Fototermalna antitumorska aktivnost grafenskih nanočestica i

S. Misirlić Denčić, Z. Marković, B. Todorović-Marković, D. Kepić, K. Arsikin, Ž. Stanojević, N. Zogović, M. Dramićanin, V. Trajković

Fototermalna antitumorska aktivnost Fototermalna antitumorska aktivnost grafenskih nanočestica igrafenskih nanočestica iugljeničnih nanotuba pobuđenih ugljeničnih nanotuba pobuđenih zračenjem bliske IC oblastizračenjem bliske IC oblasti

Uvod

U okolnostima nemogućnosti primene hirurške terapije, selektivna ablacija malignog tkiva toplotom je efikasna alternativna terapijska metoda.

Nažalost, glavne termičke ablativne tehnike (laser, ultrazvuk, mikro-talasi i radio-talasi) ne poseduju same po sebi selektivnost prema malignim ćelijama.

Uvod

U skladu sa tim, neophodno je povećati osetljivost malignih ćelija na iradijaciju u cilju povećanja efikasnosti i smanjenja toksičnosti pri primeni termalne ablacije tumorskog tkiva.

Jedna od mogućih, obećavajućih strategija fototermalne terapije maligniteta je upotreba nanočestica u cilju efikasne konverzije energije zračenja bliske IC oblasti u vibracionu energiju i sledstvenu toplotu koja ubija maligne ćelije.

Uvod

Upotreba zračenja bliske IC oblasti u opsegu 700-1000 nm za indukciju hipertermije je posebno interesantna, obzirom da biološki sistemi uglavnom nemaju hromofore koje mogu apsorbovati zračenja ovih talasnih dužina.

Uvod

Ugljenične nanotube (CNT) su cilindrične strukture do nekoliko stotina nanometara u dijametru, dužine nekoliko mikrometara, koje se sastoje od atomski-tankih listića ugljenika koji su zovu grafen.

Poslednjih par godina proučavanje osobenosti grafena ukazuje na svojstva koja prete da ugroze dominaciju CNT u nanotehnologijama, i otvaraju mogućnost primene grafena u biomedicini.

Uvod

Ipak, za razliku od potvrđenog fototermalnog antitumorskog delovanja CNT, efekti grafenskih nanočestica na ćelije tumora do danas nisu razjašnjeni.

Samo jedna skorašnja studija (Nano Lett 2010;10:3318) na mišjem modelu je pokazala da intravenski aplikovane grafenske nanočestice smanjuju veličinu tumora nakon hipertermije izazvane zračenjem bliske IC oblasti.

Uvod

Ipak, dva vrlo važna pitanja ostala su do danas bez odgovora:

1. Koji molekularni mehanizmi stoje u osnovi grafenom-posredovanog fototermalnog antitumorskog dejstva?

2. Kakva je fotermalna efikasnost grafena u poređenju sa CNT?

Cilj istraživanja

U ovom istraživanju poređeno je fototermalno antitumorsko dejstvo grafenskih nanočestica i ugljeničnih nanotuba pobuđenih kontinualnim IC laserom talasne dužine 808 nm (2 W/cm2, model „RLTMDL-808-1 W“proizvođača „Roithner LaserTechnik“), u trajanju od 30-300s.

Materijal i metode

U eksperimentima su korišćene stabilne vodene suspenzije sledećih nanočestica:

1. Polivinil-pirolidin grafenskih nanočestica (GPVP)

2. Ugljeničnih nanotuba funkcionalizovanih sa DNK- (CNTDNA)

3. Ugljeničnih nanotuba funkcionalizovanih sa natrijum dodecilbenzensulfonatom (CNTSDBS)

Materijal i metode

“Atomic force microscopy” (AFM) merenja su izvršena na AFM mikroskopu (Quesant Instrument Corp. Agoura Hills, CA).

UV-vis spektralna analiza nanougljeničnih suspenzija je vršena u opsegu talasnih dužina 500-1100 nm pomoću Avantes UV-vis spektrofotometra na 20°C uz automatsku korekciju za rastvarač (voda).

Materijal i metode

Iluminacija je vršena kontinualnim IC laserom talasne dužine 808 nm (2 W/cm2, model „RLTMDL-808-1 W“proizvođača „Roithner LaserTechnik“), u trajanju od 30-300 s.

Porast temperature je registrovan termoparom uronjenim u suspenziju tako da nije bio direktno izložen laserskoj svetlosti.

Analiza antitumorskog delovanja nanočestica je izvršena na ćelijskoj liniji humanog glioma (U251).

Materijal i metode

Za procenu vijabiliteta korišćeno je bojenje kristal violetom (CV) i MTT.

Analiza molekarnog mehanizma antitumorskog delovanja nanočestica (apoptoza/nekroza, oksidativni stres i depolarizacija mitohondrija) vršena je primenom protočne citometrije.

Rezultati

Karakterizacija ugljeničnih nanomaterijala

Large scale AFM images Small scale AFM images

Karakterizacija grafenskih nanočestica

Surface profile

Analiza dobijenih slika minimalno 200 grafenskih nanočestica je ukazala da se u suspenziji GPVP nalaze kao:

1. “single layer” čestice dijametra do 50 nm2. “bilayer” čestice dijametra 50-70 nm3. “multilayer” čestice dijametra 70-360 nm

Dominirale su “bilayer” čestice dijametra oko 70 nm debljine 2 nm.

Karakterizacija grafenskih nanočestica

Small scale AFM images

Surface profile

CNTSDBS

Large scale AFM images

Karakterizacija ugljeničnih nanotuba

Većina nanotuba CNTSDBS je u suspenziji formirala snopove prosečne dužine 1.6 µm, dijametra oko 60 nm i visine 3 nm.

Morfologija CNTDNA je bila slična.

Karakterizacija ugljeničnih nanotuba

Na osnovu koncentracije nanomaterijala u vodenoj suspenziji i njihove mase izračunata je koncentracija nanomaterijala.

Ona je iznosila oko 1015 grafenskih nanočestica/l u suspenziji koncentracije 20 µg/ml i oko 2 x 1012 CNTSDBS/l u suspenziji iste koncentracije.

Karakterizacija ugljeničnih nanomaterijala

Rezultati

Fototermalna senzitivnost grafena i CNT

UV-vis analiza absorpcije zračenja bliske IC oblasti od strane ugljeničnih nanomaterijala

CNT više apsorbuju svetlost bliske IC oblasti u odnosu na GPVP.

Kontrolni rastvori PVP, DNA i SDBS nisu apsorbovali zračenje bliske IC oblasti.

Fototermalna senzitivnost grafena i CNT

Suspenzije svih ispitivanih nanomaterijala su pokazale porast temperature nakon ekspozicije zračenju bliske IC oblasti koje je bilo zavisno od njihove koncentracije kao i od dužine trajanja ekspozicije.

Grafenske nanočestice su pod istim uslovima generisale veći porast temperature u poređenju sa CNT!!!

Fototermalna senzitivnost grafena i CNT

GPVP

65

∆TG ~ 35°C ∆TCNT ~ 18°C

48

CNTDNA

∆TG/ ∆TCNT ~ 2

65

49

GPVP CNTSDBS

∆TG ~ 35°C ∆TCNT ~ 19°C

∆TG/ ∆TCNT ~ 2

Sa druge strane, kapacitet povećanja temperature nakon apsorpcije zračenja bliske IC oblasti je bio skoro identičan za oba tipa CNT.

Iz ovoga se može zaključiti da način preparacije ovih nano suspenzija ne utiče na njihovu fototermalnu senzitivnost.

Veća fototermalna efikasnost grafenskih nano čestica verovatno se može objasniti njihovom boljom disperznošću

Fototermalna senzitivnost grafena i CNT

Uzimajući u obzir termodinamička, optička i geometrijska svojstva ugljeničnih nano materijala, upotrebili smo sledeće jednačine:

∆Q = toplotam = masa nanočesticec = toplotni kapacitet∆T = porast temperatureN = broj čestica u suspenzijim1 = masa reprezantativnog

grafenskog “bilayer”-a tj. ugljeničnog snopa nano tuba

A = apsorpcija zračenja (808 nm)

S = površina nano materijala koja apsorbuje zračenje

Ef = efikasnost apsorpcije (2.3% za “layer” grafena tj. 20% za snop CNT)

(1)

(2)

Fototermalna senzitivnost grafena i CNT

Aproksimovali smo da je razvijena toplota nakon zračenja nanočestica i CNT bliskom IC oblsti istog reda veličine.

Na osnovu jednačina (1) i (2) izvedena je jednačina za odnos relativnog porasta temperature za grafenske nanočestice i CNT:

dCNT = prosečan dijametar snopa CNT

hG = visina grafenske nanočestice

Fototermalna senzitivnost grafena i CNT

Izračunata vrednost odnosa ∆TG/ ∆TCNT je ~ 3.5 i slična je eksperimentalno dobijenoj vrednosti ~ 2.

Dakle, iako CNT imaju bolju fototermalnu senzitivnost, generišu manju količinu toplote u odnosu na grafenske nanočestice.

CNT, dakle, imaju tendenciju da agregiraju i formiraju snopove usled čega su u rastvoru manje dispergovane od grafena.

Fototermalna senzitivnost grafena i CNT

Rezultati

Fototermalna antitumorska efikasnost grafena i CNT

Fototermalno antitumorsko delovanje grafena i CNT na U251 ćelije

Dozno i vremenski zavisna citotoksičnost prema U251 ćelijama glioma

GPVP CNTDNA

Fototermalno antitumorsko delovanje grafena i CNT na U251 ćelije

U skladu sa izmerenim skokom temperature nakon primene zračenja bliske IC oblasti, grafenske nanočestice su pokazale nekoliko puta bolju efikasnost u ubijanju tumorskih ćelija u odnosu na CNT !!!

Fototermalno antitumorsko delovanje grafena i CNT na U251 ćelije

Rezultati

Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog fototermalnog

antitumorskog delovanja

Nekroza i apoptoza su dva glavna modaliteta ćelijske smrti koja se u potpunosti razlikuju po mehanizmu nastanka i morfološkim promenama koje ih prate.

Nekrozu karakteriše gubitak integriteta ćelijske membrane, stimulacija imunološkog odgovora i oštećenje okolnih zdravih ćelija.

Apoptozu karakteriše fragmentacija nuklearne DNK u odsustvu oštećenja membrane, koja eksponira fosfatidilserin.

Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog fototermalnog antitumorskog delovanja

U251 su bile izložene zračenju 3 min u prisustvu/odsustvu GPVP (10µg/ml)

Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog fototermalnog antitumorskog delovanja

Test aktivnosti LDH je ukazao na porast permeabiliteta ćelijske mebrane u 50% ćelija (49.2 ± 17.3; n=2)

Može se zaključiti da nekroza nije jednini mehanizam fototermalnog antitumorskog delovanja grafena.

Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog fototermalnog antitumorskog delovanja

FACS analize (morfologija ćelija)

Smanjenje veličine ćelija Porast granuliranosti ćelija

APOPTOZA24h

FACS – PI (fragmentacija DNK)

24h

FACS – Ann/PI (eksternalizacija fosfatidilserina)

Ann+/PI+ Ann+/PI+

Ann+/PI- Ann+/PI-Ann-/PI- Ann-/PI-

Ann-/PI+ Ann-/PI+

ZDRAVE

NEKROTIČNE KASNA APOPTOZA

RANA APOPTOZA

Ukupan broj Ann+ ćelija u kontroli 9.4% a u tretmanu 95.5%

24h

FACS – ApoStat (aktivacija kaspaza)

U251 su bile izložene zračenju 3 min u prisustvu/odsustvu GPVP (10µg/ml)

24h *p< 0.05 ANOVA

FACS – DePsi (depolarizacija mitohondrija)

4h

Gubitak mmp (Ψ)

*p< 0.05 ANOVA

FACS – DHR (produkcija ROS)

4h *p< 0.05 ANOVA

FACS – DHE (produkcija superoksida)

4h *p< 0.05 ANOVA

Zaključci:

1. Grafenske nanočestice pokazuju fototermalno antitumorsko dejstvo nakon pobuđivanja zračenjem bliske IC oblasti.

2. Bolja disperznost i manja veličina grafenskih nanočestica je odgovorna za superioran fototermalni antitumorski efekat u odnosu na CNT

3. Mehanizam antitumorskog delovanja je kombinacija apoptoze i nekroze usled indukcije oksidativnog stresa i oštećenja mitohondrija.

Zaključci:

S obzirom na veliku površinu, malu toksičnost i jeftinu proizvodnju, grafenske nanočestice mogu biti potencijalni kandidati za fototermalnu terapiju maligniteta.

REALIZATORI ISTRAŽIVANJA

Katarina ArsikinAleksandar Pantović

Rukovodilac: Vladimir Trajkovic