(I): métodos convencionales y métodos rápidos

Identificación microbiana (I):métodos convencionales y métodos

TEMA 12

métodos convencionales y métodosrápidos (manuales y automatizados)

1. Esquema general de identificación microbiana2. Métodos convencionales

2.1. Pruebas bioquímicas3. Métodos rápidos

3.1. Sistemas manuales3.1.1. API

3.1.1.1. Lectura e interpretación de los resultados

Tema 15. Identificación microbiana:

métodos bioquímicos

3.1.1.1. Lectura e interpretación de los resultados3.1.1.2. Diferentes tipos de galerías API3.1.1.3. Sistema ATB (API automatizado)

3.1.2. Enterotubo3.1.2.1. Lectura e interpretación de los resultados

3.2. Sistemas automatizados3.2.1. Abac-Abactor II

3.2.1.1. Procedimiento 3.2.2. Vitek

3.2.2.1. Procedimiento

1. Esquema general de identificación microbiana

Microscopio (fresco/tinciones)

Pruebas genéticas

Pruebas inmunológicas

Muestra

Aislamiento(medios selectivos)

Cultivo puro

Microscopio (fresco/tinciones)

Pruebas genéticas

Pruebas inmunológicas

Pruebas bioquímicas

Cultivo puro

1. Esquema general de identificación microbiana

IdentificaciónPruebas de sensibilidad a antibióticos

2.1. Pruebas bioquímicas

-Algunas pruebas bioquímicas se denominan PRUEBAS RÁPIDASporque evalúan la presencia de enzimas preformadas y se realizan de forman inmediata:

- CATALASA

2. Métodos convencionales

- CATALASA- CITOCROMO C- OXIDASA- COAGULASA- SOLUBILIDAD EN BILIS, ….

- La mayoría de las pruebas bioquímicas convencionales de

identificación se llevan a cabo cultivando los microorganismos

(bacterias) en medios que contienen el sustrato a metabolizar

- El medio se incuba generalmente de 18 a 24 horas

- La reacción positiva se revela por cambios en el pH a consecuencia

del proceso metabólico (el medio debe incluir un indicador) o bien

2. Métodos convencionales

del proceso metabólico (el medio debe incluir un indicador) o bien

detectándolo directamente mediante reactivos especiales

Pruebas bioquímicas en tubos (medios líquidos)

2. Métodos convencionales

Fermentación

de la lactosaPrueba VP

Aceite

Pruebas en

anaerobiosis (O/F)

2. Métodos convencionales

Pruebas bioquímicas en tubos (medios sólidos)

Prueba del citratoKligler

Pruebas

bioquímicas

en placas

2. Métodos convencionales

Crecimiento en sal y

Utilización de manitol

Hidrólisis del almidón

Crecimiento

en bilis

- Sistemas comerciales:

-Manuales: el operador debe realizar la inoculación y la lectura-Automatizados: instrumentos que efectúan la inoculación, la incubación y la lectura de manera automática, evaluando los resultados un ordenador que determina la identificación

3. Métodos rápidos

- Ventajas:

- Rapidez de manipulación

- Homogeneidad de resultados que permite la comparación entredistintos laboratorios

- Disposición de bases de datos computerizadas para interpretar losresultados

- En la década de los 60 aparecieron los primeros sistemas comerciales deidentificación (Enterotubo)

- Los primeros sistemas se diseñaron para enterobacterias (frecuencia enmuestras clínicas, rápido crecimiento y buen conocimiento de laspruebas bioquímicas necesarias para su identificación)

- Ventajas de estos sistemas

3.1. Sistemas manuales

- Ventajas de estos sistemas

- Fiabilidad

- Ocupan poco espacio en incubación y almacenamiento

- Duración larga (caducan en 6 a 12 meses)

- Fácil manejo, inoculación e interpretación de los resultados

- Tanto las pruebas como los medios son uniformes

-Muchos de estos sistemas incluyen en pequeños pocillos de plástico una mínima cantidad de medio o del sustrato a estudiar, liofilizado o desecado

- El medio se inocula directamente o bien el sustrato se rehidrata con un pequeño volumen de una suspensión del microorganismo en agua destilada o en medio de cultivo

3.1. Sistemas manuales

- El sistema se incuba y transcurrido un tiempo se leen los resultados

- Los sistemas suelen incluir entre 10 y 50 pruebas

- Existen sistemas dirigidos a la identificación de distintos grupos de bacterias: enterobacterias, bacilos Gram negativos no fermentadores, estafilococos, estreptococos, neisserias, corineformes, bacterias anaerobias; y levaduras

- Todos los sistemas manuales comercializados deben manipularse y leerse de acuerdo con las instrucciones del fabricante

3.1. Sistemas manuales

- Tiras de plástico con 20 minitubos con un orificio en la parte superior para la inoculación y que contienen los sustratos deshidratados de 20 pruebas bioquímicas

- Se suministran dentro de sobres de aluminio sellado

- La suspensión bacteriana se prepara a partir de colonias aisladas

API (Biomérieux)

- La suspensión bacteriana se prepara a partir de colonias aisladas inoculadas en solución salina estéril (NaCl al 0,85%)

Cúpula

- Los tubos se rellenan con una pipeta estéril o con una jeringa y aguja, con cuidado de no formar burbujas que impiden el contacto entre el sustrato y la suspensión bacteriana

-Algunos tubos se llenan hasta la cúpula ya otros se les añade aceite de parafina paraobtener condiciones de anaerobiosis

API (Biomérieux)

Cúpula

Tubo

Aceite de parafina

obtener condiciones de anaerobiosis

- Tras la inoculación se introducen en una bandeja de plástico con tapa para mantener la humedad durante la incubación; la bandeja tiene unos pocillos que se llenan con agua de grifo para mantener la humedad

- La tira se incuba de 18 a 24 horas a 37ºC

API (Biomérieux)

- La tira se incuba de 18 a 24 horas a 37ºC

Pruebas negativas

- Hay pruebas de lectura directa y otras que necesitan la adición de reactivos

- Las pruebas positivas y negativas se identifican por el color que adquieren los medios tras la incubación o tras la adición de reactivos

Lectura e interpretación de los resultados

Pruebas negativas

Pruebas positivas

API STAPH

API STREP

- Los resultados se interpretan en función de la tabla de lectura

-A cada prueba se le asigna el valor + ó – (según sea positiva o negativa) Código binario de 20 dígitos

Lectura e interpretación de los resultados

+ - + + + - + - - - + + + - + - + - + +

- Obtención de un número binario de 20 dígitos

- Muy incómodo para trabajar

+ - + + + - + - - - + + + - + - + - + +

1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1

Lectura e interpretación de los resultados

- Se convierte el código binario (+ – +) en un código octal

- Las pruebas se agrupan de tres en tres

-A cualquier prueba negativa, ocupe el lugar que ocupe, se le asigna el valor 0

- Si la primera prueba de un triplete es positiva se le asigna el valor 1

- Si es positiva la segunda se le asigna el valor 2

- Si es la tercera, se le asigna el valor 4

-Al final, las 20 pruebas se transforman en un número o código de 7 dígitos que constituye el NÚMERO DE BIOTIPO

Lectura e interpretación de los resultados

… etc. Pruebas no incluidas en la galería

Klebsiella pneumoniae

o Serratia liquefaciensCódigo de la muestra: 5215773

- Los resultados se anotan en la tarjeta y la identificación se comprueba en un manual o en la base de datos de un ordenador

Lectura e interpretación de los resultados

API 20E

Lectura e interpretación de los resultados

API STAPH

API 20 STREP

API 20 NE

API NH

API LISTERIA

API CORYNE

API 50 CHAPI CANDIDA

API 50 CH

Sistema ATB (API semi-automatizado)

- Tubo de polipropileno en forma de lápiz dividido en 12 compartimentos que permite la realización de diferentes pruebas bioquímicas (se pueden leer 15 resultados)

Enterotubo (Becton Dickinson Diagnostics)

12 medios de cultivo 15 pruebas bioquímicas

Enterotubo

- El centro del tubo está atravesado por un alambre que sirve para la

inoculación y sobresale por los dos extremos que están tapados

por sendos tapones de rosca

-No necesita preparar suspensión bacteriana

Enterotubo

- Se inocula directamente desde colonias aisladas

Hilo metálico parainocular el Enterotubo

Compartimentosdel Enterotubo

Enterotubo

- El alambre se vuelve a insertar en los 4 primeros compartimentos (paraconseguir condiciones anaerobias) y el resto se rompe, colocando acontinuación los dos tapones de rosca

- Con el alambre roto se agujerean los 8 compartimentos restantes para incubar en aerobiosis

- Se incuba horizontalmente de 18 a 24 horas a 37ºC

Enterotubo

- Pruebas de lectura directa

- Pruebas de lectura indirecta: los reactivos se inyectan con una aguja

hipodérmica a través del tubo de propileno

Enterotubo

-Tras la incubación se leen las pruebas obteniéndose un número binariode 15 dígitos (100100111001010) según que éstas sean positivas (1)o negativas (0)

- Se agrupan las pruebas de tres en tres y se obtienen los números octales (laprimera prueba de cada triplete vale 4 si es positiva; la segunda vale 2 y latercera vale 1; sin son negativas, cualquiera que sea su posición valen 0)

Lectura e interpretación de los resultados

tercera vale 1; sin son negativas, cualquiera que sea su posición valen 0)

-A partir de los números octales seobtiene el NÚMERO DE BIOTIPODE 5 DÍGITOS

- La identificación se comprueba en unregistro de perfiles denominadoENCISE (EnterobacteriaceaeNumerical Coding and IdentificationSystem)

Lectura e interpretación de los resultados

- Es un sistema automatizado e informatizado para identificación de bacterias gram negativas y realización de pruebas de sensibilidad a antibióticos

- Se compone de un conjunto de rotores (Abac) y de un instrumento para la distribución del inóculo y la lectura de las pruebas (Abactor)

3.2. Sistemas automatizados

Abac – Abactor II (Menarini Diagnostics)

para la distribución del inóculo y la lectura de las pruebas (Abactor)

1. Identificación de bacterias Gram negativas y determinación

simultánea de su sensibilidad a 15 antibióticos, basado en técnicas de

dilución en medio líquido

Abac – Abactor II

Sirve para:

2. Determinación de la sensibilidad bacteriana frente a 16

antibióticos, de bacterias Gram negativas, Gram negativas urinarias,

estafilococos y estreptococos

3. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI)

Abac: son rotores con 32 compartimentos con medios de cultivo deshidratado para la identificación bacteriana y el estudio automatizado de la sensibilidad antimicrobiana. Hay tres tipos:

- Abac-Identibiograma II: rotores que incluyen 13 pruebasbioquímicas y 15 antibióticos a una concentración única o doble

- Abac-Antibiograma: rotores que incluyen 16 antibióticos a doble

Abac – Abactor II

- Abac-Antibiograma: rotores que incluyen 16 antibióticos a dobleconcentración

- Abac-CMI: rotores que incluyen aminoglucósidos y beta-lactámicos

- Vienen empaquetados en bolsas de aluminio alvacío y se pueden conservar hasta 18 meses atemperatura ambiente

Código de colores

Abactor II: instrumento que realiza la distribución del inóculo y la

lectura de los rotores de forma automática; interpreta e imprime en

una tarjeta los resultados de la identificación bacteriana y las

pruebas de sensibilidad

Abac – Abactor II

Descripción de Abactor

- En la parte izquierda está el sector destinado a la distribución automática del inóculo y la homogeneización del cultivo después de la incubación, mediante una breve centrifugación

Inoculación: 8 mL de suspensión en la cavidad central

Abac – Abactor II

Inoculación: 8 mL de suspensión en la cavidad central

Se produce una centrifugación breve a baja velocidad que reparte el volumen por igual entre todos los compartimentos del rotor

inoculación

- La incubación se realiza en una estufa, se saca el Abac y se lleva a una

estufa a 35-37ºC

- En la parte central está el sector que realiza la muestra la lectura de los

rotores. El sistema de lectura consta de una fuente de luz que es enfocada

por una lente al centro del pocillo

- En la parte derecha se encuentra el teclado numérico para la

Abac – Abactor II

- En la parte derecha se encuentra el teclado numérico para la

introducción del número de identificación de las muestras y las teclas de

función

Tarjeta de lectura: son del mismo color que la etiqueta colocada en los

rotores y está formada por TRES HOJAS AUTOCOPIABLES DIFERENTES

lectura

La primera hoja es para el microbiólogo e indica:

- Resultados de las pruebas bioquímicas- Nombre (probable o exacto) de la bacteria- Posibles pruebas adicionales para confirmar identificacionesprobables

- Perfil de sensibilidad a los distintos antimicrobianos (resistente,intermedio, sensible)

Abac – Abactor II

intermedio, sensible)- CMI (en el caso del Abac CMI)

- Las otras dos copias se destinan al médico e indican:

- Identificación definitiva- Perfil de sensibilidad

Interpretación de los resultados

- Exacto- Probable- Imposible

Abac – Abactor II

1. Realizar suspensión bacterianaa partir de colonias aisladas

2. Verter 8 mL del inóculo enla cavidad central del Abac

Procedimiento

3. Colocar el rotor en Abactor paraque la rotación del aparato duranteunos segundos transfiera 0,1 mLde inóculo a cada compartimento 4. Incubar el Abac en recipiente adecuado

en la estufa a 37ºC de 18 a 20 horas

5. Colocar el rotor de nuevo en Abactor, esperary retirar la tarjeta con los resultados impresos

- Sistema automatizado e informatizado que permite la identificación de bacterias Gram negativas y Gram positivas incluyendo patógenos de orina, patógenos entéricos, levaduras, anaerobios, Neisseria y Haemophilus, e indica la susceptibilidad a antimicrobianos

Incubador y lector

Vitek (Biomerieux)

Módulo de llenado y sellado Tarjetas

Programa

Disco duroImpresora

- Las tarjetas son de plástico transparente- Tienen 24 micropocillos con sustratos deshidratados- El llenado de las tarjetas se realiza por succión al vacío (puede llenar 10 a la vez) en el módulo de llenado

Pocillo con

Vitek

Transferencia automática delinóculo por succión al vacío

Pocillo consustrato

- La incubación se realiza dentro del mismo aparato, se pueden incubar 240 tarjetas a la vez

- El módulo de lectura admite 30, 60, 120 ó 240 tarjetas

- Se le pueden pedir resultados en cualquier momento del proceso

Vitek

- La identificación se obtiene en 4-6 horas demedia (2 horas en el caso de bacterias decrecimiento rápido)

1. La tarjeta se marca con un número queel sistema puede leer directamente

2. Después de añadir diluyente al tubo quecontiene la muestra, se colocan las tarjetas

Procedimiento

contiene la muestra, se colocan las tarjetasen el soporte con el tubo de transferencia

dentro del tubo de muestra

3. Las tarjetas se colocan en el módulo dellenado y sellado donde la muestra seráintroducida por succión al vacío en lospocillos, sellando después la tarjeta

4. Las tarjetas se colocan en unabandeja y se introducen en elmódulo de incubación y lectura

5. Una hora después de cargar la

Procedimiento

5. Una hora después de cargar lamuestra ya se puede pedirun informe preliminar

6. El informe final se imprimeautomáticamente para cada

tarjeta al final del ciclo