Master 1 «Physiopathologie cellulaire et moléculaire ... Physiopath/Microbiologie/Mécanismes... · •neuropaludisme. Enjeux de la question • Traitement du paludisme à P. falciparum

Mécanismes moléculaires de la résistancede Plasmodium falciparum aux antipaludiques

Master 1 « Physiopathologie cellulaire et moléculaire »Unité d’enseignement de microbiologie médicale

Denis Filisetti

Laboratoire de Parasitologie des Hôpitaux Universitaires de Strasbourg

Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire du CNRS

1er avril 2011

Faculté

de médecine

Plan du cours

• Enjeux de la question (paludisme)

• Généralités sur les résistances aux traitements

– chloroquine, sulfadoxine, pyriméthamine

• P. falciparum et résistance à la chloroquine

– mécanismes d’action de la chloroquine– mécanismes d’action de la chloroquine

– gène PfMDR1 (pompe à efflux)

– gène PfCRT (canal / transporteur chloroquine)

• P. falciparum et résistance à la pyriméthamine

– métabolisme des bases pyrimidiques

– gène DHFR

– régulation traduction ARNm DHFR

Objectifs pédagogiques

Être capable d’expliquer :

• la résistance de P. falciparum à la chloroquine

• la résistance de P. falciparum à la pyriméthamine

Enjeux de la question

• Le paludisme

– Une des maladies les plus fréquentes :

• 250 000 000 cas de paludisme par an ;

• 1 000 000 de décès par an :• 1 000 000 de décès par an :– 95 % = enfants africains < 5 ans

– Femmes enceintes

– Co-infectés VIH/SIDA


• Distribution géographique du paludisme


• Le paludisme

– Transmis (Anopheles)

– Plasmodium

• falciparum• falciparum

• vivax, ovale, malariae, (knowlesi)

• parasite protozoaire (embranchement apicomplexa)


Embranchement des apicomplexa

mérozoïte


Mérozoïte

Mérozoïte

Pénétration dans le globule rouge

Vacuole parasitophore

Mérozoïte

Globule rouge


Aspect des globules rouges infectés


• Le paludisme

– Fièvre, anémie (toutes les espèces)

– Atteinte grave d’organes (P. falciparum)

Hématie normale Hématie infectéeSphérique protrusions


• Le paludisme

– Fièvre, anémie (toutes les espèces)

– Atteinte grave d’organes (P. falciparum)

• neuropaludisme• neuropaludisme


• Traitement du paludisme à P. falciparum

– Chloroquine (CQ) (NIVAQUINE) : 1946

Généralités résistance

Résistance à la chloroquine chez P. falciparum



Résistance CQ détectée


• Résistances de P. falciparum :

– classification par rapport à CQ :

• classement des pays (1-2-3)

• recommandations de traitement (curatif / préventif)• recommandations de traitement (curatif / préventif)



– Sufladoxine – pyriméthamine (SP)



Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum



Résistance SP détectée




– Sufladoxine – pyriméthamine (SP)

– Artémisinine combinée– Artémisinine combinée


Pourquoi étudier et connaitre les mécanismes des résistances ?

• pour détecter plus rapidement la résistance sur le terrain,

• pour améliorer les antipaludiques existants,

• pour aider au développement de nouveaux antipaludiques.

Résistance à la chloroquine

chez Plasmodium falciparum

Hémoglobine

Résistance chloroquine P. falciparum

Globule rouge = environnement hostile pour Plasmodium

Plasmodium falciparum



(Vacuole parasitophore)







(Vacuole digestive)



« The Big Gulp »

ProtéasesAcides Aminés



Acides Aminés

Hémoglobine

Hématine

Oxydation

Vacuole digestive

Globine

Hème

(Protoporphyrine Fe+++)

Toxique pour Plasmodium

Vacuole digestive



Hématine Hémozoïne

TOXIQUE

NON TOXIQUE

Cristal

insoluble

Vacuole digestive



Hématine Hémozoïne

TOXIQUE

Mécanisme d’action de la chloroquine ?

Vacuole digestive


Hématine HémozoïneChloroquine

Vacuole digestive



Liaison directe ? OUI mais

CQ (1 mM) v. hématine (400 mM)TOXIQUE


Vacuole digestive



TOXIQUE


HDP

HDP : Heme Detoxifying Protein

?

Vacuole digestive




HémozoïneHématine

Adsorption sur

l’hémozoïne ?

– P. falciparum résistant CQ :

– + vérapamil : réversion résistance (sensible)


Hypothèse 1

– Réversion résistance cellules cancéreuses au

vérapamil

– Surexpression d’une glycoprotéine P

– Pompe à efflux « transporteur ABC » (ATP Binding


Hypothèse 1

– Pompe à efflux « transporteur ABC » (ATP Binding

Cassette)

– Pompe à efflux « transporteur ABC »


Hypothèse 1

D. transmembranaire

D. liant l’ATPATP ATP

Cellule cancéreuse résistante

Cellule cancéreuse sensible



Hypothèse 1

ATP ATPAnti mitotique


Anti mitotique




Hypothèse 1

Anti mitotique




Hypothèse 1

ATP ATP

Anti mitotique


– « transporteur ABC » : Pgh1 (paroi vacuole digestive)

– = P. falciparum Multi Drug Resistance (PfMDR1)

Hypothèse 1


?

P. falciparum sensible CQ

P. falciparum résistant CQ

– « transporteur ABC » Pgh1

• non surexprimé en présence de CQ chez Pf R CQ

• mutations chez Pf R CQ = Pf S CQ (allèles)

Hypothèse 1



• mutations augmentent parfois la [CQ]VD

• taux pompage Pgh1 < diffusion passive CQ


Hypothèse 1


• gène muté PfMDR1 ne confère pas de R à Pf S

CQ


• Orientation vers vacuole digestive


Hypothèse 1


Hypothèse 1 rejetée

Le « transporteur ABC » Pgh1 codé par le gène

PfMDR1 n’est pas le facteur de résistance de P.

falciparum à la CQ

Hypothèse 1


falciparum à la CQ

– Régions génétiquement différentes (PfSCQ/PfRCQ)


Hypothèse 2


– Croisement gamète male et femelle (PfSCQ/PfRCQ)

– Sélection des PfRCQ en ajoutant CQ

– Etude de liaisons génétiques (marqueurs

polymorphiques)



Hypothèse 2

polymorphiques)

– Localisation d’une région de 36 Kb différente entre

PfSCQ et PfRCQ sur le chromosome 7 :



Hypothèse 2

Gène (protéine 424 AA)

7

36 Kb



Hypothèse 2

Etude des mutations dans le gène

R CQ

S CQ


Hypothèse 2


S CQ (Soudan)

R CQ

S CQ


Hypothèse 2


• Mutation K76T chez Pf S CQ :

⇒ devient résistante à la CQ⇒ devient résistante à la CQ

La résistance de P. falciparum à la CQ est due à la

mutation K76T dans le gène


S CQ

Mutation K76T = résistance CQ


S CQ (Soudan)

R CQ

S CQ

D’autres mutation (mineures)

Limites GR

Limites VP


Localisation de la protéine

La protéine est localisée dans la membrane de la VD

Anticorps @ protéine

transmembranaire


Protéine transmembranaire

Cytoplasme P. falciparum

Vacuole digestive

Membrane VDMembrane VD

AA identiques (S/R)

AA différents (R)

Plasmodium falciparum Chloroquine Resistance

Transporter (PfCRT)


Dénomination gène / protéine

– La mutation acidifie la VD

– Favorise le flux de CQ hors de la VD ?


PfCRT et chloroquine

PfCRT K76 PfCRT T76 PfCRT T76

+ vérapamil

– Canal ou transporteur ?


PfCRT et chloroquine

– Parfois résistant à CQ

– Gène homologue à PfCRT : PvCRT

– Pas de mutation dans PvCRT chez Pv R CQ

– PvCRT non responsable de la R à CQ chez P. vivax


Et chez Plasmodium vivax ?

– PvCRT non responsable de la R à CQ chez P. vivax

Résistance à la pyriméthaminechez Plasmodium falciparum

– Utilise les bases puriques de l’être humain (AG)

– Synthèse de novo des bases pyrimidiques (CT)


Résistance pyriméthamine P. falciparum

Synthèse ADN / ARN chez P. falciparum



Synthèse des bases pyrimidiques

H. sapiens / P. falciparum




H. sapiens / P. falciparum

méthylation

mTHF DHFméthylène tétra hydro folate di hydro folate




H. sapiens

TS Thymidylate synthase




H. sapiens

mTHF DHF

TS

NADPH DHFR

tétra hydro folateTHF

di hydro folate

réductase

Thymidylate synthase


mTHF DHF

THF

NADPH



P. falciparum

mTHF DHF

DHFR

TS

Une seule et même enzyme bifonctionnelle



Mécanisme d’action de la pyriméthamine

mTHF

THFNADPH

PYR

P. falciparum

mTHFDHF

DHFR

TS

La pyriméthamine est un analogue structural du DHF (inhibition compétitive)

PYR

DHFR P. falciparum sensible : S108



Résistance à la pyriméthamine

DHFR P. falciparum résistant : N108

AA 108 dans le site actif


WRA P. falciparum SENSIBLE



Site actif DHFR

WRA

(analogue PYR)

NADPH

P. falciparum SENSIBLE

(S108)


Diminution affinité P. falciparum RESISTANT



Site actif DHFR

Diminution affinité

pour WRA (PYR)

(mais pas pour DHF)NADPH

P. falciparum RESISTANT

(N108)N

• Mutation diminue affinité DHFR pour la pyriméthamine



Site actif DHFR

• Mutation diminue affinité DHFR pour la pyriméthamine

• DHF transformé en THF puis mTHF

• La synthèse de dTMP a de nouveau lieu

% de croissance cellulaire

100

P. falciparum

Fibroblaste humain



DHFR et pyriméthamine

50

Fibroblaste humain

Concentrations inhibitrices 50 (CI50)

0,1 nM 5 000 nM

WRA inhibe 50 000 fois plus la DHFR de Plasmodium

Concentration WRA

(PYR)

– Affinité PYR pour DHFR Plasmodium > affinité PYR

pour DHFR humaine ?







AA différents (H. sapiens / P. falciparum)

Affinité DHFR Plasmodium > affinité DHFR humaine ?

• Constantes d’inhibition réaction DHF – THT

identiques pour les deux DHFR




Inhibition DHFR Plasmodium > DHFR humaine

n’est pas due à une différence d’affinité

En d’autres termes, la CI50 de la PYR devrait être la même

chez Plasmodium et l’Homme

Introduction du gène de la DHFR humaine dans P. falciparum




100

% de croissance cellulaire




P. falciparum

Fibroblaste humain

Concentration WR (PYR)

50

0,1 nM 5 000 nM

Concentrations inhibitrices 50 (CI50)

1000 nM

P. falciparum devient aussi « insensible » à la PYR que des cellules humaines

Fibroblaste humain

P. falciparum + DHFR humaine


traitement WRA traitement WRA



sans

Quantité de DHFR produite

après

Plasmodium humaine Plasmodium humaine

1 2 3 4

1

6

36

La quantité de DHFR humaine est régulée

Elle s’adapte à la présence de PYR

– SANS PYR :

L’ARN messager de la DHFR est fixé sur l’enzyme DHFR (Homme et Plasmodium)



Régulation de la DHFR

(Homme et Plasmodium)

Absence traduction ARNm DHFR (rétro contrôle – )

– SANS PYR :

L’ARN messager de la DHFR est fixé sur l’enzyme DHFR (Homme et Plasmodium)




(Homme et Plasmodium)

ARNm DHFR humaine fixé dans site actif protéine

ARNm DHFR Plasmodium pas fixé dans site actif

* *

Pyriméthamine et DHFR

– AVEC PYR chez l’Homme :




Libération de l’ARNm DHFR humaine

Pyriméthamine et DHFR

– AVEC PYR chez l’Homme :




Traduction ARNm DHFR humaine

Synthèse de DHFR et de dTMP

Quantité DHFR > capacité inhibition de la PYR

dTMP


– AVEC PYR chez Plasmodium :


L’ARNm de la DHFR n’est pas libéré

La quantité d’enzyme DHFR Plasmodium n’augmente pas

DHFR Pf inhibibée totalement par PYR

Pas de dTMP synthétisé

dTMP

• Sulfadoxine (DHPS)

• Artémisinine (?)

Autres résistance chez P. falciparum

• Defining the role of PfCRT in Plasmodium falciparum chloroquine

resistance.

Bray, PG, et al. Molecular Microbiology 2005. 56(2):323-33.

• Divergent regulation of dihydrofolate reductase between malaria

parasite and human host.

Bibliographie du cours

parasite and human host.

Zhang, K., et al. Science 2002. 296(5567):545-7.

• When the host is smarter than the parasite.

Goldberg, DE. Science 2002. 296(5567):482-3.

• Organisation Mondiale de la Santé / Paludisme :

http://www.who.int/topics/malaria/fr

• Nations Unies « Faire reculer le paludisme »

http://www.rollbackmalaria.org/

Pour approfondir

http://www.rollbackmalaria.org/

• Fonds Mondial de Lutte contre le Sida, la Tuberculose et le Paludisme

http://www.theglobalfund.org/fr/

Documents

Master 1 «Physiopathologie cellulaire et moléculaire ... Physiopath/Microbiologie/Mécanismes... · •neuropaludisme. Enjeux de la question • Traitement du paludisme à P. falciparum