MALDI TOF T - fbioyf.unr.edu.ar

SU

SA

NA

A

MIG

OT

MALDI TOF

IDENTIFICACION FUNGICA

GENOTIPICO PATRON

PROTEICO

FENOTIPICO

IDENTIFICACION FUNGICA

MALDI TOF

18S rRNA ITS 1 O ITS 2

Internal transcribed

spacer regions 1 Y 2 Pruebas manuales,

Semi automatizadas

o automatizadas

MALDI

Matriz asistida por laser

desorción/ionización

TOF

Tiempo de vuelo (tiempo

que tarda cada ión en

llegar al detector)

Analiza proteínas intrínsecas

(ribosomales) de los microorganismos por

EM

El patrón proteico (ESPECTRO) se compara

con base de datos.

La concordancia de los Espectros

(microorganismo / base datos) se representa

con números 0-3

BACTERIAS

LEVADURAS

HONGOS

FILAMENTOSOS

MICOBACTERIAS

ID

MICROORG = ARMAS

BIOLOGICAS NO ID

Proceso Tecnología MALDI TOF MS

(Bruker Biotyper ).

α ciano-4

hidroxi - trans

cinámico

Biotyper

•Espectrometro Hardware+ Software + base datos (1960 ESP)

Proteínas

•2.000 a 200.000 Da

soporte

•Placa con 96pocillos reutilizable

lectura

•96 pocillos /h

Compara espectros

•1,7 a 3 fiabilidad

matriz

•Ac #ciano 4- hidroxi trans cinamico

Saramis

•Espectrometro Hardware+ Software : SHIMATZU.

• base datos SARAMIS (1160 ESP)

Proteínas

•2.000 a 200.000 Da

soporte

•Placa con 48pocillos NO reutilizable

lectura

•76 pocillos/h

Compara espectros

• CONFIABLE : SUP AL 70%

matriz

•2,5 DIHIDROBENZOICO

Plataformas comerciales

2.300 a 3.000

• Alta probabilidad de ID de especie

2.000 a 2299

• ID Género segura, especie probable

1.700 a 1.999

• ID de género probable

0.000 a 1.699

• Identificación no confiable

Score (confiabilidad de los

resultados)

(1) Aislamiento de cultivo primario

(2) Seleccionar 1colonia

(3) Realizar extendido (capafina) en un pocillo de la placaMaldi) (4) Agregar ac. Fórmico 70%

(5) Agregar Matriz HCCA(Ac. Alfa ciano-4-hidroxi cinámico)

(6) Generar perfil-espectro Por MALDI-TOF (7) Interpretación de datos

por MALDI Biotyper RTC 3.0

(8) Interpretación de resultados

Tiempo de resultado para una muestra: 5-8 minutos vs. horas o días para otros métodos de ID

BrukerMALDI Biotyper: Flujo de trabajo

MICROORGANISMOS

bacterias

Hongos

Método de extracción de proteínas

Directo – Spot

Extracción : fabricante

LIBERACIÓN DE PROTEÍNAS RIBOSOMALES

BASE DE DATOS BRUKER MALDI TOF Biotyper*

3900 microorganismos

318 géneros

1900 especies

Puntos críticos

En argentina RENAEM: RED NACIONAL MALDITOF (USUARIOS)

1 2

LEVADURAS

MEDIO CULTIVO: Sb gluc/ Chrom /AS

CULTIVO JOVEN (24 -48-72hs)

PROTOCOLO DE TRABAJO Spot directo • Sin pico o ID no confiable (2min)

Extracción Recomendada. • (20 min).

Evaluación score • .

IDENTIFICACION

Permite discriminar especies

relacionadas

C parapsilosis / C orthopsilosis / C metapsilosis

C glabrata / C bracarensis / C nivariensis

C albicans / dubliniensis

C haemulonii / C auris

C guillermondii / C famata

C neoformans / C gatti

Candida o Aspergillus

CRITERIOS DE INFORME PARA LEVADURAS POR MADI-TOF

Para la interpretación: score

≥ 1,7como identificación aceptable a nivel de especie y género, entre1,5-1,6 identificación aceptable a nivel de género menor a 1,5 como identificación NO CONFIABLE

Score menor a1,5 realizar extracción en tubo.

Para establecer un género Y/o especie diferente, diferencia mínima de10% entre el punto de corte superior y el más próximo.

Levaduras que no son identificadas, pero si obtenemos picos, enviar a

centro de referencia (Malbrán) para ser ingresadas en la base de datos

nacional

Colonias aisladas preferentemente de Sb 24-48h incubación.

FILAMENTOSOS

PLACAS

2, 5 Y 7 días

Sb, Lac, APD

Extrac Tubo C/ Zirconio,

• Mayor complejidad

para la extracción

• Conidios baja la discriminación

• Melanina impide la ionización

• Medio líquido disminuye la prod

de melanina

• Mejor técnica de extracción es

C/perlas de zirconio

Bruker aplica criterios muy estrictos ya que:

Identificación aceptable a nivel de género y

especie scores ≥ a 2,0

Identificación solo a nivel de género, 1,7- 2,0

Rechazables inferiores a 1,7 como poco

fiables

identificación como correcta a nivel de

género un score ≥ 1,6 y para especie ≥ 1,7

Las mayores limitaciones del uso de la espectrometría de masas para la identificación de los hongos filamentosos son la extracción de proteínas en la etapa pre analítica y el número de espectros en la base de datos.

FILAMENTOSOS

• El agregado de base de datos IN HOUSE mejora el rendimiento del

equipo (cepas de diferentes colecciones y regionales)

Estudios epidemiológicos

Identificación en muestras clínicas

Mecanismos de resistencia

Otras aplicaciones

Diferentes autores demuestran que se mejora el rendimiento de esta tecnología con el agregado de una base de datos in house y con cepas bien caracterizadas de colecciones de cultivos de diferentes

regiones geográficas, con el fin de reflejar la diversidad natural de las

especies Otras aplicaciones como la tipificación de aislamientos de brotes y/0 pruebas

de sensibilidad antifúngica son prometedores en Micología Clínica,

pero están todavía en etapa de desarrollo