Fluorescence spectroscopy presentación 8

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Espectroscopía de fluorescencia Principios y aplicaciones

Temas

¨  Los  métodos  de  espectroscopia:  principios  y  aplicaciones    ¤  Fluorescencia  

n  Historia  de  la  fluorescencia  n  Definir  los  principios  de  este  método,  sus  posibilidades  y  limitaciones  

n  Aplicar  métodos  adecuados  para  cues9ones  analí9cas  ;picas  y  di<ciles  

¨  Estudio  de  casos  ¨  Resolver  un  problema  en  clase  

Espectro electromagnético

Fotón •  Es la partícula elemental portadora de todas las

formas de radiación electromagnética (paquetes de energía)

•  No tiene masa y viaja en el vacío con una velocidad constante C.

•  Dualidad onda-partícula •  Energía de un fotón (Ley de Planck)

E=hv

El fenómeno de fluorescencia

Intrínseca: se excitan moléculas que forman a la proteína

(fenilalanina, triptófano, tirosina) Extrínseca: se adicionan

fluoróforos a la proteína.

Fluorescencia: proceso instantáneo (ns)

Fosforescencia: retraso entre la excitación y la emisión (ms, s, min u

horas)

Es la emisión de un fotón desde un estado electrónico excitado a

su estado basal (transición radiativa)

Luminiscencia

Fluorescencia

Fluorescencia intrínseca

Fluorescencia extrínseca

Fosforescencia

Estado  basal  

Estado  excitado  

S0  

S1  

Excitación   Emisión  

Sistema de luminiscencia

Los inicios

1905

E. Nichols and E. Merrit:

Primer espectro de excitación de un

fluoróforo

1919

Stern and Volmer: Fenómeno del

apagado de la fluorescencia

1924

S.J. Vavilov: Determinación del rendimiento de la

fluorescencia

1926

E. Gaviola: Primera medición directa del tiempo de vida en ns.

1935

A. Jablonski: Diagrama

1948

T. Förster: QM theory of dipole‐dipole interaction

Diagrama Jablonski

10-13 s

Aleksander Jablonski

Procesos  radia6vos  

Procesos  no  radia6vos  Calor  

Colisiones  

Fluorescencia intrínseca: el fluoróforo forma parte de la molécula de interés (proteína). Residuos de aminoácidos (fenilalanina, triptófano y tirosina)

Fluorescencia extrínseca: el fluoróforo se añade a la molécula de interés. (ANS, Sypro ORANGE, Congo Red, Nile Red, DCVJ, etc.)

Tipos de fluorescencia

•   Fluoróforo:  es  un  componente  químico  que  causa  que  una  molécula  absorba  energía  (excitación)  y  la  emita.  (Grupos  aromá9cos)  

Fluoróforos intrínsecos

Fenilalanina  

Tirosina  Triptófano  

Fluoróforos extrínsecos

ANS  

Bis-­‐ANS  

Nile  Red  

DCVJ  Thioflavin  T  

Congo  Red  

Fluoróforos extrínsecos

Acomplamiento

Fluorescencia  intrínseca  

Fluorescencia  extrínseca  

Fluoróforos y su ambiente

ANS  excitado  a  350  nm   Bis-­‐ANS  excitado  a  385  nm   Nile  Red  excitado  a  550  nm  

Diferentes  solventes  

Posición  

Efecto  hipsocrómico   Efecto  batocrómico  

Factores que afectan la fluorescencia

•  Polaridad del solvente

•  Temperatura

•  Viscosidad

•  pH

Apagado de la fluorescencia

•  “Fluorescence quenching” •  Proceso que disminuye la fluorescencia. •  Principal mecanismo (FRET) Foster resonance energy

transfer.

Métodos de fluorescencia

Métodos de fluorescencia

Steady-­‐state  fluorescence   Timed-­‐resolved  fluorescence   Anisotropy  

Fluorescence  correla6on  spectroscopy  

Fluorescence  microscopy  

CPS  Cu

entas  p

or  se

gund

o  

Instrumentación

FluoroMax  

FluoroLog   Aqualog      

Espectrómetros  de  fluorescencia  

FLS920      

Instrumentación

Espectrómetros  de  fluorescencia  DeltaFlex      

OB920      

Configuración

Detectores

CCD    

PMT    

• Monitorea la lámpara de Xenón

Detector de referencia de fotodiodo

• UV-lejano e IR-cercano

Detector CCD (charge-coupled device)

• Señal de emisión (monocromador de emisión) en el modo de tiempo de vida.

Detector de señal a temperatura ambiente

• Detector óptico de vacío.

Tubo fotomultiplicador

Detectores

Accesorios

Compar6mento  para  muestras  sólidas        

Controlador  de  temperatura        

Compar6mento  para  celdas        

Lámpara  de  Xenón        

nanoLED        

Accesorios

Celdas        

Intensidad de fluorescencia Steady-state fluorescence

•  Espectro de excitación •  Espectro de emisión •  Longitud de onda máxima (nm) •  Intensidad máxima (CPS) •  Rendimiento de la fluorescencia “Quantum yield”

Parámetros que se obtienen de la fluorescencia

Intensidad de fluorescencia Steady-state fluorescence

•  Emisión ocurre a longitud de onda mayor (<E) que

la excitación (Corrimiento de Stoke).

Principios básicos

λ →

Intensidad de fluorescencia Steady-state fluorescence

1.  Encender  los  controladores  del  fluorómetro  2.  Encender  la  lámpara  de  Xenón  y  su  ven9lación  30  min  antes  del  primer  barrido.  3.  Encender  el  controlador  de  temperatura  4.  Encender  la  computadora  5.  Realizar  las  verificaciones  de  la  calibración  de  ambos  monocromadores  6.  Introducir  un  blanco  (solvente)  7.  Colocar  los  parámetros  correspondientes  y  realizar  el  barrido  8.  Introducir  la  muestra  y  realizar  el  barrido  

Intensidad de fluorescencia Steady-state fluorescence

Decaimiento de fluorescencia Time-resolved fluorescence

Parámetros que se obtienen del decaimiento de la fluorescencia

•  Espectro del decaimiento •  Tiempo de vida de fluorescencia (ns)

Instrument Response Function

Decay curve

Decaimiento de fluorescencia Time-resolved fluorescence

Maneras de medir el decaimiento Time  domain  

TCSPC  (Time  correlated  single  photon  coun6ng)  

     

Frequency  domain  Frequency  modula6on  

   Diferentes  

 Detectores    Fuentes  de  pulsos  

   

   • nanoLED  

• Técnica  directa  • Intensidad  como  función  del  6empo  

     

• Fuente  de  excitación  con6nua  

• Intensidad  como  función  de  la  frecuencia  las  ondas  de  excitación  y  

emisión        

Decaimiento de fluorescencia Time-resolved fluorescence

TCSPC

Caso de análisis

Caso de análisis

Adición  de  un  quencher  (Acrilamida)      >Q, <T >Q, <I

•  Acrilamida es un quencher soluble en agua que actúa en la superficie, no penetra la matriz de la proteína.

•  Se asume que sólo los triptófanos expuestos al solvente son

apagados por la acrilamida.

Caso de análisis

Adición  de  un  desnaturalizante  (GuHCl)      >D, >T

•  Los tiempos cortos desaparecen (Buried Trp)

•  Ocurre una transferencia de E entre los triptófanos internos

Caso de análisis

Posibilidades

•  Técnica analítica muy sensitiva (a cambios conformacionales de la proteína)

•  Bajas concentraciones y volumenes de muestra •  No es un análisis destructivo (fluorescencia

intrínseca) •  No requiere un pre-tratamiento de muestra (Nativo) •  Análisis rápido •  Información sobre la estructura terciaria de la

proteína •  Agregados

Limitaciones

•  Instrumentación y accesorios costosos •  Numerosos análisis previos •  Depende de la respuesta del equipo •  Técnica muy sensitiva, la presencia de cualquier

compuesto que sea capaz de absorber energía reducirá la señal de intensidad de fluorescencia.

•  No todos los sistemas emiten E en forma de fluorescencia.

•  Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd, Edn, Springer, New York 2006, pp. 529–575.

•  Robbins, R. J., Fleming,G. R., Beddard,G. S., Robinson,G.W. et al., Photophysics of aqueous tryptophan: pH and temperature effects. J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 6271–6279.

•  Togashi D, Ryder A (2008) A fluorescence analysis of ANS bound to bovine serum albumin: binding properties revisited by using energy transfer. J Fluoresc 18:519–526

•  Moens PDJ, Helms MK, Jameson DM (2004) Detection of tryptophan to tryptophan energy transfer in proteins. Protein J23:79–83

•  Knapp. J.A. and Pace, C.N. (1974) Biochemistry 13, 1289-1294.

•  Vivian, J.T., Callis, P. R., Mechanisms of tryptophan fluorescence shifts in proteins. Biophys. J. 2001, 80, 2093–2109.

•  Beuckeleer KD, Volckaert G, Engelborghs Y (1999) Time resolved fluorescence and phosphorescence properties of the individual tryptophan residues of barnase: evidence for proteinprotein interactions. Proteins Struct Funct Genet 36:42–53

Bibliografía

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