a červenkasté sfarbenie reakcie poukazuje na mlieko
s obsahom 400 000 – 1 000 000 (v priemere 660 000) somatických buniek . ml-1 mlieka.
d; silne pozitívna reakcia, +2: hustá hlienovitá až rôsolovitá konzistencia, zmes vytvára
zhluky vo forme vločiek a je červenej farby, poukazuje na približný obsah 800 000 –
5 000 000 (v priemere 1 600 000) somatických buniek . ml-1 mlieka.
e; veľmi silne pozitívna reakcia, +3: pri hladine zmesi červenej farby sa vytvára reliéf (súvislá
vrstva zmesi), približný obsah somatických buniek je viac ako 5 000 000 (v priemere
7 500 000) . ml-1 mlieka.
1.8.1.2 Stanovenie počtu somatických buniek California mastitis testom
California mastitis test je rýchly test pre orientačné stanovenie počtu somatických
buniek v mlieku. Test reaguje predovšetkým s neutrofilnými leukocytmi prítomnými
v mlieku. Čím intenzívnejšia je reakcia, tým je v mlieku väčší počet somatických buniek.
Skúška sa robí na miskách umiestnených na palete. Testovacia paleta pozostáva zo štyroch
častí označených písmenami A, B, C, D určených pre každú štvrťku vemena. Pomocou testu
sa môže určovať približný počet somatických buniek v bazénovom mlieku.
Postup skúšky je nasledovný: testovacia paleta sa naplní malým množstvom mlieka
z každej štvrťky. K mlieku sa pridá rovnaké množstvo reagencie California mastitis testu.
Otočným pohybom testovacej palety sa premieša mlieko s reagenciou. Po desiatich sekundách
60
sa odčíta výsledok reakcie, za súčasného miešania pretože reakcia trvá iba 20 sekúnd.
Výsledok sa musí odčítať veľmi rýchlo.
Vyhodnocovanie výsledkov reakcie: reagencia California mastitis testu reaguje
s neutrofilnými leukocytmi a dochádza k zahusťovaniu až gelovateniu zmesi. Intenzita
reakcie závisí od počtu prítomných somatických buniek.
a; negatívna reakcia: mlieko nemení konzistenciu, priemerný počet somatických buniek je
100 000 . ml-1.
b; náznak mastitídy: mierne zhustnutie, reakcia sa stratí po desiatich sekundách, priemerný
počet somatických buniek je 300 000 . ml-1.
c; pozitívna reakcia, stupeň 1: zreteľné zhustnutie, gél sa netvorí, priemerný počet
somatických buniek je 900 000 . ml-1.
d; pozitívna reakcia, stupeň 2: okamžité zhustnutie, tvorba gélu na dne misky, priemerný
počet somatických buniek je 2 700 000 . ml-1.
e; pozitívna reakcia, stupeň 3: z celej zmesi sa vytvoril gél, povrch gélu je vyvýšený, v strede
sa nachádza zreteľný pík, priemerný počet somatických buniek je 8 100 000 . ml-1 (Rice,
1981; www.infovets.com).
1.8.2 Laboratórne metódy, prevádzkové metódy
1.8.2.1 Stanovenie počtu somatických buniek cytometriou tuhou fázou
D'Haese et al. (2001) vo svojej práci skúmali potenciál cytometrie tuhou fázou pri
stanovení počtu somatických buniek. Táto metóda kombinuje aspekty fluoro-opto-
elektronickej metódy a epifluorescenčnej mikroskopie. V prípade cytometrie tuhou fázou
dochádza k zachyteniu somatických buniek na membránovom filtri, označeniu somatických
buniek fluorescenčnou látkou a k následnej detekcii celého membránového filtra pomocou
laserového skenovacieho prístroja ChemScan. Fluoreskujúce body sa môžu vizuálne preveriť
pomocou epifluorescenčného mikroskopu s počítačom riadeným stolom. Táto metóda bola
porovnaná s fluoro-opto-elektronickou metódou (Fossomatic 360). Vypočítaná
61
opakovateľnosť bola horšia než pri stanovení prístrojom Fossomatic 360. Hlavným
problémom tejto metódy je filtrácia mlieka a narušenie fluorescenčných častíc. Kvôli týmto
problémom sa táto metóda v súčasnosti nedá rutinne používať pri zisťovaní počtu
somatických buniek.
1.8.2.2 Stanovenie počtu somatických buniek NIR spektroskopiou
Tsenkova et al. (2001) skúmali potenciál metódy NIR v oblasti 1,100 až 2,500 nm pri
zisťovaní počtu somatických buniek v kravskom mlieku. Vypočítaná presnosť metódy
naznačila možnosť aplikácie metódy pri skríningu zdravotného stavu dojníc. Stanovenie počtu
somatických buniek metódou NIR sa zakladá na zmenách v zložení mlieka a rozlíšení
zdravého mlieka od mastitídneho. Medzi veľmi významné faktory ovplyvňujúce NIR
spektrum patria zmena obsahu bielkovín a zmena koncentrácie iónov v mastitídnom mlieku.
Autori v závere práce konštatujú, že je ešte nutné vykonať ďalšie pozorovania a pokusy
s mliekom iných druhov hospodársky významných prežúvavcov.
1.8.2.3 Stanovenie počtu somatických buniek video mikroskopiou
Baro et al. (2005) publikovali metódu video mikroskopie pre stanovenie počtu
somatických buniek v kravskom mlieku a porovnali ju s referenčnou mikroskopickou
metódou a prevádzkovou metódou (Fossomatic). Autori uvádzajú, že mikroskopické
preparáty boli pripravené podľa postupu uvedeného v norme IDF 148. Mikroskopovanie sa
uskutočnilo na bežnom mikroskope s CCD kamerou umiestnenou na okulári. Pri snímaní
obrázkov bol použitý objektív so 40 x zväčšením. Mikroskop bol vybavený automatickým
posuvným stolom. Obrazový výstup z mikroskopu bol spracovaný v počítači s nainštalovanou
video kartou. Spracovanie získaných obrázkov sa vykonalo prostredníctvom softvéru. Postup
spracovania obrázkov bol nasledovný: upravila sa intenzita šedej farby (zblednutie pozadia),
boli vylúčené častice ležiace v blízkosti hraníc zorného poľa (zabránenie viacnásobného
počítania buniek), vyfiltrovali sa častice s veľkosťou somatickej bunky, vyfiltrovali sa častice
s nevhodným tvarom, spočítali sa zostávajúce častice. Počet somatických buniek sa vypočítal
vynásobením zisteného počtu častíc s faktorom mikroskopu. Najlepšie výsledky sa dosahovali
pri počte somatických buniek 100 až 1000 buniek v 1 µl. Pri počte nad 1000 µl boli výsledky
stanovené referenčnou mikroskopickou metódou vyššie v porovnaní s výsledkami video
mikroskopie. Relatívny rozdiel medzi oboma metódami je približne 5 % pri hladine 100 až
62
1000 somatických buniek v 1 µl a na vyššej hladine neprekračuje 10 %. Rozdiel nebol
ovplyvnený počtom spracovaných obrázkov v jednej vzorke. Výsledky referenčnej
mikroskopickej metódy a video mikroskopie boli nepatrne nižšie v porovnaní s výsledkami
stanovenými na prístroji Fossomatic.
1.8.2.4 Stanovenie počtu somatických buniek prietokovou cytometriou (prístrojom
Fossomatic)
Operátorský manuál firmy Foss Electric (Foss Electric, 2000) obsahuje technické
údaje o prístroji Fossomatic.
Princíp stanovenia prístrojom je založený na zafarbení somatických buniek, ktoré sú
následne elektronicky počítané.
Prietoková cytometria je založená na princípe priechodu veľmi malého množstva
vzorky pod počítacou jednotkou prístroja. Úzky pramienok vzorky prechádza pod počítaciu
jednotku pomocou kvapaliny, ktorá vytvorí veľmi tenký, ale dobre analyzovateľný pramienok
vzorky. Vytvorenie tenkého pramienku vzorky sa dosahuje zmenšením priemeru prietoku
v kyvete a vysokým tlakom, ktorým je vzorka hnaná cez prietokovú kyvetu. Rozmer
pramienka vzorky dovoľuje v rovnakom čase prejsť iba jednej somatickej bunke.
Potom, čo sa vzorka zafarbí fluorescenčnou látkou (fluorescenčná látka zafarbí
predovšetkým molekuly DNA, čím presne špecifikuje iba somatické bunky) je vystavená
v kyvete modrému svetlu o vlnovej dĺžke 450 nm. Modré svetlo dopadá na zafarbené bunky
a spôsobí odraz červeného svetla z buniek. Červené svetlo sa zosilňuje pomocou
fotozosilňovača a následne sa počíta ako svetelné impulzy.
Popis prietokového systému prístroja Fossomatic:
Prietok cez prístroj Fossomatic 5000 je nasledovný:
1. Prístroj nasaje vzorku mlieka.
2. V rovnakom čase vzorková dávkovacia jednotka nasaje čistiaci roztok.
3. V rovnakom čase farbiaca dávkovacia jednotka nasaje farbivo. Zmiešavacia komôrka
sa plní koncentrovaným farbivom zo zásobníka a riediacim roztokom z vonkajšieho
riediaceho zásobníka v pomere 1 : 9.
4. Mlieko a farbivo sa zmiešavajú a tlačia sa cez vstavaný filter. Prvá časť zmesi prejde
priamo do vysoko koncentrovaného odpadu.
63
5. Meracia dávkovacia jednotka sa naplní čistiacim roztokom.
6. Meracia dávkovacia jednotka vstrekne zmes mlieka s farbivom do prietokovej kyvety,
v ktorej stálou rýchlosťou preteká unášacia kvapalina. V prietokovej kyvete sa vytvorí
tenký pramienok zmesi mlieka s farbivom a unášacej kvapaliny zúžením priemeru
prietoku. Tenký pramienok sa následne analyzuje.
7. Impulzy zo zafarbených somatických buniek sa zosilnia, spočítajú a prepočítajú sa na
počet somatických buniek . ml-1.
8. Pred každou meranou vzorkou sa všetky hadičky prístroja automaticky vyčistia
a vstavaný filter sa spätne prepláchne. Odpad sa rozdelí na vysoko a nízko
koncentrovaný.
Technické údaje k prístroju Fossomatic 5000
Tabuľka 9 Rýchlosť merania: 400 vzoriek za hodinu pri meraní štandardných mliečnych
vzoriek
Rozsah merania: do 10 000 000 somatických buniek
Množstvo vzorky: 2,5 ml (programovateľné 2 – 5 ml)
Teplota vzorky: 30 – 42 °C
Opakovateľnosť metódy
pri štandardnom
nastavení:
Cv < 4 % do 500 000 buniek
Cv < 5 % do 300 000 buniek
Cv < 7 % do 100 000 buniek
Opakovateľnosť metódy
pri zvláštnom
nastavení:
Cv < 2 % do 500 000 buniek
Cv < 2,5 % do 300 000 buniek
Cv < 3,5 % do 100 000 buniek
Správnosť: lepšie než 10 % v rozpätí 100 000 - 1 500 000 buniek.ml-1
Korelácia: 0,96 – 0,99
Pracovný faktor: 300 alebo lepší
Prenosová chyba: Nekompenzovaná: pod 1 %, typicky 0,4 %
S automatickou kompenzáciou: zanedbateľná
Poznámka: Cv – variačný koeficient
(Foss Electric, 2000)
64
1.8.2.5 Stanovenie počtu somatických buniek diskovou cytometriou (prístrojom
FOSSOMATIC 90)
Mlieko určené na skúšanie sa zmieša s tlmivým a farbiacim roztokom. Zmes sa
nanesie vo forme tenkého filmu na rotujúci disk, ktorý slúži ako podložné sklíčko
mikroskopu. Každá zafarbená bunka zaznamenaná mikroskopom dáva elektrický impulz,
ktorý sa zosilňuje a registruje. Počet somatických buniek sa odčíta priamo v tisícoch . ml-1
(STN EN ISO 13366-3).
1.8.2.6 Stanovenie počtu somatických buniek metódou elektronického počítania častíc
(COULTER COUNTER)
Somatické bunky nachádzajúce sa vo vzorke, ktorá sa má skúšať, sa fixujú prídavkom
formaldehydu (formalínu). Vzorka a zriedi emulgačnou elektronickou zmesou a zahreje sa,
čím sa rozrušia tukové guľôčky, ktoré prekrývajú oblasť veľkosti somatických buniek. Počet
somatických buniek sa priamo odčíta v tisícoch . ml-1.
Mlieko prechádza v prístroji na elektronické počítanie častíc nastavenou štrbinou
medzi elektródami. Ak touto štrbinou prechádza častica, vytlačí sa jej vlastným objemom
vysoko vodivá kvapalina a nahradí sa objemom kvapaliny s nižšou vodivosťou. Zosilnený
odpor zvýši napätie, čím sa vytvorí impulz napätia úmerný objemu častice. Počet impulzov
udáva počet častíc, ktoré prešli štrbinou. Počítajú sa iba impulzy nad nastavenou prahovou
hodnotou (STN EN ISO 13366-2, 2001).
Táto metóda sa už v praxi takmer vôbec nepoužíva a bola vyradená z revízie normy
ISO 13366.
1.8.3 Referenčná metóda stanovenia počtu somatických buniek
Referenčnou metódou je mikroskopické stanovenie počtu somatických buniek.
Vzorka mlieka sa nanesie na podložné sklíčko tak, aby vznikol tenký film. Film sa
vysuší, zafarbí a nasleduje mikroskopické počítanie zafarbených buniek. Spočítaný počet
buniek na definovanej ploche sa násobí pracovným faktorom a tak sa získa počet buniek
v 1 ml (STN EN ISO 13366-1, 2001).
65
Pracovný postup:
Z pripravenej analytickej vzorky sa mikrodávkovačom odoberie 0,01 ml. Vzorka sa
nanesie na podložné sklíčko tak aby sa vytvorila plocha 20 mm x 5 mm. Náter sa vysuší pri
laboratórnej teplote niekoľko hodín. Podložné sklíčko so suchým náterom filmu sa na 10
minút ponorí do farbiaceho roztoku. Po zafarbení sa náter filmu vystaví prúdu vody, kým sa
prebytočné farbivo nevymyje. Náter sa znova suší a uchováva sa chránený pred prachom až
do mikroskopovania. Pod mikroskopom sa v nátere spočítajú bunkové jadrá. Bunkové jadrá
musia byť zreteľne rozoznateľné a v mikroskopickom poli musí byť z jadra viditeľná
najmenej polovica. Celkový počet buniek v mililitri sa vypočíta vynásobením počtu
spočítaných somatických buniek pracovným faktorom mikroskopu (STN EN ISO 13366-1,
2001).
Referenčná metóda je podrobne popísaná v experimentálnej časti tejto práce.
1.8.4 Metódy na diferenciáciu somatických buniek
Pillai et al. (2001) skúmali možnosť využitia metódy diferenciácie somatických
buniek. Autori uvádzajú že diferenciácia somatických buniek má svoje opodstatnenie, pretože
zastúpenie jednotlivých typov somatických buniek v mlieku sa mení v závislosti od
zdravotného stavu vemena. V mlieku nadojenom zo zdravého vemena je nasledovné
zastúpenie somatických buniek: 60 % tvoria makrofágy, 28 % lymfocyty a od 2 % do 5 %
PMN. V mastitídnom mlieku je percentuálny podiel PMN podstatne vyšší a dosahuje úroveň
90 %.
Pillai et al. (2001) ďalej popisujú metódu diferenciálneho počítania zápalových
buniek (DICC). DICC je metóda založená na prietokovej cytometrii a farbení somatických
buniek kombináciou dvoch fluorescenčných farbív viažucich sa na DNA. Pomocou tejto
metódy je možné identifikovať jednotlivé typy zápalových buniek prítomných v mlieku. Ako
farbivá sa používajú SYBR green 1 a propidium jodid. Počas farbenia sa farbia iba bunky
obsahujúce jadro. Zafarbené mŕtve bunky po osvietení laserovým lúčom špecifickej vlnovej
dĺžky fluoreskujú na červeno a živé bunky na zeleno.
Jednotlivé typy živých buniek je možné identifikovať na základe rozdielnej vlnovej
dĺžky a intenzity fluorescencie produkovanej po osvietení laserovým lúčom. Bunky
66
prechádzajúce cez meraciu oblasť sú osvietené laserovým lúčom. Bunky zafarbené
fluorescenčnou látkou generujú fluorescenčné svetlo. Rozdielne fluorescenčné látky
produkujú fluorescenčné svetlo rozdielnej vlnovej dĺžky. Fluorescenčné svetlo je následne
zachytávané sériou optických zariadení, deteguje sa jeho vlnová dĺžka a detektor nazývaný
fotozosilňovacia trubica ho transformuje na elektrické impulzy, ktoré sú následne
elektronicky konvertované a zaslané do počítača na spracovanie. Veľkosť a denzita buniek sa
môže zistiť z odklonu laserového lúča. Laserový lúč dopadajúci na bunku sa odkloní smerom
dopredu. Stupeň odklonu sa analyzuje detektorom. Stupeň odklonu je priamo úmerný
priemeru bunky, ktorý reprezentuje veľkosť analyzovanej bunky alebo populácie buniek.
Dopadajúci laserový lúč sa môže odkloniť aj smerom do pravej strany. Odklon do pravej
strany závisí od prítomnosti granúl alebo organel vo vnútri bunky. Čím hustejšia je bunka,
tým je väčší uhol odklonu laserového lúča do pravej strany. Na základe tohto odklonu je
možné stanoviť relatívnu denzitu bunky alebo populácie buniek. Získané dáta je možné
znázorniť na dot-plot diagrame a analyzovať pomocou software. (www.iupui.edu, 2005).
Mononukleotidy (mononukleárne leukocyty) a PMN majú rozdielne optické vlastnosti
na základe ktorých je možná ich jednoznačná identifikácia a rozlíšenie.
Zo získaných výsledkov vyplýva, že existuje výrazná pozitívna korelácia medzi
celkovým počtom somatických buniek stanoveným konvenčným elektronickým spôsobom
počítania a počtami mononukleotidov a PMN stanovenými metódou DICC.
Vo vzorkách mlieka s vysokým počtom somatických buniek je možné pomocou
metódy DICC stanoviť percentuálny podiel PMN a tak exaktne potvrdiť prítomnosť zápalu
v štvrťke vemena. Mlieko pochádzajúce zo štvrtiek so zvýšeným percentuálnym podielom
PMN sa následne môže podrobiť bakteriologickej analýze, ktorou sa získajú podklady pre
indikáciu liečebných postupov (Pillai et al. 2001).
Dosogne et al. (2003) vyvinuli metódu dieferenciácie somatických buniek pomocou
prietokovej cytometrie v mlieku s nízkym počtom somatických buniek. Cieľom ich štúdie
bolo vyvinúť metódu s minimálnym vplyvom na morfológiu bunky.
Pracovný postup pozostával zo zriedenia vzorky mlieka s 30 % fosfátovým tlmivým
roztokom, odstreďovania, farbenia DNA leukocytov pomocou farbiva SYTO 13 a analýzy
prietokovou cytometriou.
Výsledky boli nanesené na „dot-plot“ bodový diagram. Jednotlivé typy somatických
buniek fluoreskovali inou intenzitou. V oblasti zelenej fluorescencie 530 nm boli jasne
67
identifikované štyri hlavné skupiny leukocytov: lymfocyty, monocyty, polymorfonuklerárne
neutrofily, zrelé makrofágy, ďalej boli identifikované bunky s apoptickými znakmi
v dôsledku kondenzácie chromatínu a fragmentácie jadra.
Metódami diferenciácie leukocytov prietokovou cytometriou vo vzorkách kravského
mlieka sa zaoberalo viacero autorov (Hageltorn a Saad, 1986; Östensson et al., 1988;
Redelman et al., 1988; Saad a Östensson et al., 1990, Rivas et al., 2002). Tieto metódy boli
vyvinuté predovšetkým pre vzorky mlieka s vysokým obsahom somatických buniek.
68
1.9 BEZPEČNOSTNÁ SMERNICA PRE PRÁCU S ETÍDIUM BROMIDOM
1.9.1 Charakteristika etídium bromidu
Etídium bromid (EtBr) je silný mutagén, ktorý sa používa na farbenie nukleových
kyselín. Zafarbený materiál fluoreskuje pod ultrafialovým svetlom červeno oranžovým
svetlom. Intenzita fluorescencie sa zvyšuje v prípade dvojitej závitnice DNA. Etídium bromid
sa obvykle distribuuje v práškovej forme alebo ako roztok. Etídium bromid sa rozpúšťa vo
vode. Kryštalická alebo prášková forma je sfarbená na tmavo červeno (Ethidium Bromid
Safety, 1999).
Bežne používané názvy a chemické vzorce etídium bromidu sú uvedené v Tabuľke 10.
Bežne používané názvy a chemické vzorce etídium bromidu
Tabuľka 10
Bežné názvy etídium bromidu:
2,7-Diamino-10-ethyl-9-phenylphenanthridinium Bromide
3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylpehnanthridinium Bromide
2,7-Diamino-9-phenyl-10ethylphenanthridinium Bromide
2,7-Diamino-9-phenylphenanthridine Ethobromide
Dromilac
Homidium Bromide
Vzorec: C21H20BrN3
Štrukturálny vzorec: [(C4H3NH2)2C6H5C5N+CH2CH3]Br –
(Standard Operating Procedure Ethidium Bromide, 1999).
1.9.2 Škodlivé účinky na ľudský organizmus
Prášková forma dráždi horné dýchacie cesty, oči a pokožku. Etídium bromid je silný
mutagén spôsobujúci mutácie živých buniek. Aj napriek tomu, že sa v súčasnosti neeviduje
žiadny prípad karcinogenity a teratogenity u ľudí, etídium bromid sa považuje za potenciálny
karcinogén a teratogén (Ethidium Bromid Safety, 1999).
69
1.9.3 Spôsoby preniknutia do ľudského organizmu
a; inhalácia: pri práci s práškovou formou etídium bromidu, operáciách pri ktorých existuje
možnosť vzniku etídium bromidového prachu alebo aerosólov z etídium bromidového
roztoku,
b; absorbcia: pri kontakte s nechránenou pokožkou sa môže absorbovať cez pokožku.
c; ingescia: požitím,
d; inokulácia: pri vpichnutí použitej ihly mikrostriekačky do pokožky počas roztierania
vzorky na podložné sklíčko (Standard Operating Procedure Ethidium Bromide, 1999).
1.9.4 Fyzikálne nebezpečenstvo asociované s chemikáliou
a; korózne vlastnosti: má leptavé účinky na materiály,
b; horľavosť: etídium bromid nepredstavuje nebezpečenstvo – nie je horľavinou,
c; reaktivita: etídium bromid reaguje s bielidlami, čistiacimi a dezinfekčnými prostriedkami
s obsahom chlóru (Standard Operating Procedure Ethidium Bromide, 1999).
1.9.5 Určené oblasti používania
Miestnosti kde sa pracuje s etídium bromidom musia byť náležite označené.
Laboratórne dvere: „Toxické chemikálie. Neoprávneným vstup zakázaný“.
Digestor: „Etídium bromid. Nebezpečenstvo – silný mutagén“ (Standard Operating
Procedure Ethidium Bromide, 1999).
1.9.6 Autorizované osoby
Laboratórium pracujúce s etídium bromidom musí viesť zoznam autorizovaných osôb
určených na prácu s etídium bromidom. Laboratórium musí viesť evidenciu vykonávania
tréningu a školenia personálu (Standard Operating Procedure Ethidium Bromide, 1999).
70
1.9.7 Požiadavky na tréning personálu
Tréning personálu pozostáva z preskúšania zo smernice určenej na prácu s etídium
bromidom, bezpečnostných predpisov dodávaných spolu s chemikáliou, s oboznámením sa
zamestnancov s pracovným postupom pri práci so zvlášť nebezpečnými chemikáliami
a z vysvetlenia bežnej laboratórnej praxe (Standard Operating Procedure Ethidium
Bromide, 1999).
1.9.8 Uskladnenie a požiadavky na manipuláciu
Etídium bromid sa skladuje na chladnom, suchom mieste mimo dosahu silných
oxidačných zlúčenín. Nádoby v ktorých je uskladnený musia byť tesne uzatvorené.
Pri manipulácii s práškovou formou sa musí zabrániť tvorbe prachu (Standard Operating
Procedure Ethidium Bromide, 1999).
1.9.9 Technické požiadavky
S etídium bromidom sa pracuje v digestore. V blízkosti pracoviska by sa mali
nachádzať bezpečnostné sprchy a k dispozícii by mala byť možnosť umytia očí v prípade
nehody (Standard Operating Procedure Ethidium Bromide, 1999).
1.9.10 Osobná ochrana
Nosenie laboratórneho plášťa, ochranných okuliarov (štítu) a rukavíc sa považuje za
samozrejmosť pri práci s etídium bromidom. Po ukončení práce sa pracovný plášť, rukavice
a ďalšie ochranné pomôcky musia nechať v laboratóriu, zamedzí sa tým kontaminácii ďalších
priestorov a pracovníkov. Pri práci sa preferuje používanie jednorazových ochranných
pracovných pomôcok.
V prípade, že sa pri práci používa ultrafialové svetlo, musia sa dodržiavať ďalšie
ochranné opatrenia. Nechránená pokožka a oči sa musia chrániť pred UV svetlom. Ak UV
svetlo svieti smerom nahor od zdroja, tvár sa musí chrániť UV ochranným štítom. V prípade
dlhšej práce v blízkosti zdroja UV svetla sa musí pracovať v laboratórnom plášti, ktorého
rukávy sú pevne obvinuté okolo zápästia tak aby nebolo vidieť nechránenú pokožku medzi
plášťom a ochrannými rukavicami. Ak sa pri práci používa zdroj UV svetla nízkej intenzity,
71
je možné niektoré odporúčané ochranné opatrenia vynechať. K takémuto kroku sa môže
siahnuť až potom ako sa overí či je intenzita žiarenia pod úrovňou maximálneho expozičného
limitu (Ethidium Bromid Safety, 1999).
1.9.11 Pokyny pre prácu s etídium bromidom
Pri práci s etídium bromidom sa musí minimalizovať jeho rozlievanie. Ak je to možné
namiesto vlastného pripravovania zásobných roztokov je vhodné používať zásobné roztoky
dodávané distribučnými firmami. Príprava vlastných pracovných roztokov sa musí vykonávať
v digestore. Pri práci s práškovou formou etídium bromidu sa pracuje v digestore
a s ochranným rúškom, aby nedošlo k inhalácii prachových častíc. Prenášať sa smú len
menšie objemy roztoku v zásobných fliaš odolných voči rozbitiu alebo v nádobách
umiestnených do druhého obalu (Ethidium Bromid Safety, 1999).
1.9.12 Prvá pomoc
V prípade kontaktu s očami sa oči vypláchnu prúdom vody počas 15 minút. V prípade
kontaktu s pokožkou, sa zasiahnutá pokožka ihneď umyje mydlom a opláchne sa dostatočným
množstvom vody. V prípade inhalácie sa postihnutý vyvedie na čerstvý vzduch.
Bezprostredne sa kontaktuje lekár (Dawson, 1996).
1.9.13 Likvidácia rozliateho roztoku etídium bromidu
Rozliatie roztoku etídium bromidu sa oznámi spolupracovníkom. Miesto rozliatia sa
zabezpečí pred vstupom neoprávnených pracovníkov. Pred likvidáciou rozliateho roztoku sa
vypnú všetky elektrické zariadenia. Vykoná sa čistenie a dekontaminácia zasiahnutého
miesta. Pri likvidácii rozliateho roztoku etídium bromidu sa pracuje v ochrannom pracovnom
odeve. Rozliaty roztok by sa mal poutierať absorbentom (papierové utierky).
Na dekontamináciu sa použije mydlo, voda a dekontaminačný roztok. Pri umývaní rozliateho
miesta sa musí zabrániť tvorbe nadmerného prachu. Použité čistiace pomôcky sa zabalia do
igelitového vreca. Vrece sa umiestni do kontajnera určeného pre likvidáciu nebezpečného
odpadu. Vyplní sa formulár evidencie zvlášť nebezpečného odpadu (Dawson, 1996).
72
1.9.14 Likvidácia nebezpečného odpadu (starých pracovných roztokov)
Kvapalný odpad obsahujúci etídium bromid sa môže spracovať dvoma spôsobmi:
1; deaktiváciou pomocou špeciálnych komerčne dostupných filtrov
2; chemickou deaktiváciou pomocou dekontaminačných roztokov
Z uvedených spôsobov deaktivácie je vhodnejšie použiť prvý spôsob. Filtrácia roztoku
etídium bromidu je ľahšia a bezpečnejšia než chemická dekontaminácia pomocou roztokov.
Deaktivácia pomocou filtrov je založená na výmene iónov. Aktívne uhlie a živica
odstraňujú ióny etídium bromidu z roztoku. Použité filtre by sa mali umiestniť do kontajnera
určeného na likvidáciu nebezpečného odpadu. Vzniknutý filtrát sa môže vyliať do
kanalizačného odpadu. Vylievanie filtrátu do kanalizácie by sa malo zaznamenávať (Dawson,
1996).
1.9.15 Deaktivácia roztokov Etídium Bromidu
Na deaktiváciu roztokov etídium bromidu sa môže použiť viacero pracovných
postupov. (Lunn a Sansone, 1987) uvádzajú deaktiváciu pomocou kyseliny fosforečnej
a dusitanu sodného a v prípade roztoku s nízkou koncentráciou etídium bromidu pomocou
Amberlitu XAd-1 (Quillardet a Hofnung, 1988) pomocou kyseliny chlorovodíkovej
a manganistanu draselného, (Bensaude, 1988) pomocou práškového aktivovaného uhlia,
(Lunn a Sansone, 1989) uvádzajú dekontaminačný postup v prípade rozliatia roztoku etídium
bromidu.
Pre daktiváciu roztokov etídium bromidu odporúčame kvôli lepšej manipulácii použiť
metódu podľa (Lunn a Sansone, 1987) alebo (Quillardet a Hofnung, 1988), ktoré sú
popísané nižšie.
Metóda 1 (Lunn a Sansone, 1987)
1. Pomocou vody sa zriedi koncentrácia etídium bromidu na 0,5 mg.ml-1 alebo menej.
Pracuje sa v ochrannom pracovnom odeve.
73
2. Na každých 100 ml roztoku etídium bromidu sa pridá 20 ml čerstvo pripravenej 5 %
kyseliny fosforečnej a 12 ml čerstvo pripraveného 0,5 M roztoku dusitanu sodného.
Zmes sa dôkladne premieša.
Dôležité upozornenie: Musí sa overiť či je pH zmesi nižšie ako 3,0.
Kyselina fosforečná sa obyčajne dodáva koncentrovaná 50 %-ná. Koncentrovaná
kyselina fosforečná má leptavé účinky, z tohto dôvodu sa pri práci musia používať ochranné
pomôcky. Na dekontamináciu by sa mal používať čerstvo pripravený roztok. Roztok sa
pripraví nasledovne: prenesie sa 10 ml koncentrovanej kyseliny fosforečnej do 90 ml
destilovanej vody a premieša sa. Roztok sa pripravuje v digestore a v ochrannom pracovnom
odeve. Roztok dusitanu sodného o koncentrácii 0,5 M by sa mal pripraviť až pred použitím
nasledovným postupom: rozpustí sa 3,45 g dusitanu sodného vo vode a doplní sa destilovanou
vodou po objem 100 ml. Roztok sa pripravuje v digestore a v ochrannom pracovnom odeve.
3. Roztoky sa nechajú pôsobiť počas 24 hodín pri izbovej teplote.
4. Pomocou sódy bikarbóny sa upraví pH roztoku na úroveň medzi 5 až 9.
Metóda 2 (Quillardet a Hofnung, 1988)
1. Pomocou destilovanej vody sa zriedi koncentrácia etídium bromidu na 0,5 mg.ml-1
alebo menej. Pracujte v ochrannom pracovnom odeve.
2. Na každých 100 ml roztoku etídium bromidu sa pridá 100 ml 0,5 N roztoku
manganistanu draselného. Následne sa pridá 100 ml 2,5 M kyseliny chlorovodíkovej.
Zmes sa dôkladne premieša a nechá sa stáť počas niekoľkých hodín pri izbovej
teplote.
Príprava 0,5 M roztoku manganistanu draselného: rozpustí sa 7,9 g manganistanu draselného
vo vode a doplní sa vodou na objem 100 ml.
Príprava 2,5 N roztoku kyseliny chlorovodíkovej: pridá sa 20,7 ml koncentrovanej kyseliny
chlorovodíkovej do vody a doplní sa na objem 100 ml.
74
3. Pomocou 2,5 N roztoku hydroxidu sodného sa upraví pH na úroveň medzi 5 a 9, pH sa
upraví orientačne pomocou 100 ml roztoku.
Príprava 2,5 N roztoku hydroxidu sodného: v destilovanej vode sa rozpustí 10 g hydroxidu
sodného a doplní sa na objem 100 ml.
4. Zmes sa dôkladne premieša a vyleje do kanalizácie.
Pri práci s etídium bromidom sa môžu používať viaceré zdraviu škodlivé chemikálie.
Ľadová kyselina octová – vyznačuje sa silnými leptavými účinkami
Tetrachlór etán – je jed a pôsobí toxicky na životné prostredie, predovšetkým vodné živočíchy
HCl – je žieravina
Kyselina fosforečná – má leptavé účinky
KMNO4 – je silná oxidačná zlúčenina
75
1.10 MANAŽMENT KVALITY LABORATÓRNEJ PRÁCE PRE PRIAMU
MIKROSKOPICKÚ METÓDU POČÍTANIA SOMATICKÝCH BUNIEK
Ernst-Heinrich Ubben na Workshope národných referenčných laboratórií pre mlieko
a mliečne výrobky zameranom na počítanie somatických buniek mikroskopickou metódou,
ktorý sa konal v nemeckom meste Kiel 9. až 10. septembra 2004 uviedol referát zameraný na
manažment kvality práce pri stanovení počtu somatických buniek priamou mikroskopickou
metódou (Ubben, 2004).
Kvalitu laboratórnej práce ovplyvňuje: rozmanitosť a zloženie analyzovanej vzorky,
analytické vybavenie, rozdielnosti v prístrojoch a použitých chemikáliách, vplyv prostredia,
pracovné inštrukcie, pracovné postupy, normy, špeciálne pravidlá, odporúčania,
individuálnosť pracovníka vykonávajúceho analýzu, manažment a v rámci neho realizácia
a frekvencia vykonávania kontrol, testovanie kvality laboratórnej práce pomocou
referenčných vzoriek a medzilaboratórnych porovnávaní.
1. Vzorka mlieka
Každá vzorka mlieka je jedinečná a jej charakter môžu vo významnej miere
ovplyvňovať nasledovné ukazovatele:
- typ somatických buniek
- obsah somatických buniek
- degenerácia somatických buniek
- obsah, aktivita a typ prítomných enzýmov
- prítomnosť mikroorganizmov
- rôzne živé alebo neživé zložky
- homogenita vzorky
2. Analytické vybavenie a vplyv prostredia
Pre zabezpečenie kvality práce by sa v laboratóriu mali používať kalibrované prístroje
a vybavenie. Takéto prístroje pracujú veľmi presne a ich používanie znižuje chybu analýzy
a zlepšuje presnosť a správnosť analýzy. Prístroje u ktorých nie je možné vykonať kalibráciu
je preto lepšie vyradiť z ďalšieho použitia. Zmeny v laboratórnych podmienkach môžu
ovplyvniť kvalitu analýzy. Predovšetkým zmena teploty a vlhkosti môže ovplyvniť množstvo
76
pipetovanej vzorky. Odporúča sa preto vykonávať kalibráciu pipiet pri bežných laboratórnych
podmienkach. Optimálne je vykonávať kalibrácie a pracovať pri konštantnej teplote 20 °C.
Pre prípravu roztokov by sa mali používať certifikované chemikálie kvality p.a. (pre analýzu)
alebo supra pur. Pre pipetovanie vzorky sa odporúča používať mikrostriekačku pred
automatickou pipetou. Na nanášanie preparátu sa odporúča používať podložné sklíčka
s predtlačeným rozmerom, potom templát s preddefinovaným rozmerom. V nevyhnutnom
prípade sa môže použiť milimetrový papier, na ktorom sa vyznačí požadovaný rozmer.
3. Pracovné postupy
Pre zabezpečenie jednotnosti laboratórnej práce v referenčných laboratóriách
jednotlivých členských krajinách EÚ, je veľmi dôležité aplikovať rovnaké pracovné postupy.
Vo všeobecnosti sa odporúča pracovať podľa normy ISO 13366. Na základe legislatívnych
požiadaviek sa môžu zaviesť rozličné pravidlá súvisiace s používaním normy ISO 13366.
Pracovné postupy aplikované v jednotlivých laboratóriách by mali byť dostatočne
zdokumentované, aby sa v prípade potreby dali analýzy bez problémov vykonať. Pracovné
postupy by mali podliehať pravidelným kontrolám. V prípade nutnosti ich modifikácie sa
musia v rámci ich validácie vykonať náležité porovnávacie skúšky.
4. Analytik
Pracovník môže vo veľmi veľkej miere ovplyvniť výsledok analýzy. Z tohto dôvodu
sa musí vykonávať pravidelný tréning pracovníkov vykonávajúcich počítanie somatických
buniek mikroskopickou metódou. Praktické zručnosti ako odber vzorky, roztieranie vzorky na
podložné sklíčko a ďalšie praktické úlohy súvisiace s prípravou preparátu sa dajú natrénovať
až do úplnej dokonalosti a spoľahlivosti. Tieto schopnosti sú výsledkom manažmentu,
tréningu a výberu vhodného pracovníka. Detekcia somatických buniek a ich klasifikácia však
vždy závisí od vedomostí, individuálnych skúseností a talentu pracovníka vykonávajúceho
analýzu. Každý pracovník by mal poznať úroveň svojich schopností a mal by vedieť do akej
miery je schopný vykonať individuálne odčítavanie somatických buniek.
77
5. Manažment
Pred začatím práce je nevyhnutné prispôsobiť pracovný postup miestnym
podmienkam. Následne sa musí dozerať nad presným dodržiavaním zavedených pracovných
postupov a pravidiel. Je nevyhnutné vykonávať pravidelné kontroly stanovených výsledkov
s výsledkami získanými na automatických zariadeniach (napr. Fossomatic 5000).
U niektorých špeciálnych vzoriek môžu byť výsledky analýz diametrálne odlišné, pri
rozhodovaní je v takýchto prípadoch nutné využiť vedomosti z dlhodobého pozorovania.
Kvalita práce sa posudzuje na základe viacerých výsledkov a nie na základe jedného
výsledku. Pri kontrolách by sa mali využívať referenčné vzorky a medzilaboratórne skúšky
spôsobilosti. Pracovníci musia byť informovaní o dosiahnutej presnosti a správnosti
výsledkov ich práce.
Medzilaboratórne skúšky spôsobilosti sú dôležitým nástrojom pre zisťovanie kvality
laboratórnej práce. Z hodnôt opakovateľnosti stanovených v posledných medzilaboratórnych
skúškach spôsobilosti vyplýva potreba zlepšenia kvality laboratórnej práce na medzinárodnej
úrovni (Tabuľka 11). Medzilaboratórne skúšky spôsobilosti odhalili systematické chyby
u značného množstva laboratórií (Ubben a Knappstein, 2005).
78
Pokrok v zručnosti laboratórií pri počítaní somatických buniek v medzilaboratórnych
skúškach spôsobilosti
Tabuľka 11 Rok Počet účastníkov
medzilaboratórnej skúšky
spôsobilosti
Sr
[SB.ml-1]
Bias
[SB.ml-1]
1994 42 103 000 300 000
1995 49 48 000 186 000
1996 61 43 000 127 000
1997 67 37 000 118 000
1998 60 38 000 107 000
1999 65 30 000 98 000
2000 65 31 000 76 000
2001 56 35 000 96 000
2002 48 29 000 78 000
2003 45 40 000 122 000
2004 51 29 000 85 000
Sr = opakovateľnosť vyjadrená pomocou štandardnej odchýlky
Bias = systematická chyba (rozdiel od skutočnej hodnoty), u každého z účastníkov bola
vybraná najhoršia hodnota z 9 resp. 10 stanovovaných vzoriek.
Uvedené dáta reprezentujú 85 % hladinu rozdelenia účastníkov.
(Ubben a Knappstein, 2005)
79
1.11 PRÍPRAVA REFERENČNÝCH VZORIEK S PRESNÝM POČTOM
SOMATICKÝCH BUNIEK
Vermunt et al. (1995) uvádzajú, že na stanovenie počtu somatických buniek sa
používajú viaceré metódy. Skutočná, reálna, hodnota počtu somatických buniek sa musí
stanoviť pomocou priamej mikroskopickej metódy.
Schmidt-Madsen (1975) zistil, že počty somatických buniek zistené pomocou
prístrojov Fossomatic vykazujú vysoký stupeň korelácie s priamou mikroskopickou metódou
stanovenia počtu somatických buniek.
V praxi sa však častejšie využíva fluoro-opto-elektronická metóda, ktorú využívajú aj
prístroje typovej rady Fossomatic (Vermunt et al., 1995).
Prístroje na počítanie somatických buniek majú vykazovať nielen dobrú hranicu
opakovateľnosti (r) a reprodukovateľnosti (R) pri medzilaboratórnych skúškach spôsobilosti,
ale majú zaručovať vysokú správnosť strednej hodnoty alebo pokiaľ možno čo najmenšie
vychýlenie (systematickú chybu „bias“). Vzhľadom na to, že vychýlenie je definované ako
rozdiel medzi „skutočnou“ hodnotou a strednou hodnotou z počtov stanovení, musí sa táto
„skutočná“ hodnota stanoviť pokiaľ možno použitím priamej metódy.
Na stanovenie správnosti strednej hodnoty sa nemôže použiť suspenzia častíc
s definovanou veľkosťou. Vzhľadom na to, že postup počítania rôznych prístrojov obsahuje
kroky riedenia, zmiešavania s chemikáliami, farbenie, ohrev, aby sa vzorka pripravila na
finálny proces počítania, vzorky so skutočnými hodnotami musia mať prakticky rovnaké
zloženie ako vzorky mlieka, ktoré sa majú počítať (STN EN ISO 13366-3, 2001).
Vermunt et al. (1995) ďalej uvádzajú, že pre prístrojové metódy stanovenia počtu
somatických buniek sa musia zaviesť postupy kontroly kvality laboratórnej práce, aby
výsledky zistené týmito metódami skutočne odzrkadľovali reálnu hodnotu počtu somatických
buniek vo vzorke. Postupy kontroly kvality vyžadujú vzorky s konštantným a referenčným
množstvom somatických buniek. Referenčné vzorky sa môžu pripravovať viacerými
spôsobmi a ich zloženie môže byť značne odlišné.
80
Príprava referenčných vzoriek
V posledných rokoch boli navrhnuté rôzne spôsoby prípravy referenčných vzoriek
(„štandardov“):
a; prídavok plastových častíc alebo leukocytov do vzoriek mlieka s veľmi malým počtom
somatických buniek,
b; ošetrenie vzoriek mlieka s uvedeným počtom somatických buniek („pravých prirodzených“
vzoriek mlieka) takým spôsobom, že sa vzorky môžu uchovávať najmenej niekoľko
mesiacov.
Jednotlivé prístupy boli úspešné v rôznej miere. Dnes možno konštatovať, že prístup
používajúci prídavok častíc do vzorky mlieka nebol správnym riešením. Prídavok
izolovaných leukocytov (PMN, tymocytov) možno použiť, avšak je potrebné uvedomiť si,
že izolácia týchto buniek vedie často k selekcii určitých typov buniek, takže vzorky
neobsahujú bunky v rovnakom rozsahu alebo s rovnakým rozdelením ako prirodzené mlieko.
V posledných rokoch sa vyvinulo špecifické ošetrenie vzoriek mlieka s malým,
stredným a veľkým počtom buniek takým spôsobom, že pripravené štandardy („referenčné
vzorky“) môžu mať trvanlivosť i niekoľko mesiacov dokonca i pri teplote miestnosti.
Môžu sa prepravovať po celom svete, pretože ošetrenie (kombinácia tepelného
ošetrenia a chemického konzervovania) zaručuje, že sa vo vzorkách nenachádzajú žiadne
patogénne mikroorganizmy ani vírusy (je zaručená absolútna sterilita).
Pri príprave štandardov na báze mlieka sa musí uviesť postup na počítanie
„skutočného“ počtu buniek vo vzorkách mlieka pre kalibráciu a na kontrolu správnosti
elektronického počítania (napríklad fluorescenčná optická elektronická metóda). Na tento účel
je vhodná mikroskopická metóda (STN EN ISO 13366-1). Okrem toho sa musí dokázať,
že referenčné hodnoty nie sú ošetrením zaťažené systematickou odchýlkou.
Podmienky úschovy (čas a teplota) sa riadia návodom výrobcu.
Týmto spôsobom je možné získať štandardy s presne stanoveným definovaným alebo
skutočným počtom buniek. Pre laboratóriá to má výhodu v tom, že vzorky mlieka počítané
mikroskopickou metódou sú k dispozícii bez obmedzenia a môžu sa použiť kedykoľvek je to
potrebné bez toho, aby sa muselo vykonať časovo náročné a prácne mikroskopické počítanie
buniek v danom laboratóriu (STN EN ISO 13366-3, 2001).
81
Odporúčania pre zaradenie bunkových štandardov (mliečnych štandardov) do
programu zabezpečovania kontroly kvality pri počítaní buniek v laboratóriu sú podľa normy
STN EN ISO 13366-3 nasledovné:
a; stanovenie hranice opakovateľnosti (r)
Opakovane sa stanoví počet buniek vo vzorke mlieka (konzervovaného alebo
nekonzervovaného), ktorá obsahuje počet buniek od 400 000 do 500 000 v mililitri.
b; stanovenie hranice reprodukovateľnosti (R)
Účasť v mezilaboratórnych skúškach.
c; stanovenie správnosti (vychýlenia)
Používajú sa štandardy so skutočnými hodnotami stanovenými mikroskopickým
počítaním. Štandardy možno použiť niekoľkokrát za deň, aby sa zistilo, či odčítaná hodnota je
v určitých hraniciach stanovených pre hodnotu štandardu (napríklad od 5 % do 10 % pre
počet buniek od 400 000 do 500 000 . ml-1).
Nie je vždy možné dosiahnuť úzku závislosť medzi príliš veľkými a príliš malými počtami
štandardov a príslušnými odchýlkami počítaných vzoriek mlieka. Je potrebné brať do úvahy,
že štandardné vzorky sú dobre konzervované a že sú z mlieka „najlepšej kvality“.
Odlišné počty (príliš veľké alebo príliš malé) somatických buniek v rutinných vzorkách môžu
byť ovplyvnené príliš veľkými počtami baktérií alebo príliš dlhým časom konzervovania pri
použití niektorých chemických konzervačných látok (napr. azidu sodného) a inými faktormi.
Dosiahnutie počtu somatických buniek udaného pre mliečny štandard môže iba
zabezpečiť, že celkový systém počítania vrátane prípravy vzorky pracuje správne.
Laboratórium, ktoré vykonáva počítanie buniek, musí zabezpečiť, že „kvalita“
počítaných rutinných vzoriek bude taká, aby presne kalibrovaný prístroj mohol počítať
„správne“ počty buniek v týchto vzorkách.
Stabilizácia referenčných vzoriek
Vermunt et al. (1995) uvádzajú, že pri príprave referenčných vzoriek s presným
počtom somatických buniek, by sa malo mlieko preventívne ošetriť za účelom zabránenia
rozkladu somatických buniek. Na konzerváciu sa môžu použiť viaceré konzervačné látky
o rôznych koncentráciách, napr.: kyselina boritá (≤ 0,6 %), dichroman draselný (0,1 %,
82
0,2 %), azid sodný (0,024 %) a bronopol (0,05 %). Pri výrobe referenčných vzoriek sa môže
použiť kombinácia chemickej konzervácie a tepelného ošetrenia.
Autori ďalej uvádzajú, že cieľom ich štúdie bolo vyvinúť dve referenčné vzorky,
vzorku s nízkym a vysokým počtom somatických buniek tak, aby sa pri ich príprave použilo
bazénové mlieko a mlieko od individuálnych dojníc bez potreby odstreďovania, a aby bol
počet somatických buniek stabilný počas 10 týždňov. Pri výrobe referenčných vzoriek
zmiešavali mlieko od individuálnych dojníc s obsahom 100 000 až 1 250 000 somatických
buniek . ml-1 tak, aby vzorky obsahovali rozličný počet somatických buniek. Maximálne
množstvo mlieka použitého od individuálnych dojníc bolo približne 65 %. Mlieko bolo
schladené a uskladnené pri teplote od 0 °C do 2 °C.
Autori preskúmali tri rozdielne spôsoby konzervovania mlieka:
- konzerváciu s 0,1 % w/w bronopolom,
- konzerváciu s 0,1 % w/w dichromanom draselným,
- kombináciu tepelného ošetrenia a konzerváciu s 0,1 % dichromanom draselným, sterilné
zásobné banky obsahujúce 2 až 3 litre mlieka boli umiestnené do vodného kúpeľa pri teplote
70 °C počas 45 min, po tepelnom ošetrení boli chemicky zakonzervované.
Mlieko bolo zakonzervované v priebehu 5 až 10 hodín a v priebehu 24 až 36 hod po
nadojení. V mlieku bol v deň prípravy referenčných vzoriek stanovený celkový počet
mikroorganizmov štandardnou platňovou metódou a počet somatických buniek
mikroskopickou metódou. Vzorky boli zabalené do izotermických boxov s chladiacimi
vložkami a boli zaslané štyrom laboratóriám, ktoré ich uskladnili pri teplote medzi 0 °C až
2 °C. Každá analýza bola vykonaná z novej vzorkovnice.
Z výsledkov experimentu vyplynulo, že tepelné ošetrenie s následným pridaním 0,1 %
dichromanu draselného bolo lepšie než ošetrenie s 0,1 % bronopolom alebo 0,1 %
dichromanom draselným bez tepelného ošetrenia. Štatistická analýza 14 rozdielnych sérií
vzoriek stabilizovaných tepelným ošetrením a konzerváciou 0,1 % dichromanom draselným
ukázala, že tieto vzorky boli stabilné počas celej dĺžky experimentu, desiatich týždňov.
Odhadovaný pokles po 10 týždňoch bol nanajvýš 2 % a nebol významný. V dvoch prípadoch
bol zaznamenaný veľký pokles 13 % a 29 %. Autori uviedli, že v dôsledku neštandardného
pracovného postupu pri tepelnom ošetrení bol pokles v počte somatických buniek očakávaný.
Nedostatočné tepelné ošetrenie viedlo zrejme k zvýšeniu celkového počtu živých
mikrobiálnych buniek. Jedna vzorka vykazovala malý, ale stále veľmi významný pokles 3 %
po uplynutí doby 10 týždňov. Pre tento pokles autori nemali vysvetlenie.
83
Výsledky boli získané pri presne stanovených podmienkach. Mlieko bolo vždy čerstvé
a nekonzervované, vzorky boli konzervované vždy tým istým spôsobom a boli skladované za
rovnakých podmienok. Výsledky indikujú, že týmto spôsobom pripravené vzorky sa môžu
použiť ako referenčné vzorky za účelom kontroly prístrojov typovej rady Fossomatic. Takéto
vzorky môžu slúžiť na kalibrovanie prístrojov Fossomatic a na kontrolu kvality práce
laboratória. Hodnoty opakovateľnosti a reprodukovateľnosti zistené pri analyzovaní
pripravených referenčných vzoriek autori zhrnuli do tabuľky (Tabuľka 12).
Hodnoty opakovateľnosti a reprodukovateľnosti zistené pri analyzovaní šiestich
rozdielnych referenčných vzoriek konzervovaných kombináciou tepelného ošetrenia
a konzervovaním 0,1 % dichromanom draselným
Tabuľka 12 Reprodukovateľnosť
(stredná hodnota, v zátvorke je uvedená najnižšia
a najvyššia dosiahnutá hodnota)
Referenčná
vzorka
Opakovateľnosť
(stredná hodnota,
v zátvorke je uvedená
najnižšia a najvyššia
dosiahnutá hodnota)
Medziprístrojová Medilaboratórna Celková
Vzorka
s vysokým
počtom SB
60 000
(49 000 - 67 000)
89 000
(66 000 -105 000)
112 000
(83 000 -151 000)
123 000
(83 000 -151 000)
Vzorka
s nízkym
počtom SB
25 000
(22 000 - 32 000)
32 000
(26 000 - 37 000)
36 000
(28 000 - 45 000)
36 000
(29 000 - 46 000)
Poznámka: hodnoty sú uvedené v jednotkách (SB . ml-1)
(Vermunt et al., 1995)
V rámci experimentu zisťovali vplyv viacerých faktorov, ktoré by mohli ovplyvniť
množstvo somatických buniek vo vzorke.
Čerstvosť mlieka môže byť veľmi dôležitá pre kvalitu pripravenej referenčnej vzorky.
Čerstvé vzorky vykazovali nižší počet životaschopných mikroorganizmov ako staršie vzorky
pripravené po 24 až 36 hodinách od odberu mlieka. Zvýšený počet mikroorganizmov môže
viesť v nízky ale významný 6 % pokles počtu somatických buniek. Výber vhodnej
konzervačnej metódy je taktiež veľmi dôležitý. Metóda konzervácie ovplyvnila stabilitu
84
referenčných vzoriek. Konzervácia s dichromanom draselným, bola zahrnutá do experimentu
preto, že tento spôsob konzervácie sa v praxi využíva veľmi často. Metóda konzervovania
pomocou bronopolu bola vybraná preto, že bronopol je alternatívou voči dichromanu
draselnému. Konzervácia 0,1 % bronopolom bola testovaná preto, že v predbežných
experimentoch sa koncentrácia 0,03 % javila ako príliš nízka, nedokázala by vzorku
stabilizovať natoľko, aby nedochádzalo k poklesu počtu somatických buniek. Výsledky
naznačili, že konzervácia 0,1 % bronopolom stále vedie k väčšiemu poklesu počtu
somatických buniek než konzervácia 0,1 % roztokom dichromanu draselného.
Tepelné ošetrenie ovplyvňuje kvalitu referenčných vzoriek. Pri tepelnom ošetrení
dochádza k väčšej inaktivácii baktérií a enzýmov. Po 20 dňoch bol celkový počet
životaschopných buniek v piatich vzorkách konzervovaných kombináciou tepelného ošetrenia
a chemického ošetrenia v priemere 340 násobne nižší v porovnaní s neošetrenou vzorkou po
jednom dni, zatiaľ čo pri konzervácii iba s dichromanom draselným bol vykázaný
50 násobný pokles.
Uskladnenie vzoriek pri teplote od 0 °C do 2 °C je veľmi dôležité pre predchádzanie
poklesu počtu somatických buniek vo vzorke.
Autori v závere konštatujú, že bude potrebné vyskúšať ďalšie kombinácie konzervácie
pri príprave referenčných vzoriek.
85
2 CIEĽ PRÁCE
2.1 Cieľ experimentu 1 - stanovenie počtu somatických buniek v surovom kravskom
mlieku referenčnou metódou.
Zaviesť do praxe referenčnú metódu stanovenia počtu somatických buniek.
Porovnať metódu uvedenú v norme STN EN ISO 13366-1 (2001) s modifikovanou
metódou popísanou Vermuntom et al. (1995). Modifikácia tejto metódy vykonaná v NRLM
je popísaná v kapitole metodika.
Vypočítať neistoty merania pre obi dve metódy.
2.1.1 Očakávané výsledky
Očakávame, že výsledky stanovené metódou popísanou Vermuntom et al., (1995)
budú porovnateľné s výsledkami stanovenými podľa STN EN ISO 13366-1 (2001).
Predpokladáme, že aspoň jedna z uvedených metód bude natoľko presná, že ju
budeme môcť považovať za referenčnú a bude sa môcť používať na stanovenie počtu
somatických buniek za účelom prípravy sekundárnych referenčných materiálov. Halaj (2003)
udáva, že sekundárny referenčný materiál je materiál, ktorého hodnota bola určená
porovnaním s primárnym etalónom danej veličiny. V praxi sa používa ako alternatíva
finančne nákladných a nie všetkým dostupných primárnych referenčných materiálov.
2.2 Cieľ experimentu 2 - príprava sekundárnych referenčných materiálov
Preskúmať možnosť výroby sekundárnych referenčných materiálov (referenčných
vzoriek) s nízkym a vysokým počtom somatických buniek podľa postupu uvedeného v práci
Vermunta et al. (1995), určených pre dennú kontrolu automatických prístrojov na stanovenie
počtu somatických buniek vo vzorkách mlieka (prístroje typu Fossomatic).
1. Pripraviť a testovať kvalitu referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek
v NRLM.
2. Pripraviť a testovať kvalitu referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek
v NRLM.
86
3. Pripraviť referenčné vzorky s nízkym a vysokým počtom somatických buniek a testovať
ich kvalitu v reálnych laboratórnych podmienkach, porovnať výsledky stanovené v troch
laboratóriách.
2.2.1 Očakávané výsledky
Očakávame, že nami zistené výsledky budú korešpondovať s výsledkami stanovenými
v práci Vermunta et al. (1995) a pripravené referenčné vzorky sa budú môcť používať na
dennú kontrolu automatických prístrojov stanovujúcich počet somatických buniek vo
vzorkách mlieka.
2.3 Cieľ experimentu 3 - porovnanie výsledkov mikroskopických metód
Porovnať výsledky stanovené nasledovnými metódami:
A
STN EN ISO 13366-1 (2001) Mlieko - stanovenie počtu somatických buniek, Časť 1:
Mikroskopická metóda (referenčná metóda) – farbenie etídium bromidom - výsledky
NRLM.
B
ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005) Mlieko – stanovenie počtu somatických buniek – Časť
1: Mikroskopická metóda (referenčná metóda) – (modifikovaná) farbenie etídium
bromidom pri teplote 100 °C – výsledky NRLM.
C
ISO 13366-3 (1997) Mlieko, Stanovenie počtu somatických buniek, Časť 3: Fluorescenčná
optická elektronická metóda – prístroj Fossomatic (prevádzková metóda) – výsledky A.I.A.-
L.S.L. Rím.
D
ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005) Mlieko – stanovenie počtu somatických buniek – Časť
1: Mikroskopická metóda (referenčná metóda) – farbenie etídium bromidom pri teplote
50 °C – výsledky NRLM.
87
E
ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005) Mlieko – stanovenie počtu somatických buniek – Časť
1: Mikroskopická metóda (referenčná metóda) – farbenie metylénovou modrou – výsledky
kolaboratívnej štúdie.
F
ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005) Mlieko – stanovenie počtu somatických buniek – Časť
1: Mikroskopická metóda (referenčná metóda) – farbenie etídium bromidom – výsledky
kolaboratívnej štúdie.
V norme ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005) je rozpracovaný návrh novej
referenčnej metódy pre stanovenie počtu somatických buniek. Pracovný postup uvedený
v navrhovanej norme je prakticky totožný s pracovným postupom v doteraz platnej norme
STN EN ISO 13366-1 (2001), norma je však doplnená o pracovný postup farbenia etídium
bromidom, o prípravu farbiacich roztokov pre kozie mlieko, norma detailnejšie popisuje
postup počítania somatických buniek, jednotlivé typy somatických buniek a obsahuje nový
spôsob výpočtu.
Metódy A, B a C korešpondujú s metódami z experimentu 1. Výpočet však bol
vykonaný podľa navrhovanej normy ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005). Taktiež bola
vykonaná úprava v bode 9.1 normy ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005), pri farbení sa
použil pracovný farbiaci roztok pripravený podľa bodu 5.1.2.3 ale zriedený v pomere 1 : 9
s deionizovanou destilovanou vodou. Zriedenie pracovného farbiaceho roztoku neovplyvňuje
výsledky analýzy a umožňuje pohodlnejšie mikroskopovanie vzorky pretože vo vzorke nie je
nadbytok fluoreskujúceho farbiva. Tieto empirické skúsenosti boli získané v experimente 1.
Experiment 3 bolo možné uskutočniť vďaka ISO/IDF kolaboratívnej štúdie zameranej
na stanovenie počtu somatických buniek v kravskom mlieku navrhovanou referenčnou
metódou ISO 13366-1 / IDF 148-1 (2005), ktorú organizovala Silvia Orlandini, AIA –
Laboratorio Standard Latte Via dell`Industria 24, 000 57 Maccarese, Rím, Taliansko.
Experiment sa uskutočnil na vzorkách, ktoré boli súčasťou vyššie uvedenej
kolaboratívnej štúdie.
Cieľom kolaboratívnej štúdie bolo stanoviť hodnoty opakovateľnosti
a reprodukovateľnosti pre navrhovanú normu ISO 13366-1 / IDF 148 -1 (2005).
88
2.3.1 Očakávané výsledky
Očakávame, že výsledky stanovené metódami A, B, C a E budú približne na rovnakej
hladine, výsledky stanovené metódou D a F budú značne nižšie v porovnaní s ostatnými
výsledkami.
89
3 MATERIÁL A METODIKA
3.1 Experiment 1 – stanovenie počtu somatických buniek v surovom kravskom mlieku
referenčnou metódou
3.1.1 Materiál
Na skúšanie sa použili iba vzorky surového kravského mlieka. Odber vzoriek sa
realizoval podľa STN EN ISO 707 (2001). Odber vzoriek vykonával zootechnik a doktorand.
Vzorky mlieka pochádzali od dojníc zdravých, mastitídnych a odobraté boli aj bazénové
vzorky surového kravského mlieka. Výberom vhodných dojníc sme sa snažili zabezpečiť
vzorky s rozdielnymi hladinami somatických buniek (od 50 000 somatických buniek . ml-1 po
1 400 000 somatických buniek . ml-1) tak, aby väčšina vzoriek obsahovala počet somatických
buniek od 200 000 do 500 000 . ml-1, teda v intervale dôležitom z hľadiska trhového
preplácania mlieka. Všetky vzorky boli po odbere okamžite schladené na teplotu pod 6 °C.
Prevoz vzoriek sa realizoval v izotermických nádobách. Vzorky boli v laboratóriu uskladnené
v chladničke pri teplote od 2 °C do 6 °C a boli spracované do 24 hodín od ich odberu.
3.1.2 Lokalita
Vzorky surového kravského mlieka pochádzali prevažne z vybraného chovu RD
Rumanová. Okrem vzoriek z RD Rumanová boli analyzované aj vzorky pochádzajúce
z oficiálnych odberov vykonaných veterinárnymi inšpektormi. V týchto vzorkách sa prvotne
vykonali analýzy požadované veterinárnymi inšpektormi alebo vlastníkmi a následne bola
vykonaná analýza stanovenia počtu somatických buniek.
3.1.3 Časový harmonogram a rozsah experimentu
Experiment prebiehal počas rokov 2004 a 2005. Celkovo bolo vyšetrených 120
vzoriek surového kravského mlieka a mikroskopicky zhodnotených 524 preparátov. V každej
analyzovanej vzorke bol stanovený počet somatických buniek tromi metódami A, B a C.
Tieto metódy sú popísané nižšie.
Pri mikroskopických metódach A a B sa vykonávali paralelné stanovenia. Pri
inštrumentálnej metóde C (automatické stanovenie pomocou prístroja Fossomatic 5000) sa
v každej vzorke stanovil počet somatických buniek minimálne 6-krát. Priemerná hodnota
90
počtu somatických buniek zistená prístrojom Fossomatic 5000 slúžila ako orientačná
a kontrolná hodnota.
3.1.4 Použité metódy
Metóda A
STN EN ISO 13366-1 (2001) Mlieko, Stanovenie počtu somatických buniek časť 1:
Mikroskopická metóda
Metóda B
Metóda publikovaná Vermuntom et al. (1995), modifikovaná na základe našich
pozorovaní a empirických skúseností. Pri pracovnom kroku farbenia somatických buniek bola
zmenená teplota 50 °C teplotou 100 °C, nasledovalo pridanie farbiaceho roztoku, farbenie
počas 1 minúty za stáleho miešania a vychladenie laboratórnej vzorky na teplotu 20 °C.
Metóda C
STN EN ISO 13366-3 (2001) Mlieko, Stanovenie počtu somatických buniek, časť 3:
Fluorescenčná optická elektronická metóda. Stanovenie počtu somatických buniek prístrojom
Fossomatic 5000.
3.1.4.1 Prístroje, pomôcky, chemikálie a príprava roztokov pre metódy A a B, príprava
podložných sklíčok
Upozornenie
Etídium bromid je silný mutagén, pravdepodobný karcinogén a teratogén.
Pri práci sa musí používať laboratórny plášť, okuliare (štít) a ochranné rukavice.
V prípade, že sa pri práci s etídium bromidom používa ultrafialové svetlo, musia sa
dodržiavať ďalšie ochranné opatrenia.
Pri práci s práškovou formou etídium bromidu sa používa ochranné rúško.
Každý pracovník musí byť zaškolený pre prácu s etídium bromidom.
91
Prístroje a pomôcky
Fluorescenčný mikroskop Olympus BX51
Mikropipeta o objeme 10 µl (resp. mikrodávkovač) s max. odchýlkou ± 2 %
Automatická pipeta o objeme 1 ml
Skúmavky o objeme 10 ml
Stojan na skúmavky
Fľaša so zabrúseným hrdlom z tmavého skla
Fľaša so zabrúseným hrdlom
Odmerná banka 100 ml
Vodný kúpeľ s teplotou udržiavanou na 65 °C ± 5 °C
Vodný kúpeľ s teplotou udržiavanou na 50 °C ± 5 °C
Vodný kúpeľ s teplotou udržiavanou na 40 °C ± 5 °C
Filter s veľkosťou pórov od 10 µm do 12 µm alebo menšou, odolný proti používaným
rozpúšťadlám
Podložné sklíčka s vyznačeným obrysom s rozmermi 20 mm x 5 mm
Ohrievacia doska s teplotou udržiavanou na 30 °C až 40 °C
Papierová vata
Ochranné pracovné pomôcky
Digestor
Chladnička
Vpichový teplomer s presnosťou (± 0,5 °C)
Kalibrovaný teplomer s teplotným rozsahom do 100 °C s presnosťou (± 0,5 °C)
Roztoky pripravené podľa postupov uvedených v sekcii príprava roztokov.
Chemikálie
Všetky chemikálie musia byť analytickej kvality alebo lepšej.
Etanol 95 %
Tetrachlóretán
Ľadová kyselina octová
Metylénová modrá
92
Etídium bromid (Sigma) tabletová forma
Deionizovaná voda
Hydrogén ftalát draselný
Hydroxid draselný
Triton-X-100
Imerzný olej
Technický benzín
Éter
Príprava roztokov
Metodika A
Farbiaci roztok:
Etanol 95 % 54 ml
Tetrachlóretán 40 ml
Etídium bromid (metylénová modrá) 0,6 g
Ľadová kyselina octová 6,0 ml
Príprava farbiaceho roztoku:
Etanol a tetrachlóretán sa zmiešajú vo fľaši a zahrejú vo vodnom kúpeli na teplotu
65 °C. Potom sa pridá etídium bromid (namiesto etídium bromidu sa môže použiť metylénová
modrá) a dôkladne sa premieša. Ochladí sa v chladničke na 4 °C. Pridá sa ľadová kyselina
octová. Roztok sa prefiltruje a uchováva sa v tesne uzavretej fľaši z tmavého skla, pri teplote
0 až 5 °C po dobu maximálne 3 mesiacov. Ak je to potrebné, pred použitím sa znova
prefiltruje.
Metylénová modrá nie je tak citlivá ako etídium bromid, ale na druhej strane je menej
toxická a nepreniká (nevkladá sa) medzi reťazce nukleových kyselín. (WIKIPEDIA – THE
FREE ENCYCLOPEDIA2, 2006)
93
Metodika B
Farbiaci roztok:
Etídium bromid 2,5 g
Deionizovaná voda 1000 ml
Príprava farbiaceho roztoku:
Etídium bromid sa rozpustí v 1000 ml deionizovanej vody. Dôkladne sa mieša až do
úplného rozpustenia etídium bromidu. Proces sa môže urýchliť zahriatím na teplotu od 40 °C
do 60 °C. Po rozpustení etídium bromidu sa roztok prefiltruje. Takto pripravený roztok sa
môže skladovať v tme počas 6 mesiacov pri teplote 0 až 5 °C.
Tlmivý roztok:
Hydrogén ftalát draselný 5,1 g
KOH 1,4 g
Deionizovaná voda 1000 ml
Príprava tlmivého roztoku:
Hydrogén ftalát draselný sa rozpustí v 1000 ml deionizovanej vody. Po rozpustení sa
pridá KOH. Opatrne sa mieša až do úplného rozpustenia KOH. Takto pripravený roztok sa
neskladuje, vždy sa pripravuje čerstvý.
Štandardný roztok:
Farbiaci roztok 200 ml
Tlmivý roztok 800 ml
Triton X-100 10 ml
Príprava štandardného roztoku:
94
Zmieša sa tlmivý roztok s farbiacim. Pridá sa Triton X-100 a mieša sa až do úplného
rozpustenia Tritonu X-100. Takto pripravený roztok sa môže skladovať v tme vo
vzduchotesnej nádobe pri teplote 0 až 5 °C max. 6 mesiacov.
Pracovný roztok:
Štandardný roztok 10 ml
Deionizovaná voda 90 ml
Príprava pracovného roztoku:
Roztok sa pripraví zmiešaním štandardného roztoku s deionizovanou vodou. Takto
pripravený roztok sa môže skladovať v tme pri teplote 0 až 5 °C maximálne 1 týždeň.
Roztok na čistenie mikroskopu
Etanol 7 dielov
Éter 3 diely
Príprava čistiaceho roztoku:
Etanol a éter sa odmerajú pomocou odmerného valca a zmiešajú sa. Pracuje sa
v digestore. Pripravený čistiaci roztok sa uchováva v zásobnej fľaši.
Príprava podložných sklíčok
Podložné sklíčka sa musia pred prípravou preparátu dôkladne vyčistiť pomocou
papierovej vaty a alkoholu.
Odmastenie sklíčok sa vykonáva ponorením sklíčka do alkoholu a vypálením (sklíčko
sa vystaví plameňu iba za účelom splanutia alkoholu - nevystavuje sa plameňu dlhšie ako 1
sekundu z dôvodu jeho poškodenia).
V prípade čistenia použitých podložných sklíčok sa z nich najskôr odstráni pod
prúdom teplej vody a pomocou čistiaceho prostriedku zaschnutá vrstva preparátu a imerzný
95
olej. Následne sa podložné sklíčka osušia papierovou vatou a potom sa odmastia podľa vyššie
popísaného postupu pomocou alkoholu.
3.1.4.2 Metóda A
Podstata metódy
Vzorka mlieka sa nanesie na podložné sklíčko tak, aby vznikol tenký film. Film sa
vysuší, zafarbí a nasleduje mikroskopické počítanie (fluoreskujúcich) jadier somatických
buniek na definovanej ploche.
Výsledný počet somatických buniek v 1 ml vzorky sa získa vynásobením spočítaných
jadier somatických buniek s pracovným faktorom mikroskopu.
Príprava vzoriek
Čerstvá vzorka mlieka sa dôkladne ale jemne premieša prevrátením 25 krát, (vzorky
s vystúpeným tukom by sa mali zahriať na teplotu 40 °C ± 2 °C a premiešať, tak aby došlo
k rovnomernému rozptýleniu tuku. Zo vzorky sa odpipetuje 1 ml do skúmavky tak, že špička
pipety sa ponorí do stredu vzorkovnice a 3 krát sa prepláchne vzorkou. Štvrté nasatie sa
prenesie do skúmavky tak, že vonkajšia časť špičky, ktorá prišla do styku so vzorkou sa
opatrne utrie papierovou vatou a vzorka sa pomaly vypustí na dno skúmavky. Vzorka mlieka
v skúmavke sa zahreje vo vodnom kúpeli na teplotu 40 °C ± 2 °C. Teplota sa kontroluje
vpichovým teplomerom ponoreným do ekvivalentného množstva vzorky v druhej skúmavke.
Potom sa vzorka dôkladne a jemne premieša a ochladí sa prúdom studenej vody alebo
v chladničke na teplotu 20 °C (pri tejto teplote je kalibrovaná mikropipeta resp.
mikrodávkovač). Teplota sa kontroluje vpichovým teplomerom ponoreným
do ekvivalentného množstva vzorky v druhej skúmavke.
Pracovný postup
Z pripravenej vzorky sa zo skúmavky odoberie 0,01 ml pomocou mikropipety
(mikrodávkovača). Špička mikropipety sa ponorí pod hladinu. Pozor sa musí dávať na penu,
špička musí byť ponorená v mlieku. Špička sa tri-krát premyje vzorkou a štvrté nasatie sa
prenesie na podložné sklíčko. Vonkajší okraj špičky mikropipety, ktorý prišiel do styku so
96
vzorkou sa pred vypustením vzorky na podložné sklíčko opatrne očistí papierovou vatou.
Na čistom podložnom sklíčku sa najskôr obtiahne vyznačený obrys (20 mm x 5 mm) malým
množstvom skúšanej vzorky z mikropipety. Potom sa vyznačená plocha čo najrovnomernejšie
vyplní zvyšným množstvom skúšanej vzorky z mikropipety. Náter sa suší do úplného
vysušenia na vzduchu počas 12 hodín. Sušenie sa môže vykonať aj na vodorovnej ohrievacej
doske pri teplote 30 °C až 40 °C, pri tomto spôsobe sušenia však môže dôjsť k poškodeniu
preparátu potrhaním sa naneseného filmu vzorky).
Podložné sklíčko s vysušeným náterom sa na 10 minút ponorí do farbiaceho roztoku.
Pracuje sa v digestore za použitia ochranných pracovných pomôcok. Po zafarbení sa náter
vystaví prúdu vlažnej vody, kým sa nevymyje prebytočné farbivo. Podložné sklíčko sa
opatrne zbaví prebytočnej vody osušením papierovou vatou. Papierová vate nesmie prísť do
styku s nanesenou vzorkou aby nedošlo k poškodeniu preparátu. Náter sa znovu suší až do
úplného vysušenia na vzduchu alebo na vodorovnej ohrievacej doske pri teplote 30 °C až
40 °C a po vysušení sa uchováva chránený pred prachom až do mikroskopovania.
Mikroskopuje sa:
- fluorescenčným svetlom o vlnovej dĺžke 450 nm (modré svetlo) pri použití farbiaceho
roztoku s etídium bromidom, kedy sa počítajú fluoreskujúce bunkové jadrá.
Poznámka: mikroskopovanie bez fluorescenčného svetla sa vykonáva pri použití farbiaceho
roztoku s metylénovou modrou, kedy sa počítajú zreteľne na modro sfarbené bunkové jadrá.
Farbenie metylénovou modrou však nebolo predmetom tohto experimentu.
V oboch prípadoch sa pri pozorovaní použije 500 až 1000-násobné zväčšenie (objektív so
zväčšením 60 x) a imerzný olej.
V preparáte sa musí napočítať najmenej 400 bunkových jadier.
Poznámka: v prípade vzoriek s veľmi nízkym počtom somatických buniek
(do 100 000 . ml-1) nie je možné napočítať 400 somatických buniek. Z tohto dôvodu je
postačujúce ak sa spočítajú somatické bunky v minimálne 12 pruhoch. Pruhy sa musia zrátať
kompletne. V prípade vzoriek s veľmi vysokým počtom somatických buniek (800 000 . ml-1
97
a viac) by počítanie do 400 somatických buniek nemuselo stačiť na stanovenie presnej
hodnoty počtu somatických buniek (400 somatických buniek by sa nachádzalo v 2 až 3
pruhoch). V takomto prípade sa odporúča kompletne zrátať minimálne 7 pruhov.
Bunkové jadrá musia byť zreteľne rozoznateľné a v mikroskopickom poli musí byť
z jadra viditeľná najmenej polovica. Dĺžka každého z pruhov, v ktorom sa má počítať je
5 mm. Šírka zodpovedá priemeru zorného poľa mikroskopu. Šírka zorného poľa mikroskopu
sa určí pomocou objektívového mikrometra. Ak je objem skúšanej vzorky 0,01 ml, tak potom
sa pracovný faktor mikroskopu (wf) určí podľa nasledovnej rovnice:
wf = (20 x 100) / (d x b)
Kde: d – je číselná hodnota priemeru zorného poľa mikroskopu v milimetroch (0,36 mm pri
objektíve 60 x)
b – je počet kompletne zrátaných pruhov použitých na počítanie somatických buniek.
Vypočítané faktory sú uvedené v Prílohe 10, v Tabuľke 1.
Výpočet
Celkový počet somatických buniek v ml sa vypočíta vynásobením počtu spočítaných
somatických buniek pracovným faktorom mikroskopu wf.
Vypočítané pracovné faktory mikroskopu sú uvedené v Prílohe10, v Tabuľke 1.
3.1.4.3 Metóda B
Podstata metódy
Vzorka mlieka sa zmieša s farbiacim roztokom a nanesie sa na podložné sklíčko tak,
aby vznikol tenký film. Film sa vysuší a nasleduje mikroskopické počítanie fluoreskujúcich
jadier somatických buniek na definovanej ploche.
Výsledný počet somatických buniek v 1 ml vzorky sa získa vynásobením spočítaných
jadier somatických buniek s pracovným faktorom mikroskopu.
98
Príprava vzoriek
Čerstvá vzorka mlieka sa dôkladne ale jemne premieša prevrátením 25 krát, (vzorky
s vystúpeným tukom by sa mali zahriať na teplotu 40 °C ± 2 °C a premiešať, tak aby došlo
k rovnomernému rozptýleniu tuku. Zo vzorky sa odpipetuje 1 ml do skúmavky tak, že špička
pipety sa ponorí do stredu vzorkovnice a 3 krát sa prepláchne vzorkou. Štvrté nasatie sa
prenesie do skúmavky. Štvrté nasatie sa prenesie do skúmavky tak, že vonkajšia časť špičky,
ktorá prišla do styku so vzorkou sa opatrne utrie papierovou vatou a vzorka sa pomaly vypustí
na dno skúmavky. Vzorka mlieka v skúmavke sa zahreje vo vodnom kúpeli na teplotu
50 °C ± 2 °C a udržuje sa pri tejto teplote počas 5 minút. Teplota sa kontroluje vpichovým
teplomerom ponoreným do ekvivalentného množstva vzorky v druhej skúmavke. Potom sa
vzorka dôkladne a jemne premieša a ochladí sa prúdom studenej vody alebo v chladničke na
teplotu 20 °C (pri tejto teplote je kalibrovaná mikropipeta resp. mikrodávkovač). Teplota sa
kontroluje vpichovým teplomerom ponoreným do ekvivalentného množstva vzorky v druhej
skúmavke.
Pracovný postup
Skúmavka so vzorkou sa opatrne zohrieva nad plameňom na teplotu 100 °C.
V okamihu varu sa skúmavka ihneď odstaví od plameňa (nesmie dôjsť k vykypeniu vzorky).
Do vzorky sa okamžite napipetuje 1 ml farbiaceho roztoku tak, že vonkajšia časť špičky,
ktorá prišla do styku s farbiacim roztokom sa opatrne utrie papierovou vatou a vzorka sa
vypustí do skúmavky. Vzorka sa mieša počas 1 min. Následne sa vzorka ochladí prúdom
studenej vody alebo v chladničke na teplotu 20 °C (pri tejto teplote je kalibrovaná
mikropipeta resp. mikrodávkovač). Teplota sa kontroluje vpichovým teplomerom ponoreným
do ekvivalentného množstva vzorky v druhej skúmavke.
Z takto pripravenej vzorky sa odoberie 0,01 ml pomocou mikropipety.
Špička mikropipety sa ponorí pod hladinu. Pozor sa musí dávať na penu, špička musí byť
ponorená v mlieku. Špička sa tri-krát premyje vzorkou a štvrté nasatie sa prenesie na
podložné sklíčko. Vonkajšia strana špičky mikropipety, ktorá prišla do styku so vzorkou sa
pred vypustením vzorky na podložné sklíčko opatrne očistí papierovou vatou. Na čistom
podložnom sklíčku sa najskôr obtiahne vyznačený obrys (20 mm x 5 mm) malým množstvom
skúšanej vzorky z mikropipety. Potom sa vyznačená plocha čo najrovnomernejšie vyplní
zvyšným množstvom skúšanej vzorky z mikropipety. Náter sa suší do úplného vysušenia na
99
vzduchu počas 12 hodín. Sušenie sa môže vykonať aj na vodorovnej ohrievacej doske pri
teplote 30 °C až 40 °C, pri tomto spôsobe sušenia však môže dôjsť k poškodeniu preparátu
potrhaním sa naneseného filmu vzorky).
Mikroskopuje sa fluorescenčným mikroskopom s 500 až 1000 násobným zväčšením
pri vlnovej dĺžke fluorescenčného svetla 450 nm (modré svetlo). Pri mikroskopovaní sa
použije objektív (60 x) a imerzný olej. Počítajú sa fluoreskujúce bunkové jadrá.
Musí sa napočítať najmenej 400 bunkových jadier.
Poznámka: v prípade vzoriek s veľmi nízkym počtom somatických buniek
(do 100 000 . ml-1) nie je možné napočítať 400 somatických buniek. Z tohto dôvodu je
postačujúce ak sa spočítajú somatické bunky v minimálne 12 pruhoch. Pruhy sa musia zrátať
kompletne.
Bunkové jadrá musia byť zreteľne rozoznateľné a v mikroskopickom poli musí byť
z jadra viditeľná najmenej polovica. Dĺžka každého z pruhov, v ktorom sa má počítať je
5 mm. Šírka zodpovedá priemeru zorného poľa mikroskopu. Šírka zorného pola mikroskopu
sa určí pomocou objektívového mikrometra. Ak je objem skúšanej vzorky 0,01 ml, tak potom
sa pracovný faktor mikroskopu (wf) určí podľa nasledovnej rovnice:
wf = (20 x 100) / (d x b)
Kde: d – je číselná hodnota priemeru zorného poľa mikroskopu v milimetroch (0,36
mm pri objektíve 60 x)
b – je počet kompletne zrátaných pruhov použitých na počítanie somatických buniek.
Vypočítané faktory sú uvedené v Prílohe 11, v Tabuľke 1.
Výpočet
Celkový počet somatických buniek v mililitri sa vypočíta vynásobením počtu
spočítaných somatických buniek pracovným faktorom mikroskopu wf.
Vypočítané pracovné faktory mikroskopu sú uvedené v Prílohe 11, v Tabuľke 1.
100
3.1.4.4 Metóda C
Podstata metódy
Vzorka sa v prístroji Fossomatic 5000 farbí farbiacim roztokom, ktorý zafarbí DNA
somatických buniek. Somatické bunky sa v prietokovej bunke zoraďujú za sebou. Pri
prechode somatickej bunky cez prietokovú štrbinu, je somatická bunka pod čítacím
zariadením vystavená modrému svetlu, čo spôsobí emitáciu červeného svetla.
Emitované svetelné impulzy sa zachytávajú a rátajú. Zrátaný počet svetelných impulzov sa
vynásobí pracovným faktorom prístroja. Výsledok sa udáva ako počet somatických buniek
v 1 ml.
Príprava vzoriek
Vzorka mlieka sa umiestni do vodného kúpeľa o teplote 40 °C ± 2 °C a temperuje sa
po dobu 10 min. Dôkladne a jemne sa premieša prevrátením (25 krát).
Pracovný postup
Vzorkovnica sa so vzorkou umiestni pod nasávaciu pipetu prístroja Fossomatic 5000.
Po vykonaní nastavení v software prístroja sa pristúpi k analýze vzorky. Po spustení programu
prístroj automaticky zmeria počet somatických buniek vo vzorke. Výstupné dáta sa zobrazia
na monitore prístroja. Celý proces merania na prístroji Fossomatic 5000 sa uskutočňuje podľa
interného pracovného postupu č. PP4 Národného referenčného laboratória ŠVPÚ Nitra, ktorý
bol zostavený na základe normy STN EN ISO 13366-3 (2001).
Výpočet
Prístroj automaticky počíta svetelné impulzy zafarbených somatických buniek
a prevádza ich na počet somatických buniek v 1 ml vzorky.
Počet SB v 1 ml vzorky prístroj Fossomatic 5000 vypočíta automaticky podľa
zadefinovaného vzorca x = a . kx
101
kde: a - je počet impulzov indikovaných prístrojom
kx - konštantný pracovný koeficient prístroja
3.1.5 Štatistické vyhodnotenie experimentu 1 - stanovenie počtu somatických buniek
v surovom kravskom mlieku referenčnou metódou
Na vyhodnotenie získaných výsledkov (Tabuľka 17) sa použila dvojfaktorová analýza
rozptylu (ANOVA) bez interakcií. Na mnohonásobné porovnanie metód sa použil Tukeyov
test a Sheffeho test. Pre vzájomné porovnanie metód boli vypočítané korelačné koeficienty
(Príloha 17, Tabuľka 1). Výpočet sa uskutočnil v profesionálnom štatistickom programe
STATISTICA CZ.
3.1.5.1 Výpočet neistôt merania metódy A a B
Výpočet neistôt meraní metód sa uskutočnil podľa odbornej literatúry (Kazda, 2006;
Ľalík, 2006; Rimarčík, 2006; Urban 2006; Koller, 2002; Halaj, 2004; Eurachem, 2000;
SNAS, 1997). Zo zistených údajov sa vypočítala štandardná odchýlka, variačný koeficient,
neistota typu A, neistota typu B, kombinovaná štandardná neistota typu C a rozšírená neistota
merania. Pracovný postup výpočtu neistôt merania je uvedený v Tabuľke 13.
Výpočet neistoty typu A pre metódu A je uvedený v Tabuľke 22 a Tabuľke 23. Výpočet
neistoty typu A pre metódu B je uvedený v Tabuľke 24 a Tabuľke 25.
102
Postup pre výpočet neistôt merania Tabuľka 13
p.č Operácia Rovnica Číslo rovnice
Citácia
1. stanovenie počtu meraní i = 1 až n 2. stanovenie aritmetických priemerov xi = 1, 2, ... n 3. stanovenie výberového priemeru
nxxxxx n321
s+++
= (II.1)
Urban (2006), SNAS (1997)
4. stanovenie odchýlok aritmetických priemerov jednotlivých meraní od výberového priemeru
∆ xi = xi - xs (II. 2)
5. stanovenie druhej mocniny odchýlok ∆ xi2 = (xi - xs)2 (II. 3)
6. stanovenie súčtu druhých mocnín odchýlok ∑∑
=
−=n
1i
2si
2)x(xi∆x
(II. 4)
7. Výpočet štandardnej odchýlky rovnicu (II. 4) podeliť výrazom (n-1) a vypočítať druhú odmocninu celého výrazu
∑=
−−
=n
1i
2sid )x(x
1)(n1S
(II. 5)
Urban (2006), SNAS (1997), Koller (2002)
Výpočet štandardnej neistoty typu A vynásobiť korelačným koeficientom kA v závislosti od počtu meraní Hodnoty korelačného koeficientu
uA = kA.Sd Urban (2006)
n 2 3 4 5 6 7 8 9 10
8.
kA 7 2,3 1,7 1,4 1,3 1,3 1,2 1,2 1
Ľalík (2006)
9. Výpočet variačného koeficientu Cv (%) Cv = .100
(II.1)Sd
Rimarčík (2006)
10 Výpočet čiastkových neistôt typu B Predpokladáme rovnomerné rozdelenie pravdepodobnosti, t.j. κ = √3, ∆i = variačný koeficient zistený pri kalibrácii pipety a pod.
3∆iu Bi =
Eurachem (2000), Kazda (2006), Halaj (2004)
11. Výpočet štandardnej neistoty typu B Štandardná neistota typu B má zložkový charakter. uBi sú štandardné neistoty typu B pochádzajúce od jednotlivých zdrojov.
∑=
=n
1i
2BiB uu
Kazda (2006)
12. Výpočet kombinovanej štandardnej neistoty typu C
2B
2AC uuu += Koller
(2002) 13. Výpočet rozšírenej neistoty U
kde k je faktor pokrytia, pričom k = 2 čo zodpovedá konfidenčnej pravdepodobnosti približne 95 %.
U = k . uC Koller (2002), Halaj (2004)
103
3.2 Experiment 2 – príprava sekundárnych referenčných materiálov
3.2.1 Materiál
Na výrobu referenčných vzoriek sa použilo iba surové kravské mlieko. Odber mlieka
sa realizoval podľa STN EN ISO 707 (2001). Odber mlieka vykonával zootechnik
a doktorand. Mlieko pochádzalo z bazénu a od mastitídnych dojníc. Mlieko bolo okamžite po
odbere schladené na teplotu 6 °C. Prevoz mlieka sa realizoval v izotermických nádobách.
Mlieko bolo v laboratóriu uskladnené v chladničke pri teplote od 2 °C do 6 °C a bolo
spracované do 12 hodín od odberu.
3.2.2 Lokalita
Mlieko použité na výrobu referenčných materiálov pochádzalo z vybraného chovu RD
Rumanová.
3.2.3 Časový harmonogram a rozsah experimentu
Experiment prebiehal počas obdobia rokov 2004 a 2005. Pripravené boli 4 referenčné
vzorky. V prvej fáze experimentu boli pripravené dve referenčné vzorky, boli skúšané
v Národnom referenčnom laboratóriu pre mlieko a mliečne výrobky v Nitre. V druhej fáze
experimentu boli pripravené dve referenčné vzorky, ktoré boli skúšané v Národnom
referenčnom laboratóriu pre mlieko a mliečne výrobky v Nitre a v dvoch ďalších
akreditovaných skúšobných laboratóriách.
Experiment bol rozdelený nasledovne:
1. Príprava a skúšanie kvality referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických
buniek.
2. Príprava a skúšanie kvality referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických
buniek.
3. Príprava referenčných vzoriek s nízkym a vysokým počtom somatických
buniek, skúšanie kvality pripravených referenčných vzoriek v reálnych laboratórnych
podmienkach, porovnanie výsledkov stanovených v troch laboratóriách.
104
3.2.4 Prístroje, pomôcky a chemikálie
Prenosná chladiaca taška
Elektrická sušiareň
Uzatvárateľné zásobné fľaše o objeme 1 liter
Vzorkovnice o objeme 300 ml
Erlenmayerova banka o objeme 1 liter
Vodný kúpeľ 70 ± 2 °C
Kalibrovaný teplomer s teplotným rozsahom do 100 °C s presnosťou ± 0,5 °C
Prístroj Fossomatic 5000
Mikroskop Olympus BX51
Pracovné pomôcky a chemikálie pre mikroskopické stanovenie počtu somatických
buniek
Odmerný valec
Papierová vata
Alobal
Ochranné pracovné pomôcky
Dichroman draselný K2Cr2O7
Analytické váhy s presnosťou 0,001 g
3.2.5 Pracovný postup prípravy referenčných vzoriek
Na prípravu referenčných vzoriek sa použije čerstvé surové kravské mlieko,
maximálne 12 hodín od pôdoja, prepravované a uchovávané pri teplote od 2 °C do 6 °C.
V mlieku sa stanoví orientačný počet somatických buniek pomocou prístroja
Fossomatic 5000.
Vypočíta sa pomer riedenia mlieka na dosiahnutie požadovaného počtu somatických
buniek v referenčnej vzorke podľa rovnice materiálovej bilancie, ktorá je uvedená spolu
s príkladom v Prílohe 12.
Podľa vypočítaného pomeru sa nariedi požadované množstvo referenčnej vzorky.
Mlieko s nariedeným obsahom somatických buniek sa naleje do vysterilizovanej
erlenmayerovej banky a dôkladne sa premieša.
Z premiešaného mlieka sa odleje potrebné množstvo do 2 sterilných vzorkovníc za
účelom mikroskopického stanovenia počtu somatických buniek.
105
Erlenmayerová banka s mliekom sa umiestni do vodného kúpeľa o teplote
70 °C ± 2 °C. Mlieko sa pasterizuje vo vodnom kúpeli pri teplote 70 °C ± 2 °C po dobu
45 minút za občasného premiešania tyčinkou tak, aby sa na povrchu nevytvorila vrstva
(kožka) zrazených albumínových bielkovín. Čas sa začína merať až po dosiahnutí teploty
70 °C v mlieku. Teplota sa kontroluje pomocou kalibrovaného teplomera ponoreného priamo
do mlieka.
Po tepelnom ošetrení sa mlieko chemicky konzervuje pomocou dichromanu
draselného. Do mlieka sa pridáva dichroman draselný vo forme prášku v takom množstve aby
sa získal 0,1 % roztok. Navážky dichromanu draselného na určitý objem mlieka sú uvedené
v Prílohe 13, v Tabuľke 1. Dichroman draselný sa naváži do sterilnej vzorkovnice
a kvantitatívne sa pomocou malého množstva ošetreného mlieka prenesie do celkového
objemu ošetreného mlieka. Obsah erlenmayerovej banky sa dôkladne premieša.
Zakonzervované mlieko sa nadávkuje rozlievaním do vopred pripravených
vysterilizovaných vzorkovníc. Vzorkovnice sa uzatvoria.
Po vychladnutí na laboratórnu teplotu sa pripravené vzorky umiestnia do chladničky
a skladujú sa pri teplote od 2 °C do 6 °C maximálne po dobu 1 mesiaca.
Stanovenie počtu somatických buniek.
Mikroskopickou metódou sa stanoví počet somatických buniek v nezakonzervovanom
nariedenom mlieku. Vypočíta sa štandardná odchýlka a variačný koeficient.
Pomocou prístroja Fossomatic 5000 sa stanoví počet somatických buniek
v pripravených zakonzervovaných vzorkách. Priemerný počet somatických buniek sa stanoví
z výsledkov meraní minimálne 3 vzorkovníc (minimálne 18 výsledkov). Prístroj vypočíta
nasledovné hodnoty: priemernú hodnotu počtu somatických buniek, variačný koeficient
a štandardnú odchýlku.
Priemerná hodnota počtu somatických buniek stanovená prístrojom Fossomatic 5000
sa porovná s priemernou hodnotou počtu somatických buniek stanovenou mikroskopickou
metódou.
Priemerná hodnota stanovená referenčnou mikroskopickou metódou sa musí
pohybovať v intervale variačného koeficientu vypočítaného prístrojom Fossomatic 5000 pri
meraní vyššie uvedených 3 vzorkovníc.
V prípade nezhody priemerných výsledkov oboch metodík sa vykoná opätovná
analýza alebo sa pripravená vzorka vyleje.
106
Po stanovení presného počtu somatických buniek sa vystaví validačný protokol.
Validačný protokol musí obsahovať:
- názov laboratória, ktoré pripravilo referenčnú vzorku spolu s adresou a kontaktom,
- názov laboratória ktorému bude vzorka zaslaná,
- číslo referenčnej vzorky,
- dátum prípravy referenčnej vzorky,
- dátum odoslania referenčnej vzorky,
- dátum expirácie referenčnej vzorky,
- podpis zodpovedného pracovníka,
- priemerný počet somatických buniek v ml-1, stanovené rozpätie,
- stanovené počty somatických buniek v referenčnej vzorke v ml-1,
- štandardnú odchýlku v ml-1,
- variačný koeficient v %,
- spôsob manipulácie s referenčnou vzorkou,
- návod na použitie referenčnej vzorky,
- údaje o kontrole pripravenej referenčnej vzorky.
Príklad validačného protokolu je uvedený v Prílohe 14 v Tabuľke 1. Po vystavení
validačného protokolu sa vzorka môže deklarovať ako referenčná.
Referenčné vzorky sa označia etiketou, ktorá musí obsahovať: číslo šarže, dátum
expirácie, priemernú hodnotu počtu somatických buniek a interval počtu somatických buniek
stanovený na základe výpočtu štandardnej odchýlky.
Referenčné vzorky sa uchovávajú pri teplote od 2 °C do 6 °C. Referenčné vzorky sa
distribuujú v izotermických chladiacich boxoch pri teplote od 2 °C do 6 °C. Vzorky by mali
byť stabilné počas jedného mesiaca od ich výroby.
Kontrola kvality referenčných vzoriek
Kvalitu referenčných vzoriek je nutné kontrolovať minimálne 3 x do týždňa počas
celej dĺžky ich expirácie. Kontrola sa vykoná stanovením počtu somatických buniek na
prístroji Fossomatic 5000 a porovnaním výsledku s hodnotami uvedenými na validačnom
protokole.
107
V prípade zistenia nezhody výsledkov sa najskôr skontroluje prístroj Fossomatic 5000,
následne sa zmerajú ďalšie dve referenčné vzorky. V prípadne potvrdenia sa nezhody
výsledkov sa ihneď upovedomia laboratóriá do ktorých bola referenčná vzorka zaslaná
a oznámi sa im poškodenie kvality referenčných vzoriek.
Pred prípravou referenčnej vzorky sa vykoná kontrola mikrobiálnej kvality mlieka.
Stanoví sa celkový počet mikroorganizmov platňovou metódou za použitia noriem STN EN
ISO 4833 (2003), STN ISO 7218 (2000), STN EN ISO 8261 (2001), STN ISO 6887-1
(1999) vo vzorke mlieka s namiešaným počtom somatických buniek ešte pred vykonaním
tepelného ošetrenia. Celkový počet mikroorganizmov sa stanoví aj v zakonzervovanej vzorke.
Na základe výsledkov mikrobiologického skúšania sa zistí účinnosť pasterizácie
a chemického ošetrenia.
3.2.6 Skúšanie kvality pripravených referenčných vzoriek
Prvé dve referenčné vzorky, vzorka s nízkym a vzorka s vysokým počtom
somatických buniek sa pripravia a odskúšajú len v Národnom referenčnom laboratóriu pre
mlieko a mliečne výrobky v Nitre. Po vyhodnotení ich kvality sa pripravia ďalšie referenčné
vzorky, ktoré sa budú skúšať v reálnych laboratórnych podmienkach v troch akreditovaných
laboratóriách (Národné referenčné laboratórium pre mlieko a mliečne výrobky v Nitre,
laboratórium 2, laboratórium 3). Laboratóriá sa uvedú kvôli anonymite pod kódom.
Vo všetkých vzorkách sa bude počas celej doby trvania experimentu stanovovať počet
somatických buniek pomocou automatických prístrojov (Fossomatic 5000 resp. Combi Foss
6000).
3.2.7 Štatistické vyhodnotenie experimentu 2 – príprava sekundárnych referenčných
materiálov
Pre vyhodnotenie výsledkov experimentu 2 (Tabuľka 26, Obrázok 3, Tabuľka 27,
Obrázok 4, Tabuľka 28, Tabuľka 29, Tabuľka 30 a Tabuľka 31) sme vypočítali aritmetický
priemer meraní počtu somatických buniek, štandardnú odchýlku a variačný koeficient.
Priemerné výsledky sa porovnali voči referenčnej hodnote, ktorá sa určila na začiatku
experimentu.
108
Priemerné výsledky sa ďalej porovnali voči internému limitu, ktorý bol daný
štandardnou odchýlkou, ktorá sa stanovila na začiatku experimentu pri určovaní referenčnej
hodnoty počtu somatických buniek v pripravovanej referenčnej vzorke.
Priemerné výsledky sa taktiež porovnali voči externému limitu, ktorý sa určil
odborným odhadom a predstavoval približne dvojnásobok štandardnej odchýlky vypočítanej
z hodnôt nameraných prístrojom Fossomatic 5000 pri určovaní počtu somatických buniek
(18 výsledkov) v pripravovanej referenčnej vzorke.
Priemerné výsledky jednotlivých meraní sa zoradili za sebou na časovú os v podobe
grafu a určil sa trend za obdobie experimentu (stabilita referenčného materiálu).
Výsledky druhej fázy experimentu 2 sa okrem vyššie uvedeného postupu porovnali
navzájom.
Výsledky sa porovnali s výsledkami zistenými Vermuntom et al. (1995).
109
3.3 Experiment 3 – porovnanie výsledkov mikroskopických metód
3.3.1 Materiál
Na skúšanie sa použili vzorky mlieka konzervované 0,02 % w/w bronopolom. Vzorky
mlieka boli doručené v izotermických nádobách. Celkovo bolo doručených 16 vzoriek mlieka
v sklenených fľaštičkách o objeme 3 ml. Počet somatických buniek vo vzorkách sa pohyboval
v rozmedzí od 200 000 do 800 000 . ml-1. Vzorky sa do prípravy preparátov uchovávali pri
teplote 4 °C. Po príprave preparátov sa vzorky mlieka ihneď analyzovali.
3.3.2 Analýza vzoriek
Na skúšanie sa použili vzorky pripravené v A.I.A. Laboratorio Standard Latte, Via
dell` Industria 24, 000 57 Maccarese, Rím, Taliansko. Do kolaboratívnej štúdie boli zapojené
nasledovné laboratóriá (Tabuľka 14):
Účastníci kolaboratívnej štúdie stanovenia počtu somatických buniek metódou
ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005)
Tabuľka 14
AIA LABORATORIO STANDARD LATTE Taliansko BFEL KIEL Nemecko CECALAIT Francúzsko CENTRO NATIONAL DE ALIMENTACION A.E.S.A. Španielsko CLO-DVK Belgicko COKZ Holandsko IST.SUPERIORE DI SANITA' / IST.ZOOPROFILATTICO (RM) Taliansko ISTITUTO SPERIMENTALE PER LA ZOOTECNIA Taliansko LABORATORIO AGROALIMENTARIO DE SANTANDER Španielsko MILK CONTROL STATION NEDERLAND Holandsko NAT.REF.LABORATORY FOR MILK AND MILK PRODUCTS Slovensko NATIONAL VETERINARY AND FOOD RESEARCH INSTITUTE, EELA
Fínsko
NATIONAL VETERINARY LABORATORY Litva NATIONAL VETERINARY RESEARCH INSTITUTE Poľsko RIKILT INSTITUTE OF FOOD SAFETY Holandsko S.VET.MED.DIAGNOSTIC C.OF FOOD AND VET.SER.FOOD CONT. LAB
Lotyšsko
VETERINARY AND FOOD LABORATORY Estónsko (Orlandini, 2005)
110
3.3.3 Časový harmonogram a rozsah experimentu
- august 2005: rozosielanie prihlášok do kolaboratívnej štúdie,
- september 2005: zaslanie dokumentov, návrhu normy ISO/WD 13366-1 IDF 148-1,
inštrukcií a elektronického formuláru pre zaznamenávanie výsledkov,
- október 2005: distribúcia laboratórnych vzoriek,
- 10 až 14. október 2005: príprava preparátov,
- 21. október 2005: zasielanie stanovených výsledkov,
- 31. december 2005: vyhotovenie záverečnej správy.
3.3.4 Pracovný postup
1. Pripraviť 2 preparáty z každej vzorky pre metódy A, B a D (spolu 96 preparátov).
2. Mikroskopicky stanoviť počet somatických buniek v pripravených preparátoch.
3. Porovnať a štatisticky vyhodnotiť výsledky stanovené metódami A, B, C, D, E, F.
Výsledky metód A, B a D sa stanovia v NRLM.
Výsledky metódy C sa stanovia v AIA – Laboratorio Standard Latte v Ríme pomocou
prístroja Fossomatic.
Výsledky metódy E a F sa stanovia laboratóriami zúčastnenými v kolaboratívnej štúdii.
Poznámka:
Všetky vzorky sa musia analyzovať len jedným laborantom.
Pri výpočte sa musí použiť ten istý prepočítavací faktor pre každú vzorku.
Mikroskopické počítanie somatických buniek v preparáte sa musí vykonať bez prerušenia.
Výpočet koncentrácie somatických buniek v 1 ml vzorky sa vykonal podľa vzorca
uvedeného v Tabuľke 15.
111
Vzorec pre výpočet koncentrácie somatických buniek v 1 ml vzorky podľa návrhu
normy ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005)
Tabuľka 15
c = VmBf
NHrWr
..2
Df.
..2
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛π
c = koncentrácia somatických buniek v 1 ml vzorky Vypočíta sa
Wr = šírka náteru 20 mm
Hr = dĺžka náteru 5 mm
N = celkový počet zrátaných buniek Zistí sa mikroskopovaním
Df = priemer zorného poľa v mm 0,36 mm
bf = počet kompletne zrátaných zorných polí Kvôli splneniu podmienky
kolaboratívnej štúdie sa bude počítať v
168 zorných poliach u každého
analyzovaného preparátu.
0,01 ml
IDF 148A (1995)
Vm = množstvo naneseného mlieka
0,005 ml
ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005) Návrh normy ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005) udáva, že vo všeobecnosti sú bunky
v mlieku rozptýlené podľa Poisonovho rozdelenia. Poisonovo rozdelenie predpokladá že:
M = V = sd
Kde: M – je stredná hodnota
V – je rozptyl
Sd – je štandardná odchýlka
Variačný koeficient Cv = % 100.Msd alebo Cv =
ds% 100 alebo Cv =
M% 100
Kde: M – je stredná hodnota, v prípade počítania počtu somatických buniek je to počet
zrátaných častíc (buniek).
112
Z uvedeného vyplýva, že minimálny počet buniek (N), ktorý je nevyhnutné napočítať
pri mikroskopovaní v závislosti od množstva buniek vo vzorke a za účelom splnenia
podmienky variačného koeficientu (Cv) je nasledovný (Tabuľka 16):
Minimálny počet buniek, ktorý je nevyhnutné napočítať pri mikroskopovaní v závislosti
od počtu somatických buniek vo vzorke a splnenia podmienky variačného koeficientu
Tabuľka 16
Koncentrácia buniek . ml-1 Cv (%) N (bunky)
< 150 000 10 100
150 000 – 250 000 7 200
250 000 – 400 000 6 300
≥ 400 000 5 400
3.3.5 Štatistické vyhodnotenie experimentu 3 - porovnanie výsledkov mikroskopických
metód
Na vyhodnotenie získaných výsledkov (Tabuľka 33) sa použila dvojfaktorová analýza
rozptylu (ANOVA) bez interakcií. Na mnohonásobné porovnanie metód sa použil Tukeyov
test a Sheffeho test. Pre vzájomné porovnanie metód boli vypočítané korelačné koeficienty
(Príloha 17, Tabuľka 2). Výpočet sa uskutočnil v profesionálnom štatistickom programe
STATISTICA CZ.
113
4 VÝSLEDKY
4.1 Vvyhodnotenie experimentu 1 - stanovenie počtu somatických buniek v surovom
kravskom mlieku referenčnou metódou
Na vyhodnotenie získaných výsledkov (Tabuľka 17) sa použila dvojfaktorová analýza
rozptylu (ANOVA) bez interakcií.
Dvojfaktorová ANOVA bez interakcií sa riadi modelom
Yijp = µ + αi + βj + eijp,
kde µ, αi, βj (i =1,2, ..., I; k = 1,2, ... ,J; p = 1,2, ...,nij) sú neznáme parametre a eijp sú nezávislé
veličiny s rozdelením N (0, σ2). Parametre αi, βj vyjadrujú po rade riadkové a stĺpcové efekty,
µ je absolútny člen. Budeme sa zaoberať iba vyváženými modelmi, teda nij = n pre i =1,2, ...,
I; k = 1,2, ...,J.
Faktor A pôsobí na I úrovniach a faktor B na J úrovniach. Predpokladajme, že efekty
faktorov A, B sa nasčítajú do stredných hodnôt premenných a pôsobia aditívne.
V našom prípade Faktor A je Sample (vzorka) a pôsobí na deväťdesiatich úrovniach,
faktor B je Method (metóda) a pôsobí na troch úrovniach.
Zaujíma nás len testovanie hypotézy H0: β1 = β2 = β3 proti H1: existujú také i,j (i ≠ j),
pre ktoré platí βi ≠ βj, kde βi je príspevkom k strednej hodnote počtu somatických buniek pre
i-tu metódu.
Výpočet sa uskutočnil v profesionálnom štatistickom programe STATISTICA CZ.
Použila sa štandardná ANOVA hlavných efektov. Na mnohonásobné porovnávanie metód bol použitý Tukeyov test a Sheffeho test.
114
Zdrojové údaje počtu somatických buniek pre analýzu rozptylu – výsledky stanovenia
počtu somatických buniek v surovom kravskom mlieku metódami A, B, C
Tabuľka 17
Metóda Metóda Interné číslo
vzorky
Poradové číslo
A B C Interné číslo
vzorky
Poradové číslo
A B C
F25 1 747 100 895 555 881 750 F71 46 147 157 164 001 161 500F26 2 202 525 199 335 185 250 F72 47 247 530 256 001 246 500F27 3 186 342 197 667 191 250 F73 48 171 154 171 556 168 750F28 4 555 556 567 259 532 500 F74 49 212 122 212 001 211 500F29 5 278 818 317 778 270 250 F75 50 185 416 187 556 188 500F31 6 89 723 100 000 100 500 F76 51 118 241 132 889 130 000F32 7 223 891 243 212 233 500 F77 52 373 649 381 905 365 750F33 8 248 764 260 635 241 750 F78 53 282 290 291 112 290 000F34 9 762 037 762 857 743 000 F79 54 269 753 282 074 276 786F35 10 651 672 668 335 653 750 F81 55 370 372 385 999 388 500F36 11 353 150 398 938 391 750 F82 56 319 444 332 000 336 750F37 12 274 073 289 220 267 167 F83 57 135 556 162 667 155 000F38 13 278 123 282 043 278 250 F84 58 318 254 320 000 324 000F39 14 318 651 324 337 320 500 F89 59 562 963 585 777 562 056F40 15 223 058 252 000 233 000 F90 60 146 946 158 667 137 500F41 16 308 889 323 528 316 000 F91 61 191 946 218 000 201 000F42 17 53 889 50 000 50 500 F92 62 656 945 719 332 715 500F43 18 168 890 175 333 172 000 F93 63 370 372 393 333 374 500F44 19 105 926 114 667 108 500 F94 64 262 344 268 666 274 500F45 20 247 036 261 111 251 250 F95 65 120 926 129 334 138 500F46 21 202 627 229 001 210 000 F96 66 124 815 135 112 125 250F47 22 194 823 225 778 205 250 F97 67 132 949 156 889 150 250F48 23 116 112 140 000 138 250 F98 68 247 221 277 333 258 500F49 24 247 530 249 111 241 250 F99 69 774 818 803 764 870 000F50 25 179 451 199 334 197 000 F100 70 279 512 323 333 291 000F51 26 135 989 149 334 149 750 F101 71 568 056 557 779 558 821F52 27 178 525 190 223 176 750 F102 72 372 687 372 741 379 125F53 28 148 333 168 001 166 750 F103 73 319 576 344 593 336 063F54 29 232 963 249 778 238 000 F105 74 445 185 476 333 453 500F55 30 130 926 155 556 141 500 F106 75 278 933 295 062 291 000F56 31 200 725 218 667 209 500 F108 76 216 887 241 481 230 333F57 32 318 651 323 945 317 500 F109 77 446 296 458 888 448 679F58 33 113 426 132 889 123 750 F110 78 224 796 247 407 233 438F59 34 204 293 217 778 214 000 F111 79 203 535 234 074 201 167F60 35 179 131 198 223 174 500 F112 80 505 290 539 554 516 208F61 36 153 625 168 445 167 250 F113 81 448 888 507 676 516 208F62 37 267 938 285 556 275 750 F114 82 221 634 234 074 230 458F63 38 159 923 175 556 167 750 F115 83 457 222 536 888 510 828F64 39 212 122 234 238 215 500 F116 84 279 859 316 296 300 103F65 40 193 602 213 778 200 250 F117 85 560 186 594 567 547 292F66 41 234 568 270 223 234 667 F118 86 645 767 674 445 670 333F67 42 223 335 234 223 221 000 F119 87 318 518 328 518 327 667F68 43 653 336 700 445 677 750 F121 88 622 994 670 002 647 343F69 44 464 449 505 334 500 500 F122 89 248 647 293 703 271 367F70 45 166 072 186 223 176 000 F123 90 567 659 600 493 571 481
115
ANOVA tabuľka
Tabuľka 18
Súčet štvorcov Stupne voľnosti
Priemerný súčet štvorcov
F P
Absolútny člen 2,563255E+13 1 2,563255E+13 143265,5 0,00000
Sample 8,303247E+12 89 9,329491E+10 521,4 0,00000 Method 2,034400E+10 2 1,017200E+10 56,9 0,00000 Chyba 3,184712E+10 178 1,789164E+08 - -
Podľa ANOVA tabuľky (Tabuľka 18) hypotézu o rovnosti stredných hodnôt H0: β1 =
β2 = β3 zamietame, lebo P-hodnota pre faktor Method je menšia ako 0,01.
95 % intervaly spoľahlivosti pre rôzne typy metód sú uvedené na Obrázku 2. Výsledky
použitých metód A, B, C sa v priemere významne líšia.
Obrázok 2. Porovnanie metód A, B, C. Na obrázku sú uvedené stredné hodnoty počtu
somatických buniek pre metódy A,B,C a ich 95 % intervaly spoľahlivosti.
116
Opisné charakteristiky
Opisné štatistiky a intervaly spoľahlivosti pre metódy A, B, C sú uvedené v Tabuľke 19.
Opisné štatistiky a intervaly spoľahlivosti pre strednú hodnotu počtu somatických
buniek
Tabuľka 19
Metóda Priemer priemerných výsledkov
Štandardná chyba
Dolná hranica 95 %
Horná hranica 95 %
Počet priemerných výsledkov
(n) A 297398,7 1409,950 294616,3 300181,1 90 B 318659,0 1409,950 315876,6 321441,3 90 C 308289,9 1409,950 305507,5 311072,2 90
Mnohonásobné porovnávanie metód
Tukeyov test (Tabuľka 20) aj Sheffeho test (Tabuľka 21) dávajú rovnaké výsledky.
Z Tukeyovho HSD testu vyplýva, že významné rozdiely sú medzi priemernými výsledkami
každých dvoch metód. Významné rozdiely medzi priemermi sú u metód, ktorých P-hodnota je
vyznačená červenou farbou (P-hodnota < 0,05), teda medzi metódami A-B, B-C a A-C.
Približné pravdepodobnosti (P-hodnoty) pre Tukeyov HSD test
Tabuľka 20
A
Priemer (297398,7) B
Priemer (318659,0) C
Priemer (308289,9) A - 0,000022 0,000022 B 0,000022 - 0,000022 C 0,000022 0,000022 -
Približné pravdepodobnosti (P-hodnoty) pre Scheffeho test
Tabuľka 21
A
Priemer (297398,7) B
Priemer (318659,0) C
Priemer (308289,9) A - 0,000000 0,000001 B 0,000000 - 0,000003 C 0,000001 0,000003 -
117
Výpočet neistôt pre metódu A
Výpočet neistoty typu A (pri spôsobe počítania do 400 buniek)
Tabuľka 22
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. xi xs ∆ xi ∆ xi
2 Sd uA Cv i
[SB.ml-1] [SB.ml-1] [SB.ml-1] [SB.ml-1] 1)(n∆x 2
i
−∑
[SB.ml-1] [SB.ml-1] % 1 444 444 -3111,20 9679565,44 2 446 666 -889,20 790676,64 3 444 444 -3111,20 9679565,44 4 450 000 2444,80 5977047,04 5 446 666 -889,20 790676,64 6 451 111 3555,80 12643713,647 450 000 2444,80 5977047,04 8 447 777 221,80 49195,24 9 444 444 -3111,20 9679565,44 10 450 000
2444,80 5977047,04 priemer suma
447555,2 61244099,6 6804899,95 2608,62 2608,62 0,5829
Výpočet neistoty typu A (pri kompletnom zrátaní pruhov)
Tabuľka 23
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. xi xs ∆ xi ∆ xi
2 Sd uA Cv i
[SB.ml-1] [SB.ml-1] [SB.ml-1] [SB.ml-1] 1)(n∆x 2
i
−∑
[SB.ml-1] [SB.ml-1] % 1 417 590 -4166,60 17360555,562 399 997 -21759,60 473480192,163 424 071 2314,40 5356447,36 4 431 479 9722,40 94525061,765 410 646 -11110,60 123445432,366 405 553 -16203,60 262556652,967 430 090 8333,40 69445555,568 440 275 18518,40 342931138,569 416 201 -5555,60 30864691,3610 441 664
19907,40 396304574,76 priemer suma
421756,6 1816270302,4 201807811,3 14205,9 14205,9 3,3683
118
10.
Výpočet čiastkových neistôt typu B
V metóde A boli na základe analýzy pracovného postupu stanovené dve čiastkové
neistoty typu B.
uB1 - na pipetovanie mlieka bola použitá kalibrovaná pipeta s hodnotou objemu 1000 µl, ktorej
chyba stanovená na základe kalibrácie je 0,103591602 %. Predpokladá sa rovnomerné
rozdelenie pravdepodobnosti, t.j. κ = √3
% 90,05980863 3
20,10359160u B1 ==
uB2 - na pipetovanie mlieka bola použitá kalibrovaná pipeta s hodnotou objemu 10 µl pipeta,
ktorej chyba stanovená na základe kalibrácie je 1,226818956 %. Predpokladáme
rovnomerné rozdelenie pravdepodobnosti, t.j. κ = √3
361,22681895u B2 = = 0,708304254 %
11.
Výpočet štandardnej neistoty typu B.
2B2
2B1B uu u +=
% 60,7108248640,70830425 90,05980863 u 22B =+=
12.
Výpočet kombinovanej štandardnej neistoty typu C.
2B
2AC uu u +=
22C 60,71082486 0,5829 u += = 0,919237614 % pri spôsobe počítania do 400 buniek
22C 60,71082486 3,3683 u += = 3,4424870 % pri kompletnom počítaní pruhov
119
13.
Výpočet rozšírenej neistoty U
U = k.uC
U = 2 . 0,919237614 = 1,838475227 % = 2 % pri spôsobe počítania do 400 buniek
U = 2 . 3,4424870 = 6,884974039 % = 7 % pri kompletnom počítaní pruhov
U = 2 % (platí pri stanovení počtu somatických buniek počítaním do 400 buniek).
U = 7 % (platí pri stanovení počtu somatických buniek v siedmych kompletne zrátaných
pruhoch v prípade vzorky s veľmi vysokým obsahom somatických buniek ako aj v prípade
vzorky s veľmi nízkym obsahom somatických buniek kedy sa kompletne zráta minimálne
12 pruhov).
Výpočet neistôt pre metódu B
Výpočet neistoty typu A (pri spôsobe počítania do 400 buniek)
Tabuľka 24
1 2 3 4 5 6 7 8 9 xi xs ∆ xi ∆ xi
2 Sd uA CV i
[SB.ml-1] [SB.ml-1] [SB.ml-1] [SB.ml-1] 1)(n∆x 2
i
−∑
[SB.ml-1] [SB.ml-1] % 1 487 272 10939,20 119666096,642 484 848 8515,20 72508631,04 3 484 848 8515,20 72508631,04 4 487 272 10939,20 119666096,645 447 777 -28555,80 815433713,646 492 121 15788,20 249267259,247 457 777 -18555,80 344317713,648 444 444 -31888,80 1016895565,449 487 272 10939,20 119666096,6410 489 697
13364,20 178601841,64 priemer suma
476332,8 3108531645,6 345392405,06 18584,735 18584,735 3,9016
120
Výpočet neistoty typu A (pri kompletnom zrátaní pruhov)
Tabuľka 25
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. xi xs ∆ xi ∆ xi
2 Sd uA CV i
[SB.ml-1] [SB.ml-1] [SB.ml-1] [SB.ml-1] 1)(n∆x 2
i
−∑
[SB.ml-1] [SB.ml-1] % 1 491 111 20667,10 427129022,412 481 111 10667,10 113787022,413 476 666 6222,10 38714528,41 4 468 888 -1555,90 2420824,81 5 427777 -42666,90 1820464355,616 495 555 25111,10 630567343,217 457 777 -12666,90 160450355,618 431 111 -39332,90 1547077022,419 485 555 15111,10 228345343,2110 488 888
18444,10 340184824,81 priemer suma
470443,9 5309140642,9 589904515,8 24287,95 24287,95 5,1628
10.
Výpočet čiastkových neistôt typu B
V metóde B boli na základe analýzy pracovného postupu stanovené tri čiastkové
neistoty typu B.
uB1 - na pipetovanie mlieka bola použitá kalibrovaná pipeta s hodnotou objemu 1000 µl, ktorej
chyba je 0,103591602 %. Predpokladáme rovnomerné rozdelenie pravdepodobnosti, t.j.
κ = √3
% 90,05980863 3
20,10359160u B1 ==
uB2 - na pipetovanie mlieka bola použitá kalibrovaná pipeta s hodnotou objemu 1000 µl,
ktorej chyba je 0,103591602 %. Predpokladáme rovnomerné rozdelenie
pravdepodobnosti, t.j. κ = √3
121
% 90,05980863 3
20,10359160u B2 ==
uB3 - na pipetovanie mlieka bola použitá kalibrovaná pipeta s hodnotou objemu 10 µl pipeta,
ktorej dovolená chyba je 1,226818956 %. Predpokladáme rovnomerné rozdelenie
pravdepodobnosti, t.j. κ = √3
% 40,70830425 3
61,22681895u B3 ==
11.
Výpočet štandardnej neistoty typu B.
3B3
2B2
2B1B uuu u ++=
% 10,7133365740,70830425 90,05980863 90,05980863 u 222B =++=
12.
Výpočet kombinovanej štandardnej neistoty typu C.
2B
2AC uu u +=
22C 10,71333657 3,9016 u += = 3,966302213 % pri spôsobe počítania do 400 buniek.
22C 10,71333657 5,1628 u += = 5,21184735 % pri kompletnom spočítaní pruhov
13.
Výpočet rozšírenej neistoty U.
U = k.uC
U = 2 . 3,966302213 = 7,932604426 % = 8 % pri spôsobe počítania do 400 buniek
U = 10,42369471992 pri kompletnom spočítaní pruhov
U = 8 % (platí pri stanovení počtu somatických buniek počítaním do 400 buniek)
U = 10 % (platí pri stanovení počtu somatických buniek v minimálne dvanástich kompletne
zrátaných pruhoch – pri vzorke s nízkym počtom somatických buniek)
122
4.1.1 Zhrnutie výsledkov experimentu 1 - stanovenie počtu somatických buniek
v surovom kravskom mlieku referenčnou metódou
Výsledky metód A, B, C, sa významne líšia. Z porovnania priemerných výsledkov
vyplýva, že najnižšie výsledky počtu somatických buniek boli stanovené metódou A, následne
metódou C, a najvyššie výsledky počtu somatických buniek boli stanovené metódou B.
Výsledky stanovené metódou A boli o 21 000 somatických buniek . ml-1 nižšie
v porovnaní s výsledkami metódy B a o 11 000 somatických buniek . ml-1 nižšie v porovnaní
s výsledkami metódy C. Výsledky metódy B boli o 10 000 somatických buniek . ml-1 vyššie
v porovnaní s výsledkami metódy C.
Štatisticky zistený rozdiel medzi metódami A a C a rovnako B a C neprekračuje
hodnotu 5 %, ktorá predstavuje variačný koeficient pri meraní na prístroji Fossomatic (metóda
C) na hladine 300 000 somatických buniek . ml-1. Z uvedeného vyplýva, že metódy A a B sa
môžu zaviesť do praxe.
Rozšírená neistota merania vypočítaná pre metódu A je 2 %, resp. 7 % v závislosti od
použitého spôsobu počítania jadier somatických buniek.
Rozšírená neistota merania vypočítaná pre metódu B je 8 %, resp. 10 % v závislosti
od použitého spôsobu počítania jadier somatických buniek.
123
4.2 Vyhodnotenie experimentu 2 – príprava sekundárnych referenčných materiálov
Vyhodnotenie bodu 1 experimentu 2 (Príprava a skúšanie kvality referenčnej vzorky
s nízkym počtom somatických buniek):
Referenčná vzorka bola pripravená z bazénovej vzorky mlieka odobratej dňa 1.3.2004,
do ktorej nebolo primiešané ďalšie mlieko (Tabuľka 26). Celkový počet mikroorganizmov
v mlieku pred konzerváciou vzorky bol 12 . 103 KTJ (4,08 log). Po konzervácii neboli
vo vzorke vykultivované žiadne mikroorganizmy, referenčná vzorka bola sterilná.
Výsledky skúšania referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek sú uvedené na
Obrázku 3.
Príprava referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek
Tabuľka 26 Výsledky stanovené referenčnou metódou
[SB.ml-1]
Výsledky stanovené inštrumentálnou metódou [SB.ml-1]
Metóda A Experiment 1
Metóda B Experiment 1
Metóda C Experiment 1
222 224 248 889 229 000 250 000 239 000 247 000 255 000 231 000248 147 258 667 239 000 223 000 239 000 237 000 240 000 242 000Výsledky
stanovení 228 518 241 778 246 000 260 000 235 000 240 000 250 000 242 000232 963 249 778 Aritmetický
priemer 241 371 241 333
Sd 13 521,05769 8 479,52 9 120,114 Cv % 5,803950708 3,39482 3,779053
Splnená Splnená Podmienka:* Splnená
Interval: 241 333 ± 9 120 [SB.ml-1] <232 213 – 250 453>
*Priemerná hodnota stanovená referenčnou mikroskopickou metódou sa musí pohybovať
v intervale variačného koeficientu vypočítaného prístrojom Fossomatic 5000 pri meraní
referenčnej vzorky. Interný limit: ± 9 120 [SB.ml-1]. Externý limit ± 20 000 [SB.ml-1].
124
Výsledky skúšania referenčnej vzorky s nízkym počtom somaticých buniek
211 000213 000215 000217 000219 000221 000223 000225 000227 000229 000231 000233 000235 000237 000239 000241 000243 000245 000247 000249 000251 000253 000255 000257 000259 000261 000263 000265 000267 000269 000271 000
4.3.04
6.3.04
8.3.04
10.3.04
12.3.04
14.3.0416.3.04
18.3.04
20.3.04
22.3.04
24.3.04
26.3.04
28.3.04
30.3.04
1.4.04
3.4.045.4.04
7.4.04
9.4.04
11.4.04
13.4.04
15.4.04
17.4.04
19.4.04
21.4.04
23.4.04
25.4.0427.4.04
29.4.04
1.5.04
3.5.04
5.5.04
7.5.04
9.5.04
11.5.04
13.5.04
15.5.04
17.5.0419.5.04
21.5.04
23.5.04
25.5.04
27.5.04
29.5.04
31.5.04
2.6.04
4.6.04
6.6.048.6.04
10.6.04
12.6.04
14.6.04
16.6.04
18.6.04
dátum skúšania
hlad
ina
som
atic
kých
bun
iek
NRLM
Dátum 4.3. 04 5.3. 04 16.3. 04 23.3. 04 24.3. 04 1.4. 04 8.4. 04 16.4. 04 19.4. 04 29.4. 04 4.5. 04 6.5. 04 7.5. 04 11.5. 04 17.5. 04 28.5. 04 4.6. 04 9.6. 04 17.6. 04 18.6. 04 Priemer SB.ml-1 235 900 233 750 234 750 239 500 238 250 237 250 233 250 236 750 230 000 237 750 231 500 234 000 237 250 233 750 236 375 239 667 239 000 239 500 241 250 241 100 Sd SB.ml-1 13 552 7 667 1 500 5 802 8 421 3 304 7 365 8 342 11 972 5 737 9 713 8 315 15 500 6 752 6 718 6 683 6 512 7 681 6 702 11 396 Cv % 5,74 3,28 0,64 2,42 3,53 1,39 3,16 3,52 5,21 2,41 4,20 3,55 6,53 2,89 2,84 2,79 2,72 3,21 2,78 4,73 Legenda: Priemerný počet somatických buniek v referenčnej vzorke Interval kvality udávaný na komerčne dostupných vzorkách Interval kvality vyplývajúci zo štandardnej odchýlky Sd Trendová čiara
Obrázok 3. Výsledky skúšania referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek
125
Vyhodnotenie bodu 2 experimentu 2 (Príprava a skúšanie kvality referenčnej vzorky
s vysokým počtom somatických buniek):
Referenčná vzorka bola pripravená z mlieka pochádzajúceho od individuálnej dojnice
dňa 11. 5. 2004 (Tabuľka 27). K mlieku nebolo primiešané ďalšie mlieko. Celkový počet
mikroorganizmov v mlieku pred konzerváciou bol 45.103 KTJ (4,65 log). Po konzervácii
neboli vo vzorke vykultivované žiadne mikroorganizmy, referenčná vzorka bola sterilná.
Výsledky skúšania referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek sú uvedené
na Obrázku 4.
Príprava referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek
Tabuľka 27 Výsledky stanovené referenčnou metódou
[SB.ml-1]
Výsledky stanovené inštrumentálnou metódou [SB.ml-1]
Metóda A Experiment 1
Metóda B Experiment 1
Metóda C Experiment 1
570 834 582 222 553 000 601000 606 000 565 000 561 000 586 000555 556 589 332 585 000 572 000 560 000 560 000 563 000 544 000
Výsledky stanovení 562 500 546 665 569 000 563 000 565 000 583 000 564 000 559 000
562 963 572 740 Aritmetický priemer 567 852
569 944
Sd 7 649,5313 22 859,4446 16202,65854 Cv % 1,3587974 3,991245221 2,842848755
Splnená Splnená Podmienka:* Splnená
Interval: 569 944 ± 16 203 [SB.ml-1] <553 741 – 586 147>
*Priemerná hodnota stanovená referenčnou mikroskopickou metódou sa musí pohybovať
v intervale variačného koeficientu vypočítaného prístrojom Fossomatic 5000 pri meraní
referenčnej vzorky.
Interný limit: ± 16 203 [SB.ml-1]. Externý limit ± 30 000 [SB.ml-1].
126
Výsledky skúšania referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek
539 000542 000545 000548 000551 000554 000557 000560 000563 000566 000569 000572 000575 000578 000581 000584 000587 000590 000593 000596 000599 000602 000605 000608 000611 000614 000617 000620 000623 000626 000629 000632 000635 000638 000
11.5.0412.5.0413.5.0414.5.0415.5.0416.5.0417.5.0418.5.0419.5.0420.5.0421.5.0422.5.0423.5.0424.5.0425.5.0426.5.0427.5.0428.5.0429.5.0430.5.0431.5.041.6.042.6.043.6.044.6.045.6.046.6.047.6.048.6.049.6.0410.6.0411.6.0412.6.0413.6.0414.6.0415.6.0416.6.0417.6.0418.6.0419.6.0420.6.0421.6.0422.6.0423.6.0424.6.0425.6.0426.6.0427.6.0428.6.0429.6.0430.6.041.7.042.7.043.7.044.7.045.7.046.7.047.7.048.7.049.7.0410.7.0411.7.0412.7.0413.7.0414.7.0415.7.0416.7.0417.7.0418.7.0419.7.0420.7.0421.7.0422.7.0423.7.0424.7.0425.7.0426.7.0427.7.0428.7.0429.7.0430.7.0431.7.041.8.042.8.043.8.044.8.04
dátum skúšania
hlad
ina
som
atic
kých
bun
iek
NRLM
Dátum 11.5. 04 13.5. 04 14.5. 04 18.5. 04 21.5. 04 24.5. 04 26.5. 04 28.5. 04 1.6. 04 4.6. 04 9.6. 04 17.6. 04 18.6. 04 25.6. 04 1.7. 04 2.7. 04 6.7. 04 9.7. 04 15.7. 04 22.7. 04 27.7. 04 3.8. 04 4.8. 04 Priemer SB.ml-1 558 375 568 375 575 250 576 000 586 000 587 500 594 500 582 333 591 000 598 667 573 500 605 500 598 000 607 125 595 500 635 667 585 167 592 500 572 625 596 375 586 250 595 333 588 833
Sd SB.ml-1 29 115 10 141 21 125 16 912 11 576 12 276 18 469 15 807 9 823 21 584 10 909 9 678 10 755 8 560 2 121 11 003 8 909 16 750 9 709 19 071 6 882 8 406 26 026 Cv % 5,21 1,78 3,67 2,94 1,98 2,09 3,11 2,71 1,66 3,61 1,90 1,60 1,80 1,41 0,36 1,73 1,52 2,83 1,70 3,20 1,17 1,41 4,42
Legenda: Priemerný počet somatických buniek v referenčnej vzorke Interval kvality udávaný na komerčne dostupných vzorkách Interval kvality vyplývajúci zo štandardnej odchýlky Sd Trendová čiara
Obrázok 4. Výsledky skúšania referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek
127
Vyhodnotenie bodu 3 experimentu 2 (Príprava referenčných vzoriek s nízkym
a vysokým počtom somatických buniek, skúšanie kvality pripravených referenčných
vzoriek v reálnych laboratórnych podmienkach, porovnanie výsledkov stanovených
v troch laboratóriách):
Referenčná vzorka s nízkym počtom somatických buniek bola pripravená z bazénovej
vzorky mlieka s obsahom somatických buniek 170 000 . ml-1 dňa 8. 2. 2005. K mlieku bolo
primiešané mlieko od individuálnej dojnice s obsahom somatických buniek 1 200 000 . ml-1
(Tabuľka 28). Celkový počet mikroorganizmov v mlieku pred konzerváciou bol 14.103 KTJ
(4,15 log). Po konzervácii neboli vo vzorke vykultivované žiadne mikroorganizmy,
referenčná vzorka bola sterilná. Výsledky skúšania referenčnej vzorky s nízkym počtom
somatických buniek sú uvedené v Tabuľke 30 a na Obrázku 5.
Príprava referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek
Tabuľka 28 Výsledky stanovené referenčnou metódou
[SB.ml-1]
Výsledky stanovené inštrumentálnou metódou [SB.ml-1]
Metóda A Experiment 1
Metóda B Experiment 1
Metóda C Experiment 1
204 545 225 555 214 000 239 000 210 000 236 000 229 000 243 000223 335 258 889 232 000 230 000 246 000 240 000 248 000 228 000
Výsledky stanovení 222 780 240 000 221 000 232 000 245 000 240 000 231 000 239 000
216 887 241 481 Aritmetický priemer 229 184
233 500
Sd 10 691,799 16 716,29894 10 578,8357 Cv % 4,9296708 6,922397981 4,530550620
Nesplnená Splnená Podmienka:*
Splnená
Interval: 233 500 ± 10 580 [SB.ml-1] <222 921 – 244 079>
*Priemerná hodnota stanovená referenčnou mikroskopickou metódou sa musí pohybovať
v intervale variačného koeficientu vypočítaného prístrojom Fossomatic 5000 pri meraní
referenčnej vzorky.
Interný limit: ± 10 579 [SB.ml-1]. Externý limit ± 20 000 [SB.ml-1].
128
Komentár: V prípade metódy A, nebola splnená podmienka, avšak po vylúčení odľahlého
výsledku jeden výsledok podmienku spĺňal a druhý sa nachádzal v tesnej blízkosti hraničnej
hodnoty, preto sme sa rozhodli postupovať ďalej v príprave referenčnej vzorky.
Referenčná vzorka s vysokým počtom somatických buniek bola pripravená
z bazénového mlieka s obsahom somatických buniek 170 000 . ml-1 dňa 8. 2. 2005. K mlieku
bolo primiešané mlieko od individuálnej dojnice s obsahom somatických buniek 1 200 000 .
ml-1 (Tabuľka 29). Celkový počet mikroorganizmov v mlieku pred konzerváciou bol 55 .103
KTJ (4,74 log). Po konzervácii neboli vo vzorke vykultivované žiadne mikroorganizmy,
referenčná vzorka bola sterilná. Výsledky skúšania referenčnej vzorky s vysokým počtom
somatických buniek sú uvedené v Tabuľke 31 a na Obrázku 6.
Príprava referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek
Tabuľka 29 Výsledky stanovené referenčnou metódou
[SB.ml-1]
Výsledky stanovené inštrumentálnou metódou [SB.ml-1]
Metóda A Experiment 1
Metóda B Experiment 1
Metóda C Experiment 1
444 444 458 888 449 000 456 000 440 000 457 000 461 000 471 000450 000 452 222 464 000 460 000 448 000 460 000 432 000 427 000Výsledky
stanovení 444 444 465 555 449 000 423 000 474 000 443 000 483 000 457 000446 296 458 888 Aritmetický
priemer 452 592 454 625
Sd 3 207,7581 6 666,500006 14 997,2200
Cv % 0,7187513 1,452749944 3,298811540 Splnená Splnená Podmienka:*
Splnená Interval: 454 625 ± 14 997 [SB.ml-1]
<439 628 – 469 622> *Priemerná hodnota stanovená referenčnou mikroskopickou metódou sa musí pohybovať
v intervale variačného koeficientu vypočítaného prístrojom Fossomatic 5000 pri meraní
referenčnej vzorky.
Interný limit: ± 14 997 [SB.ml-1]. Externý limit ± 30 000 [SB.ml-1].
129
Porovnanie výsledkov skúšania referenčnej vzorky 0405N RV - N3
204 000206 000208 000210 000212 000214 000216 000218 000220 000222 000224 000226 000228 000230 000232 000234 000236 000238 000240 000242 000244 000246 000248 000250 000252 000254 000256 000258 000260 000262 000264 000
9.2.05
10.2.05
11.2.05
12.2.05
13.2.05
14.2.05
15.2.05
16.2.05
17.2.05
18.2.05
19.2.05
20.2.05
21.2.05
22.2.05
23.2.05
24.2.05
25.2.05
26.2.05
27.2.05
28.2.05
1.3.05
2.3.05
3.3.05
4.3.05
5.3.05
6.3.05
7.3.05
8.3.05
9.3.05
10.3.05
11.3.05
dátum skúšania
hlad
ina
som
atic
kých
bun
iek
LAB 1
LAB 2
LAB 3
LAB 1
LAB 3
LAB 2
Legenda:
Priemerný počet somatických buniek v referenčnej vzorke Interval kvality udávaný na komerčne dostupných vzorkách Interval kvality vyplývajúci zo štandardnej odchýlky Sd Trendová čiara LAB 1 Trendová čiara LAB 2 Trendová čiara LAB 3
Obrázok 5. Porovnanie výsledkov skúšania referenčnej vzorky 0405N RV-N3
130
Zdrojové údaje počtu somatických buniek k Obrázku 5 - Porovnanie výsledkov skúšania referenčnej vzorky 0405N RV-N3
Tabuľka 30
Laboratórium 1 Dátum 9.2. 05 10.2. 05 11.2. 05 14.2. 05 16.2. 05 18.2. 05 21.2. 05 23.2. 05 25.2. 05 1.3. 05 2.3. 05 4.3. 05 8.3. 05 9.3. 05 11.3. 05 - -
245 000 222 000 233 000 222 000 228 000 211 000 219 000 221 000 231 000 236 000 228 000 218 000 232 000 217 000 216 000 - - 236 000 239 000 236 000 240 000 247 000 216 000 228 000 234 000 232 000 242 000 221 000 218 000 243 000 221 000 235 000 - - 240 000 230 000 218 000 228 000 232 000 242 000 246 000 226 000 247 000 224 000 214 000 222 000 233 000 228 000 234 000 - - 240 000 225 000 234 000 243 000 240 000 236 000 225 000 238 000 238 000 232 000 236 000 227 000 216 000 234 000 244 000 - - 229 000 221 000 214 000 227 000 219 000 238 000 243 000 242 000 227 000 215 000 233 000 239 000 247 000 229 000 255 000 - - 248 000 231 000 235 000 233 000 225 000 246 000 234 000 229 000 242 000 246 000 241 000 229 000 245 000 233 000 239 000 - - 231 000 213 000 - 227 000 - - 226 000 236 000 234 000 241 000 241 000 241 000 222 000 255 000 232 000 - -
Namerané výsledky
243 000 222 000 - 234 000 - - 242 000 221 000 238 000 234 000 250 000 220 000 226 000 237 000 245 000 - - Priemer SB.ml-1 239 000 225 375 228 333 231 750 231 833 231 500 232 875 230 875 236 125 233 750 233 000 226 750 233 000 231 750 237 500 - -
Sd SB.ml-1 6 633 7 873 9 688 7 126 10 226 14 446 9 891 7 864 6 446 10 181 11 686 9 099 11 339 11 523 11 452 - - Cv % 2,78 3,49 4,24 3,08 4,41 6,24 4,25 3,41 2,73 4,36 5,02 4,01 4,87 4,97 4,82 - -
Laboratórium 2 Dátum 10.2. 05 11.2. 05 15.2. 05 16.2. 05 17.2. 05 18.2. 05 22.2. 05 23.2. 05 25.2. 05 2.3. 05 3.3. 05 4.3. 05 8.3. 05 - - - -
235 000 239 000 231 000 228 000 232 000 232 000 239 000 234 000 220 000 220 000 240 000 237 000 238 000 - - - - 233 000 240 000 234 000 257 000 241 000 241 000 227 000 233 000 222 000 238 000 223 000 253 000 229 000 - - - - 234 000 232 000 224 000 246 000 249 000 249 000 224 000 248 000 224 000 225 000 256 000 229 000 243 000 - - - - 240 000 226 000 255 000 235 000 239 000 239 000 251 000 222 000 226 000 238 000 234 000 247 000 234 000 - - - - 235 000 240 000 239 000 239 000 236 000 236 000 247 000 226 000 239 000 220 000 254 000 234 000 226 000 - - - - 226 000 244 000 245 000 231 000 233 000 233 000 229 000 227 000 239 000 231 000 243 000 226 000 234 000 - - - - 238 000 211 000 255 000 244 000 239 000 239 000 229 000 230 000 240 000 233 000 229 000 245 000 226 000 - - - -
Namerané výsledky
239 000 233 000 240 000 227 000 223 000 223 000 229 000 254 000 208 000 223 000 237 000 237 000 243 000 - - - - Priemer SB.ml-1 235 000 233 125 240 375 238 375 236 500 236 500 234 375 234 250 227 250 228 500 239 500 238 500 234 125 - - - -
Sd SB.ml-1 4 408 10 616 11 006 10 281 7 597 7 597 10 042 11 145 11 348 7 502 11 427 9 227 6 875 - - - - Cv % 1,88 4,55 4,58 4,31 3,21 3,21 4,28 4,76 4,99 3,28 4,77 3,87 2,94 - - - -
131
Pokračovanie Tabuľky 30
Laboratórium 3 Dátum 10.2. 05 11.2. 05 15.2. 05 16.2. 05 17.2. 05 17.2. 05 18.2. 05 18.2. 05 22.2. 05 22.2. 05 23.2. 05 23.2. 05 24.2. 05 24.2. 05 25.2. 05 25.2. 05 1.3. 05
211 000 246 000 241 000 215 000 229 000 209 000 202 000 225 000 209 000 234 000 219 000 216 000 215 000 222 000 216 000 239 000 248 000 244 000 246 000 225 000 239 000 241 000 218 000 224 000 231 000 227 000 228 000 232 000 217 000 223 000 224 000 209 000 217 000 234 000 263 000 238 000 238 000 231 000 233 000 230 000 230 000 229 000 244 000 234 000 234 000 228 000 223 000 219 000 222 000 231 000 221 000 237 000 229 000 235 000 224 000 227 000 229 000 231 000 230 000 215 000 229 000 233 000 228 000 219 000 222 000 240 000 232 000 236 000 242 000 243 000 239 000 225 000 221 000 215 000 232 000 220 000 235 000 222 000 230 000 218 000 225 000 223 000 227 000 221 000 236 000 246 000 233 000 249 000 231 000 266 000 231 000 230 000 219 000 228 000 219 000 231 000 227 000 225 000 235 000 238 000 222 000 232 000
- - - - - - - - - - - - - - - - -
Namerané výsledky
- - - - - - - - - - - - - - - - - Priemer SB.ml-1 240 500 239 167 237 833 227 500 236 167 222 000 224 833 225 667 226 333 227 667 229 833 222 333 221 667 224 167 225 333 227 000 234 500
Sd SB.ml-1 16 932 7 083 7 859 8 142 16 055 9 252 11 531 5 203 12 801 6 154 5 492 5 888 3 933 5 565 12 193 8 319 8 666 Cv % 7,04 2,96 3,30 3,58 6,80 4,17 5,13 2,31 5,66 2,70 2,39 2,65 1,77 2,48 5,41 3,66 3,70
Sumár za všetky tri laboratóriá Priemer SB.ml-1
232 156
Sd SB.ml-1
10 337
Cv % 4,45
132
Porovnanie výsledkov skúšania referenčnej vzorky 0405V RV - V3
415 000417 000419 000421 000423 000425 000427 000429 000431 000433 000435 000437 000439 000441 000443 000445 000447 000449 000451 000453 000455 000457 000459 000461 000463 000465 000467 000469 000471 000473 000475 000477 000479 000481 000483 000
9.2.05
10.2.05
11.2.05
12.2.05
13.2.05
14.2.05
15.2.05
16.2.05
17.2.05
18.2.05
19.2.05
20.2.05
21.2.05
22.2.05
23.2.05
24.2.05
25.2.05
26.2.05
27.2.05
28.2.05
1.3.05
2.3.05
3.3.05
4.3.05
5.3.05
6.3.05
7.3.05
8.3.05
9.3.05
10.3.05
11.3.05
dátum skúšania
hlad
ina
som
atic
kých
bun
iek
LAB 1
LAB 2
LAB 3
LAB 1
LAB 3
LAB 2
Legenda: Priemerný počet somatických buniek v referenčnej vzorke Interval kvality udávaný na komerčne dostupných vzorkách Interval kvality vyplývajúci zo štandardnej odchýlky Sd Trendová čiara LAB 1 Trendová čiara LAB 2 Trendová čiara LAB 3
Obrázok 6. Porovnanie výsledkov skúšania referenčnej vzorky 0405V RV-V3
133
Zdrojové údaje počtu somatických buniek k Obrázku 6 - Porovnanie výsledkov skúšania referenčnej vzorky 0405V RV-V3
Tabuľka 31
Laboratórium 1 Dátum 9.2. 05 10.2. 05 11.2. 05 14.2. 05 16.2. 05 18.2. 05 21.2. 05 23.2. 05 25.2. 05 1.3. 05 2.3. 05 4.3. 05 8.3. 05 9.3. 05 11.3. 05 - -
449 000 474 000 427 000 510 000 447 000 477 000 465 000 451 000 474 000 434 000 433 000 442 000 477 000 - 453 000 - - 464 000 - 457 000 446 000 467 000 474 000 464 000 456 000 459 000 441 000 486 000 480 000 454 000 465 000 462 000 - - 449 000 460 000 443 000 414 000 447 000 481 000 435 000 437 000 483 000 440 000 465 000 486 000 458 000 493 000 459 000 - - 456 000 486 000 457 000 431 000 437 000 - 445 000 445 000 467 000 446 000 482 000 457 000 469 000 449 000 487 000 - - 460 000 461 000 472 000 457 000 470 000 458 000 446 000 421 000 415 000 454 000 467 000 474 000 467 000 445 000 457 000 - - 423 000 - 464 000 467 000 448 000 - 499 000 466 000 460 000 448 000 443 000 446 000 454 000 469 000 461 000 - - 440 000 483 000 - 476 000 - - 432 000 475 000 450 000 447 000 468 000 473 000 481 000 478 000 454 000 - -
Namerané výsledky
448 000 471 000 - 459 000 - - 459 000 444 000 481 000 449 000 469 000 460 000 463 000 490 000 457 000 - - Priemer SB.ml-1 448 625 472 500 453 333 457 500 452 667 472 500 455 625 449 375 461 125 444 875 464 125 464 750 465 375 469 857 461 250 - -
Sd SB.ml-1 12 828 10 821 16 058 29 076 12 941 10 083 21 514 16 843 21 814 6 244 17 972 15 989 10 099 18 641 10 859 - - Cv % 2,86 2,29 3,54 6,36 2,86 2,13 4,72 3,75 4,73 1,40 3,87 3,44 2,17 3,97 2,35 - -
Laboratórium 2 Dátum 10.2. 05 11.2. 05 15.2. 05 16.2. 05 17.2. 05 18.2. 05 22.2. 05 23.2. 05 25.2. 05 2.3. 05 3.3. 05 4.3. 05 8.3. 05 - - - -
465 000 476 000 458 000 467 000 470 000 434 000 449 000 440 000 441 000 454 000 440 000 - 468 000 - - - - 448 000 458 000 462 000 461 000 449 000 472 000 472 000 475 000 457 000 472 000 470 000 437 000 455 000 - - - - 500 000 445 000 430 000 468 000 453 000 471 000 474 000 494 000 461 000 455 000 439 000 475 000 442 000 - - - - 480 000 482 000 466 000 451 000 456 000 453 000 448 000 456 000 465 000 437 000 465 000 466 000 456 000 - - - - 499 000 472 000 467 000 467 000 471 000 456 000 412 000 489 000 462 000 471 000 476 000 450 000 455 000 - - - - 485 000 470 000 496 000 435 000 435 000 449 000 452 000 466 000 476 000 448 000 457 000 481 000 471 000 - - - - 473 000 466 000 454 000 473 000 472 000 470 000 444 000 432 000 462 000 468 000 464 000 452 000 479 000 - - - -
Namerané výsledky
452 000 471 000 468 000 478 000 434 000 435 000 449 000 484 000 479 000 446 000 468 000 447 000 522 000 - - - - Priemer SB.ml-1 475 250 467 500 462 625 462 500 455 000 455 000 450 000 467 000 462 875 456 375 459 875 458 286 468 500 - - - -
Sd SB.ml-1 19 594 11 464 18 260 13 690 15 362 15 362 19 086 22 810 11 679 12 839 13 685 16 039 24 501 - - - - Cv % 4,12 2,45 3,95 2,96 3,38 3,38 4,24 4,88 2,52 2,81 2,98 3,50 5,23 - - - -
134
Pokračovanie Tabuľky 31
Laboratórium 3 Dátum 10.2. 05 11.2. 05 15.2. 05 16.2. 05 17.2. 05 17.2. 05 18.2. 05 18.2. 05 22.2. 05 22.2. 05 23.2. 05 23.2. 05 24.2. 05 24.2. 05 25.2. 05 25.2. 05 1.3. 05
462 000 441 000 443 000 405 000 415 000 425 000 419 000 443 000 419 000 409 000 409 000 433 000 411 000 424 000 441 000 421 000 431 000 437 000 437 000 444 000 418 000 463 000 415 000 422 000 445 000 428 000 425 000 427 000 433 000 425 000 430 000 419 000 454 000 461 000 444 000 452 000 470 000 435 000 461 000 444 000 423 000 418 000 427 000 419 000 425 000 404 000 410 000 427 000 411 000 417 000 426 000 440 000 447 000 441 000 429 000 425 000 420 000 411 000 469 000 421 000 452 000 421 000 433 000 431 000 423 000 440 000 444 000 436 000 439 000 433 000 439 000 456 000 435 000 420 000 412 000 442 000 408 000 435 000 426 000 399 000 426 000 397 000 429 000 435 000 463 000 447 000 428 000 435 000 430 000 437 000 419 000 430 000 437 000 420 000 460 000 420 000 - 400 000 440 000 427 000 465 000 430 000
- - - - - - - - - - - - - - - - -
Namerané výsledky
- - - - - - - - - - - - - - - - - Priemer SB.ml-1 444 833 439 667 445 333 428 833 439 333 423 833 419 500 442 333 420 500 433 333 421 333 420 400 417 167 423 500 427 833 439 333 441 167
Sd SB.ml-1 9 152 8 892 12 501 17 105 19 242 10 381 7 176 16 367 7 176 19 643 6 653 17 344 11 957 14 349 117 03 18 705 16 461 Cv % 2,06 2,02 2,81 3,99 4,38 2,45 1,71 3,70 1,71 4,53 1,58 4,13 2,87 3,39 2,74 4,26 3,73
Sumár za všetky tri laboratóriá Priemer SB.ml-1
450 888
Sd SB.ml-1
21 802
Cv % 4,84
135
4.2.1 Zhrnutie výsledkov experimentu 2
Bod 1 experimentu 2 (Príprava a skúšanie kvality referenčnej vzorky s nízkym počtom
somatických buniek)
Referenčná vzorka s nízkym počtom somatických buniek bola skúšaná počas obdobia
4. 3. 2004 až 16. 6. 2004. Referenčná vzorka si udržala kvalitatívne vlastnosti počas celej
dĺžky experimentu. Bol zaznamenaný iba mierny vzostup počtu somatických buniek.
Vypočítaná hodnota opakovateľnosti merania na prístroji Fossomatic 5000, bola
± 9 120 somatických buniek . ml-1, táto hodnota predstavovala interný limit pre posudzovanie
kvality referenčnej vzorky. Interný limit bol nepatrne prekročený iba pri dvoch meraniach.
Externý limit bola hodnota ± 20 000 somatických buniek . ml-1. Externý limit bol odhadnutý
zo štandardnej odchýlky vypočítanej z výsledkov nameraných na prístroji Fossomatic 5000
pri určovaní počtu somatických buniek v pripravovanej referenčnej vzorke a predstavoval
dvojnásobok hodnoty štandardnej odchýlky. Externý limit nebol prekročený počas celej dĺžky
experimentu.
Pracovný postup prípravy referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek je
vhodný pre prípravu sekundárnych referenčných materiálov s presným počtom somatických
buniek.
Bod 2 experimentu 2 (Príprava a skúšanie kvality referenčnej vzorky s vysokým počtom
somatických buniek)
Referenčná vzorka s vysokým počtom somatických buniek bola skúšaná počas
obdobia 11. 5. 2004 až 4. 8. 2004. Referenčná vzorka si neudržala kvalitatívne vlastnosti
počas celej dĺžky experimentu. Bol zaznamenaný vzostup počtu somatických buniek.
Vypočítaná hodnota opakovateľnosti merania na prístroji Fossomatic 5000 bola
± 16203 somatických buniek . ml-1, táto hodnota predstavovala interný limit pre posudzovanie
kvality referenčnej vzorky. Interný limit bol nepatrne prekročený už 14 dní od začatia
experimentu. Bolo pozorované zvýšenie počtu somatických buniek. Externý limit bola
hodnota ± 30 000 somatických buniek . ml-1. Externý limit bol odhadnutý zo štandardnej
odchýlky vypočítanej z výsledkov nameraných na prístroji Fossomatic 5000 pri určovaní
počtu somatických buniek v pripravovanej referenčnej vzorke a predstavoval dvojnásobok
hodnoty štandardnej odchýlky. Externý limit bol prekročený 37 dní od začatia experimentu.
136
Referenčné vzorky pripravené týmto pracovným postupom sa budú môcť použiť
v praxi iba za toho predpokladu, že sa zvýši hodnota externého limitu za súčasného skrátenia
doby úschovy referenčných vzoriek. Z výsledkov vyplýva, že doba úschovy referenčných
vzoriek by mala byť maximálne jeden mesiac od ich prípravy.
Bod 3 experimentu 2 (Príprava referenčných vzoriek s nízkym a vysokým počtom
somatických buniek, skúšanie kvality pripravených referenčných vzoriek v reálnych
laboratórnych podmienkach, porovnanie výsledkov stanovených v troch laboratóriách)
Referenčná vzorka s nízkym počtom somatických buniek bola skúšaná počas obdobia
9. 2. 2005 až 11. 3. 2005 v troch akreditovaných skúšobných laboratóriách. Referenčná
vzorka si udržala kvalitatívne vlastnosti počas celej dĺžky experimentu. Bol zaznamenaný
veľmi mierny vzostup počtu somatických buniek v prípade laboratória č. 1. V laboratóriu č. 2
bol zaznamenaný nepatrný pokles počtu somatických buniek. V laboratóriu č. 3 bol
zaznamenaný pokles počtu somatických buniek.
Vypočítaná hodnota opakovateľnosti merania na prístroji Fossomatic 5000 bola
± 10 579 somatických buniek . ml-1, táto hodnota predstavovala interný limit pre
posudzovanie kvality referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek. Interný limit
bol nepatrne prekročený iba pri jednom meraní v laboratóriu č. 3.
Hodnota reprodukovateľnosti stanovená z výsledkov meraní troch zúčastnených
laboratórií bola v prípade referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek ± 10 337
somatických buniek . ml-1. Externý limit bola hodnota ± 20 000 somatických buniek . ml-1.
Externý limit bol odhadnutý zo štandardnej odchýlky vypočítanej z výsledkov nameraných na
prístroji Fossomatic 5000 pri určovaní počtu somatických buniek v pripravovanej referenčnej
vzorke a predstavoval približne dvojnásobok hodnoty štandardnej odchýlky. Externý limit
nebol prekročený počas celého experimentu.
Z výsledkov experimentu vyplýva, že všetky tri zúčastnené laboratóriá stanovili počet
somatických buniek približne na tej istej hladine.
Kvalita referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek bola overená priamo
v reálnych laboratórnych podmienkach. Kvalita referenčnej vzorky s nízkym počtom
somatických buniek sa počas celej dĺžky experimentu v prípade výsledkov laboratória č. 1
a laboratória č. 2 nemenila. V laboratóriu č. 3 bolo zaznamenané zhoršenie kvality referenčnej
vzorky, namerané výsledky mali klesajúcu tendenciu, ale až na jeden výsledok sa všetky
nachádzali v tolerancii interného limitu.
137
Nami použitý pracovný postup prípravy referenčnej vzorky s nízkym počtom
somatických buniek je vhodný pre prípravu sekundárnych referenčných materiálov s presným
počtom somatických buniek.
Referenčná vzorka s vysokým počtom somatických buniek bola skúšaná počas
obdobia 9. 2. 2005 až 11. 3. 2005. Z výsledkov meraní laboratória č. 1 a laboratória č. 2
vyplýva, že referenčná vzorka si zachovala kvalitatívne vlastnosti počas celej dĺžky
experimentu.
Bol zaznamenaný mierny vzostup počtu somatických buniek v laboratóriu č. 1
a laboratóriu č. 2. V laboratóriu č. 3 bol zaznamenaný pokles počtu somatických buniek.
Vypočítaná hodnota opakovateľnosti merania na prístroji Fossomatic 5000 bola
± 14 997 somatických buniek . ml-1, táto hodnota predstavovala interný limit pre
posudzovanie kvality referenčnej vzorky.
V laboratóriu č. 1 tri výsledky prekročili interný limit, ostatné výsledky boli
v tolerancii stanoveného interného limitu. Žiadny výsledok laboratória 1 neprekročil externý
limit. V laboratóriu č. 2 jeden výsledok prekročil stanovený interný limit, ostatné výsledky
boli v tolerancii stanoveného interného limitu. Laboratórium č. 1 a laboratórium č. 2 stanovili
počet somatických buniek na tej istej hladine. Značná časť výsledkov meraní laboratória č. 3
sa nachádzala pod hranicou interného limitu a výsledky piatich meraní boli pod hranicou
externého limitu. Laboratórium č. 3 v porovnaní s laboratóriami č. 1 a č. 2 stanovilo počet
somatických buniek na hladine približne o 30 000 somatických buniek . ml-1 nižšej.
Hodnota reprodukovateľnosti stanovená z výsledkov meraní všetkých troch laboratórií
bola ± 21 802 somatických buniek . ml-1.
Externý limit bola hodnota ± 30 000 somatických buniek . ml-1. Externý limit bol
odhadnutý zo štandardnej odchýlky vypočítanej z výsledkov nameraných na prístroji
Fossomatic 5000 pri určovaní počtu somatických buniek v pripravovanej referenčnej vzorke
a predstavoval približne dvojnásobok hodnoty štandardnej odchýlky. Externý limit nebol
prekročený v prípade výsledkov laboratória č. 1 a laboratória č. 2. Päť výsledkov meraní
laboratória č. 3 sa nachádzalo pod hranicou externého limitu.
Kvalita referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek bola overená
priamo v reálnych laboratórnych podmienkach. Z výsledkov stanovených v laboratóriu č. 1
a laboratóriu č. 2 sa dá usúdiť, že kvalita referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických
buniek je postačujúca. Výsledky stanovené v laboratóriu č. 3 naznačujú určitý pokles kvality
referenčnej vzorky.
138
Z výsledkov vyplýva, že bude nutné zvýšiť hranicu externého limitu alebo použiť
vhodnejší spôsob konzervácie referenčnej vzorky.
139
4.3 Vyhodnotenie experimentu 3 – porovnanie výsledkov mikroskopických metód
Na vyhodnotenie získaných výsledkov (Tabuľka 33, Obrázok 7) sa opäť použila
dvojfaktorová analýza rozptylu bez interakcií. Model je popísaný v časti 4.1.
Riadkovým faktorom je Sample (vzorka) a pôsobí na šestnástich úrovniach,
stĺpcovým faktorom je Method (metóda) a pôsobí na šiestich úrovniach.
Zaujíma nás len testovanie problému H0: β1 = β2 = β3 = β4 = β5 = β6 proti H1: existujú
také i,j (i ≠ j), pre ktoré platí βi ≠ βj, kde βi je príspevkom k strednej hodnote počtu
somatických buniek pre i-tu metódu.
Výpočet sa uskutočnil v profesionálnom štatistickom programe STATISTICA CZ.
Použila sa štandardná analýza ANOVA hlavných efektov. Na mnohonásobné porovnávanie metód sa použili Tukeyov test a Sheffeho test.
140
Súhrn výsledkov meraní metód A, B, C, D, E, F experimentu 3. Tabuľka 32
Použitá laboratórna metóda
A B C D E F STN EN ISO 13366-1 (2001)
EtBr
ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005) návrh
EtBr 100 °C
Fossomatic ISO 13366-3
(1997)
ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005) návrh
EtBr 50 °C
ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005)
návrh (kolaboratívna
štúdia – metylénová
modrá)
ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005)
návrh (kolaboratívna štúdia – EtBr)
Výsledky NRLM
Výsledky NRLM Výsledky A.I.A.-L.S.L
Rím
Výsledky NRLM Výsledky kolaboratívnej
štúdie
Výsledky kolaboratívnej
štúdie
Čís
lo v
zork
y
Iden
tifik
ačný
kód
z k
olab
. štú
d.
Meranie 1
Meranie 2
Priemer Meranie 1
Meranie 2
Priemer Priemer Meranie 1
Meranie 2
Priemer Priemer 14-tich
laboratórií
Priemer 4-roch
laboratórií 1 G 758 850 779 913 769 000 761 776 758 265 760 000 817 000 624 867 615 505 620 000 819 000 668 000 2 H 766 456 782 253 774 000 772 307 779 328 776 000 775 000 640 079 627 207 634 000 802 000 610 000 3 A 201 853 205 363 204 000 217 650 225 841 222 000 228 000 154 461 157 972 156 000 228 000 193 000 4 B 216 480 233 447 225 000 219 990 227 011 224 000 249 000 163 823 160 312 162 000 253 000 207 000 5 C 379 133 396 100 388 000 395 515 411 897 404 000 434 000 354 559 345 198 350 000 428 000 368 000 6 D 432 375 439 396 436 000 429 450 416 578 423 000 475 000 344 028 360 410 352 000 469 000 410 000 7 E 563 433 555 242 559 000 554 657 596 783 576 000 614 000 509 021 511 361 510 000 611 000 535 000 8 F 718 480 682 205 700 000 714 969 720 820 718 000 723 000 551 146 555 827 553 000 716 000 599 000 9 G 813 263 817 358 815 000 786 349 802 731 795 000 817 000 697 417 705 608 702 000 819 000 668 000
10 H 403 121 393 174 398 000 392 004 388 494 390 000 775 000 346 368 339 347 343 000 802 000 610 000 11 A 201 268 198 928 200 000 218 820 228 182 224 000 228 000 179 035 179 035 179 000 228 000 193 000 12 B 245 149 238 713 242 000 223 501 229 352 226 000 249 000 174 354 184 886 180 000 253 000 207 000 13 C 380 303 394 930 388 000 380 303 392 004 386 000 434 000 327 645 331 156 329 000 428 000 368 000 14 D 424 769 392 589 409 000 407 216 429 450 418 000 475 000 360 410 353 389 357 000 469 000 410 000 15 E 597 953 610 825 604 000 609 654 597 953 604 000 614 000 530 083 538 275 534 000 611 000 535 000 16 F 713 799 705 023 709 000 672 843 697 417 685 000 723 000 606 144 610 825 608 000 716 000 599 000
141
020 00040 00060 00080 000
100 000120 000140 000160 000180 000200 000220 000240 000260 000280 000300 000320 000340 000360 000380 000400 000420 000440 000460 000480 000500 000520 000540 000560 000580 000600 000620 000640 000660 000680 000700 000720 000740 000760 000780 000800 000820 000840 000860 000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
číslo vzorky
poče
t som
atic
kých
bun
iek
/ ml
A: STN EN ISO 13366-1 (2001) EtBr - Výsledky NRLM B: ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005) návrh EtBr 100°C - Výsledky NRLMC: FOSSOMATIC ISO 13366-3 (1997) - Výsledky A.I.A.-L.S.L Rím D: ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005) návrh EtBr 50°C - Výsledky NRLME: ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005) návrh (kolaboratívna štúdia – metylénová modrá) F: ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005) návrh (kolaboratívna štúdia – EtBr)
Obrázok 7. Grafické znázornenie priemerných výsledkov meraní metód A, B, C, D, E, F experimentu 3.
142
Zdrojové údaje počtu somatických buniek pre analýzu rozptylu – zaokrúhlené
priemerné výsledky stanovenia počtu somatických buniek z Tabuľky 32
Tabuľka 33 Metóda
Vzorka A B C D E F 1 769 000 760 000 817 000 620 000 819 000 668 000 2 774 000 776 000 775 000 634 000 802 000 610 000 3 204 000 222 000 228 000 156 000 228 000 193 000 4 225 000 224 000 249 000 162 000 253 000 207 000 5 388 000 404 000 434 000 350 000 428 000 368 000 6 436 000 423 000 475 000 352 000 469 000 410 000 7 559 000 576 000 614 000 510 000 611 000 535 000 8 700 000 718 000 723 000 553 000 716 000 599 000 9 815 000 795 000 817 000 702 000 819 000 668 000
10 398 000 390 000 775 000 343 000 802 000 610 000 11 200 000 224 000 228 000 179 000 228 000 193 000 12 242 000 226 000 249 000 180 000 253 000 207 000 13 388 000 386 000 434 000 329 000 428 000 368 000 14 409 000 418 000 475 000 357 000 469 000 410 000 15 604 000 604 000 614 000 534 000 611 000 535 000 16 709 000 685 000 723 000 608 000 716 000 599 000
ANOVA tabuľka
Tabuľka 34
Súčet štvorcov Stupne voľnosti
Priemerný súčet štvorcov F p
Absolútny člen 2,270010E+13 1 2,270010E+13 8565,341 0,000000
Vzorka 3,676538E+12 15 2,451025E+11 92,484 0,000000 Metóda 2,071003E+11 5 4,142007E+10 15,629 0,000000 Chyba 1,987670E+11 75 2,650227E+09
Podľa ANOVA tabuľky (Tabuľka 34) hypotézu o rovnosti stredných hodnôt H0: β1 =
β2 = β3 = β4 = β5 = β6 zamietame, lebo P-hodnota pre faktor Method je menšia ako 0,01.
95 % intervaly spoľahlivosti pre rôzne typy metód sú uvedené na Obrázku 8. Výsledky
použitých metód A,B,C,D,E,F sa v priemere významne líšia.
143
Obrázok 8. Porovnanie metód A, B, C, D, E, F. Na obrázku sú uvedené stredné hodnoty
počtu somatických pre metódy A,B,C,D,E,F a ich 95 % intervaly spoľahlivosti.
Opisné charakteristiky
Opisné štatistiky a intervaly spoľahlivosti pre metódy A, B, C, D, E, F sú uvedené
v Tabuľke 35.
144
Opisné štatistiky a intervaly spoľahlivosti pre strednú hodnotu počtu somatických
buniek
Tabuľka 35
Metóda Priemer
priemerných výsledkov
Štandardná chyba
Dolná hranica 95 %
Horná hranica 95 %
Počet priemerných výsledkov
A 488 750,0 12 870,09 463 111,5 514 388,5 16 B 489 437,5 12 870,09 463 799,0 515 076,0 16 C 539 375,0 12 870,09 513 736,5 565 013,5 16 D 410 562,5 12 870,09 384 924,0 436 201,0 16 E 540 750,0 12 870,09 515 111,5 566 388,5 16 F 448 750,0 12 870,09 423 111,5 474 388,5 16
Mnohonásobné porovnávanie metód.
Tukeyov test (Tabuľka 36) aj Sheffeho test (Tabuľka 37) dávajú rovnaké výsledky.
Z Tukeyovho HSD testu vyplýva, že významné rozdiely medzi priemermi sú u metód,
ktorých P-hodnota je vyznačená červenou farbou (P-hodnota < 0,05), teda medzi metódami
A-D, B-D, C-D, C-F, D-E, E-F.
Približné pravdepodobnosti (P-hodnoty) pre Tukeyov HSD test
Tabuľka 36
metóda A B C D E F A - 1,000000 0,071778 0,000820 0,059524 0,251223 B 1,000000 - 0,078662 0,000733 0,065408 0,234286 C 0,071778 0,078662 - 0,000126 1,000000 0,000175 D 0,000820 0,000733 0,000126 - 0,000126 0,299585 E 0,059524 0,065408 1,000000 0,000126 - 0,000162 F 0,251223 0,234286 0,000175 0,299585 0,000162 -
Približné pravdepodobnosti (P-hodnoty) pre Scheffeho test
Tabuľka 37
metóda A B C D E F A - 1,000000 0,185532 0,004855 0,161810 0,444201 B 1,000000 - 0,198272 0,004340 0,173380 0,424076 C 0,185532 0,198272 - 0,000000 1,000000 0,000563 D 0,004855 0,004340 0,000000 - 0,000000 0,498537 E 0,161810 0,173380 1,000000 0,000000 - 0,000437 F 0,444201 0,424076 0,000563 0,498537 0,000437 -
145
4.3.1 Výsledky kolaboratívnej štúdie
Výsledky kolaboratívnej štúdie stanovenia počtu somatických buniek metódou ISO/WD
13366-1 / IDF sú uvedené v Tabuľke 38 a Tabuľke 39, grafické znázornenie opakovateľnosti
výsledkov zúčastnených laboratórií je na Obrázku 9, grafické znázornenie opakovateľnosti
vyjadrenej na vzorku je na Obrázku 10, grafické znázornenie celkovej správnosti výsledkov
laboratórií je na Obrázku 11.
Súhrn výsledkov kolaboratívnej štúdie stanovenia počtu somatických buniek
metódou ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005)
Tabuľka 38
(Orlandini, 2005)
146
Súhrn priemerných výsledkov kolaboratívnej štúdie stanovenia počtu somatických
buniek metódou ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005)
Tabuľka 39
(Orlandini, 2005)
147
Obrázok 9. Grafické znázornenie opakovateľnosti výsledkov laboratórií zúčastnených
v kolaboratívnej štúdii stanovenia počtu somatických buniek metódou ISO/WD 13366-1 /
IDF 148-1 (2005), (NRLM figuruje pod označením LAB 12) (Orlandini, 2005).
148
Obrázok 10. Grafické znázornenie opakovateľnosti vyjadrenej na vzorku v kolaboratívnej
štúdii stanovenia počtu somatických buniek metódou ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005),
(Orlandini, 2005).
149
Obrázok 11. Grafické znázornenie celkovej správnosti výsledkov laboratórií zúčastnených
v kolaboratívnej štúdii stanovenia počtu somatických buniek metódou
ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005), (NRLM figuruje pod označením LAB 12)
(Orlandini, 2005).
4.3.2 Zhrnutie výsledkov experimentu 3
Výsledky metód A, B, C, D, E, F sa v priemere významne líšia. Významné rozdiely
existujú medzi metódami A-D, B-D, C-D, C-F, D-E, E-F. Z porovnania priemerných
výsledkov vyplýva, že najnižšie hodnoty počtu somatických buniek boli stanovené metódou
D, následne metódou F, potom na rovnakej úrovni metódami A a B a najvyššie hodnoty počtu
somatických buniek boli stanovené na rovnakej úrovni metódami C a E. Z uvedeného
vyplýva, že sa čiastočne potvrdil náš predpoklad. Výsledky stanovené metódou D a F boli
150
podľa predpokladu najnižšie. Nepotvrdil sa však predpoklad, že výsledky stanovené
metódami A a B budú na rovnakej hladine ako výsledky stanovené metódami C a E.
Výsledky stanovené metódou A a B boli o 50 000 somatických buniek . ml-1 nižšie
v porovnaní s výsledkami metód C a E. Výsledky stanovené metódou D boli v porovnaní
s výsledkami stanovenými metódami C a E o 130 000 somatických buniek . ml-1 nižšie
a v porovnaní s metódami A a B o 80 000 somatických buniek . ml-1 nižšie. Výsledky
stanovené metódou F boli v porovnaní s výsledkami stanovenými metódami C a E o 90 000
somatických buniek . ml-1 nižšie a v porovnaní s metódami A a B o 40 000 somatických
buniek . ml-1 nižšie.
Z výsledkov experimentu 3 vyplýva, že pri použití rôznych mikroskopických metód
sa dosahujú rozdielne výsledky. Výber mikroskopickej metódy potom môže ovplyvniť
správnosť nastavenia rutinných laboratórnych prístrojov typu Fossomatic a následne
správnosť laboratórnych výsledkov u reálnych laboratórnych vzoriek.
151
5 DISKUSIA
5.1 Experiment 1 - stanovenie počtu somatických buniek v surovom kravskom mlieku
referenčnou metódou
Pri realizácii experimentu 1 sme získali mnoho empirických skúseností. Zistili sme,
že pracovný postup prípravy mikroskopického preparátu metódou A je v porovnaní s metódou
B podstatne náročnejší a vyžaduje veľmi precíznu prácu. Keďže sa na podložné sklíčko
nanáša veľmi malý objem mlieka (10 µl), je nevyhnutné pracovať s veľmi presnými pipetami.
Pri práci sa nám osvedčilo používanie mikropipety aj napriek tomu, že sa vo všeobecnosti
odporúča pracovať s mikrostriekačkou ako uvádza Ubben (2004). Pri používaní mikropipety
sme na rozdiel od mikrostriekačky pracovali s menšou prenosovou chybou (prenosová chyba
bola zistená kalibráciou). Pri práci sa musia používať výlučne kalibrované pipety s overenou
chybou prenosu pipetovaného objemu. Z hľadiska presnosti laboratórnej práce je dôležité
používať podložné sklíčka s predtlačeným rozmerom 5 mm x 20 mm. V porovnaní so
sklíčkami bez predtlačeného rozmeru sa dosahujú presnejšie výsledky a najmä rovnomerné
rozvrstvenie mlieka na definovanej ploche podložného sklíčka. Použitie podložných sklíčok
s preddefinovaným rozmerom odporúča používať Ubben (2004). Predtlačený rozmer sa pred
použitím podložného sklíčka musí preveriť pomocou mikrometra. Podložné sklíčka musia byť
dokonale odmastené, pretože inak dochádza v prípade metódy A k oddeľovaniu a zmývaniu
zafixovaného filmu mlieka počas pracovnej operácie vymývania farbiva pod prúdom vody.
Po rozvrstvení mlieka na podložnom sklíčku odporúčame uprednostniť fixáciu voľným
sušením na vzduchu pred fixáciou sušením na výhrevnej doske. Pri sušení na výhrevnej doske
často dochádza k potrhaniu naneseného filmu. Neskôr pri farbení preparátu metódou A môže
farbivo preniknúť do vzniknutých trhliniek a pri následnom vymývaní sa už nedá dostatočne
odstrániť. Pri dlhšom vymývaní môže dôjsť k potrhaniu filmu, jeho oddeleniu sa od
podložného sklíčka a úplnej deštrukcii preparátu. V prípade nedostatočného vymytia farbiva
je preparát prakticky nepozorovateľný kvôli veľmi intenzívnej fluorescencii. Pri veľmi dlhom
vymývaní farbiva môže dochádzať k nadmernému vymytiu farbiva, čím sa znemožní
identifikácia jadier somatických buniek. Metóda A má v porovnaní s metódou B aj ďalšie
nevýhody. Na prípravu farbiacich roztokov sa používajú agresívnejšie a toxickejšie
chemikálie ako tetrachlóretán a ľadová kyselina octová. Pracovné úkony sa musia vykonávať
v digestore, čo sťažuje samotnú prácu. Fixácia preparátu trvá pri metóde A 24 hodín. Pri
metóde B sa pri fixácii môže použiť výhrevná platňa a preparát sa môže mikroskopovať
152
prakticky ihneď po vysušení naneseného filmu. Výhodou metódy A v porovnaní s metódou B
je príjemnejšie mikroskopovanie. Na preparáte sa nenachádza nadbytočné fluorescenčné
farbivo, fluoreskujú len zafarbené jadrá somatických buniek jasne zlato žltou až mierne
oranžovou farbou a pozadie preparátu má príjemnú olivovo zelenú farbu. Uvedené platí ak sa
mikroskopuje s fluorescenčným svetlom o vlnovej dĺžke 450 nm.
Správnosť výsledku závisí od kvality pripraveného mikroskopického preparátu. Pri
príprave preparátu metódou A existuje viac pracovných operácií a tým sa zvyšuje riziko
možných chýb a riziko poškodenia zafixovaného filmu. Farbenie preparátu sa vykonáva za
„sucha“, vysušený preparát sa ponorí do farbiaceho roztoku. Po zafarbení preparátu nasledujú
pracovné operácie vymývania farbiva a opätovné sušenie preparátu. Znásobuje sa tým riziko
poškodenia naneseného filmu. Pri vymývaní by sa mal použiť mierny prúd vlažnej vody, aby
nedošlo k poškodeniu naneseného filmu. Pri metóde B sa farbiaci roztok pridáva priamo do
mlieka zahriateho na teplotu 100 °C. Farbivo zostáva prítomné v mlieku. Mlieko sa pri
farbení zriedi s farbiacim roztokom v pomere 1 : 1. Na podložné sklíčko sa nanáša mlieko
zriedené s farbiacim roztokom. Zafarbené jadrá somatických buniek fluoreskujú zlato žltou až
oranžovou farbu. Pozadie preparátu mierne fluoreskuje z dôvodu prítomnosti farbiva v celom
objeme vzorky a má oranžovú farbu. Uvedené platí ak sa mikroskopuje s fluorescenčným
svetlom o vlnovej dĺžke 450 nm. Metóda B obsahuje pri príprave preparátu menej pracovných
operácií, čím sa znižuje riziko poškodenia naneseného filmu. Nevýhodou metódy B je,
že obsahuje o jedno pipetovanie viac v porovnaní s metódou A. Každá chyba spôsobená
pipetovaním môže ovplyvniť výsledok analýzy. Domnievame sa, že v prípade metódy B sa
jedná o najzávažnejšiu chybu, keďže prípadné poškodenie filmu pri sušení a vzniknuté
trhlinky nemôžu ovplyvniť výsledok, pretože operácia farbenia sa vykonáva skôr.
Častým problémom metódy A je vytvorenie sa veľmi intenzívne fluoreskujúceho pásu
pozdĺž celej dĺžky okraja preparátu. V dôsledku intenzívnej fluorescencie je znemožnené
počítanie somatických buniek v okrajových oblastiach preparátu. Príčinou uvedeného
problému je pravdepodobne zaschnutie väčšieho objemu mlieka a vytvorenie hrubšej vrstvy
filmu pozdĺž okrajov preparátu. Ostatné časti preparátu sú obyčajne dobre pozorovateľné.
Zistili sme, že na prípravu preparátov by sa malo používať iba nezakonzervované
surové kravské mlieko alebo mlieko zakonzervované bronopolom. Gonzalo et al. (2003)
taktiež použili nezakonzervované mlieko pri mikroskopickom skúšaní somatických buniek
v ovčom mlieku. Neodporúčame pripravovať preparát z mlieka zakonzervovaného
dichromanom draselným z dôvodu zníženia priľnavosti filmu mlieka na podložnom sklíčku
ako aj z dôvodu nedostatočného farbenia sa jadier somatických buniek farbivom EtBr.
153
V porovnaní s našim pracovným postupom, Gonzalo et al. (2003) použili pri príprave
podložných sklíčok poly-L-lyzín za účelom zvýšenia priľnavosti filmu mlieka.
Ubben (2004) odporúča preparáty pozorovať ihneď po ich príprave. Z uvedeným
názorom súhlasíme, avšak zistili sme, že preparáty je možné pozorovať aj niekoľko týždňov
až mesiacov po ich príprave bez ovplyvnenia výsledku. Preparáty však musia byť počas
skladovania chránené pred prachom a svetlom. Samotné počítanie somatických buniek pod
mikroskopom odporúčame vykonávať pri zväčšení 600 x za použitia imerzného oleja.
Pri menších zväčšeniach by mohol nastať problém s identifikáciou jadier somatických buniek
prítomných v zhlukoch. Väčšie zväčšenia nie je nutné použiť, navyše by sa predĺžila doba
analýzy. Vo všeobecnosti doba za ktorú je skúsený laborant schopný spočítať jadrá somatický
buniek v preparáte je približne 20 minút.
Výhodou oboch metód je, že farbivo EtBr farbí výlučne jadrá somatických buniek
pretože obsahujú DNA, umožňuje sa tým exaktné stanovenie počtu somatických buniek vo
vzorke a eliminuje sa chyba počítania útvarov, ktoré nie sú somatickými bunkami. K tejto
chybe môže dôjsť pri počítaní somatických buniek v preparáte zafarbenom farbivom
metylénovou modrou. Identifikácia fluoreskujúcich jadier somatických buniek je jednoduchá
a laborant sa môže pri počítaní sústrediť iba na fluoreskujúce jadrá somatických buniek.
Pri príprave preparátu farbivo EtBr farbí aj DNA prítomných mikroorganizmov. V prípade
metódy A, je identifikácia prítomných mikroorganizmov jednoznačná. Mikroorganizmy majú
v porovnaní s jadrami somatických buniek menšiu veľkosť a charakteristické tvary. V prípade
metódy B sú prítomné baktérie prakticky nepozorovateľné, pretože ich identifikácia je kvôli
prítomnosti nerozrušených tukových guľôčok nemožná. Tukové guľôčky v prípade metódy B
do určitej miery sťažujú mikroskopovanie, pretože môžu prekrývať prítomné somatické
bunky. Uvedený problém je možné riešiť preostrením zorného poľa. V prípade metódy A sa
tento problém nevyskytuje, pretože tukové guľôčky sú rozrušené.
Najväčším problémom oboch metód je spôsob výpočtu výsledku. Pri výpočte sa
používa vzorec, do ktorého sa dosadzuje faktor, ktorý závisí od počtu kompletne spočítaných
pruhov, resp. počtu pruhov, v ktorých sa pri počítaní dosiahol počet 400 jadier somatických
buniek. Výsledok závisí predovšetkým od použitého faktora, čím sa vlastne stráca zmysel
samotného počítania somatických buniek. Číselné hodnoty faktorov sa veľmi líšia u metódy
A. V prípade metódy B sú kvôli zriedeniu vzorky pri jej farbení rozdiely medzi číselnými
hodnotami faktorov menšie. Pri vzorkách u ktorých sa počet 400 bunkových jadier dosiahne
na rozhraní dvoch pruhov môže nastať situácia, že vplyvom požitia zlého faktora dôjde
k výraznému ovplyvneniu výsledku. Existuje možnosť napočítať aj viac ako 400 bunkových
154
jadier a počítanie zastaviť na konci niektorého z pruhov. Výsledky vypočítané týmto
spôsobom rátania („rátanie úplných pruhov“) sa s výsledkami vypočítanými spôsobom
„rátania do 400 bunkových jadier“ a použitia faktora pre posledný kompletne zrátaný pruh
podstatne líšia. „Výhodou“ uvedených skutočností je, že ak sa pri viacerých paralelných
preparátoch použije rovnaký faktor, výsledky budú v podstate rovnaké a budú sa líšiť len
v dôsledku rozdielnych počtov bunkových jadier napočítaných v poslednom zornom poli.
Vo väčšine prípadov nie je možné v poslednom zornom poli skončiť počítanie presne počtom
400 bunkových jadier pretože sa v zornom poli nachádza viac somatických buniek. Do vzorca
sa potom dosadzuje hodnota nad 400 bunkových jadier (napr. 403) a dochádza k určitému
zvýšeniu výsledku. Kvôli rozdielnemu počtu jadier somatických buniek napočítaných
v poslednom zornom poli sa výsledky paralelných skúšaní odlišujú, avšak za použitia
rovnakého prepočítavacieho faktora sú si veľmi podobné. Myslíme si že pri uvedenom
spôsobe výpočtu dochádza ku skresleniu výsledkov a preto ďalej neodporúčame používať
spôsob počítania jadier somatických buniek v pruhoch. Ako vhodnú alternatívu odporúčame
použiť nový spôsob výpočtu, ktorý sa uvádza v návrhu normy ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1
(2005). Pri novom spôsobe výpočtu sa do vzorca dosádza počet odmikroskopovaných
zorných polí a počet spočítaných jadier somatických buniek. Medzi výsledkami paralelných
skúšaní vypočítaných týmto spôsobom existuje väčšia variabilita a podľa nášho názoru tieto
výsledky predstavujú reálne hodnoty počtu somatických buniek vo vzorke. Počet jadier
somatických buniek, ktoré je nevyhnutné napočítať sa riadi Poisonovým rozdelením.
V experimente 1 sme overili možnosť využitia referenčnej metódy EN ISO 13366-1
(2001) s použitím farbiva EtBr a metódu sme porovnali s metódou publikovanou
Vermuntom et al. (1995), v ktorej sa pri farbení taktiež používa farbivo EtBr, avšak pri
farbení sme použili teplotu 100 °C namiesto uvádzaných 50 °C.
Štatisticky zistený rozdiel medzi metódami bol 21 000 somatických buniek . ml-1.
Tento rozdiel bol podľa nášho názoru okrem samotného postupu prípravy preparátu
ovplyvnený aj metodikou výpočtu. Výsledky oboch metód sa v porovnaní s výsledkami
stanovenými na prístroji Fossomatic nelíšili na hladine 300 000 somatických buniek . ml-1
o viac než 5 %. Gonzalo et al. (2003) pri stanovení počtu somatických buniek v ovčom
mlieku porovnali tri rozdielne mikroskopické metódy (farbenie metylénovou modrou - MB,
farbenie podľa May-Grünvald-Giemsa - MGG a farbenie pyronin Y-metylénovou zelenou -
PMG) a vypočítali korelačné koeficienty medzi jednotlivými metódami. Autori uvádzajú,
že korelačný koeficient medzi metódami MB a MGG bol 0,981, medzi metódami MB a PMG
bol 0,982 a medzi metódami MGG a PMG bol 0,990. Korelačný koeficient medzi metódami
155
MB a Fossomaticom bol 0,957 a medzi metódami MGG a Fossomaticom bol 0,996). Autori
ďalej uvádzajú, že všetky tri použité mikroskopické metódy sa môžu považovať za referenčné
vo vzťahu k prístrojovej metóde Fossomatic.
Uvedené výsledky súhlasia s výsledkami, ktoré sme zistili v experimente 1
a v experimente 3. V experimente 1 sme zistili nasledovné korelačné koeficienty (Príloha 17,
Tabuľka 1): 0,995 medzi metódami A a B, 0,994 medzi metódami A a C a 0,997 medzi
metódami B a C. Tieto výsledky súhlasia aj s výsledkami ďalších autorov (Grappin
a Jeunet, 1974; Heeschen, 1975; Schmidt-Madsen, 1975, 1979; Heald et al., 1977), ktorí
uvádzajú vysoké korelačné koeficienty, blízke 1,00.
Rozšírená neistota merania vypočítaná pre metódu EN ISO 13366-1 (2001) je 2 %
a resp. 7 % v závislosti od použitého spôsobu počítania jadier somatických buniek.
Rozšírená neistota merania vypočítaná pre nami modifikovanú metódu popísanú
Vermuntom et al. (1995) je 8 %, resp. 10 % v závislosti od použitého spôsobu počítania
jadier somatických buniek.
Počas realizácie experimentu 1 sme chceli overiť, či farbivo etídium bromid farbí
erytrocyty. Kulíšek et al. (1996) uvádzajú, že erytrocyty sú bezjadrové bunky, ktoré v čase
vývoja stratili jadro a ostatné typické organely buniek. Podľa Martínez et al. (2003)
a Ethidium Bromid Safety (1999) sa etídium bromid používa na farbenie nukleových
kyselín. Keďže erytrocyty neobsahujú jadro, namali by sa farbiacim roztokom etídium
bromidu zafarbiť. Pre overenie tejto hypotézy sme získali z krvi hovädzieho dobytka čistú
suspenziu červených krviniek podľa postupu, ktorý uvádza Mikula et al. (1985). Suspenziu
červených krviniek sme následne zafarbili farbiacim roztokom etídium bromidu
a experimentálne sme dokázali, že etídium bromid erytrocyty nefarbí pretože neobsahujú
jadrovú DNA.
Táto skutočnosť znamená, že u mastitídneho mlieka obsahujúceho krv, sa pri farbení
buniek etídium bromidom erytrocyty nezafarbia a môže preto dochádzať k podhodnoteniu
výsledku laboratórnej skúšky.
5.2 Experiment 2 – príprava sekundárnych referenčných materiálov
V prvej fáze experimentu 2 (bod 1 - Príprava a skúšanie kvality referenčnej vzorky
s nízkym počtom somatických buniek; a bod 2 - Príprava a skúšanie kvality referenčnej
vzorky s vysokým počtom somatických buniek) sme skúšali kvalitu referenčných vzoriek
v podmienkach NRLM.
156
Zo zistených výsledkov vyplýva, že referenčná vzorka s nízkym počtom somatických
buniek si zachovala kvalitatívne vlastnosti, predovšetkým stabilný počet somatických buniek
počas celého experimentu. Bol zaznamenaný iba mierny vzostup počtu somatických buniek.
Toto zistenie nekorešponduje s údajmi zistenými Vermuntom et al. (1995), ktorí zistili
mierny pokles počtu somatických buniek.
V referenčnej vzorke s vysokým počtom somatických buniek sme zistili porušenie
kvality referenčnej vzorky v podobe zvýšenia počtu somatických buniek. Toto zistenie
nekorešponduje s údajmi zistenými Vermuntom et al. (1995), ktorí zistili pokles počtu
somatických buniek. Predpokladáme, že k zvýšeniu počtu somatických buniek mohlo dôjsť
v dôsledku pretrvávajúcej enzymatickej aktivity mikrobiálnych enzýmov a enzýmov
somatických buniek, ktoré nemuseli byť inaktivované počas tepelného ošetrenia vzorky
a následnej chemickej konzervácie. Enzýmy mohli rozrušiť zhluky somatických buniek, ktoré
sú často prítomné v mastitídnom mlieku, čím sa zvýšil počet somatických buniek. Saeman et
al. (1988) zistili, že aktivita plazmínu sa na celkovej proteolýze vo vzorkách mlieka podieľala
päťdesiatimi štyrmi percentami. Verdi a Barbano (1991) zistili, že relatívna proteázová
aktivita buniek pochádzajúcich z mlieka s vysokým počtom somatických buniek bola pri pH
6,6 výrazne vyššia v porovnaní s aktivitou buniek izolovaných priamo z krvi. Vyššia
proteázová aktivita mohla byť spôsobená väčšou koncentráciou aktivovaných makrofágov.
Výsledky Saemana et al. potvrdili Le Roux et al. (1995), ktorí uvádzajú, že zvýšenie počtu
somatických buniek viedlo k zhoršeniu kvality proteínov prítomných v mlieku. Autori ďalej
konštatujú, že na degradácii proteínov sa podieľa plazmín a proteázy zo somatických buniek.
Santos et al. (2003) uvádzajú, že počas mastítídy dochádza k zvýšeniu prestupu zložiek krvi
(leukocytov) do mlieka. Leukocyty obsahujú veľké množstvo enzýmov, ktoré následne
ovplyvňujú zloženie mlieka, predovšetkým rozkladajú kazeín a mliečny tuk. Najdôležitejšie
z týchto enzýmov sú plazmín a mliečne proteázy, ktoré rozkladajú kazeín. Taktiež bolo
dokázané, že vplyvom lipolýzy a proteolýzy dochádza k zmenám chuťových vlastností mlieka
a k jeho zhorknutiu (Ma et al., 2000). Proteolýza v mlieku má dva pôvody, mikrobiálny
a mastitídny. Fairbairn a Law (1986) uvádzajú, že mikroorganizmy môžu počas skladovania
mlieka v chladiacich tankoch produkovať tepelne rezistentné exogénne proteázy. Narušenie
zdravotného stavu mliečnej žľazy vedie k zvýšeniu množstva endogénnych proteáz,
predovšetkým tých, ktoré pochádzajú z plazmín-plazminogénneho systému (Politis a Ng-
Kwai-Hang, 1988). Grieger a Holec et al. (1990) uvázajú, že mikrobiálne lipázy sú na
rozdiel od mliečnych lipáz termorezistentné, zachovávajú si aktivitu aj po sterilizácii.
Termorezistencia lipáz sa líši podľa druhu lipolytických mikroorganizmov. Pri zahriatí mlieka
157
na 63 °C po 30 min aktivita lipáz klesá od 14,5 % do 56 %. Pri zahriatí mlieka na 72 °C
aktivita lipáz klesá po 17 sekundách od 1,5 % do 41,3 %. V našom pracovnom postupe sme
použili teplotu 70 °C ± 2 °C počas 45 minút.
Uvažujeme, že príčinou zvýšenia počtu somatických buniek v referenčnej vzorke
s vysokým počtom somatických buniek by mohla byť aj použitá pasterizačná teplota,
vplyvom ktorej mohlo dôjsť k denaturácii povrchových častí somatických buniek a následne
k oddeľovaniu somatických buniek zo zhlukov, čo mohlo mať za následok zvýšenie
celkového počtu somatických buniek vo vzorke.
Pri príprave referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek sa za účelom
zvýšenia počtu somatických buniek použilo mlieko pochádzajúce od dojnice s mastitídou.
Toto mlieko malo v porovnaní s bazénovou vzorkou mlieka zvýšený celkový počet
mikroorganizmov (55 . 103 KTJ = 4,74 log v porovnaní so 14 . 103 KTJ = 4,15 log). Po
tepelnom a chemickom ošetrení mlieka sme však nezistili prítomnosť živých
mikroorganizmov v zakonzervovanom mlieku. Zakonzervovaná referenčná vzorka bola
sterilná. Nepredpokladáme, že príčinou zvýšenia počtu somatických buniek bola mikrobiálna
aktivita, pretože mikrobiologickým vyšetrením zakonzervovaných referenčných vzoriek na
začiatku experimentu a na konci experimentu neboli vykultivované žiadne mikroorganizmy,
referenčná vzorka bola sterilná. Súhlasíme však s Griegerom a Holecom et al. (1990)
a Fairbairnom a Lawom (1986), ktorí uvádzajú že termorezistentné enzýmy môžu ovplyvniť
kvalitatívne vlastnosti mlieka.
Z uvedeného vyplýva, že bude treba vykonať ďalšie experimenty zamerané na
stabilizáciu počtu somatických buniek v referenčnej vzorke s vysokým počtom somatických
buniek alebo zvýšiť „externý limit“ (teoretický interval v ktorom by sa mali nachádzať
výsledky stanovené laboratóriami pri skúšaní referenčnej vzorky). Pracovný postup prípravy
referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek sa bude môcť aplikovať na
prípravu referenčných vzoriek iba vtedy, ak sa dodržia vyššie uvedené odporúčania.
Z výsledku experimentu vyplynulo viacero otázok, ktoré by mali byť predmetom
ďalšieho výskumu. Predovšetkým sa bude musieť porovnať ako pôsobia rôzne koncentrácie
a kombinácie konzervačných látok za aplikácie alebo bez aplikácie tepelného ošetrenia. Pri
ďalšom výskume budeme môcť vychádzať z výsledkov prác viacerých autorov. Vplyvmi
rozdielnych faktorov na zmeny v počte somatických buniek vo vzorkách mlieka sa zaoberali
Gonzalo et al. (2003). Najdôležitejšie faktory ovplyvňujúce počet somatických buniek vo
vzorke sú: konzervačná látka, analytická teplota, vek vzoriek, spôsob uskladnenia a interakcie
týchto faktorov. Autori uvádzajú, že v zakonzervovaných vzorkách sa logPSB (logaritmus
158
počtu somatických buniek) pohyboval od 5,67 (bronopol), 5,63 (dichroman draselný) a 5,62
(azidiol). Najvyššia hodnota logPSB bola u nezakonzervovaného mlieka (5,72) a k jej
zvýšeniu došlo v dôsledku pomnoženia sa baktérií vo vzorke. Hodnota logPSB bola vyššia pri
použití teploty 60 °C (5,68) než pri teplote 40 °C (5,65). Hodnota logPSB bola pri skladovaní
vzoriek mlieka pri chladničkovej teplote (5,67) a pri laboratórnej teplote (5,65). Zvýšenie
počtu somatických buniek pri konzervovaní mlieka bronopolom zistil v minulosti aj
Bertrand (1996). Sánchez et al. (2005) zistili, že použitie bronopolu pri konzervácii vzoriek
poskytuje najlepšie výsledky vo vzťahu k rozdielnym skúmaným modelovým podmienkam.
Barkema et al. (1997) a Martínez (2003) skúmali vplyv zmrazenia na počet somatických
buniek vo vzorke mlieka. Autori uvádzajú, že tento postup sa môže použiť v protimastitídych
kontrolných programoch.
Vypočítaná hodnota opakovateľnosti merania na prístroji Fossomatic 5000 bola
v prípade referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek ± 9 120 somatických
buniek . ml-1 a v prípade referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek ± 16 203
somatických buniek.ml-1. Vermunt et al. (1995) uvádzajú hodnotu opakovateľnosti až
± 60 000 somatických buniek . ml-1. Nami zistené výsledky boli v tolerancii tejto hodnoty.
Podľa návrhu normy ISO/FDIS 13366-2 / IDF 148-2 (2006) by hodnoty opakovateľnosti (r)
mali byť nasledovné: na hladine 150 000 SB . ml-1 (r) 25 000 SB . ml-1, na hladine 300 000
SB . ml-1 (r) 42 000 SB . ml-1, na hladine 450 000 SB . ml-1 (r) 50 000 SB . ml-1, na hladine
750 000 SB . ml-1 (r) 63 000 SB . ml-1, na hladine 1 500 000 SB . ml-1 (r) 126 000 SB . ml-1.
Nami zistené hodnoty opakovateľnosti boli v toleranciách uvádzaných v návrhu vyššie
uvedenej normy.
V druhej fáze experimentu 2 (bod 3 experimentu 2) sme skúšali kvalitu referenčných
vzoriek s nízkym a vysokým počtom somatických buniek v reálnych laboratórnych
podmienkach v troch akreditovaných skúšobných laboratóriách.
V prípade referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek mierny vzostup
počtu somatických buniek v laboratóriu č. 1 nekorešponduje a nepatrný pokles počtu
somatických buniek v laboratóriu č. 2 a pokles počtu somatických buniek v laboratóriu č. 3
korešpondujú s údajmi zistenými Vermuntom et al. (1995), ktorí zistili mierny pokles počtu
somatických buniek.
V prípade referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek mierny vzostup
počtu somatických buniek v laboratóriu č. 1 a laboratória č. 2 nekorešpondujú a mierny
159
pokles počtu somatických buniek v laboratóriu č.3 korešponduje s údajmi zistenými
Vermuntom et al. (1995), ktorí zistili mierny pokles počtu somatických buniek.
Pokles počtu somatických buniek súhlasí s výsledkami Gonzala et al. (2003), ktorí
v prípade konzervácie vzoriek mlieka s dichromanom draselným zistili pokles počtu
somatických buniek.
Laboratórium č. 3 v porovnaní s laboratóriami č. 1 a č. 2 stanovilo počet somatických
buniek na hladine približne o 30 000 somatických buniek . ml-1 nižšej. Päť výsledkov meraní
laboratória č. 3 sa nachádzalo pod hranicou externého limitu. Predpokladáme, že meranie na
nižšej hladine súviselo s nastavením prístroja a nesúviselo s porušením kvality referenčnej
vzorky.
Z výsledkov vyplýva, že bude nutné zvýšiť hranicu externého limitu alebo použiť
vhodnejší spôsob konzervácie referenčnej vzorky.
Vypočítané hodnoty opakovateľnosti a reprodukovateľnosti boli v porovnaní
s hodnotami uvádzanými Vermuntom et al. (1995) podstatne nižšie.
Vypočítané hodnoty opakovateľnosti boli ± 10 579 somatických buniek . ml-1
v prípade referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek a ± 14 997 somatických
buniek . ml-1 v prípade referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek. Merania
boli uskutočnené na prístroji Fossomatic 5000. Hodnoty opakovateľnosti podľa návrhu normy
ISO/FDIS 13366-2 / IDF 148-2 (2006) boli uvedené vyššie. Nami vypočítané hodnoty
opakovateľnosti boli v toleranciách uvádzaných v návrhu tejto normy.
Vypočítané hodnoty reprodukovateľnosti boli ± 10 337 somatických buniek . ml-1
v prípade referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek a ± 21 802 somatických
buniek . ml-1 v prípade referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek. Merania
boli uskutočnené na prístroji Fossomatic 5000 a dvoch prístrojoch Combi Foss 6000). Podľa
návrhu normy ISO/FDIS 13366-2 / IDF 148-2 (2006) by hodnoty reprodukovateľnosti (R)
mali byť nasledovné: na hladine 150 000 SB . ml-1 (R) 38 000 SB . ml-1, na hladine 300 000
SB . ml-1 (R) 67 000 SB . ml-1, na hladine 450 000 SB . ml-1 (R) 88 000 SB . ml-1, na hladine
750 000 SB . ml-1 (R) 126 000 SB . ml-1, na hladine 1 500 000 SB . ml-1 (R) 252 000 SB.ml-1.
Nami zistené hodnoty reprodukovateľnosti boli v toleranciách uvádzaných v návrhu tejto
normy.
160
Vermunt et al. (1995) uvádzajú priemerné hodnoty opakovateľnosti ± 25 000
somatických buniek . ml-1 v prípade referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek
a ± 60 000 somatických buniek . ml-1 v prípade referenčnej vzorky s vysokým počtom
somatických buniek. Autori uvádzajú nasledovné priemerné hodnoty reprodukovateľnosti:
± 36 000 somatických buniek . ml-1 v prípade referenčnej vzorky s nízkym počtom
somatických buniek a ± 112 000 somatických buniek . ml-1 v prípade referenčnej vzorky
s vysokým počtom somatických buniek.
Z vypočítaných hodnôt reprodukovateľnosti a rozšírenej neistoty merania, ktoré sme
vypočítali z nameraných výsledkov všetkých troch zúčastnených laboratórií je možné
vypočítať externý limit.
Externý limit pre referenčnú vzorku s nízkym počtom somatických buniek by potom
mal byť ± 27 701 somatických buniek . ml-1 a pre referenčnú vzorku s vysokým počtom
somatických buniek ± 44 685 somatických buniek . ml-1.
Vypočítané externé limity odporúčame používať v praxi pri výrobe sekundárnych
referenčných materiálov s presným počtom somatických buniek.
Pri výpočte externého limitu sme zohľadnili nasledovné čiastkové neistoty typu B:
rozlišovacia schopnosť prístroja 1 000 SB . ml-1, opakovateľnosť prístroja na hladine do
300 000 SB . ml-1 (5 % = 15 000 SB . ml-1), opakovateľnosť prístroja na hladine do 500 000
SB . ml-1 (4 % = 20 000 SB . ml-1).
5.3 Experiment 3 – porovnanie výsledkov mikroskopických metód
V experimente 3 sme zistili, že výsledky metód A a B boli v porovnaní s výsledkami
metód C a E o 50 000 somatických buniek . ml-1 nižšie. Rozdiel medzi metódami bol do
určitej miery ovplyvnený nízkymi výsledkami stanovenými v NRLM u vzorky č. 10.
Nemáme však vysvetlenie prečo boli výsledky v prípade vzorky č. 10 nižšie v porovnaní
s výsledkami ostatných metód. Domnievame sa, že výsledky mohli byť ovplyvnené zlou
homogenizáciou vzorky počas prípravy vzorky, chybou pri pipetovaní počas prípravy
mikroskopického preparátu alebo kvalitou laboratórnej vzorky. Taktiež sa domnievame,
že rozdiel medzi metódami mohol byť ovplyvnený aj odľahlými výsledkami stanovenými
niektorými laboratóriami v kolaboratívnej štúdii. Ak sme do štatistického vyhodnotenia
nezahrnuli výsledky vzorky č.10, rozdiel medzi metódami A a B v porovnaní s metódami
C a E predstavoval 29 000 somatických buniek . ml-1. Pri porovnaní korelačných
koeficientov (Príloha 17, Tabuľka 2) sme zistili, že najvyšší korelačný koeficient je medzi
161
metódami C a E (0,999) a ďalej medzi metódami A a B (0,998). Tieto údaje súhlasia s údajmi
autorov, (Grappin a Jeunet, 1974; Heeschen, 1975; Schmidt-Madsen, 1975, 1979; Heald
et al., 1977, Gonzalo et al., 2003), ktorí zistili vysoké hodnoty korelačného koeficientu,
blízke hodnote 1,00.
162
6 NÁVRH NA VYUŽITIE ZISTENÝCH POZNATKOV
Poznatky zistené v experimente 1 boli využité pri optimalizácii a zavádzaní
referenčnej metódy stanovenia počtu somatických buniek v surovom kravskom mlieku, jej
validácii a následnej akreditácii v Národnom referenčnom laboratóriu pre mlieko a mliečne
výrobky v Nitre v decembri 2004, tieto poznatky sme odporučili zohľadniť pri tvorbe
medzinárodnej normy ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1.
Zavedenie referenčnej metódy stanovenia počtu somatických buniek bolo prvým
predpokladom pre realizáciu experimentu 2, v ktorom sme sa zamerali na prípravu
sekundárnych referenčných materiálov s presným počtom somatických buniek. Nami
pripravené sekundárne referenčné materiály sa v súčasnosti používajú v laboratóriách
vykonávajúcich stanovenie počtu somatických buniek v surovom mlieku. Predovšetkým
slúžia na kontrolu prístrojov typovej rady Fossomatic v Národnom referenčnom laboratóriu
pre mlieko a mliečne výrobky v Nitre a v centrálnych skúšobných laboratóriách v Bratislave
a v Žiline, ktoré vykonávajú skúšanie surového kravského mlieka pre trhové účely. Použitím
rovnakých referenčných materiálov vo vyššie uvedených laboratóriách sa zjednotilo
nastavenie laboratórnych prístrojov typu Fossomatic, odstránili sa rozdiely v laboratórnych
výsledkoch, zlepšila sa presnosť a správnosť laboratórnych výsledkov. Presné a správne
laboratórne výsledky sú dôležité pre prvovýrobcov mlieka ako aj spracovateľov mlieka,
pretože slúžia ako podkladové informácie pre účely preplácania. Z pohľadu hygieny
a technológie výroby mliečnych výrobkov je dôležité aby sa nespracovalo hygienicky
nevyhovujúce mlieko s vysokým počtom somatických buniek. Správne nastavené laboratórne
prístroje musia spoľahlivo detegovať počet somatických buniek v mlieku v oblasti
hygienického limitu (400 000 SB.ml-1) daného Nariadením Komisie (ES) č. 1662/2006,
ktorým sa mení a dopĺňa nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004.
Referenčné materiály pripravené v Národnom referenčnom laboratóriu pre mlieko
a mliečne výrobky umožňujú nastaviť laboratórne prístroje tak, aby merali presne a správne
v oblasti legislatívneho limitu. Sekundárne referenčné materiály s presným počtom
somatických buniek by mali mať uplatnenie aj v prevádzkových laboratóriách jednotlivých
mliekarenských podnikov, kde budú slúžiť na zvyšovanie kvality laboratórnej
práce, zvyšovanie presnosti a správnosti laboratórnych výsledkov pri skúšaní vstupnej
suroviny.
163
Z pohľadu vedy a laboratórnej diagnostiky, poznatky zistené v experimente 3 budú
slúžiť pre optimalizáciu mikroskopickej referenčnej metódy stanovenia počtu somatických
buniek v surovom kravskom mlieku. Na základe výsledkov experimentu sme porovnali
viaceré mikroskopické metódy stanovenia počtu somatických buniek. Doteraz nebola
publikovaná práca, ktorá by detailne porovnávala rozdielne mikroskopické metódy určené na
stanovenie počtu somatických buniek v surovom kravskom mlieku, predovšetkým postup
farbenia somatických buniek metylénovou modrou a postup farbenia etídium bromidom.
Poznatky zistené v experimente 3 sme navrhli zohľadniť pri tvorbe medzinárodnej normy
ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1. Veľké množstvo vedeckých prác zameraných na mastitídu
v chovoch dojníc, zvyšovanie účinnosti veterinárnych liečiv, genetiku a šľachtenie
hovädzieho dobytka, hygienu prvovýroby mlieka, technológiu výroby mliečnych výrobkov
využíva výsledky stanovenia počtu somatických buniek zistené pomocou prístrojov typu
Fossomatic. Vedecký výskum preto často závisí od správneho nastavenia laboratórnych
prístrojov. Optimalizácia referenčnej metódy stanovenia počtu somatických buniek a výroba
kvalitných sekundárnych referenčných materiálov môžu prispieť k získavaniu presných
údajov dôležitých pre vedecký výskum.
164
7 ZÁVER
Mastitída patrí medzi najdôležitejšie ochorenia hovädzieho dobytka. Ovplyvňuje
ekonomiku výroby mlieka, znižuje kvalitu mlieka a jeho technologickú využiteľnosť.
Hlavným indikátorom a diagnostickým štandardom pri zisťovaní mastitídy sú somatické
bunky. V bežnej praxi sa na stanovenie počtu somatických buniek používajú inštrumentálne
laboratórne metódy, ktorých presnosť sa musí overovať referenčnou metódou. V súčasnosti je
referenčnou metódou metóda EN ISO 13366-1 (2001) Mlieko, Stanovenie počtu somatických
buniek, Časť 1: Mikroskopická metóda.
V experimente 1 sme overili možnosť využitia vyššie uvedenej referenčnej metódy
s použitím farbiva EtBr a metódu sme porovnali s metódou publikovanou Vermuntom et al.
(1995), v ktorej sa pri farbení taktiež používa farbivo EtBr.
Medzi porovnávanými metódami sme zistili štatistický rozdiel 21 000 somatických
buniek . ml-1. Tento rozdiel bol podľa nášho názoru ovplyvnený metodikou výpočtu.
Výsledky oboch metód sa v porovnaní s výsledkami stanovenými na prístroji Fossomatic
nelíšili na hladine 300 000 somatických buniek . ml-1 o viac než 5 %.
Rozšírená neistota merania vypočítaná pre metódu EN ISO 13366-1 (2001) je 2 %,
resp. 7 % v závislosti od použitého spôsobu počítania jadier somatických buniek.
Rozšírená neistota merania vypočítaná pre metódu popísanú Vermuntom et al. (1995)
je 8 %, resp. 10 % v závislosti od použitého spôsobu počítania jadier somatických buniek.
Z empirických poznatkov zistených počas experimentu 1 vyplýva, že uvedené metódy
majú viaceré nedostatky, predovšetkým metodika počítania jadier somatických buniek
a výpočet môžu výrazne ovplyvniť výsledok analýzy. Pri výpočte odporúčame použiť vzorec
uvedený v návrhu normy ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005). Správnosť výsledku je vo
veľmi veľkej miere ovplyvnená zručnosťou, talentom a skúsenosťami laboranta.
Uvedené metódy sme validovali a akreditovali v decembri 2004.
V nadväznosti na experiment 1 sme vykonali experiment 2, v ktorom sme sa zamerali
na vývoj sekundárneho referenčného materiálu s presným počtom somatických buniek.
Pracovný postup prípravy referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek je
vhodný pre prípravu sekundárnych referenčných materiálov. Pripravené referenčné vzorky
boli stabilné počas celého experimentu. Hodnota reprodukovateľnosti stanovená z výsledkov
meraní troch zúčastnených akreditovaných skúšobných laboratórií pri skúšaní referenčnej
vzorky s nízkym počtom somatických buniek bola ± 10 337 somatických buniek . ml-1.
165
Pracovný postup prípravy referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek
sa bude môcť použiť na výrobu referenčných vzoriek iba vtedy ak sa zvýši „externý limit“
(interval, v ktorom sa musia nachádzať výsledky stanovené laboratóriami pri skúšaní
referenčnej vzorky), alebo sa zmení spôsob konzervácie referenčnej vzorky. Hodnota
reprodukovateľnosti stanovená z výsledkov meraní troch zúčastnených akreditovaných
skúšobných laboratórií pri skúšaní referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek
bola ± 21 802 somatických buniek . ml-1.
Zistené hodnoty reprodukovateľnosti sú v porovnaní s hodnotami udávanými
Vermuntom et al. (1995) podstatne nižšie a naznačujú zlepšenie presnosti inštrumentálnej
laboratórnej metódy vplyvom jej technického vývoja za uplynulých desať rokov.
Pomocou referenčných vzoriek bude môcť Národné referenčné laboratórium pre
mlieko a mliečne výrobky vykonávať kontrolu súčasného systému hodnotenia kvality
surového kravského mlieka na Slovensku v oblasti somatických buniek.
Z výsledkov experimentu 2 vyplynulo viacero otázok, ktoré by mali byť predmetom
ďalšieho výskumu. Predovšetkým sa bude musieť porovnať ako pôsobia rôzne koncentrácie
a kombinácie konzervačných látok za aplikácie alebo bez aplikácie tepelného ošetrenia na
kvalitu referenčných vzoriek.
V experimente 3 sme navzájom porovnali výsledky piatich mikroskopických metód
stanovenia počtu somatických buniek a inštrumentálnej metódy. Zistili sme, že výsledky
metód sa v priemere významne líšia. Výsledky stanovené v NRLM modifikovaným
pracovným postupom návrhu normy ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 za použitia farbiva EtBr
a farbení pri 100 °C boli o 50 000 somatických buniek . ml-1 nižšie v porovnaní s výsledkami
stanovenými pri farbení metylénovou modrou podľa normy ISO/WD 13366-1 IDF 148-1.
Rozdiel medzi metódami bol však ovplyvnený výsledkami vzorky č. 10 stanovenými
v NRLM a odľahlými výsledkami stanovenými v kolaboratívnej štúdii pri farbení
metylénovou modrou. Výsledky stanovené pracovným postupom návrhu normy ISO/WD
13366-1 IDF 148-1 za použitia farbiva EtBr a farbení pri 50 °C boli o 130 000 somatických
buniek . ml-1 nižšie v porovnaní s výsledkami stanovenými pri farbení metylénovou modrou
podľa normy ISO/WD 13366-1 IDF 148-1.
Odporúčame vykonať zmenu v návrhu normy ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 a pri
metóde farbenia pomocou EtBr navrhujeme použiť teplotu 100 °C. Neodporúčame ďalej
používať spôsob výpočtu podľa STN EN ISO 13366-1 (2001) s použitím faktora závislého od
počtu kompletne zrátaných pruhov, pretože môže dochádzať k skresleniu výsledkov.
166
Ako vhodnú alternatívu odporúčame použiť nový spôsob výpočtu, ktorý sa uvádza v návrhu
normy ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1.
Správnosť laboratórnych výsledkov stanovenia počtu somatických buniek má význam
z pohľadu laboratórnej diagnostiky, hygieny prvovýroby mlieka, technológie výroby
mliečnych výrobkov a bezpečnosti potravín. Veríme, že prostredníctvom zistených výsledkov
a poznatkov sme prispeli k optimalizácii referenčnej mikroskopickej metódy stanovenia počtu
somatických buniek v surovom kravskom mlieku.
167
8 ZOZNAM POUŽITEJ LITERATÚRY
1. BARO, J. A. – ROLDÁN, P. – CARLEOS, C. E. – GRILLO, G. J. – PÉREZ, M. A.
Video-microscopy as an Alternative Method for Evaluation of Somatic Cell Count. In
Journal Dairy Research, roč. 72, February 2005, č. 1, s. 93 -100.
2. BARKEMA, H. W. – VAN DER SCHANS, J. – SCHUKKEN, Y. H. – DE GEE, A. L.
W. – LAM, T. J. G. M. – BENEDICTUS, G. Effest of Freezing on Somatic Cell Count
of Quarter Milk Samples as Determined by a Fossomatic Electronic Cell Counter. In
Journal Dairy Science, roč. 80, 1997, s. 422 – 426.
3. BENSAUDE, O. Ethidium Bromide and Safety-Readers Suggest Alternative Solutions. In
Trends Gent. roč. 4, 1988, s. 89.
4. BERTRAND, J. A. Influence of shipping container, preservative, and breed on analysis
of milk components of shipped samplies. In Journal Dairy Science, roč. 79, 1996, s. 145 -
148.
5. BODDIE, R. L. – OWENS, W. E. – RAY, C. H. – NICKERSON, S. C. – BODDIE, N.
T. Germicidal Activities of Representatives of Five Different Teat Dip Classes Against
Three Bovine Mycoplasma Species Using a Modified Excised Teat Model. In Journal
Dairy Science, roč. 85, 2002, s. 1909 -1912.
6. BORM, A. A. – FOX, K. L. – LESLIE, K. E. – HOGAN, J. S. – ANDREW, S. M. –
MOYES, K. M. – OLIVER, S. P. – SCHUKKEN, Y. H. – HANOCK, D. D. –
GASKINS, C. T. – OWENS, W. E. – NORMAN, C. Effects of Prepartum
Intramammary Antibiotic Therapy on Udder Health, Milk Production, and Reproductive
Performance in Dairy Heifers. In Journal Dairy Science, roč. 89, 2006, s. 2090 - 2098.
7. BRADLEY, A. J. – GREEN, M. J. An Investigation of the Impact of Intramammary
Antibiotic Dry Cow Therapy on Clinical Coliform Mastitis. In Journal Dairy Science, roč.
2001, s. 1632 -1639.
8. BYRON, F. BREHM-STECHER. – JOHNSON, E. A. Sensitization of Staphylococcus
aureus and Escherichia coli to Antibiotics by the Sesquiterpenoids Nerolidol, Farnesol,
Bisabolol, and Apritone. In Antimicrob Agents Cemother, roč. 47, October 2003, č. 10, s.
3357 - 3360.
9. BURDOVÁ, O. Kvalita potravín z pohľadu výrobnej a kontrolnej činnosti na konferencii
Hygiena Alimentorum XIX. In Mliekarstvo, roč. 29, 1998, č. 4, s. 46.
10. BURDOVÁ, O. – BARANOVÁ, M. – MAĽA, P. – PAŽÁKOVÁ, J. Mastitídy I.
Aktuálny problém prvovýroby mlieka. In Infovet, roč. 6, 1999, s. 27 - 28.
168
11. CARTER. E. W. – KERR, D. E. Optimization of DNA-based Vaccination in Cows
Using Green Fluorescent Protein and Protein A as a Prelude to Immunization Against
Staphylococcal Mastitis. In Journal Dairy Science, roč. 86, 2003, s.1177 - 1186.
12. DAWSON, S. Ethidium bromide Decontamination. [online]. February 1996 [cit. 2005-01-
25] Department of Biochemistry, University of Nottingham. Dostupné na internete:
<http://www.nottingham.ac.uk/~mbzspd/methods/Ethidium_ Bromide_Dec.html>.
13. DE HAAS, Y. 2003. Somatic cell count patterns: Improvement of udder health by
genetics and management: PhD Thesis. Wageningen : Wageningen Universiteit, 2003.
177 s. ISBN 90-5808-873-1.
14. DELUYKER, H. A. – VAN OYEE, S. N. – BOUCHER, J. F. Factors Affecting Cure
and Somatic Cells Count After Pirlimycin Treatment of Subclinical Mastitis in Lactating
Cows. In Journal Dairy Science, roč. 88, s. 604 - 614.
15. D'HAESE, E. - NELIS, H. J. - REYBROECK, W. Determination of somatic cells in
milk by solid phase cytometry. In J. Dairy Research, roč. 68, February 2001, č. 1, s. 9 -14.
16. DOSOGNE, H. – VANGROENWEGHE, F. – MEHRZAD, J. – MASSART-LEËB,
A. M. – BURVENICH, C. Differential Leukocyte Count Method for Bovine Low
Somatic Cell Count Milk. In Journal Dairy Science, roč. 86, 2003, s. 828 - 834.
17. DRAHOŠOVÁ, K. – DRONČOVSKÝ, M. Mastitída – najčastejšia príčina zníženej
akosti mlieka. In Mliekarstvo, roč. 35, december 2004, č. 4, s. 7.
18. ELEČKO, J. Trendy v problematike výskumu ÚEVM V Košiciach. Mastitídy a sekrečné
poruchy mliečnej žľazy. In Slovenský veterinársky časopis, roč. XX, 1995, č. 5, s. 218 -
226.
19. Ethidium Bromid Safety: [online]. May 1999 [cit. 2005-01-25]. University of
Washington, Enviromental Health and Safety. Dostupné na internete: <http://www.ehs.
washington.edu/updates/TipsEthidium.htm>.
20. Eurachem: Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement – Guide. 8. Step 4.
Calculating the Combined Uncertainty. [online]. 2000 [cit. 2006-02-19]. Dostupné na
internete: <www.measurementuncertainty.org/mu/guide/index.html>.
21. FAIRBAIM, D. J. – LAW, B. A. Proteinases of psychrotrophic bacteria: their
production, properties, effects and control. In J. Dairy Res., roč. 53, 1986, s. 139 – 177.
22. FITTS, J. E. – MURPHY, S. Direct Microscopic Somatic Cell Count Guideline – Rules
and Examples for Counting Somatic Cell in Milk. [online]. July 2004 [cit. 2006-01-08].
Department of Food Science Cornell University, Ithaca, New York, Dostupné na
internete: <http://www.foodscience.cornell.edu/mqip/BACT-DMCmum-SCC.doc>.
169
23. FOLTYS, V. – KIRCHNEROVÁ, K. Uplatnenie kontrolného mastitídneho programu
v praxi. [online]. 2003 [cit. 2005-12-30]. Ústav vedecko-technických informácií pre
pôdohospodárstvo, Nitra. Dostupné na internete: <http://www.agroporadenstvo.sk/zv/hd/
drobnosti/mastitpr.htm>.
24. FOSS ELECTRIC: Integrated Milk TestingTM Type 29500 Reference manual. GB FOSS
Issue 5GB October 2000 P/N 491647.
25. GERALD, M. J. J. How Does Somatic Cell Count Affect Milk Quality & Safety?
[online]. 2001 [cit. 2005-12-29]. College of Agriculture and Life Sciences, Department of
Dairy Science. Dostupné na internete: <www.dasc.vt.edu/faculty/jones/ MilkSafe.htm>.
26. GOLIAN, J. 1998. Ochorenia z potravín. 1. vyd. SPU v Nitre : Tlačové a edičné
stredisko SPU v Nitre, 1998. 128 s. ISBN 80-7137-519-5.
27. GONZALO, C. - MARTI´NEZ, J. R. – CARRIEDO, J. A. – SAN PRIMITIVO, F.
Fossomatic Cell-Cunting on Ewe Milk: Comparison with Direct Microscopy and Study of
Variation Factors. In Journal Dairy Science, roč. 86, 2003, s. 138 - 145.
28. GRAPPIN, R. – JEUNET, R. Premiers essais de l’appareil Fossomatic pour la
de´termination automatique du nombre de cellules du lait. In Le lait, roč. 54, 1974 s. 627 -
644.
29. GRIEGER, C. – HOLEC, J. et al. 1990. Hygiena mlieka a mliečnych výrobkov. 1. vyd.
Bratislava : Príroda, 1990. 397 s. ISBN 80-07-00253-7.
30. GRÖHN, Y. T. – WILSON, D. J. – GONZÁLEZ, R. N. – HERTL, J. A. –
SCHULTE, H. – BENNETT, G. – SCHUKKEN, Y. H. Effect of Pathogen-Specific
Clinical Mastitis on Milk Yield in Dairy Cows. In Journal Dairy Science, roč. 87, 2004, s.
3358 - 3374.
31. HAGELTORN, M. – SAAD, M. A. Flow cytofluorometric characterization of bovine
blood and milk leukocytes. In Am. J. Vet. Res., roč. 47, 1986, s. 2012 - 2016.
32. HALAJ, M. Meradlá – Prednáška 2 - Všeobecná metrológia: Prednáška. Strojnícka
fakulta STU v Bratislave, 2003, zimný semester 2003/2004. s.31. [online]. 2003 [cit.
2006-06-18]. Strojnícka fakulta STU v Bratislave. Dostupné na internete:
<http://www.kam.sjf.stuba.sk/katedra/vyuka/pt4/ VM-prednaska2-meradla.pdf>.
33. HALAJ, M. Chyby a neistoty merania – neistoty merania - Všeobecná metrológia:
Prednáška. Strojnícka fakulta STU v Bratislave, november 2004. s. 3, s.17, s.19 a s. 20.
[online]. 2004 [cit. 2006-06-18]. Strojnícka fakulta STU v Bratislave. Dostupné na
internete: <http://www.kam.sjf.stuba.sk/ katedra/vyuka/pt4/VM-prednaska6-neistota.pdf>.
170
34. HANUŠ, O. et al.. Význam laboratórního testování syrového kravského mléka pro
chavatele dojnic. In Mliekarstvo, roč. 35, 2004, č. 2, s. 31 - 38.
35. HARMON, R. J. Controlling Contagious Mastitis, [online]. 2006 [cit. 2005-01-25]. A
Global Organization for Mastitis Control and Milk Quality, Verona, WI, USA. Dostupné
na internete: <http://www.nmconline.org/articles/contagious.htm>.
36. HARMON, R. J. Physiology of Mastitis and Factors Affecting Somatic Cell Counts. In
Journal Dairy Science, roč. 77, 1994, č. 7, s. 2103 – 2112.
37. HEALD, C.W. – JONES, G. M. – NICKERSON, S. C. – PATTERSON, W. N. –
VINSON, W. E. Preliminary evaluation of the Fossomatic somatic cell counter for
analysis of individual cow samples in a central testing laboratory. In J. Food Prot., roč.
40, 1977, s. 523 – 526.
38. HEESCHEN, W. Determination of somatic cells in milk (technical aspect of counting).
Bull. Int. Dairy Fed. roč. 85, s. 79 - 92.
39. HOGAN, J. S. – HARMON, R. J. - LANGLOIS, B. E. - HEMKEN, R. W. – CRIST,
L. W. Efficacy of an iodine backflush for preventing new intramammary infections. In
Journal Dairy Science, roč. 67, 1984, s.1850 - 1859.
40. HOGAN, J. S. – SMITH, K. L. A practical look at enviromental mastitis. Cornp.
Continuing Educ. Bacterial. In Pract. Vet., roč. 9, 1987, č. 10, s. F341.
41. HOGAN, J. S. – SMITH, K. L. – TOOHUNTER, D. A. – SCHIENBERGER, P.S.
Bacterial Counts Associated with Recycled Newspaper Bedding. In Journal Dairy
Science, roč. 73, 1990, s.1756 – 1761.
42. HOGAN, J. S. – WEISS, W. P. – SMITH, K. L. Role of Vitamin E and Selenium in
Host Defense Against Mastitis. In Journal Dairy Science, roč. 76, 1993, s.2795 – 2803.
43. HOGAN, J. S. – SMITH, K. L. Bacteria Counts in Sawdust Bedding. In Journal Dairy
Science, roč. 80, 1997, s.1600 – 1605.
44. HRAZDÍRA, I. 1990. Biofyzika. Učebnice pro lékařské fakulty. 2. vyd. Praha :
Avicenum, 1990. 318 s. ISBN 80-201-0046-6.
45. CHAMBERLAIN, N. Gastrointestinal tract infection. [online]. 2005 [cit. 2005-03-23].
Kirksville College of Osteopathic Medicine. Dostupné na internete: <http://www.kcom
.edu/faculty/chamberlain/gastro.htm#staph>.
46. CHORVÁT, D. Biofyzika. Bratislava: Univerzita Komenského Bratislava, 1998. s. 42-43.
ISBN 80-223-1083-2. [online – elektronický učebný text]. 2006 [cit. 2006-06-22].
Univerzita Komenského Bratislava. Dostupné na internete: <http://www.fmph.uniba.sk/
mffuk/studium/stud_materialy/stud_ materialy/biofyz/biof03.pdf>.
171
47. ICAR: Analytical methods for milk recording analysis. [online]. Version n°1 –
13/10/2005 [cit. 2005-12-30]. International Committee for Animal Recording. Dostupné
na internete: <http://www.icar.org/DOCS/milk_laboratories_leray/List_analytical_ metho
ds_in_milk_recording.pdf>.
48. IKONEN, T. – MORRI, S. – TYRISEVÄ, A. M. – RUOTTINEN, O. – OJALA, M.
Genetic and Phenotypic Correlations Between Milk Coagulation Properties, Milk
Production Traits, Somatic Cell Count, Casein Content, and pH of Milk. In Journal Dairy
Science, roč. 87, 2004, s.458 - 467.
49. INGAWA, K. H. – ADKINSON, R. W. – GOUGH, R. H. Evaluation of Gel Teat
Cleaning and Sanitizing Compounds for Premilking Hygiene. In Journal Dairy Science,
roč. 75, 1992, s.1224 – 1232.
50. ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1: 2005, Milk - Enumaration of somatic cells - Part 1:
Microscopic method (Reference method).
51. ISO/WD 13366-2 / IDF 148-2: 2006, Milk – Enumeration of somatic cells – Part 2:
Guidance on the operation of fluoro-opto-electronic counters.
52. ISO 13366-3: 1997, Milk - Enumeration of somatic cells - Part 3: Fluoro-opto-electronic
method.
53. KAZDA, J. Úvod do nejistot měření. In Zborník prednášok zo seminára Stanovovanie
neistôt merania, kalibrácie a výkonu skúšok. Spišská Nová Ves, Kalibračné združenie SR
a Q-Test plus s.r.o. Bratislava, február 2006, s. 70 a s. 73.
54. KLEI, L. – YUN, J. – SAPRU, A. – LYNCH, J. – BARBANO, D. – SEARS, P. –
GALTON, D. Effects of Milk Somatic Cell Count on Cottage Cheese Yield and Quality.
In Journal Dairy Science, roč. 81, 1998, s. 1205 - 1213.
55. KOLLER, L. Analytická chémia. Princípy analytických metód pre anorganickú prvkovú
analýzu: Študijný materiál pre študentov HF a FBERG TU. Košice: Technická univerzita
v Košiciach, 2002 s. 16. [online]. 2002 [cit. 2006-01-19]. Technická univerzita Košice.
Dostupné na internete: <http://sk ripta.lib.tuke.sk/16000/pdf/AnalytickaChemiaLadislav
Koller_ALL.pdf>.
56. KOVÁČ, G. - et al. Choroby hovädzieho dobytka. 1. vyd. Prešov : M&M vydavateľstvo
Prešov, október 2001. s. 673.- 676. ISBN 80-88950-14-7.
57. KOVÁČIK, J. – VALENT, M. – KOLLÁROVÁ, E. Fyziológia zvierat. 2. upravené
vyd. Nitra : Vydavateľské a edičné stredisko Vysokej školy poľnohospodárskej v Nitre,
1996. 284 s. ISBN 80-7137-322-2.
172
58. KRISTULA, M. A. – ROGERS, W. – HOGAN, J. S. – SABO, M. Comparison of
Bacteria Populations in Clean and Recycled Sand used for Bedding in Dairy Facilities. In
Journal Dairy Science, roč. 88, 2005, s. 4317 - 4325.
59. KULÍŠEK, V. – HLUCHÝ, S. – MASSANYI, L. – MARENČÁK, L. – UHRÍN, V.
Funkčná anatómia hospodárskych zvierat. 3. upravené vyd. Nitra : Vysoká škola
poľnohospodárska v Nitre, 1996. s. 6., s. 40. ISBN 80-7137-323-0.
60. LE ROUX, Y. – COLIN, O. LAURENT, F. Proteolysis in Samples of Quarter Milk with
Varying Somatic Cell Counts. 1. Comparison of Some Indicators of Endogenous
Proteolysis in Milk. In Journal Dairy Science, roč. 78, 1995, s. 1289 – 1297.
61. LONGUET, M. – SERDUC, R. – RIVA, C. Implication of bax in apoptosis depends on
microtubule network mobility. In International Journal Oncology, roč. 25, 2004, s. 309-
317. [online]. 2004 [cit. 2006-06-22]. University of Crete, Faculty of Medicine. Dostupné
na internete: <http://147.52.72.117/IJO/ 2004/volume25/number2/309.pdf>.
62. LUNN, G. - SANSONE, E. B. Ethidium Bromide. Destruction and Decontamination of
Solutions. In Anal. Biochem. roč. 162, 1987, s. 453 - 458.
63. LUNN, D. - SANSONE, E. B. Decontamination of Ethidium Bromide Spills. In Appl.
Ind. Hyg. roč. 4, 1989, s. 234-237.
64. ĽALÍK, V. Neistoty merania pri kalibrácii posuvných meradiel. In Zborník prednášok zo
seminára Stanovovanie neistôt merania, kalibrácie a výkonu skúšok. Spišská Nová Ves :
Kalibračné združenie SR a Q-Test plus s.r.o. Bratislava, február 2006, s. 103.
65. MA, Y. – RYAN, C. – BARBANO, D. M. – GALTON, D. M. – RUDAN, M. A.
BOOR, K. J.: Effects of Somatic Cell Count on Quality and Shelf-Life of Pasteurized
Fluid Milk. In Journal Dairy Science, roč. 83, 2000, s. 264 - 274.
66. MAF NZ: Ministry of Agriculture and Forestry New Zealand: MAF Food: Dairy
Plants, Circular number 69, Dairy Industry Regulations 1990, D115.1 Raw Milk
Acceptance, 1990. ISBN 0-478-07639-8. [online]. 1990 [cit. 2006-01-13]. Dostupné na
internete: <http://www.nzfsa.govt.nz/dairy/publications/standards/d115-1.pdf>.
67. MARCUS, E. – KEHRLI, JR. Factors Affecting Milk Somatic Cells and Their Role in
Health of the Bovine Mammary Gland. In Journal Dairy Science, roč. 77, 1994, s. 619 -
627.
68. MARTÍNEZ, J. R. – GONZALO, C. – CARRIEDO, J. A. – SAN PRIMITIVO, F.
Effect of Freezing on Fossomatic Cell Counting in Ewe Milk. In Journal Dairy Science,
roč. 86, 2003, s. 2583 – 2587.
173
69. MATTHEWS, K. R. – REJMAN J. J. – TURNER, J.D. – OLIVER, S.P. Proliferation
of a Bovine Mammary Epithelial Cell Line in the Presence of Bacterial Virulence Factors.
In Journal Dairy Science, roč. 77, 1994, s. 2959 - 2964.
70. MIDOUX, P. – MAYER, R. – MONSIGNY, M. Membrane permeabilization by α-
helical peptides: a flow cytometry study. In Biochim. Biophys. Acta. roč.1239(2), 1995, s.
249-256. [online]. November 1, 1995 [cit. 2006-06-01]. National Center for
Biotechnology Information, U. S. National Library for Medicine. Dostupné na internete:
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abs
tract &list_uids =7488630>.
71. MIKULA, I. – PILIPČINEC, E. – TKÁČIK, J. – PISTIL, J. – HOLODA, E.:
Veterinárna mikrobiológia a imunológia. Praktické cvičenia. 1. vyd. Bratislava : Príroda
pre Vysokú školu veterinársku v Košiciach, 1985. 205 s.
72. MILES, H. – LESSER, W – SEARS, P. Our Industry Today. The Economic
Implications of Bioengineered Mastitis Control. In Journal Dairy Science, roč. 75, 1992,
s. 596 – 605.
73. MILK QUALITY REGULATION: Dairy Products Act, N.B. Reg. 86-118. [online].
1986 [cit. 2005-02-25]. Canadian Legal Information Institute. Dostupné na internete:
<http://www.canlii.org/nb/laws/regu/1986 r.118/20050114/whole.html>.
74. MURPHY, S. C. – BOOR, K. J. Sources and Causes of High Bacteria Counts in Raw
Milk: An Abbreviated Review. [online]. 1999 [cit. 2005-01-25]. Department of Food
Science Cornell University, Ithaca, New York, Dostupné na internete:
<http://www.foodscience.cornell.edu/mqip/BACTRawRev.doc>.
75. Nariadenie (ES) č. 853/2004 Európskeho parlamentu a Rady z 29. apríla 2004, ktorým sa
ustanovujú osobitné hygienické predpisy pre potraviny živočíšneho pôvodu. [online]. 2004
[cit. 2006-02-07]. Štátna veterinárna a potravinová správa SR. Dostupné na internete:
<http://www.svps.sk/sk/pdf/legislativa/nk_0853 _2004.pdf>.
76. Nariadenie (ES) č. 854/2004 Európskeho parlamentu a Rady z 29. apríla 2004, ktorým sa
ustanovujú osobitné predpisy na organizáciu úradných kontrol produktov živočíšneho
pôvodu určených na ľudskú spotrebu. [online]. 2004 [cit. 2006-02-07]. Štátna veterinárna
a potravinová správa SR. Dostupné na internete: <http://www.svps.sk/sk/pdf/legisl
ativa/nk_0854_2004.pdf>.
77. Nariadenie Komisie (ES) č. 1662/2006 zo 6. novembra 2006 , ktorým sa mení a dopĺňa
nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004, ktorým sa ustanovujú
osobitné hygienické predpisy pre potraviny živočíšneho pôvodu. [online]. 2006 [cit. 2006-
174
10-07]. Eurlex. Dostupné na internete: <http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/
LexUriServ.do?uri=OJ:L:2006:320:0001:0010:SK:PDF>.
78. Nariadenie Komisie (ES) č. 1664/2006 zo 6. novembra 2006, ktorým sa mení a dopĺňa
nariadenie (ES) č. 2074/2005, pokiaľ ide o vykonávacie opatrenia pre určité produkty
živočíšneho pôvodu určené na ľudskú spotrebu, a zrušujú určité vykonávacie opatrenia.
[online]. 2006 [cit. 2006-10-07]. Eurlex. Dostupné na internete: <http://eur-
lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2006:320:0013:0045:SK:PDF>.
79. Nariadenie vlády Slovenskej republiky č. 312/2003 Z.z. o zdravotných požiadavkách na
výrobu a uvádzanie na trh surového mlieka, tepelne ošetreného mlieka a mliečnych
výrobkov. [online]. 2003 [cit. 2006-02-07]. Štátna veterinárna a potravinová správa SR.
Dostupné na internete: <http://www.svps.sk/sk /pdf/legislativa/nv_312_2003.pdf>.
80. Nariadenie vlády Slovenskej republiky č. 284/2004 Z.z., ktorým sa mení a dopĺňa
nariadenie vlády Slovenskej republiky č. 312/2003 Z. z. o zdravotných požiadavkách na
výrobu a uvádzanie na trh surového mlieka, tepelne ošetreného mlieka a mliečnych
výrobkov. [online]. 2004 [cit. 2006-02-07]. Štátna veterinárna a potravinová správa SR.
Dostupné na internete: <http://www.svps.sk /sk/pdf/legislativa/nv_0284_2004.pdf>.
81. NEAVE, F. K. - DODD, D. H. - KINGWILL, R.G. – WESTGARTH, D.R. Control of
mastitis in the dairy herd by hygiene and management. In Journal Dairy Science, roč. 79,
1996, s. 52:696.
82. NICKERSON, S.C. Clinical Mastitis: to Treat Or Not to Treat, [online]. 1995 [cit. 2005-
12-18]. Department of Agricultural, Food and Nutritional Science. University of Alberta,
Edmonton. Dostupné na internete: <http://www.wcds.afns.ualberta.ca/Proceedings/1996/
wcd96355.htm>.
83. NZFSA: New Zealand food safety authority. Dairy Circular. [online]. 1997 [cit. 2005-
03-23]. Dostupné na internete: <http://www.nzfsa.govt.nz/dairy/publications/circulars
/no31.htm>.
84. OLIVER, S. P. – KING, S. H. – TORRE, P. M. – SHULL, E. P. - DOWLEN, H. H. –
LEWIS, M. J. – SORDILLO, L. M. Prevention of bovine mastitis by a postmilking teat
disinfectant containing chlorous acid and chlorine dioxide in a soluble polymer gel. In
Journal Dairy Science, roč. 72, 1989, s. 3091 – 3097.
85. ORLANDINI, S. Collaborative Study – Reference Method For Somatic Cell Counting
ISO 13366-1 FIL/IDF 148-1, Cow Milk, October 2005 : kolaboratívna štúdia. Roma :
Joint Action Team on Automated Method-Working group “Somatic Cell Count”,
175
Associazione Italiana Allevatori Laboratorio Standard Latte V.dell’ Industria, 24
Maccarese, Roma – Italy, 2005. 11 s.
86. ÖSTENSSON, K. – HAGELTORN, M. – ASTROM, G. Differential cell counting in
fraction-collected milk from dairy cows. In Acta Vet. Scand. roč. 29, 1988, s. 493 – 500.
87. OWENS, W. E. – NICKERSON, S. C. – BODDIE, L. R. – TOMITA, G. M. – RAY,
C. H. Prevalence of Mastitis in Dairy Heifers and Effectiveness of Antibiotic Therapy. In
Journal Dairy Science. roč. 84, 2001, s. 814 - 817.
88. PILLAI, S. R. – KUNZE, E. – SORDILLO, L. M. – JAYARAO, B. M. Application of
Differential Inflammatory Cell Count as a Tool to Monitor Udder Health. In Journal
Dairy Science, roč. 84, 2001, s. 1413 - 1420.
89. POLITIS, I. – NG-KWAI-HANG, K. F. Effects of somatic cells count and milk
composition on the coagulating properties of milk. In Journal Dairy Science, roč. 71,
1988, s. 1740 – 1746.
90. POPELKA, P. Rezíduá penicilínov v potravinách a surovinách živočíšneho pôvodu :
dizertačná práca. Košice : Univerzita veterináskeho lekárstva, Katedra hygieny
a technológie potravín, 2001. 66 s.
91. PYÖRÄRLÄ, S. Indicators of inflammation in the diagnosis of mastitis. In Vet. Res. roč.
34, 2003, 565 - 578.
92. QUILLARDET, P.- HOFNUNG, M. Ethidium Bromide and Safety-Readers Suggest
Alternative Solutions. In Trends Genet., roč. 4, 1988, s. 89 - 90.
93. RAJAH, R. Mastitis. In Small-Scale Dairy Farming Manual, roč. 5, 1993, Husbandry
Unit 10.5, s. 119. [online]. 1993 [cit. 2005-12-30]. Food and Agriculture Organization of
the United Nations. Dostupné na internete: <http://www.fao.org/ag/againfo/subjects/
documents/Dairyman/Dairy/V5U10_5.htm>.
94. REDELMAN, D. – BUTLER, S. – ROBISON, J. – GARNER, D. Identification of
inflammatory cells in bovine milk by flow cytometry. In Cytometry, roč. 9, 1988, s. 463 –
468.
95. RIAN, M. P. – MEANEY, W. J. – ROSS, P. E. – HILL, C. Evaluation of Lacticin 3147
and Teat Seal Containing This Bacteriocin for Inhibition of Mastitis Pathogens. In Appl.
Environ. Microbiol., roč. 64, 1998, č. 6, s. 2287 - 2290.
96. RICE, D. N. Using the California Mastitis Test (CMT) to Detect Subclinical Mastitis.
File G556 under DAIRY C-3, Herd Management. [online]. 1987, electronic version
issued: January1997 [cit. 2005-12-30]. University of Nebraska-Lincoln. Dostupné na
internete: <http://ianrpubs.unl. edu/dairy/g556.htm#top>.
176
97. RIMARČÍK, M. Opisné charakteristiky. [online]. [cit. 2006-02-19]. Marián Rimarčík,
osobná web stránka. Dostupné na internete: <http://rimarcik.com/sk/navigator/och.htm>.
98. RIVAS, A. L. – TADEVOSYAN, R. – QUIMBY, F. W. – COAKSAYGAN, T. –
LEIN, D. H. Identification of subpopulations of bovine mammary-gland phagocytes and
evaluation of sensitivity and specificity of morphologic and functional indicators of
bovine mastitis. In Canadian J. Vet. Res., roč. 66, 2002, s. 165 - 172.
99. RUEGG, P. L. – TABONE, T. J. The Relationship Between Antibiotic Residue
Violations and Somatic Cell Counts in Wisconsin Dairy Herds. In Journal Dairy Science,
roč. 83, 2000, s. 2805 – 2809.
100. SAAD, A. M. – ÖSTENSSON, K. Flow cytofluorometric studies on the alteration of
leukocyte populations in blood and milk during endotoxin-induced mastitis in cows. In
Am. J. Vet. Res. roč. 51, 1990, s. 1603 – 1607.
101. SAEMAN, A. I. – VERDI, R. J. – GALTON, D. M. – BARBANO, D. M. Effect of
mastitis on proteolytic activity in bovine milk. In Journal Dairy Science, roč. 71, 1988 s.
505 - 512.
102. SANTOS, M. V. – MA, Y. – BARBANO, D. M. Effect of Somatic Cell Count on
Proteolysis and Lipolysis in Pasteurized Fluid Milk During Shelf-Life Storage. In
Journal Dairy Science, roč. 86, 2003, s. 2491 – 2503.
103. SCHAIK, V.G. – LOTEM, M. – SCHUKKEN, Y.H. Trends in Somatic Cell Counts,
Bacterial Counts, and Antibiotic Residue Violations in New York State During 1999–
2000. In Journal Dairy Science. roč. 85, 2002, s. 782 – 789.
104. SCHMIDT-MADSEN, P. Fluoro-opto-electronic cell-counting on milk. In Journal
Dairy Research, roč. 42, 1975, s. 227 - 239.
105. SCHMIDT-MADSEN, P. Influence of storage and preservation of milk samples on
microscopic and Fossomatic somatic cell counts. In Nord. Vet. Med. roč. 31, 1979, s.
449 – 454.
106. SCHUKKEN, F. J. – GROMMERS, D. VAN DE GEER. – ERE, H. N. – BRAND,
A. Risk Factors for Clinical Mastitis in Herds with a Low Bulk Milk Somatic Cell
Count. Risk Factors for Escherichia coli and Staphylococcus aureus. In Journal Dairy
Science, roč. 74, 1991, s. 826 - 832.
107. Sigma-Aldrich Co.: 2006-2007 Biochemicals, Reagents & Kits for Life Science
Research – catalogue. Sigma-Aldrich Co., 2006, s. 964.
108. SLANINA, Ľ. – BARTKO, P. – ČANECKÝ, P. – FRIED, K. – HOJOVCOVÁ, M.
– RADEMACHER, R. – VRZGULA, L. Klinická propedeutika a diagnostika
177
vnútorných chorôb hospodárskych zvierat. 1. vydanie. Bratislava : Slovenské
vydavateľstvo pôdohospodárskej literatúry Bratislava, 1965. 574 s.
109. Smernica rady 92/46/EHS zo 16. júna 1992, ktorou sa stanovujú hygienické predpisy
pre výrobu surového mlieka, tepelne ošetreného mlieka a mliečnych výrobkov a ich
uvádzanie na trh. Official Journal of the European Communities No. L 268, 14-9-1992.
110. SMITH, K. L. – TODHUNTER. L. D. A., - SCHOENBERGER, S. Enviromental
mastitis: cause, prevalence, prevention. In Journal Dairy Science, roč. 68, 1985, s. 1531.
111. SMITH, K. L. Standards for somatic cells in milk: Physiological and regulatory.
Mastitis Newsletter, Newsletters of the IDF No.144, 1996. s 7.
112. SMITH, K. L. – HOGAN, J.S. Milk Quality a Worldwide Perspective. [online]. 1998
[cit. 2005-01-25]. A Global Organization for Mastitis Control and Milk Quality, Verona,
WI, USA. Dostupné na internete: <http://www.nmconline.org/articles/keynote98.htm>.
113. SNAS: Slovenský národný akreditačný systém: Metodické smernice na akreditáciu.
Vyjadrovanie neistôt merania pri kalibrácii, MSA 0104-97 EAL R2. [online]. 1997 [cit.
2006-01-19]. ÚNMS SR. Dostupné na internete: <http://www.snas.sk/files/msa/MSA
_0104_december1997.pdf>.
114. Standard Operating Procedure Ethidium Bromide: Dickinson College Health &
Safety. [online]. January 1999 [cit. 2005-01-25]. Dickinson College, Carlisle, Pa.
Dostupné na internete: <http://www.dickinson.edu/departments/hazard/SOPs/ethidium_
bromide.html>.
115. STN EN ISO 707: 2001, Mlieko a mliečne výrobky. Návod na odber vzoriek.
116. STN EN ISO 4833: 2003, Mikrobiológia potravín a krmív. Horizontálna metóda na
stanovenie počtu mikroorganizmov. Metóda počítania kolónií kultivovaných pri 30 °C.
117. STN EN ISO 6887-1: 1999, Mikrobiológia potravín a krmív. Úprava analytických
vzoriek, príprava základnej suspenzie a desaťnásobných riedení na mikrobiologické
skúšanie. Časť 1: Všeobecné pokyny na prípravu základnej suspenzie a desaťnásobných
riedení.
118. STN EN ISO 8261: 2001, Mlieko a mliečne výrobky. Všeobecné pravidlá úpravy
analytických vzoriek, prípravy základných suspenzií a desaťnásobných riedení na
mikrobiologické skúšanie.
119. STN EN ISO 13366-1: 2001, Mlieko, Stanovenie počtu somatických buniek, Časť 1:
Mikroskopická metóda.
120. STN EN ISO 13366-2: 2001, Mlieko, Stanovenie počtu somatických buniek, Časť 2:
Metóda elektronického počítania častíc.
178
121. STN EN ISO 13366-3: 2001, Mlieko, Stanovenie počtu somatických buniek, Časť 3:
Fluorescenčná optická elektronická metóda.
122. STN 570529: 1999, Surové kravské mlieko na mliekarenské ošetrenie a spracovanie.
123. STN ISO 7218: 2000, Mikrobiológia potravín a krmív. Všeobecné pravidlá
mikrobiologického skúšania.
124. SUAREZ, V. H. – BUSETTI, M. R. – MIRANDA, A. O. – CALVINHO, L. F. –
BEDOTTI, D. O. – CANAVESIO, V. R. Effect of Infectious Status and Parity on
Somatic Cell Count and California Mastitis Test in Pampinta Dairy Ewes. In J. Vet.
Med., Series B, roč. 49, June 2002, č. 5, s. 230.
125. ŠVPS SR, Štátna veterinárna a potravionová správa Slovenskej republiky. Rozhodnutie
č. 11448/2003-480 o autorizácii ŠVPÚ Nitra na výkon odborných činností Národného
referenčného laboratória pre mlieko a mliečne výrobky (2003).
126. TANČIN, V. – HLUCHÝ, S. – MIHINA, Š. – UHRINČAŤ, M. – HETÉNYI, L.
2001. Fyziológia získavania mlieka a anatómia vemena. 1. vyd. Nitra : Výskumný ústav
živočíšnej výroby Nitra vo vydavateľstve Slovenský chov, 2001. 122 s.
ISBN 80-88872-13-8.
127. TODHUNTER, A. – SMITH, K. L. – HOGAN, J. S. Physiology and Management,
Environmental Streptococcal Intramammary Infections of the Bovine Mammary Gland.
In Journal Dairy Science, roč. 78, 1995, s. 2366 - 2374.
128. TONGEĽ, P. – MIHINA, Š. Mastítída – zlodej mlieka. [online]. 2005 [cit. 2006-01-
08]. Ústav vedecko-technických informácií pre pôdohospodárstvo, Nitra. Dostupné na
internete: <http://www.agroporadenstvo.sk/zv/hd/mlieko/mastitida.htm>.
129. TSENKOVA, R. – ATANASSOVA, S. – KAWANO, S. – TOYODA, K. Somatic cell
count determination in cow’s milk by near-infrared spectroscopy: A new diagnostic
tool. In J. Anim. Sci., roč. 79, 2001, s. 2550 - 2557.
130. TWOMEY, D. P. – WHEELOCK, A. I. – FLYNN, J. – MEANEY, W. J. – HILL,
C. – ROSS, R. P. Protection Against Staphylococcus aureus Mastitis in Dairy Cows
Using a Bismuth-Based Teat Seal Containing the Bacteriocin, Lacticin 3147. In Journal
Dairy Science, roč. 83, 2000, s. 1981 - 1988.
131. UBBEN, E. H. Quality management for DMSCC from milk sample to ring trial. Lecture
In: Workshop of the European National Reference Laboratories “Milk and Milk
Products” at the Federal Research Centre for Nutrition and Food, Kiel, Germany
September 9 - 10, 2004. In LOMBARD, B.: Report of the Workshop of the National
Reference Laboratories „Milk and Milk Products“ on the microscopic counting of
179
somatic cells in milk. 9 - 10 September 2004, BFEL, Kiel, Germany, (EU Community
Reference Laboratory for Milk and Milk Products, AFSSA, 23 Avenue du General De
Gaulle, Maisons-Alfort, Paris, France).
132. UBBEN, E. H. – KNAPPSTEIN, K. 10 years of inter-comparisons on counting of
somatic cells. In IDF Mastitis Newsletter, roč. 26, 2005. s. 26 - 27. [online]. 2005 [cit.
2006-01-06]. International Dairy Federation. Dostupné na internete: <http://www.fil-
idf.org/WebsiteDocuments/Mastitis%20Newsletter%2026-2005.pdf>.
133. URBAN, P. Zdroje neistôt pri kalibrácii strmeňových mikrometrov. In Zborník
prednášok zo seminára Stanovovanie neistôt merania, kalibrácie a výkonu skúšok.
Spišská Nová Ves : Kalibračné združenie SR a Q-Test plus s.r.o. Bratislava, február
2006, s. 111.
134. USDA: United States Department of Agriculture: General Specifications for Dairy
Plants Approved for USDA Inspection and Grading Service. [online]. 2002 [cit. 2005-
03-23]. United States Department of Agriculture. Dostupné na internete:
<http://www.ams. usda.gov/ dairy/genpecs.pdf>.
135. VASIĽ, M. Mastitídy dojníc – liečiť alebo neliečiť? In Infovet, roč. 5, 1998, č. 2, s. 7.
136. VERDI, R. J. – BARBANO, D. M. Properties of Proteases from Milk Somatic Cells
and Blood Leukocytes. In Journal Dairy Science, roč. 74, 1991, s. 2077 - 2081.
137. VERMUNT, A.E.M. – LOEFFEN, G.J.M – VAN DER VOET, H. – NABER,
M.A.A.M.: Development of reference samples for the calibration and quality control of
somatic cell count using a Fossomatic instrument. In Netherlands Milk & Dairy Journal.
roč. 49, 1995, s. 000 - 000.
138. WATSON, J. D. – TOOZE, J. – KURTZ, D. T. 1998. Rekombinantní DNA. Krátký
kurs. 1. vyd. Praha : Academia, 1988. s. 40 – 41, ISBN 21-028-88. Americký originál:
Recombinant DNA (A Short Course). 1st published in the United States by W.H.
Freeman and Company, New York, New York and Oxford.
139. WIKIPEDIA – THE FREE ENCYCLOPEDIA: White blood cell. [online]. [s.a.].
[cit. 2006-06-18]. Wikipedia. Dostupné na internete: <http://en.wikipedia.org/wiki/
Leucocytes>.
140. WIKIPEDIA – THE FREE ENCYCLOPEDIA2: Methylene blue. [online]. 4th June
2006 [cit. 2006-06-18]. Wikipedia. Dostupné na internete: <http://en.wikipedia.org/
wiki/Methylene_blue>.
180
141. WIKIPEDIA – THE FREE ENCYCLOPEDIA3: Intercalation (chemistry). [online].
3rd January 2006 [cit. 2006-06-18]. Wikipedia. Dostupné na internete: <http://en.wikipe
dia.org/wiki/Intercalation_(chemistry)>.
142. WILSON, D. J. – GONZALES, R. N. – CASE, K. L. – GARRISON, L. L. –
GROÖHN, T. Comparison of Seven Antibiotic Treatmens with No Treatment for
Bacteriological Efficacy Against Bovine Mastitis Pathogens. In Journal Dairy Science,
roč. 82, 1999, s. 1664 - 1670.
143. WILSON, D. J. – GONZALEZ, R. N. – SEARS, P. M. Segregation or Use of
Separate Milking Units for Cows Infected with Staphylococcus aureus: Effects on
Prevalence of Infection and Bulk Tank Somatic Cell Count. In Journal Dairy Science,
roč. 78, 1995, s. 2083 - 2085.
144. www.infovets.com: D100 California Mastitis Test (CMT). [online]. [s.a.]. [cit. 2005-
12-31]. Infovets.com. Dostupné na internete: <http://www.infovets.com/demo/demo/
smrm/ D100.HTM>.
145. www.iupui.com: Indiana University-Purdue University Indianapolis. Molecular
medicine in action. Flow cytometry. [online]. 2005 [cit. 2006-01-12]. Indiana
University-Purdue University Indianapolis. Dostupné na internete: < http://www.iup
ui.edu/~wellsctr/MMIA/htm/flowcytometry.htm>.
146. www.nmconline.org: National Mastitis Council, Inc.: Summary of Peer-Reviewed
Publications of Efficacy of Premilking and Postmilking Teat Disinfectants Published
Since 1980. [online]. Updated january, 2005 [cit. 2005-12-20]. National Mastitis
Council, Inc.Dostupné na internete: <http://www.nmconline.org/docs/Teatbibl.pdf>.
147. www.olympus.com – LONG, J. C. – DAVIDSON, M. W. Olympus BX51 Microscope
Light Pathways, Interactive Java Tutorial. [online]. [s.a.]. [cit. 2006-01-08]. Olympus
America, Inc. Dostupné na internete: <http://www.olympusmicro.com/primer/java/
lightpaths/bx51fluorescence/index.html>.
148. www.olympus.com (2): UIS Fluorescence Mirror Units Technical Specifications.
Printed in Japan M1501E-0303B. [online]. [s.a.]. [cit. 2006-01-08]. Olympus Europa.
Dostupné na internete: <http://resources.olympus-europa.com/micro/catalogs/C125
67B6003775C790216DDC27B5B6DAC1256D5500341E72_UISMirrorUnit.pdf#search
=%22UIS%20Fluorescence%20Mirror%20Units%20Technical%20Specifications%22>.
149. ZADOKS, R. N. – ALLORE, H. G. – BARKEMA, H. W. – SAMPIMON, O. C. –
GRÖHN, Y. T. – SCHUKKEN, Y. H. Analysis of an Outbreak of Streptococcus
uberis Mastitis. In. Journal Dairy Science. roč. 84, 2001, s. 590 - 599.
181
150. ZAJÁC, P. – GOLIAN, J. – NOVÁKOVÁ, R. Vplyv Zvýšeného počtu somatických
buniek na zdravotnú neškodnosť surového kravského mlieka. In Zborník
z medzinárodnej vedeckej konferencie „Bezpečnosť a kontrola potravín“. Nitra 6. – 7.
apríl 2005 : Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, s. 151 –155. ISBN 80-
8069-503-2.
151. ZDANOWICZ, M. – SHELFORD, J. A. – TUCKER, C. B. – WEARY, D. M. –
KEYSERLINGK, M. A. G. Bacterial Populations on Teat Ends of Dairy Cows Housed
in Free Stalls and Bedded with Either Sand or Sawdust. In Journal Dairy Science, roč.
87, 2004, s. 1694 - 1701.
9 PRÍLOHY
Príloha 1 – Pravidlá pre identifikáciu a počítanie somatických buniek v surovom
kravskom mlieku
Pravidlá zostavili James E. Fitts z NYS Department of Agriculture & Markets Control
v spolupráci so S. Murphy z Department of Food Science, Cornell University
(Fitts a Murphy, 2004).
Použitá metóda: priame mikroskopické počítanie somatických buniek, metóda (STN
EN ISO 13366-1) s metylénovou modrou (Príloha 1, Obrázok 1 až 24).
1. Charakteristika buniek zafarbených metylénovou modrou.
Jadrá somatických buniek zložené z jednej alebo viacerých jadrových jednotiek sa
dobre farbia metylénovou modrou. Intenzita modrého zafarbenia závisí od techniky farbenia
a vlastností somatických buniek. Jadrová hmota buniek má vo všeobecnosti nerozoznateľnú
formu. Po zafarbení sa môže javiť ako jednoliaty modrý útvar, v niektorých bunkách môže
mať granulovaný vzhľad alebo sa môžu vyskytovať deštrukcie v jej celistvosti. Pri počítaní sa
preto rátajú iba somatické bunky s charakteristickým jadrom. Jadrá leukocytov sú laločnatého
tvaru pričom laloky sú premostené jadrovou hmotou. Multilaločnaté jadrá s premosteniami sa
počítajú ako jedna bunka. Cytoplazma, ktorá za normálnych podmienok obklopuje jadro
somatickej bunky sa môže farbiť rozdielne. Po zafarbení môže mať svetlo modrú farbu alebo
nemusí byť zafarbená vôbec, čo sa javí ako číra zóna. V prípade, že je rozpadnutá nemusí byť
prítomná.
2. Veľkosť somatických buniek
Jadrá počítateľných somatických buniek majú vo všeobecnosti veľkosť 8 µm alebo
o niečo väčšiu. Bunky alebo ich fragmenty (bunky ktoré boli zničené alebo sú rozpadnuté) sa
môžu javiť ako menšie. Pri rátaní sa nepočítajú bunky s jadrom menším ako 4 µm.
Rozpadnuté bunky sa počítajú iba vtedy ak je vidieť viac než 50 % jadra (najmenej 4 µm).
Bunky bez jadra sa nepočítajú.
3. Zhluky somatických buniek
Zhluky somatických buniek sa počítajú ako jedna somatická bunka s tou výnimkou,
že ak sú v zhluku prítomné zreteľne separované jadrá, tieto sa počítajú zvlášť. V prípade,
že sú prítomné zhluky somatických buniek, pri mikroskopovaní sa zvolí nasledovný postup.
Veľmi jemným zaostrovaním sa pozorujú jednotlivé časti zhluku. V prípade, že je jadro
somatickej bunky oddelené od ostatných jadier viditeľnou čírou zónou, počíta sa ako jedna
bunka. Ak sa jadro nedá zreteľne odlíšiť a sú prítomné evidentné premostenia medzi jadrami,
takéto spojenie sa počíta ako jedna somatická bunka.
4. Systém počítania somatických buniek v zornom poli mikroskopu
Pri mikroskopovaní sa vždy zvolí vyhovujúci systém počítania somatických buniek.
Jadrá somatických buniek, ktoré sa dotýkajú okrajov alebo zachádzajú za okraje zorného poľa
sa počítajú tak, aby nedochádzalo k duplicitnému počítaniu somatických buniek,
resp. počítaniu vo väčšej oblasti. Na základe zvoleného systému sa počítajú iba tie bunky,
ktoré sa dotýkajú alebo presahujú zvolený okraj zorného poľa. Pri počítaní v horizontálnych
pruhoch sa vyberie vrchný alebo spodný okraj. Pri počítaní vo vertikálnych pruhoch sa
vyberie ľavý alebo pravý okraj. Nepočítajú sa tie bunky, ktoré sa dotýkajú iného než
zvoleného okraja.
5. Ako počítať v prípade pochybností s určením somatickej bunky
V prípade akýchkoľvek pochybností o tom či daný útvar je alebo nie je somatická
bunka, sa takýto útvar nepočíta.
Obrázok 1. A, B a C sú počítateľné somatické
bunky (3 bunky).
Obrázok 2. A a B sú počítateľné somatické bunky (2 bunky).
Obrázok 3. A je počítateľná somatická bunka
(1 bunka). Obrázok 4. A a B sú počítateľné somatické bunky,
obe sú obklopené dezintegrovanou cytoplazmou (2 bunky).
Obrázok 5. A až D sú typické počítateľné
somatické bunky, E je rozložená somatická bunka, ktorá sa nepočíta (4 bunky).
Obrázok 6. A je jedna somatická bunka s lalokmi spojenými s jadrovým premostením. Počíta sa ako
jedna bunka (1 bunka).
A
A
B
A
B
C
D
E A
A
B
C A
B
Obrázok 7. A a C sú typické fragmenty
cytoplazmy, ktoré sa nepočítajú. B a D sú typické somatické bunky (2 bunky).
Obrázok 8. A je útvar pripomínajúci somatickú bunku (nie je to časť z jadra bunky), ktorý sa
nepočíta, B je somatická bunka (1 bunka).
Obrázok 9. A je jedna počítateľná somatická bunka s dezitegrovaným jadrom (1 bunka).
Obrázok 10. A až E sú typické somatické bunky s viacerými lalokmi (5 buniek).
Obrázok 11. A je typická somatická bunka. B je
typický monocyt. Obe bunky sú počítateľné (2 bunky).
Obrázok 12. A je jedna somatická bunka s veľkou cytoplazmou (1 bunka).
B A
D
C A
B
A C
A
B E
D
A
B
A
Obrázok 13. Všetko sú počítateľné somatické
bunky. B a E majú dvojlaločnaté jadro s premostením a počítajú sa ako jedna bunka
(6 buniek).
Obrázok 14. A nie je počítateľná somatická bunka pretože jej veľkosť je menšia ako 4 µm. B je
dezinegrovaná počítateľná somatická bunka. C je typická somatická bunka (2 bunky).
Obrázok 15. A, C a D sú počítateľné somatické
bunky. B je fragment cytoplazmy, ktorý sa nepočíta.
Obrázok 16. A až G sú všetko počítateľné somatické bunky (7 buniek).
Obrázok 17. A, B, C a E sú typické somatické
bunky. D je počítateľná somatická bunka s veľkou oblasťou dezintegrovanej cytoplazmy. F je útvar,
ktorý sa nepočíta. Na obrázku je 5 buniek.
Obrázok 18. A, C a D sú typické somatické bunky. B je buď veľmi zle viditeľná somatická bunka
alebo útvar, ktorý sa nepočíta (3 bunky).
B
A D C
F A
E
B
C
B
D
A
C D
F
E
B
A
G C
A
C D
B
C
A
D
F
E B
Obrázok 19. A až G sú typické somatické bunky (7
buniek). Obrázok 20. A a B nie sú somatické bunky
(0 buniek).
Obrázok 21. A je typická počítateľná somatická
bunka. B a C sú fragmenty po cytoplazme, ktoré sa nepočítajú (1 bunka).
Obrázok 22. A a D sú typické somatické bunky. B je fragment väčší ako 50 %, ktorý sa počíta. C má dezintegrovaný jadrový materiál a považuje sa za
počítateľnú somatickú bunku (4 bunky).
Obrázok 23. A a B sú typické somatické bunky. C
a D sú počítateľné somatické bunky vykazujúce začiatok degenerácie (4 bunky).
Obrázok 24. A je dezintegrovaná somatická bunka, ktorá sa aj napriek dezintegrácii počíta
(1 bunka).
B
A D C
F A
E B
G
B
A
C
D B
A
C
A
B
C
A
D
Príloha 2 - California mastitis test
Obrázok 1. California mastitis test – testovacia sada (www.infovets.com).
Obrázok 2. California mastitis test – dojenie mlieka na testovaciu paletu (www.infovets.com).
Obrázok 3. California mastitis test – zmiešavanie mlieka s reagenciou (www.infovets.com).
Obrázok 4. California mastitis test – odčítavanie výsledku (www.infovets.com).
Príloha 3 – Mikroskop Olympus BX51
Obrázok 1. Mikroskop Olympus BX51 – prierez a svetelné cesty, pôvodná anglická verzia (www.olympus.com).
Príloha 4 - Spektrálna charakteristika použitého svetelného zdroja – ortuťovej lampy
404.7
100
300 500 600 700 800Wavelength (nm)
50
0Ultraviolet excitation
luminescent lineViolet excitation
luminescent lineBlue excitation luminescent line
Green excitation luminescent line
Green excitation luminescent line
Blue excitation luminescent range
400
312.6/313.2
334.2
577.0/579.1
280.4
546.1
435
Ligh
t int
ensi
ty (%
)
Mercury lamp
LIGHT SOURCE SPECTRAL CHARACTERISTICS
Obrázok 1. Spektrálna charakteristika použitého svetelného zdroja – ortuťovej lampy, pôvodná anglická verzia (www.olympus.com 2)
Príloha 5 - Zoznam fluorochrómov, výber fluorochrómov, charakteristika vlnových
dĺžok použitých zrkadlových jednotiek s excitačným a emisným filtrom a dichroickým
zrkadlom, interkalácia etídium bromidu do molekuly DNA
Zoznam fluorochrómov
Tabuľka 1 Fluorochrome Excitation Emission Applicable mirror unit Comment
maximum maximum (nm) (nm)
Nuclei, nucleic acid stainingNuclei, nucleic acid
Acridine Orange 490 530, 640 U-MWB2, U-MNB2, U-MNIB2 Single/double-stranded nucleic acid
Acridine Yellow 470 550 U-MWB2, U-MNB2, U-MNIB2 Nucleic acid
Acriflavine-Feulgen 430 515 U-MWBV2, U-MNBV2 DNA
Auramine O-Feulgen 460 550 U-MWB2, U-MNB2, U-MNIB2 DNA
7-Amino Actinomycin D 555 655 U-MWIY2, U-MWIG2 Probe for G-C rich regions
bis-Aminophenyl-oxadizole (BAO) -Feulgen 380 470 U-MWU2, U-MNU2, U-MNUA2 DNA
BOBO 1 462 481 U-MWBV2, U-MNBV2, U-MWB2 DNA
BO PRO 1 462 481 U-MWBV2, U-MNBV2, U-MWB2
Chromomycin A3 450 570 U-MWB2, U-MNB2, Probe for G-C rich regionsU-MWIB2, U-MNIB2
4, 6-diamidino-2-phenyl-indole HCI (DAPI) 372 456 U-MWU2, U-MNU2, U-MNUA2 Probe for A-T rich regions
Ethidium Bromide 545 605 U-MWG2, U-MNG2, U-MWIG2 DNA/RNA
Hoechst 33258 365 465 U-MWU2, U-MNU2, U-MNUA2 Probe for A-T rich regions
Hoechst 33342 355 465 U-MWU2, U-MNU2, U-MNUA2 Probe for A-T rich regions
Mithramycin 395 570 U-MWBV2, U-MNBV2 Probe for G-C rich regions
Olivomycin 430 545 U-MWBV2, U-MNBV2 Probe for G-C rich regions
Pararosaniline-Feulgen 560 625 U-MWG2, U-MNG2, U-MWIG2 DNA
POPO 1 434 456 U-MWBV2, U-MNBV2
Propidium Iodide (PI) 530 615 U-MWG2, U-MNG2, U-MWIG2 DNA/RNA
Pyronin Y 540 570 U-MWIG2 DNA/RNA
Quinacrine Mustard 385 525 U-MWBV2, U-MNBV2 Probe for A-T rich regions, Q band
SYTOX Green nucleic acid stain 504 523 U-MWIB2, U-MWIBA2, U-MNIBA2
Thiazole Orange 509 533 *1
TOTO 1 514 533 *1 DNA
TOTO 3 642 661 *1
TO PRO 3 642 661 *1
YO PRO 1 491 509 U-MWIB2, U-MWIBA2, U-MNIBA2
YOYO 1 490 510 U-MWIB2, U-MWIBA2, U-MNIBA2 DNA
Cell viability judgementLiving cell staining
Acridine Orange 490 590 U-MWB2, U-MNB2, Acid organelleU-MSWB2, U-MNIB2
BCECF/AM 500 530 U-MWIB2, U-MWIBA2, U-MNIBA2 Esterase substrates
Calcein/AM 495 520 U-MWIB2, U-MWIBA2, U-MNIBA2 Esterase substrates
Carboxyfluorescein-diacetate (CFDA) 495 520 U-MWIB2, U-MWIBA2, U-MNIBA2 Esterase substrates
Fluoresceindiacetate (FDA) 495 520 U-MWIB2, U-MWIBA2, U-MNIBA2 Esterase substrates
Dead cell staining
Ethidium Bromide 545 605 U-MWG2, U-MNG2, U-MWIG2 Cell membrane impermeability
Ethidium homodimer-1 528 617 U-MWG2, U-MNG2, U-MWIG2 Cell membrane impermeability
Propidium Iodide (PI) 530 615 U-MWG2, U-MNG2, U-MWIG2 Cell membrane impermeability
(www.olypmus.com 2)
Výber fluorochrómov podľa typu použitej fluorescenčnej zrkadlovej jednotky
Tabuľka 2
Mirror unit Excitation Emission Dichromatic Applicable fluorochromefilter filter mirror
U-MNB2 470-490 520IF 500 Acridine Orange, Acridine Yellow, Auramine O, Auramine O-Feulgen,Calcein, Chromomycin A3, Coriphosphine ODiO, Nile Red
U-MNG2 530-550 590 570 Acidic Fuchsin (Pararosaniline), Alexa Fluor 568, Dil, Ethidium Bromide, Ethidium homodimer-1, Evans Blue, Merocyanine 540, Pararosaniline-Feulgen, Phycoerythrin B (PE-B), Phycoerythrin R (PE-R), Propidium Iodide (PI), Resorufin, Rhodamine B-isothiocyanate (RITC), Rhodamine-Phalloidin, Spectrum Orange, Xylenol Orange
(www.olypmus.com 2)
Green excitation (narrow band) U-MNG2
3000
102030405060708090
100
350 400 450 500 550Wavelength (nm)
Tran
smis
sion
ratio
(%)
3000
102030405060708090
100
350 400 450 500 550Wavelength (nm)
Tran
smis
sion
ratio
(%)
Blue excitation (narrow band) U-MNB2
BP: Excitation filter BA: Barrier filter DM: Dichromatic mirror
BP: Excitation filter BA: Barrier filter DM: Dichromatic mirror
CHARACTERISTICS OF MIRROR UNIT'S WAVELENGTH
600 650 700 750 800
600 650 700 750 800
Obrázok 1. Charakteristika vlnových dĺžok použitých fluorescenčných zrkadlových jednotiek s excitačným a emisným filtrom a dichroickým zrkadlom. Pri experimente bola použitá jednotka U-MNB2, pôvodná anglická verzia (www.olympus.com 2)
Poznámka1
Firma Olympus odporúča použiť pri farbení DNA pomocou etídium bromidu
fluorescenčné zrkadlové jednotky U-MWG2, U-MNG2 a UMWIG2. V laboratóriu sme
disponovali jednotkami U-MNG2 a U-MNB2. Na základe empirických skúseností sme aj
napriek odporúčaniu firmy Olympus použili jednotku U-MNB2 z dôvodu príjemnejšieho
pozorovania mikroskopického preparátu (Príloha 9, obrázky 1 až 11). Pri pozorovaní
mikroskopického preparátu pomocou jednotky U-MNG2 sa preparát javil intenzívne červený,
čo značne znepríjemňovalo jeho pozorovanie (Príloha 9, Obrázok 12). Identifikácia
somatických buniek a zrátané počty somatických buniek boli pri použití jednotiek U-MNB2
a U-MNG2 rovnaké.
Poznámka 2
Firma Olympus uvádza, že na farbenie mŕtvych buniek sa môže použiť farbivo
etídium bromid (www.olympus.com 2).
Longuet et al. (2004) uvádzajú, že pri morfologickom stanovení apoptických buniek
sa používa akridínová oranžová a etídium bromid. Akridínová oranžová preniká cez
plazmatické membrány živých buniek a buniek v počiatočnom štádiu apoptózy. Etídium
bromid môže farbiť DNA iba vtedy, ak je narušená integrita bunkovej membrány. Etídium
bromid farbí iba mŕtve alebo nekrotické bunky.
Etídium bromid je nefluoreskujúca molekula, ktorá zle prechádza cez bunkovú
membránu. Etídium bromid ľahko prestupuje do buniek s poškodenou alebo upravenou
bunkovou membránou. Etídium bromid po prestupe cez bunkovú membránu vstupuje do
dvojitej závitnice DNA a stáva sa intenzívne fluoreskujúcim. Pre túto vlastnosť sa etídium
bromid používa ako farbivo pri zisťovaní integrity bunkových membrán (Midoux et al.,
1995).
Etídium bromid je veľmi často používané farbivo určené na farbenie nukleových
kyselín pri elektroforéze. Etídium bromid môže vstupovať do dvojzávitnicovej DNA
(deoxiribonukleová kyselina) a do RNA (ribonukleová kyselina). Fluorescenicia etídium
bromidu stúpa 21 násobne až po interkalácii do dvojzávitnicovej RNA a 25 násobne po
interkalácii do dvojzávitnicovej DNA, takže v prípade nízkych koncentrácií (10 µg . ml-1) nie
je potrebné odfarbenie pozadia (Sigma-Aldrich Co., 2006).
Cytoplazmatická membrána je selektívne permeabilná blana, ktorá okrem stavebnej
a opornej funkcie separuje rôzne fázy prostredia, riadi selektívny prestup látok z okolitého
prostredia do bunky a naopak a tým udržiava osmotickú rovnováhu buniek (Kulíšek et al.,
1996).
Podľa Chorváta (1998) všetky biologické membrány (vrátane plazmatickej
membrány a membrán subbunkových štruktúr eukaryotických buniek) majú všeobecné
štruktúrne osobitosti: predstavujú súbor lipidických a bielkovinových molekúl, udržiavaných
spolu pomocou nekovalentných väzieb. Vďaka tomu sa udržuje štruktúrna celistvosť
membrán.
Lipidická dvojvrstva o hrúbke približne 5 nm je základnou štruktúrou membrány,
ktorá vytvára relatívne nepriepustnú bariéru pre väčšinu vo vode rozpustných molekúl.
Bielkoviny sú akoby „rozpustené“ v lipidickej dvojvrstve. Sú to základné štruktúry pre
vykonávanie rôznych funkcií membrán. Jedny zabezpečujú transport molekúl do vnútra alebo
von z bunky, iné sú enzýmami a katalyzujú reakcie viazané s membránou.
Jednotlivé funkcie membrán sa sprostredkúvajú špecifickými bielkovinami.
Bielkoviny uskutočňujú úlohu púmp, kanálov, receptorov, enzýmov a transformačných
energetických prvkov. Bielkoviny membrán sú zabudované do lipidickej dvojvrstvy,
čo vytvára výhodné prostredie pre prejavy ich aktivity.
Eukaryotické bunky obsahujú vnútrobunkové membrány, ktoré uzavierajú skoro
polovicu celkového objemu bunky do jednotlivých vnútrobunkových špecializovaných
priestorov – kompartmentov. Základné typy membránových organel vo všetkých
eukaryotických bunkách sú: endoplazmatické retikulum, Golgiho aparát, jadro, mitochondrie,
lyzozómy, endozómy a peroxizómy. Každá organela obsahuje vo svojej výbave rôzne
bielkoviny, určujúce jej unikátne funkcie. Centrálnu úlohu v kompartmentalizácii
eukaryotickej bunky hrajú bielkoviny.
Jadro bunky je uzavreté do obálky, zloženej z dvoch koncentrických membrán.
Vonkajšia jadrová membrána prechádza do membrány endoplazmatického retikula
(endoplazmatické retikulum je továreň na výrobu bielkovinových a lipidických zložiek
mnohých organel. Jeho obrovská membrána obsahuje veľa enzýmov biosyntézy) a priestor
medzi vonkajšou a vnútornou jadrovou membránou prechádza do dutiny endoplazmatického
retikula.
Výmena materiálu medzi jadrom a cytoplazmou prebieha cez póry jadra, ktoré sa
nachádzajú v dvojitej jadrovej membráne, a ktoré zabezpečujú priame spojenie cez vnútornú
a vonkajšiu jadrovú membránu. Póry sú vytvárané špeciálnymi pórovými komplexmi,
predstavujúcimi súbor veľkých bielkovinových granúl, zoskupených do oktagonálnej
štruktúry. V strede komplexu je kanál o priemere 9 nm a dĺžke 15 nm. Cez tento pór
prechádzajú do jadra voľne malé molekuly (5 kDa (kilo Daltona) a menšie). Ukázalo sa však,
že na oboch koncoch týchto pórov sú uložené receptory, ktoré po rozpoznaní veľkých, v jadre
potrebných a signálom označených častíc, (typu DNA, RNA a polymeráz o molekulárnych
hmotnostiach až 1 200 kDa), zrejme rozširujú tieto póry takým spôsobom, aby aj tak veľké
častice prenikli celé do jadra. spätne póry po rozpoznaní špecifických signálových sekvencií
prepúšťajú do cytoplazmy napr. mRNA (teda opäť častice väčšie, ako rozmer pórov).
Za účelom vstupu molekuly etídium bromidu medzi spárované bázy musí dôjsť
k oddialeniu báz na viac ako 0,3 nanometra (WIKIPEDIA – THE FREE
ENCYCLOPEDIA3, 2006).
Z uvedeného vyplýva, že molekula etídium bromidu je malá a môže preto prechádzať
cez póry jadrovej membrány.
Pôsobením silných kyselín, varom alebo vplyvom ťažkých kovov strácajú bielkoviny
svoje natívne schopnosti a dochádza k ich denaturácii. Denaturácia bielkovín je vo väčšine
prípadov nevratný proces, ktorý sa prejavuje rozpadom trojrozmernej štruktúry bielkoviny
pričom ostáva zachovaná len primárna štruktúra, t.j. poradie aminokyselín v reťazci.
Denaturovaná bielkovina nie je schopná ďalej plniť svoju funkciu v organizme (Hrazdíra,
1990).
Za fyziologických podmienok sa vlákna dvojitej závitnice DNA takmer nikdy od seba
spontánne neoddeľujú, avšak, ak je dvojitá závitnica DNA vystavená pôsobeniu teplôt
blízkym bodu varu vody alebo extrémnemu pH (pH < 3 alebo pH > 10), rýchlo sa rozdeľuje
(je denaturovaná) na jednotlivé vlákna. DNA je tvorená pármi báz (guanín-cytozín, adenín-
tymín), ktoré sú spojené vodíkovými mostíkmi. Guanín sa viaže s cytozínom tromi silnými
vodíkovými mostíkmi a adenín s tymínom dvomi silnými vodíkovými mostíkmi. DNA
obsahujúca prevažne páry guanín-cytozín je preto oveľa stabilnejšia, denaturuje pri vyšších
teplotách než DNA, v ktorej prevládajú páry adenín-tymín (Watson et al., 1988).
Byron et al. (2003) sa vo svojej práci zameranej na zvýšenie citlivosti
mikroorganizmov voči antibiotikám zaoberali prestupom etídium bromidu do buniek
mikroorganizmov (Staphylococcus aureus, Escherichia coli). Autori uvádzajú, že bunky
zahriate vo vodnom kúpeli počas 6 minút na teplotu 55 °C za stáleho miešania slúžili ako
pozitívna kontrola pre pozorovanie zvýšenia prestupu etídium bromidu do buniek
mikroorganizmov. Autori použili viacero chemických látok a pozorovali ako sa menila
intenzita fluorescencie a homogénnosť zafarbenia buniek etídium bromidom. Autori ďalej
uvádzajú, že sesqiterpénom sprostredkované zvýšenie prestupu etídium bromidu bolo možné
pozorovať bezprostredne po prídavku 0,5 mM nerolidolu. Z uvedeného vyplýva, že chemické
látky môžu ovplyvniť vlastnosti bunkovej membrány a tým prestup etídium bromidu do
bunky.
Gonzalo et al. (2003) uvádzajú, že hodnota logPSB bola vyššia pri 60 °C
(5,68 ± 0.001) než pri 40 °C (5,65 ± 0.001) pravdepodobne preto, že vplyvom pôsobenia
vyššej teploty dochádza k lepšiemu prenikaniu etídium bromidu do buniek alebo preto, že sa
lepšie disperguje v tuku ovčieho mlieka.
Výsledky experimentu 3 naznačili, že tepelné ošetrenie vzoriek mlieka je jednou
z možností, ktorou sa dá zvýšiť prestup farbiva etídium bromidu cez bunkovú membránu do
buniek. Pri zahriatí vzorky mlieka na teplotu 100 °C počas 1 min boli v porovnaní so
zahriatím vzorky mlieka na teplotu 50 °C počas 5 minút napočítané vyššie počty somatických
buniek (Experiment 3, Obrázok 8).
Interkalácia
Interkalácia je termín používaný v chémii pre reverzibilnú inklúziu molekuly alebo
skupiny molekúl medzi dve ďalšie molekuly alebo skupinu molekúl. Hostiteľská molekula
alebo skupina molekúl obyčajne tvorí v pravidelných sekvenciách opakujúcu sa reťaz alebo
sieť. Schopnosť vstupovať do priestoru medzi dvoma susediacimi spárovanými bázami
reťazca DNA má veľké množstvo molekúl. Molekuly farbiace nukleové kyseliny sú
predovšetkým polycyklické, aromatické alebo planárne. Medzi intenzívne skúmané farbivo
patrí napríklad etídium. Za účelom vstupu molekuly farbiva medzi spárované bázy musí dôjsť
k oddialeniu báz na viac ako 0,3 nanometra, pričom dochádza k lokálnym zmenám v reťazci
DNA. Zmeny v reťazci DNA môžu potom viesť k funkčným zmenám a často aj k inhibícii
transkripcie a procesu replikácie. Z uvedeného vyplýva, že farbivá vstupujúce do DNA môžu
byť potenciálne mutagény a karcinogény (WIKIPEDIA – THE FREE ENCYCLOPEDIA3,
2006).
Obrázok 2. Farbivo etídium vstupujúce medzi dva adenín-uracylové bázové páry.
(WIKIPEDIA – THE FREE ENCYCLOPEDIA3, 2006)
Obrázok 3. Interkalácia. V ľavej časti obrázku je nezmenená DNA. V pravej časti obrázku je
zmenený reťazec DNA obsahujúci cudziu molekulu v troch červeno vyznačených oblastiach.
(WIKIPEDIA – THE FREE ENCYCLOPEDIA3, 2006)
Chorvát (1998) uvádza, že DNA interaguje s farbivami, ktorých charakteristickou
zvláštnosťou je prítomnosť pretiahnutých heterocyklických aromatických chromofórov. Ako
dôsledok takýchto interakcií sa objavuje veľmi silné ovplyvnenie procesov metabolizmu
a spomalenie alebo zastavenie rastu buniek. Pri interkalácii sa interagujúca molekula zasúva
medzi dva susedné páry báz bez porušenia wac párovania. Pri zasúvaní aromatických molekúl
s „hrúbkou“ 3,4 nanometra sa dokonca ani celkový súbor vertikálnych (stacking) interakcií
nemusí narušiť. Na to, aby interkalácia prebehla, sa však páry musia oddialiť, a to vedie
k zmene geometrie sacharidovo-fosfátovej kostry a k porušeniu regulárnej závitnicovej
štruktúry. V dôsledku toho sa molekula DNA musí predĺžiť a musí sa súčasne zväčšiť aj
tuhosť dvojitej závitnice. O tom svedčí aj pozorované zvýšenie viskozity a zmenšenie
koeficientu sedimentácie. Väzba látok na DNA pomocou interkalácie prebieha v dvoch
štádiách. Počas prvého štádia sa látky pripájajú na periférii špirály. V druhom štádiu prebieha
podstata interkalačného javu – zasunutie do závitnice. Molekuly interkalovaných látok
zapĺňajú iba polovicu miest, v ktorých by sa mohli zasunúť, pretože pri zasunutí do každej
polohy by vyvolali stérické obmedzenia. Posúvanie báz pri interkalácii je sprevádzané
zmenami konformácie sacharidu a príslušných torzných uhlov. V niektorých z takýchto
komplexov boli nájdené poruchy ďalekého dosahu.
Príloha 6 - Prístroj Fossomatic 5000
Obrázok 1. Prístroj Fossomatic 5000, Štátny veterinárny a potravinový ústav Nitra, Národné referenčné laboratórium pre mlieko a mliečne výrobky.
Príloha 7 – Fotodokumentácia pracovného postupu podľa normy STN EN ISO 13366-1 (2001)
Obrázok 1. 1000 µl a 10 µl pipeta, 10 µl
mikrostriekačka Obrázok 2. Podložné sklíčko s preddefinovaným
obrysom 5 mm x 20 mm
Obrázok 3. Pracovné a zásobné roztoky etídium
bromidu Obrázok 4. Dôkladné premiešanie čerstvej vzorky.
V prípade vystúpenia tuku sa vzorka musí vytemperovať na 40 °C ± 2 °C a zhomogenizovať.
Obrázok 5. Pipetovanie 1 ml čerstvej vzorky do
skúmavky. Obrázok 6. Jemné osušenie vonkajších okrajov
špičky od prebytočného mlieka.
Obrázok 7. Skúmavky so vzorkou č.1, č.2 a
skúmavka pre kontrolu teploty.
Obrázok 8. Temperovanie vzorky na teplotu 40 °C ± 2 °C vo vodnom kúpeli, kontrola teploty.
Obrázok 9. Homogenizácia vytemperovanej
vzorky pretrepaním. Obrázok 10. Chladenie vzorky na teplotu
20 °C ± 2 °C. Chladenie je možné vykonať aj v chladničke!
Obrázok 11. Pipetovanie 10 µl vychladenej
vzorky. Obrázok 12. Jemné osušenie vonkajších okrajov
špičky od prebytočného mlieka.
Obrázok 13. Nanášanie 10 µl vzorky na podložné
sklíčko. Obrázok 14. Nanášanie 10 µl vzorky na podložné
sklíčko.
Obrázok 15. Nanášanie 10 µl vzorky na podložné
sklíčko, rozotieranie vzorky po obrysoch. Obrázok 16. Nanesená, rozotrená vzorka.
Obrázok 17. Sušenie (fixácia) vzorky 24 hodín
v uzatvorenej nádobe. Obrázok 18. Farbiaca komôrka naplnená farbiacim
roztokom.
Obrázok 19. Farbenie vzorky 10 min.
Obrázok 20. Vymývanie prebytočného farbiva pod
prúdom vlažnej vody.
Obrázok 21. Vymývanie prebytočného farbiva pod
prúdom vlažnej vody. Obrázok 22. Vymývanie prebytočného farbiva pod
prúdom vlažnej vody.
Obrázok 23. Vymývanie prebytočného farbiva pod
prúdom vlažnej vody. Obrázok 24. Hrubé odstránenie vody z podložného sklíčka. Treba dávať pozor na poškodenie povrchu
preparátu. Povrch preparátu sa neutiera!
Obrázok 25. Rýchle sušenie vzorky na vyhrievanej platni. Pri voľnom sušení na vzduchu sa dosahujú lepšie výsledky ako pri sušení na výhrevnej platni.
Obrázok 26. Uskladnenie vzorky, chránenie vzorky pred prachom až do mikroskopovania.
Obrázok 27. Nanášanie kvapky imerzného oleja.
Obrázok 28. Nanesená kvapka imerzného oleja.
Obrázok 29. Mikroskopovanie.
Obrázok 30. Mikroskopovanie.
Príloha 8 – Fotodokumentácia pracovného postupu prípravy preparátu podľa
modifikovanej metódy publikovanej Vermuntom et al. (1995)
Obrázok 1. Dôkladné premiešanie čerstvej vzorky.
V prípade vystúpenia tuku sa vzorka musí vytemperovať na 40 °C ± 2 °C a zhomogenizovať.
Obrázok 2. Pipetovanie 1 ml čerstvej vzorky do skúmavky.
Obrázok 3. Jemné osušenie vonkajších okrajov
špičky od prebytočného mlieka. Obrázok 4. Temperovanie vzorky 5 minút pri
teplote 50 °C ± 2 °C vo vodnom kúpeli, kontrola teploty.
Obrázok 5. Chladenie vzorky na teplotu
20 °C ± 2 °C. Chladenie je možné vykonať aj v chladničke!
Obrázok 6. Zahriatie vzorky nad kahanom na 100 °C.
Obrázok 7. Pipetovanie 1 ml farbiaceho roztoku
etídium bromidu. Obrázok 8. Jemné osušenie vonkajších okrajov
špičky od prebytočného roztoku etídium bromidu.
Obrázok 9. Vstreknutie farbiaceho roztokom
etídium bromidu. Obrázok 10. Miešanie skúmavky počas 1 minúty.
Obrázok 11. Chladenie zafarbenej vzorky na
teplotu 20 °C ± 2 °C. Lepšou a rýchlejšou alternatívou je chladenie vzorky v chladničke!
Obrázok 12. Pipetovanie 10 µl vychladenej zafarbenej vzorky.
Obrázok 13. Jemné osušenie vonkajších okrajov
špičky od prebytočnej zafarbenej vzorky. Obrázok 14. Nanášanie 10 µl vzorky na podložné
sklíčko.
Obrázok 15. Nanášanie 10 µl vzorky na podložné
sklíčko. Obrázok 16. Nanášanie 10 µl vzorky na podložné
sklíčko.
Obrázok 17. Nanášanie 10 µl vzorky na podložné
sklíčko. Obrázok 18. Nanášanie 10 µl vzorky na podložné
sklíčko.
Obrázok 19. Rozotieranie nanesenej vzorky. Obrázok 20. Rozotieranie nanesenej vzorky.
Obrázok 21. Nanesená, rozotrená vzorka. Obrázok 22. Sušenie vzorky a jej uchovávanie
v uzatvorenej nádobe až do mikroskopovania.
Obrázok 23. Mikroskopovanie. Obrázok 24. Mikroskopovanie.
Obrázok 25. Mikroskopovanie. Obrázok 26. Mikroskopovanie.
Príloha 9 – Fotodokumentácia, obrázky mikroskopických preparátov metódy
A a metódy B
Obrázok 1. Experiment 1, metóda B, zlatožlto fluoreskujúce somatické bunky na oranžovom pozadí, preparát pripravený zo surového kravského mlieka s obsahom 9 000 000 SB . ml-1, okulár 10x, objektív 4x.
Obrázok 2. Experiment 1, metóda B, zlatožlto fluoreskujúce somatické bunky na oranžovom pozadí, preparát pripravený zo surového kravského mlieka s obsahom 9 000 000 SB . ml-1, okulár 10x, objektív 20x.
Obrázok 3. Experiment 1, metóda B, zlatožlto fluoreskujúce somatické bunky na oranžovom pozadí, preparát pripravený zo surového kravského mlieka s obsahom 9 000 000 SB . ml-1, okulár 10x, objektív 60x, (17 somatických buniek).
Obrázok 4. Experiment 1, metóda B, zlatožlto fluoreskujúce somatické bunky na oranžovom pozadí, okulár 10x, objektív 60x (3 somatické bunky).
Obrázok 5. Experiment 1, metóda B, zlatožlto fluoreskujúca somatická bunka na oranžovom pozadí, typický PMN, tmavé útvary sú tukové guľôčky, okulár 10x, objektív 60x.
Obrázok 6. Experiment 1, metóda A, zlatožlto fluoreskujúce somatické bunky na olivovo zelenom pozadí, preparát pripravený zo surového kravského mlieka s obsahom 600 000 SB . ml-1, okulár 10x, objektív 4x.
Obrázok 7. Experiment 1, metóda A, zlatožlto fluoreskujúce somatické bunky na olivovo zelenom pozadí , preparát pripravený zo surového kravského mlieka s obsahom 600 000 SB . ml-1, okulár 10x, objektív 20x.
Obrázok 8. Experiment 1, metóda A, zlatožlto fluoreskujúce somatické bunky na olivovo zelenom pozadí, preparát pripravený zo surového kravského mlieka s obsahom 600 000 SB . ml-1, okulár 10x, objektív 60x (3 somatické bunky).
Obrázok 9. Experiment 1, metóda A, zlatožlto fluoreskujúce somatické bunky na olivovo zelenom pozadí, preparát pripravený zo surového kravského mlieka s obsahom 1 500 000 SB . ml-1, okulár 10x, objektív 60x, na obrázku je nepočítateľný zhluk buniek.
Obrázok 10. Experiment 1, metóda A, zlatožlto fluoreskujúca somatická bunka na olivovo zelenom pozadí, v ľavom hornom rohu je vidieť fluoreskujúce baktérie tyčinkového tvaru, okulár 10x, objektív 60x (1 somatická bunka).
Obrázok 11. Experiment 1, metóda A, zlatožlto fluoreskujúce somatické bunky na olivovo zelenom pozadí, preparát pripravený zo surového kravského mlieka s obsahom 600 000 SB . ml-1, okulár 10x, objektív 4x, na obrázku je vidieť okraj náteru a veľmi intenzívne fluoreskujúci pás vedúci pozdĺž celého okraja náteru. Intenzívne fluoreskujúci pás znemožňuje počítanie somatických buniek, tento problém sa vyskytuje pri príprave preparátu metódou A pomerne často.
Obrázok 12. Mikroskopický preparát pozorovaný so zrkadlovou jednotkou U-MNG2. okulár 10x, objektív 60x (2 somatické bunky). Pozadie a somatické bunky sú intenzívne červené.
Obrázok 13. Kvasinky - Candida albicans, metóda B, okulár 10x, objektív 60x. Kvasinky sa farbia etídium bromidom, niektoré sa podobajú somatickým bunkám, môžu preto ovplyvniť výsledok laboratórnej skúšky. Zistili sme, že v prípade kvasiniek klesá intenzita fluorescencie po osvietení veľmi rýchlo, v prípade somatických buniek sme nepozorovali jej pokles.
Obrázok 14. Kalibrácia mierky pomocou mikrometra. Okulár 10x, objektív 60x, rozlíšenie obrázku 72 dpi, veľkosť obrázku 640 pixelov x 480 pixelov (obrázok bol po vložení do textového editora zmenšený na 60 % pôvodnej veľkosti. Rovnako boli zmenšené aj Obrázky 1 až 13 Prílohy 9).
Príloha 10 – Faktory mikroskopu pre objektív 60 x, pre metódu A
Tabuľka 1
Počet zrátaných
pruhov
Faktor
mikroskopu
Počet zrátaných
pruhov
Faktor
mikroskopu
1 5555,56 15 370,37
2 2777,78 16 347,22
3 1851,85 17 326,80
4 1388,89 18 308,64
5 1111,11 19 292,40
6 925,93 20 277,78
7 793,65 21 264,55
8 694,44 22 252,53
9 617,28 23 241,55
10 555,56 24 231,48
11 505,05 25 222,22
12 462,96 - -
13 427,35 - -
14 396,83 - -
Príloha 11 – Faktory mikroskopu pre objektív 60 x, pre metódu B
Tabuľka 1
Počet
zrátaných pruhov
Faktor
mikroskopu
Počet zrátaných
pruhov
Faktor
mikroskopu
1 13333,33 15 888,89
2 6666,67 16 833,33
3 4444,44 17 784,31
4 3333,33 18 740,74
5 2666,67 19 701,75
6 2222,22 20 666,67
7 1904,76 21 634,92
8 1666,67 22 606,06
9 1481,48 23 579,71
10 1333,33 24 555,56
11 1212,12 25 533,33
12 1111,11 - -
13 1025,64 - -
14 952,38 - -
Príloha 12 – Príklad výpočtu pomeru riedenia mlieka pri príprave referenčných vzoriek
Vypočítajte aký pomer mlieka treba zmiešať ak treba pripraviť 2,5 litra referenčnej vzorky
s obsahom 350 000 somatických buniek . ml-1 a k dispozícii je:
- mlieko A s obsahom 1 500 000 somatických buniek . ml-1
- mlieko B s obsahom 200 000 somatických buniek . ml-1
Rovnica: požadovaný objem mlieka . požadovaná koncentrácia PSB = x . PSB mlieka A + (požadovaný objem mlieka – x) . PSB mlieka B Výpočet: 2,5 l . 350 000 = x . 1 500 000 + (2,5 l – x) . 200 000 875 000 = 1 500 000 x + 500 000 – 200 000 x 875 000 – 500 000 = 1 308 000 x 375 000 = 1 300 000 x x = 375 000 / 1 300 000 x = 0,28 l mlieka A 2,5 l – 0,28 l = 2,22 l mlieka B Na prípravu 2,5 litra referenčnej vzorky treba zmiešať 0,28 l mlieka A s 2,22 l mlieka B.
Príloha 13 – Navážka K2Cr2O7 pre prípravu referenčnej vzorky
Tabuľka 1 Objem pripravovanej
referenčnej vzorky Navážka K2Cr2O7 na
prípravu 0,1 % roztoku Objem pripravovanej
referenčnej vzorky Navážka K2Cr2O4 na
prípravu 0,1 % roztoku
500 ml 0,5000 g 2800 ml 2,8000 g
600 ml 0,6000 g 2900 ml 2,9000 g
700 ml 0,7000 g 3000 ml 3,0000 g
800 ml 0,8000 g 3100 ml 3,1000 g
900 ml 0,9000 g 3200 ml 3,2000 g
1000 ml 1,0000 g 3300 ml 3,3000 g
1100 ml 1,1000 g 3400 ml 3,4000 g
1200 ml 1,2000 g 3500 ml 3,5000 g
1300 ml 1,3000 g 3600 ml 3,6000 g
1400 ml 1,4000 g 3700 ml 3,7000 g
1500 ml 1,5000 g 3800 ml 3,8000 g
1600 ml 1,6000 g 3900 ml 3,9000 g
1700 ml 1,7000 g 4000 ml 4,0000 g
1800 ml 1,8000 g 4100 ml 4,1000 g
1900 ml 1,9000 g 4200 ml 4,2000 g
2000 ml 2,0000 g 4300 ml 4,3000 g
2100 ml 2,1000 g 4400 ml 4,4000 g
2200 ml 2,2000 g 4500 ml 4,5000 g
2300 ml 2,3000 g 4600 ml 4,6000 g
2400 ml 2,4000 g 4700 ml 4,7000 g
2500 ml 2,5000 g 4800 ml 4,8000 g
2600 ml 2,6000 g 4900 ml 4,9000 g
2700 ml 2,7000 g 5000 ml 5,0000 g
Príloha 14 – Príklad validačného protokolu
Tabuľka 1
VALIDAČNÝ PROTOKOL Výrobca referenčnej vzorky
Národné referenčné laboratórium pre mlieko a mliečne výrobky, Akademická 3, 949 01
Nitra Tel.: + 421 37 653 65 20 – 22, Fax.: + 421 37 653 65 23, e-mail: nrlm@svunitra.sk
www.svpunitra.sk Zákazník
Číslo referenčnej vzorky 0905V (RV - V 7)
Dátum prípravy 14. september 2005
Dátum odoslania 21. september 2005
Dátum expirácie 14. október 2005
Podpis zodpovedného pracovníka
Ing. Peter Zajác
Priemerný počet somatických buniek, ml-1
571 000
Stanovené rozpätie počtu somatických buniek, ml-1
interval od 541 000 do 601 000
Stanovené počty somatických buniek v referenčnej vzorke, ml-1
588 000 560 000 580 000 570 000 568 000 594 000 – 600 000 541 000 547 000 554 000 575 000 572 000 – 550 000 560 000 555 000 600 000 563 000 – – 565 000 587 000 535 000 607 000 585 000 – – 577 000 597 000 531 000 588 000 581 000 – –
Štandardná odchýlka, ml-1 20 709
Variačný koeficient (%) 3,62
Manipulácia s referenčnou vzorkou
Referenčné vzorky skladujte v tme pri teplote od 0 °C do + 6 °C. V referenčných vzorkách garantujeme deklarovaný počet somatických buniek maximálne do dátumu expirácie.
Návod na použitie referenčných vzoriek
Pred použitím referenčné vzorky zahrejte vo vodnom kúpeli na teplotu 40 °C ± 0,5 °C. Počas zahrievania vzorky dôkladne ale opatrne premiešajte prevrátením vzorkovnice 15 až 20 - krát, úkon zopakujte 3 - krát. Pred meraním premiešajte ešte 1 - krát. Vzorku zmerajte 6 až 8 – krát. Stanovte aritmetický priemer meraní. Meranie je vyhovujúce, ak je Vami stanovený aritmetický priemer meraní v rozpätí, ktoré je uvedené vo validačnom protokole.
Hodnota počtu somatických buniek v referenčnej vzorke bola overená stanovením pomocou akreditovanej mikroskopickej metódy podľa normy STN EN ISO 13366 - 1 – Mlieko. Stanovenie počtu somatických buniek. Časť 1: Mikroskopická
metóda (referenčná metóda). Národné referenčné laboratórium prehlasuje, že vykonáva pravidelnú kontrolu kvality referenčných vzoriek od dátumu ich výroby až po dátum ich expirácie. V prípade zistenia odchýlky od deklarovaných hodnôt
referenčnej vzorky, ihneď upozorní všetkých zákazníkov. Zákazníkom budú následne dodané náhradné referenčné vzorky.
Príloha 15 – Biele krvinky (leukocyty)
Obrázok 1. Neutrofilný granulocyt
Obrázok 2. Eozinofilný granulocyt
Obrázok 3. Bazofilný granulocyt
Obrázok 4. Lymfocyt
Obrázok 5. Monocyt
Obrázok 6. Makrofág
(WIKIPEDIA – THE FREE ENCYCLOPEDIA, 2006)
Príloha 16 – Krv hovädzieho dobytka
Obrázok 1. Krv hovädzieho dobytka. 1 – segmentovojadrový bazofil, 2 – tyčinkovojadrový
eozinofil, 3 – segmentovojadrový eozinofil, 4 – mladý neutrofil, 5,6,7 – segmentovojadrové
neutrofily, 8 – monocyt so značne rozčleneným jadrom, 9 – veľký, 10 – stredný s azúrofilnou
granuláciou v cytoplazme, 11 – mladý lymfocyt, 12 – trombocyty, 13 – erytrocyty.
(Autor obrázku Nikitin, zdroj: Slanina et al., 1965)
Príloha 17 – Vypočítané korelačné koeficienty pre mikroskopické metódy stanovenia
počtu somatických buniek v experimente 1 a experimente 3
Vypočítané korelačné koeficienty pre porovnanie metód A, B, C stanovenia počtu
somatických buniek v experimente 1
Tabuľka 1 A B C
A - - -
B 0,995 - -
C 0,994 0,997 -
Vypočítané korelačné koeficienty pre porovnanie metód A, B, C, D, E, F stanovenia
počtu somatických buniek v experimente 3
Tabuľka 2 A B C D E F
A - - - - - -
B 0,998 - - - - -
C 0,918 0,912 - - - -
D 0,993 0,992 0,919 - - -
E 0,908 0,902 0,999 0,908 - -
F 0,927 0,923 0,996 0,933 0,992 -
Výpočet sa uskutočnil v profesionálnom štatistickom programe STATISTICA CZ.
© 2006 Ing. Peter Zajác (peter.zajac@post.sk)
© 2006 Štátny veterinárny a potravinový ústav Nitra – Národné referenčné
laboratórium pre mlieko a mliečne výrobky (nrlm@svunitra.sk)
Recommended