Fluorescence spectroscopy presentación 8

Espectroscopía de fluorescencia Principios y aplicaciones

Temas

¨  Los métodos de espectroscopia: principios y aplicaciones ¤  Fluorescencia

n  Historia de la fluorescencia n  Definir los principios de este método, sus posibilidades y limitaciones

n  Aplicar métodos adecuados para cues9ones analí9cas ;picas y di<ciles

¨  Estudio de casos ¨  Resolver un problema en clase

Espectro electromagnético

Fotón •  Es la partícula elemental portadora de todas las

formas de radiación electromagnética (paquetes de energía)

•  No tiene masa y viaja en el vacío con una velocidad constante C.

•  Dualidad onda-partícula •  Energía de un fotón (Ley de Planck)

E=hv

El fenómeno de fluorescencia

Intrínseca: se excitan moléculas que forman a la proteína

(fenilalanina, triptófano, tirosina) Extrínseca: se adicionan

fluoróforos a la proteína.

Fluorescencia: proceso instantáneo (ns)

Fosforescencia: retraso entre la excitación y la emisión (ms, s, min u

horas)

Es la emisión de un fotón desde un estado electrónico excitado a

su estado basal (transición radiativa)

Luminiscencia

Fluorescencia

Fluorescencia intrínseca

Fluorescencia extrínseca

Fosforescencia

Estado basal

Estado excitado

S0

S1

Excitación Emisión

Sistema de luminiscencia

Los inicios

1905

E. Nichols and E. Merrit:

Primer espectro de excitación de un

fluoróforo

1919

Stern and Volmer: Fenómeno del

apagado de la fluorescencia

1924

S.J. Vavilov: Determinación del rendimiento de la

fluorescencia

1926

E. Gaviola: Primera medición directa del tiempo de vida en ns.

1935

A. Jablonski: Diagrama

1948

T. Förster: QM theory of dipole‐dipole interaction

Diagrama Jablonski

10-13 s

Aleksander Jablonski

Procesos radia6vos

Procesos no radia6vos Calor

Colisiones

Fluorescencia intrínseca: el fluoróforo forma parte de la molécula de interés (proteína). Residuos de aminoácidos (fenilalanina, triptófano y tirosina)

Fluorescencia extrínseca: el fluoróforo se añade a la molécula de interés. (ANS, Sypro ORANGE, Congo Red, Nile Red, DCVJ, etc.)

Tipos de fluorescencia

•  Fluoróforo: es un componente químico que causa que una molécula absorba energía (excitación) y la emita. (Grupos aromá9cos)

Fluoróforos intrínsecos

Fenilalanina

Tirosina Triptófano

Fluoróforos extrínsecos

ANS

Bis-‐ANS

Nile Red

DCVJ Thioflavin T

Congo Red

Fluoróforos extrínsecos

Acomplamiento

Fluorescencia intrínseca

Fluorescencia extrínseca

Fluoróforos y su ambiente

ANS excitado a 350 nm Bis-‐ANS excitado a 385 nm Nile Red excitado a 550 nm

Diferentes solventes

Posición

Efecto hipsocrómico Efecto batocrómico

Factores que afectan la fluorescencia

•  Polaridad del solvente

•  Temperatura

•  Viscosidad

•  pH

Apagado de la fluorescencia

•  “Fluorescence quenching” •  Proceso que disminuye la fluorescencia. •  Principal mecanismo (FRET) Foster resonance energy

transfer.

Métodos de fluorescencia

Métodos de fluorescencia

Steady-‐state fluorescence Timed-‐resolved fluorescence Anisotropy

Fluorescence correla6on spectroscopy

Fluorescence microscopy

CPS Cu

entas p

or se

gund

o

Instrumentación

FluoroMax

FluoroLog Aqualog

Espectrómetros de fluorescencia

FLS920

Instrumentación

Espectrómetros de fluorescencia DeltaFlex

OB920

Configuración

Detectores

CCD

PMT

• Monitorea la lámpara de Xenón

Detector de referencia de fotodiodo

• UV-lejano e IR-cercano

Detector CCD (charge-coupled device)

• Señal de emisión (monocromador de emisión) en el modo de tiempo de vida.

Detector de señal a temperatura ambiente

• Detector óptico de vacío.

Tubo fotomultiplicador

Detectores

Accesorios

Compar6mento para muestras sólidas

Controlador de temperatura

Compar6mento para celdas

Lámpara de Xenón

nanoLED

Accesorios

Celdas

Intensidad de fluorescencia Steady-state fluorescence

•  Espectro de excitación •  Espectro de emisión •  Longitud de onda máxima (nm) •  Intensidad máxima (CPS) •  Rendimiento de la fluorescencia “Quantum yield”

Parámetros que se obtienen de la fluorescencia


•  Emisión ocurre a longitud de onda mayor (<E) que

la excitación (Corrimiento de Stoke).

Principios básicos

λ →


1. Encender los controladores del fluorómetro 2. Encender la lámpara de Xenón y su ven9lación 30 min antes del primer barrido. 3. Encender el controlador de temperatura 4. Encender la computadora 5. Realizar las verificaciones de la calibración de ambos monocromadores 6. Introducir un blanco (solvente) 7. Colocar los parámetros correspondientes y realizar el barrido 8. Introducir la muestra y realizar el barrido


Decaimiento de fluorescencia Time-resolved fluorescence

Parámetros que se obtienen del decaimiento de la fluorescencia

•  Espectro del decaimiento •  Tiempo de vida de fluorescencia (ns)

Instrument Response Function

Decay curve


Maneras de medir el decaimiento Time domain

TCSPC (Time correlated single photon coun6ng)

Frequency domain Frequency modula6on

Diferentes

Detectores Fuentes de pulsos

• nanoLED

• Técnica directa • Intensidad como función del 6empo

• Fuente de excitación con6nua

• Intensidad como función de la frecuencia las ondas de excitación y

emisión


TCSPC

Caso de análisis

Caso de análisis

Adición de un quencher (Acrilamida) >Q, <T >Q, <I

•  Acrilamida es un quencher soluble en agua que actúa en la superficie, no penetra la matriz de la proteína.

•  Se asume que sólo los triptófanos expuestos al solvente son

apagados por la acrilamida.

Caso de análisis

Adición de un desnaturalizante (GuHCl) >D, >T

•  Los tiempos cortos desaparecen (Buried Trp)

•  Ocurre una transferencia de E entre los triptófanos internos

Caso de análisis

Posibilidades

•  Técnica analítica muy sensitiva (a cambios conformacionales de la proteína)

•  Bajas concentraciones y volumenes de muestra •  No es un análisis destructivo (fluorescencia

intrínseca) •  No requiere un pre-tratamiento de muestra (Nativo) •  Análisis rápido •  Información sobre la estructura terciaria de la

proteína •  Agregados

Limitaciones

•  Instrumentación y accesorios costosos •  Numerosos análisis previos •  Depende de la respuesta del equipo •  Técnica muy sensitiva, la presencia de cualquier

compuesto que sea capaz de absorber energía reducirá la señal de intensidad de fluorescencia.

•  No todos los sistemas emiten E en forma de fluorescencia.

•  Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd, Edn, Springer, New York 2006, pp. 529–575.

•  Robbins, R. J., Fleming,G. R., Beddard,G. S., Robinson,G.W. et al., Photophysics of aqueous tryptophan: pH and temperature effects. J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 6271–6279.

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Bibliografía

Documents

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