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Mécanismes moléculaires de la résistancede Plasmodium falciparum aux antipaludiques
Master 1 « Physiopathologie cellulaire et moléculaire »Unité d’enseignement de microbiologie médicale
Denis Filisetti
Laboratoire de Parasitologie des Hôpitaux Universitaires de Strasbourg
Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire du CNRS
1er avril 2011
Faculté
de médecine
Plan du cours
• Enjeux de la question (paludisme)
• Généralités sur les résistances aux traitements
– chloroquine, sulfadoxine, pyriméthamine
• P. falciparum et résistance à la chloroquine
– mécanismes d’action de la chloroquine– mécanismes d’action de la chloroquine
– gène PfMDR1 (pompe à efflux)
– gène PfCRT (canal / transporteur chloroquine)
• P. falciparum et résistance à la pyriméthamine
– métabolisme des bases pyrimidiques
– gène DHFR
– régulation traduction ARNm DHFR
Objectifs pédagogiques
Être capable d’expliquer :
• la résistance de P. falciparum à la chloroquine
• la résistance de P. falciparum à la pyriméthamine
Enjeux de la question
• Le paludisme
– Une des maladies les plus fréquentes :
• 250 000 000 cas de paludisme par an ;
• 1 000 000 de décès par an :• 1 000 000 de décès par an :– 95 % = enfants africains < 5 ans
– Femmes enceintes
– Co-infectés VIH/SIDA
Enjeux de la question
• Distribution géographique du paludisme
Enjeux de la question
• Le paludisme
– Transmis (Anopheles)
– Plasmodium
• falciparum• falciparum
• vivax, ovale, malariae, (knowlesi)
• parasite protozoaire (embranchement apicomplexa)
Enjeux de la question
Embranchement des apicomplexa
mérozoïte
Enjeux de la question
Mérozoïte
Mérozoïte
Pénétration dans le globule rouge
Vacuole parasitophore
Mérozoïte
Globule rouge
Enjeux de la question
Aspect des globules rouges infectés
Enjeux de la question
• Le paludisme
– Fièvre, anémie (toutes les espèces)
– Atteinte grave d’organes (P. falciparum)
Hématie normale Hématie infectéeSphérique protrusions
Enjeux de la question
• Le paludisme
– Fièvre, anémie (toutes les espèces)
– Atteinte grave d’organes (P. falciparum)
• neuropaludisme• neuropaludisme
Enjeux de la question
• Traitement du paludisme à P. falciparum
– Chloroquine (CQ) (NIVAQUINE) : 1946
Généralités résistance
Résistance à la chloroquine chez P. falciparum
Généralités résistance
Résistance à la chloroquine chez P. falciparum
Résistance CQ détectée
Généralités résistance
• Résistances de P. falciparum :
– classification par rapport à CQ :
• classement des pays (1-2-3)
• recommandations de traitement (curatif / préventif)• recommandations de traitement (curatif / préventif)
• Traitement du paludisme à P. falciparum
– Chloroquine (CQ) (NIVAQUINE) : 1946
– Sufladoxine – pyriméthamine (SP)
Généralités résistance
Généralités résistance
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Généralités résistance
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Résistance SP détectée
Généralités résistance
• Traitement du paludisme à P. falciparum
– Chloroquine (CQ) (NIVAQUINE) : 1946
– Sufladoxine – pyriméthamine (SP)
– Artémisinine combinée– Artémisinine combinée
Généralités résistance
Pourquoi étudier et connaitre les mécanismes des résistances ?
• pour détecter plus rapidement la résistance sur le terrain,
• pour améliorer les antipaludiques existants,
• pour aider au développement de nouveaux antipaludiques.
Résistance à la chloroquine
chez Plasmodium falciparum
Hémoglobine
Résistance chloroquine P. falciparum
Globule rouge = environnement hostile pour Plasmodium
Plasmodium falciparum
Résistance chloroquine P. falciparum
Globule rouge = environnement hostile pour Plasmodium
(Vacuole parasitophore)
Résistance chloroquine P. falciparum
Globule rouge = environnement hostile pour Plasmodium
Plasmodium falciparum
Résistance chloroquine P. falciparum
Globule rouge = environnement hostile pour Plasmodium
Plasmodium falciparum
(Vacuole digestive)
Résistance chloroquine P. falciparum
Globule rouge = environnement hostile pour Plasmodium
« The Big Gulp »
ProtéasesAcides Aminés
Résistance chloroquine P. falciparum
Globule rouge = environnement hostile pour Plasmodium
Acides Aminés
Hémoglobine
Hématine
Oxydation
Vacuole digestive
Globine
Hème
(Protoporphyrine Fe+++)
Toxique pour Plasmodium
Vacuole digestive
Résistance chloroquine P. falciparum
Globule rouge = environnement hostile pour Plasmodium
Hématine Hémozoïne
TOXIQUE
NON TOXIQUE
Cristal
insoluble
Vacuole digestive
Résistance chloroquine P. falciparum
Globule rouge = environnement hostile pour Plasmodium
Hématine Hémozoïne
TOXIQUE
Mécanisme d’action de la chloroquine ?
Vacuole digestive
Résistance chloroquine P. falciparum
Hématine HémozoïneChloroquine
Vacuole digestive
Résistance chloroquine P. falciparum
Mécanisme d’action de la chloroquine ?
Liaison directe ? OUI mais
CQ (1 mM) v. hématine (400 mM)TOXIQUE
Hématine HémozoïneChloroquine
Vacuole digestive
Résistance chloroquine P. falciparum
Mécanisme d’action de la chloroquine ?
TOXIQUE
Hématine HémozoïneChloroquine
HDP
HDP : Heme Detoxifying Protein
?
Vacuole digestive
Résistance chloroquine P. falciparum
Mécanisme d’action de la chloroquine ?
Hématine HémozoïneChloroquine
HémozoïneHématine
Adsorption sur
l’hémozoïne ?
– P. falciparum résistant CQ :
– + vérapamil : réversion résistance (sensible)
Résistance chloroquine P. falciparum
Hypothèse 1
– Réversion résistance cellules cancéreuses au
vérapamil
– Surexpression d’une glycoprotéine P
– Pompe à efflux « transporteur ABC » (ATP Binding
Résistance chloroquine P. falciparum
Hypothèse 1
– Pompe à efflux « transporteur ABC » (ATP Binding
Cassette)
– Pompe à efflux « transporteur ABC »
Résistance chloroquine P. falciparum
Hypothèse 1
D. transmembranaire
D. liant l’ATPATP ATP
Cellule cancéreuse résistante
Cellule cancéreuse sensible
– Pompe à efflux « transporteur ABC »
Résistance chloroquine P. falciparum
Hypothèse 1
ATP ATPAnti mitotique
Cellule cancéreuse résistante
Anti mitotique
Cellule cancéreuse sensible
– Pompe à efflux « transporteur ABC »
Résistance chloroquine P. falciparum
Hypothèse 1
Anti mitotique
Cellule cancéreuse sensible
– Pompe à efflux « transporteur ABC »
Résistance chloroquine P. falciparum
Hypothèse 1
ATP ATP
Anti mitotique
Cellule cancéreuse résistante
– « transporteur ABC » : Pgh1 (paroi vacuole digestive)
– = P. falciparum Multi Drug Resistance (PfMDR1)
Hypothèse 1
Résistance chloroquine P. falciparum
?
P. falciparum sensible CQ
P. falciparum résistant CQ
– « transporteur ABC » Pgh1
• non surexprimé en présence de CQ chez Pf R CQ
• mutations chez Pf R CQ = Pf S CQ (allèles)
Hypothèse 1
Résistance chloroquine P. falciparum
– « transporteur ABC » Pgh1
• mutations augmentent parfois la [CQ]VD
• taux pompage Pgh1 < diffusion passive CQ
Résistance à la chloroquine chez P. falciparum
Hypothèse 1
Résistance chloroquine P. falciparum
• gène muté PfMDR1 ne confère pas de R à Pf S
CQ
– « transporteur ABC » Pgh1
• Orientation vers vacuole digestive
Résistance à la chloroquine chez P. falciparum
Hypothèse 1
Résistance chloroquine P. falciparum
Hypothèse 1 rejetée
Le « transporteur ABC » Pgh1 codé par le gène
PfMDR1 n’est pas le facteur de résistance de P.
falciparum à la CQ
Hypothèse 1
Résistance chloroquine P. falciparum
falciparum à la CQ
– Régions génétiquement différentes (PfSCQ/PfRCQ)
Résistance à la chloroquine chez P. falciparum
Hypothèse 2
Résistance chloroquine P. falciparum
– Croisement gamète male et femelle (PfSCQ/PfRCQ)
– Sélection des PfRCQ en ajoutant CQ
– Etude de liaisons génétiques (marqueurs
polymorphiques)
Résistance à la chloroquine chez P. falciparum
Résistance chloroquine P. falciparum
Hypothèse 2
polymorphiques)
– Localisation d’une région de 36 Kb différente entre
PfSCQ et PfRCQ sur le chromosome 7 :
Résistance à la chloroquine chez P. falciparum
Résistance chloroquine P. falciparum
Hypothèse 2
Gène (protéine 424 AA)
7
36 Kb
Résistance à la chloroquine chez P. falciparum
Résistance chloroquine P. falciparum
Hypothèse 2
Etude des mutations dans le gène
R CQ
S CQ
Résistance chloroquine P. falciparum
Hypothèse 2
Etude des mutations dans le gène
S CQ (Soudan)
R CQ
S CQ
Résistance chloroquine P. falciparum
Hypothèse 2
Etude des mutations dans le gène
• Mutation K76T chez Pf S CQ :
⇒ devient résistante à la CQ⇒ devient résistante à la CQ
La résistance de P. falciparum à la CQ est due à la
mutation K76T dans le gène
Résistance chloroquine P. falciparum
S CQ
Mutation K76T = résistance CQ
Etude des mutations dans le gène
S CQ (Soudan)
R CQ
S CQ
D’autres mutation (mineures)
Limites GR
Limites VP
Résistance chloroquine P. falciparum
Localisation de la protéine
La protéine est localisée dans la membrane de la VD
Anticorps @ protéine
transmembranaire
Résistance chloroquine P. falciparum
Protéine transmembranaire
Cytoplasme P. falciparum
Vacuole digestive
Membrane VDMembrane VD
AA identiques (S/R)
AA différents (R)
Plasmodium falciparum Chloroquine Resistance
Transporter (PfCRT)
Résistance chloroquine P. falciparum
Dénomination gène / protéine
– La mutation acidifie la VD
– Favorise le flux de CQ hors de la VD ?
Résistance chloroquine P. falciparum
PfCRT et chloroquine
PfCRT K76 PfCRT T76 PfCRT T76
+ vérapamil
– Canal ou transporteur ?
Résistance chloroquine P. falciparum
PfCRT et chloroquine
– Parfois résistant à CQ
– Gène homologue à PfCRT : PvCRT
– Pas de mutation dans PvCRT chez Pv R CQ
– PvCRT non responsable de la R à CQ chez P. vivax
Résistance chloroquine P. falciparum
Et chez Plasmodium vivax ?
– PvCRT non responsable de la R à CQ chez P. vivax
Résistance à la pyriméthaminechez Plasmodium falciparum
– Utilise les bases puriques de l’être humain (AG)
– Synthèse de novo des bases pyrimidiques (CT)
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Résistance pyriméthamine P. falciparum
Synthèse ADN / ARN chez P. falciparum
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Résistance pyriméthamine P. falciparum
Synthèse des bases pyrimidiques
H. sapiens / P. falciparum
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Résistance pyriméthamine P. falciparum
Synthèse des bases pyrimidiques
H. sapiens / P. falciparum
méthylation
mTHF DHFméthylène tétra hydro folate di hydro folate
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Résistance pyriméthamine P. falciparum
Synthèse des bases pyrimidiques
H. sapiens
TS Thymidylate synthase
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Résistance pyriméthamine P. falciparum
Synthèse des bases pyrimidiques
H. sapiens
mTHF DHF
TS
NADPH DHFR
tétra hydro folateTHF
di hydro folate
réductase
Thymidylate synthase
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
mTHF DHF
THF
NADPH
Résistance pyriméthamine P. falciparum
Synthèse des bases pyrimidiques
P. falciparum
mTHF DHF
DHFR
TS
Une seule et même enzyme bifonctionnelle
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Résistance pyriméthamine P. falciparum
Mécanisme d’action de la pyriméthamine
mTHF
THFNADPH
PYR
P. falciparum
mTHFDHF
DHFR
TS
La pyriméthamine est un analogue structural du DHF (inhibition compétitive)
PYR
DHFR P. falciparum sensible : S108
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Résistance pyriméthamine P. falciparum
Résistance à la pyriméthamine
DHFR P. falciparum résistant : N108
AA 108 dans le site actif
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
WRA P. falciparum SENSIBLE
Résistance pyriméthamine P. falciparum
Résistance à la pyriméthamine
Site actif DHFR
WRA
(analogue PYR)
NADPH
P. falciparum SENSIBLE
(S108)
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Diminution affinité P. falciparum RESISTANT
Résistance pyriméthamine P. falciparum
Résistance à la pyriméthamine
Site actif DHFR
Diminution affinité
pour WRA (PYR)
(mais pas pour DHF)NADPH
P. falciparum RESISTANT
(N108)N
• Mutation diminue affinité DHFR pour la pyriméthamine
Résistance pyriméthamine P. falciparum
Résistance à la pyriméthamine
Site actif DHFR
• Mutation diminue affinité DHFR pour la pyriméthamine
• DHF transformé en THF puis mTHF
• La synthèse de dTMP a de nouveau lieu
% de croissance cellulaire
100
P. falciparum
Fibroblaste humain
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Résistance pyriméthamine P. falciparum
DHFR et pyriméthamine
50
Fibroblaste humain
Concentrations inhibitrices 50 (CI50)
0,1 nM 5 000 nM
WRA inhibe 50 000 fois plus la DHFR de Plasmodium
Concentration WRA
(PYR)
– Affinité PYR pour DHFR Plasmodium > affinité PYR
pour DHFR humaine ?
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Résistance pyriméthamine P. falciparum
DHFR et pyriméthamine
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Résistance pyriméthamine P. falciparum
DHFR et pyriméthamine
AA différents (H. sapiens / P. falciparum)
Affinité DHFR Plasmodium > affinité DHFR humaine ?
• Constantes d’inhibition réaction DHF – THT
identiques pour les deux DHFR
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Résistance pyriméthamine P. falciparum
DHFR et pyriméthamine
Inhibition DHFR Plasmodium > DHFR humaine
n’est pas due à une différence d’affinité
En d’autres termes, la CI50 de la PYR devrait être la même
chez Plasmodium et l’Homme
Introduction du gène de la DHFR humaine dans P. falciparum
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Résistance pyriméthamine P. falciparum
DHFR et pyriméthamine
100
% de croissance cellulaire
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Résistance pyriméthamine P. falciparum
DHFR et pyriméthamine
P. falciparum
Fibroblaste humain
Concentration WR (PYR)
50
0,1 nM 5 000 nM
Concentrations inhibitrices 50 (CI50)
1000 nM
P. falciparum devient aussi « insensible » à la PYR que des cellules humaines
Fibroblaste humain
P. falciparum + DHFR humaine
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
traitement WRA traitement WRA
Résistance pyriméthamine P. falciparum
DHFR et pyriméthamine
sans
Quantité de DHFR produite
après
Plasmodium humaine Plasmodium humaine
1 2 3 4
1
6
36
La quantité de DHFR humaine est régulée
Elle s’adapte à la présence de PYR
– SANS PYR :
L’ARN messager de la DHFR est fixé sur l’enzyme DHFR (Homme et Plasmodium)
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Résistance pyriméthamine P. falciparum
Régulation de la DHFR
(Homme et Plasmodium)
Absence traduction ARNm DHFR (rétro contrôle – )
– SANS PYR :
L’ARN messager de la DHFR est fixé sur l’enzyme DHFR (Homme et Plasmodium)
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Résistance pyriméthamine P. falciparum
Régulation de la DHFR
(Homme et Plasmodium)
ARNm DHFR humaine fixé dans site actif protéine
ARNm DHFR Plasmodium pas fixé dans site actif
* *
Pyriméthamine et DHFR
– AVEC PYR chez l’Homme :
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Résistance pyriméthamine P. falciparum
Régulation de la DHFR
Libération de l’ARNm DHFR humaine
Pyriméthamine et DHFR
– AVEC PYR chez l’Homme :
Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum
Résistance pyriméthamine P. falciparum
Régulation de la DHFR
Traduction ARNm DHFR humaine
Synthèse de DHFR et de dTMP
Quantité DHFR > capacité inhibition de la PYR
dTMP
Résistance pyriméthamine P. falciparum
– AVEC PYR chez Plasmodium :
Régulation de la DHFR
L’ARNm de la DHFR n’est pas libéré
La quantité d’enzyme DHFR Plasmodium n’augmente pas
DHFR Pf inhibibée totalement par PYR
Pas de dTMP synthétisé
dTMP
• Sulfadoxine (DHPS)
• Artémisinine (?)
Autres résistance chez P. falciparum
• Defining the role of PfCRT in Plasmodium falciparum chloroquine
resistance.
Bray, PG, et al. Molecular Microbiology 2005. 56(2):323-33.
• Divergent regulation of dihydrofolate reductase between malaria
parasite and human host.
Bibliographie du cours
parasite and human host.
Zhang, K., et al. Science 2002. 296(5567):545-7.
• When the host is smarter than the parasite.
Goldberg, DE. Science 2002. 296(5567):482-3.
• Organisation Mondiale de la Santé / Paludisme :
http://www.who.int/topics/malaria/fr
• Nations Unies « Faire reculer le paludisme »
http://www.rollbackmalaria.org/
Pour approfondir
http://www.rollbackmalaria.org/
• Fonds Mondial de Lutte contre le Sida, la Tuberculose et le Paludisme
http://www.theglobalfund.org/fr/
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