Medicina molecular

• Dr. Juan Rodríguez-Tafur D.

Prof. Asociado de Farmacología e Inmunología

Facultad de Medicina

Universidad Nacional Mayor de San Marcos

• Secretario General

Sociedad Peruana de Inmunología y Alergia

Fundamentos de Biología

Molecular y su utilidad en

la práctica médica.

1 Gen 1 o más funciones

ARNADN

GEN

Proteína

2-5 FUNCIONES

Expresión Génica

Transcripción / traducción

>300 ’000 funciones

(>150 ’000 funciones)

100 ’000 genes

(50 ’000 genes?)

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan Rodriguez-T

2012

Que es un gen?: un segmento de ADN que

actua como una maquina regulada para

producir ARN

ARNADN Proteína

GEN FUNCIONTranscriptión / traducción

codificanteespaciador espaciadorregulator

ADN

ARN

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan Rodriguez-T

2012

DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA MOLECULAR

1 Organismo mas de 105

funciones geneticamente controladas

2m 2 mm 0.2mm

0.02mm

ADN ARN Proteína

0.001mm

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan Rodriguez-T

2012

Organismos Modelos

Secuenciación en progreso:

Estructura Genómica

• 3 GB

• Solo el 3% codifica proteínas!!

• ~50% secuencias

repetitivas

ARN ADN

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan Rodriguez-T

2012

DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA MOLECULAR

ES POSIBLE TRANSGREDIRLO?

La hipótesis de Howard

Temin (1970) y el descubrimiento

de la Transcriptasa reversa

TRANSCRIPTASA

REVERSA

Proteína?

Inserció

n

Genoma

del

Huésped

VIH

ARN

VIH

mARN

VIH

AR

N

VIH

ARN

S. S.

VIH

ADN

VIH

proteínas

precursor

as

VIRUS

NUEVO

RIBOSOMAS

VIH LG. PROTEINAS

INTEGRASA

TRANSCRIPTASA

REVERSA

VIRUS

INFECTANTE

EMSAMBLAJE

D. S.

VIH

ADN

TRANSCRIPCION

REVERSAINTEGRACION

Paradigma de la Biología del reduccionismo

molecular (defectos génicos y transferencia

de genes)

GEN transferido FUNCION transferida

GEN KO FUNCION KO

GEN OK FUNCION OK

ADN

GEN

Proteína

FUNCION(s)

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan Rodriguez-T

2012

Variación GenéticaCCCCAGCCTCCTTGCCAACGCCCCCTTTCCCTCTCCCCCTCCCGCTCGGCGCTGACC

CCCCATCCCCACCCCCGTGGGAACACTGGGAGCCTGCACTCCACAGACCCTCTCCTT

GCCTCTTCCCTCACCTCAGCCTCCGCTCCCCGCCCTCTTCCCGGCCCAGGGCGCCG

GCCCACCCTTCCCTCCGCCGCCCCCCGGCCGCGGGGAGGACATGGCCGCGCACAG

GCCGGTGGAATGGGTCCAGGCCGTGGTCAGCCGCTTCGACGAGCAGCTTCCAATAA

AAACAGGACAGCAGAACACACATACCAAAGTCAGTACTGAGCACAACAAGGAATGTC

TAATCAATATTTCCAAATACAAGTTTTCTTTGGTTATAAGCGGCCTCACTACTATTTTAA

AGAATGTTAACAATATGAGAATATTTGGAGAAGCTGCTGAAAAAAATTTATATCTCTCT

CAGTTGATTATATTGGATACACTGGAAAAATGTCTTGCTGGGCAACCAAAGGACACAA

TGAGATTAGATGAAACGATGCTGGTCAAACAGTTGCTGCCAGAAATCTGCCATTTTCT

TCACACCTGTCGTGAAGGAAACCAGCATGCAGCTGAACTTCGGAATTCTGCCTCTGG

GGTTTTATTTTCTCTCAGCTGCAACAACTTCAATGCAGTCTTTAGTCGCATTTCTACCA

GGTTACAGGAATTAACTGTTTGTTCAGAAGACAATGTTGATGTTCATGATATAGAATTG

TTACAGTATATCAATGTGGATTGTGCAAAATTAAAACGACTCCTGAAGGAAACAGCAT

TTAAATTTAAAGCCCTAAAGAAGGTTGCGCAGTTAGCAGTTATAAATAGCCTGGAAAA

GGCATTTTGGAACTGGGTAGAAAATTATCCAGATGAATTTACAAAACTGTACCAGATC

CCACAGACTGATATGGCTGAATGTGCAGAAAAGCTATTTGACTTGGTGGATGGTTTTG

CTGAAAGCACCAAACGTAAAGCAGCAGTTTGGCCACTACAAATCATTCTCCTTATCTT

GTGTCCAGAAATAATCCAGGATATATCCAAAGACGTGGTTGATGAAAACAACATGAAT

AAGAAGTTATTTCTGGACAGTCTACGAAAAGCTCTTGCTGGCCATGGAGGAAGTAGG

CAGCTGACAGAAAGTGCTGCAATTGCCTGTGTCAAACTGTGTAAAGCAAGTACTTACA

TCAATTGGGAAGATAACTCTGTCATTTTCCTACTTGTTCAGTCCATGGTGGTTGATCTT

AAGAACCTGCTTTTTAATCCAAGTAAGCCATTCTCAAGAGGCAGTCAGCCTGCAGATG

TGGATCTAATGATTGACTGCCTTGTTTCTTGCTTTCGTATAAGCCCTCACAACAACCAA

CACTTTAAGATCTGCCTGGCTCAGAATTCACCTTCTACATTTCACTATGTGCTGGTAAA

TTCACTCCATCGAATCATCACCAATTCCGCATTGGATTGGTGGCCTAAGATTGATGCT

GTGTATTGTCACTCGGTTGAACTTCGAAATATGTTTGGTGAAACACTTCATAAAGCAG

TGCAAGGTTGTGGAGCACACCCAGCAATACGAATGGCACCGAGTCTTACATTTAAAG

AAAAAGTAACAAGCCTTAAATTTAAAGAAAAACCTACAGACCTGGAGACAAGAAGCTA

TAAGTATCTTCTCTTGTCCATGGTGAAACTAATTCATGCAGATCCAAAGCTCTTGCTTT

GTAATCCAAGAAAACAGGGGCCCGAAACCCAAGGCAGTACAGCAGAATTAATTACAG

GGCTCGTCCAACTGGTCCCTCAGTCACACATGCCAGAGATTGCTCAGGAAGCAATGG

AGGCTCTGCTGGTTCTTCATCAGTTAGATAGCATTGATTTGTGGAATCCTGATGCTCC

TGTAGAAACATTTTGGGAGATTAGCTCACAAATGCTTTTTTACATCTGCAAGAAATTAA

CTAGTCATCAAATGCTTAGTAGCACAGAAATTCTCAAGTGGTTGCGGGAAATATTGAT

CTGCAGGAATAAATTTCTTCTTAAAAATAAGCAGGCAGATAGAAGTTCCTGTCACTTTC

CCCCAGCCTCCTTGCCAACGCCCCCTTTCCCTCTCCCCCTCCCGCTCGGCGCTGACC

CCCCATCCCCACCCCCGTGGGAACACTGGGAGCCTGCACTCCACAGACCCTCTCCTT

GCCTCTTCCCTCACCTCAGCCTCCGCTCCCCGCCCTCTTCCCGGCCCAGGGCGCCG

GCCCACCCTTCCCTCCGCCGCCCCCCGGCCGCGGGGAGGACATGGCCGCGCACAG

GCCGGTGGAATGGGTCCAGGCCGTGGTCAGCCGCTTCGACGAGCAGCTTCCAATAA

AAACAGGACAGCAGAACACACATACCAAAGTCAGTACTGAGCACAACAAGGAATGTC

TAATCAATATTTCCAAATACAAGTTTTCTTTGGTTATAAGCGGCCTCACTACTATTTTAA

AGAATGTTAACTATATGAGAATATTTGGAGAAGCTGCTGAAAAAAATTTATATCTCTCT

CAGTTGATTATATTGGATACACTGGAAAAATGTCTTGCTGGGCAACCAAAGGACACAA

TGAGATTAGATGAAACGATGCTGGTCAAACAGTTGCTGCCAGAAATCTGCCATTTTCT

TCACACCTGTCGTGAAGGAAACCAGCATGCAGCTGAACTTCGGAATTCTGCCTCTGG

GGTTTTATTTTCTCTCAGCTGCAACAACTTCAATGCAGTCTTTAGTCGCATTTCTACCA

GGTTACAGGAATTAACTGTTTGTTCAGAAGACAATGTTGATGTTCATGATATAGAATTG

TTACAGTATATCAATGTGGATTGTGCAAAATTAAAACGACTCCTGAAGGAAACAGCAT

TTAAATTTAAAGCCCTAAAGAAGGTTGCGCAGTTAGCAGTTATAAATAGCCTGGAAAA

GGCATTTTGGAACTGGGTAGAAAATTATCCAGATGAATTTACAAAACTGTACCAGATC

CCACAGACTGATATGGCTGAATGTGCAGAAAAGCTATTTGACTTGGTGGATGGTTTTG

CTGAAAGCACCAAACGTAAAGCAGCAGTTTGGCCACTACAAATCATTCTCCTTATCTT

GTGTCCAGAAATAATCCAGGATATATCCAAAGACGTGGTTGATGAAAACAACATGAAT

AAGAAGTTATTTCTGGACAGTCTACGAAAAGCTCTTGCTGGCCATGGAGGAAGTAGG

CAGCTGACAGAAAGTGCTGCAATTGCCTGTGTCAAACTGTGTAAAGCAAGTACTTACA

TCAATTGGGAAGATAACTCTGTCATTTTCCTACTTGTTCAGTCCATGGTGGTTGATCTT

AAGAACCTGCTTTTTAATCCAAGTAAGCCATTCTCAAGAGGCAGTCAGCCTGCAGATG

TGGATCTAATGATTGACTGCCTTGTTTCTTGCTTTCGTATAAGCCCTCACAACAACCAA

CACTTTAAGATCTGCCTGGCTCAGAATTCACCTTCTACATTTCACTATGTGCTGGTAAA

TTCACTCCATCGAATCATCACCAATTCCGCATTGGATTGGTGGCCTAAGATTGATGCT

GTGTATTGTCACTCGGTTGAACTTCGAAATATGTTTGGTGAAACACTTCATAAAGCAG

TGCAAGGTTGTGGAGCACACCCAGCAATACGAATGGCACCGAGTCTTACATTTAAAG

AAAAAGTAACAAGCCTTAAATTTAAAGAAAAACCTACAGACCTGGAGACAAGAAGCTA

TAAGTATCTTCTCTTGTCCATGGTGAAACTAATTCATGCAGCTCCAAAGCTCTTGCTTT

GTAATCCAAGAAAACAGGGGCCCGAAACCCAAGGCAGTACAGCAGAATTAATTACAG

GGCTCGTCCAACTGGTCCCTCAGTCACACATGCCAGAGATTGCTCAGGAAGCAATGG

AGGCTCTGCTGGTTCTTCATCAGTTAGATAGCATTGATTTGTGGAATCCTGATGCTCC

TGTAGAAACATTTTGGGAGATTAGCTCACAAATGCTTTTTTACATCTGCAAGAAATTAA

CTAGTCATCAAATGCTTAGTAGCACAGAAATTCTCAAGTGGTTGCGGGAAATATTGAT

CTGCAGGAATAAATTTCTTCTTAAAAATAAGCAGGCAGATAGAAGTTCCTGTCACTTTC

La diferencia genómica entre dos individuos genéticamente

no relacionados es de 0.01%

No solamente el genoma determina el

estatus de la salud.....surgimiento de la

Epigenética.

genética conducta medioambiente

Distrofia Muscular

Obesidad

Arterioesclerosis

Enf. de Alzheimer

Parkinson

Drogadicción

Ca Mama Familiar

Cancer Pulmón

Ca Mama Espor.

También condiciones adquiridas

pueden tener componentes

genéticos

que modulan su reparación

trauma

fracturas

quemaduras

infecciones

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan Rodriguez-T

2012

Amplificación Génica / técnicas de

manipulación (ingenieria genética, ADN

recombinante)

segmentos de ADN genómico pueden ser

especificamente cortados y aislados

segmentos aislados pueden recombinarse con un

plasmidio vector

plasmidio vector es transferido a una bacteria donde se

multiplica

ADN aislado recombinante puede ademas ser

recombinado para obtener la molécula final deseada

molecula final es transferida dentro de las células u

organismos

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan Rodriguez-T

2012

Las TRES misiones de la medicina:

Impacto de las técnicas moleculares

Prevención

Diagnóstico

Terapia

Medicina MolecularAplicación de la

Genética

molecular a la Medicina

+

+

+

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan Rodriguez-T

2012

Las CUATRO eras de la medicina

molecular

Los Ochenta

Genes como

sondas

ok ** ** **ok1 2 4 53

Los Noventa

Genes como

factorias

80 85 90 95 99

10

50

A partir del 2000

Genes como

fármaco

80 85 90 95 00

1000

3000

Y2000+n Era post-genómica = mejoras tecnológicas

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan Rodriguez-T

2012

Inversion Alta y a largo plazo

- Costos : 300~700M U$ /producto

- Tiempo : 10~15 años

Alto riesgo

- Taza de exito : 0.02%

(Descubrimiento/Preclínico 5000 Clinico 5

Aprobación 1)

Alto retorno

- Pico de venta: 0.3~8.6B U$ /year

-Protección de Patente : generalmente, 8~12 años

despues de aprobado.

El costo verdaderamente asombroso

para Inventar nuevos medicamentos

FORBES 2/10/2012

Genética en Medicina

Nacimiento

genética

factores

medioambientales }prenatal

presintomática

enfermedad

Modelos

Genotipo

Fenotipo

Medioambiente

Modelos

Genotipo

Fenotipo

Medioambiente

Modelos

Genotipo

Fenotipo

Medioambiente

Medicina en Transformación

Dos Fuerzas ConvergentesTecnologías de la Información Genética

Test Predictivos y prevención

Estratificación de la enfermedad y blancos terapéuticos

Farmacogenética y farmacogenómica

“Medicina Individualizada”

Los más importantes retos médicos

de siglo 21: Envejecimiento

60

70

80

50

1920 1940 1960 1980 1991900

Life e

xpecta

ncy (

CH

)

aa getting oldcomp2.mov

Fac. Med.

UNMSM

Dr. JuanRodriguez-

T

2012

Los más importantes retos médicos

de siglo 21: Envejecimiento

60

70

80

50

1920 1940 1960 1980 1991900

Life e

xpecta

ncy (

CH

)

aa getting oldcomp

Fac. Med.

UNMSM

Dr. JuanRodriguez-

T

2012

4

20 40 60 80

100

10

1

cancer

incid

ence

1900 2000

Los más importantes retos médicos

de siglo 21: Envejecimiento

60

70

80

50

1920 1940 1960 1980 1991900

Life e

xpecta

ncy (

CH

)Fac. Med.

UNMSM

Dr. JuanRodriguez-

T

2012

4

20 40 60 80

100

10

1

cancer

incid

ence

1900 200020 40 60 80

100%

M

E2/E

E3/E4

E4/E4

Alz

heim

er’

s f

ree %

1900 2000

Terapia con Genes Somáticos

(transferencia de genes somaticos)

Definicion de TG:

'Uso de genes como

fármacos:

Corregir enfermedades por

Transferencia de genes

somáticos

Tratamiento Crónico

Tratamiento Agudo

Tratamiento Preventivo

Enfer. Hereditarias

Enfer. Adquiridas

Perdida función

Ganancia función

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan

Rodriguez-T

2012

TRES clases de Aplicacion fisiológica de

genes

Ex-vivo In-vivo

Adm. topica

In-vivo

Adm. sistemica

V

Ejemplos:

- Medula osea

- Cels hepaticas

- Cels piel

Ejemplos:

- cerebro

- musculos

- ojos

- articulaciones

- tumores

Ejemplos:

- intravenosa

- intra-arterial

- intra-peritoneal

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan

Rodriguez-T

2012

Dos clases de genes transferidos: no viral y

viral

a

b

No transf. viral

(transfeccion)

Transf. gen Viral

(Infeccion)

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan

Rodriguez-T

2012

Lista de vectores populares/métodos

Adenovirus

Adeno-asociados V.

Retrovirus (incl. HIV)

ADN desnudo

Liposomas & Co.

Oligonucleotidos

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan Rodriguez-

T

2012

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan

Rodriguez-T

2012

Geneterapia Historia

1990, 1993, 2000 // ADA deficiency

F Anderson, M Blaese // C Bordignon

Anderson, 1990

Bordignon, 2000 (ESGT, Stockholm)

proves efficacy of the same protocol

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan

Rodriguez-T

2012

Geneterapia Historia

1990, 1993, 2000 // ADA deficiency

F Anderson, M Blaese // C Bordignon

1997, 2000, Critical limb ischemia

J Isner († 4.11.2001), I Baumgartner,

Circulation 1998

Isner, 1998

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan

Rodriguez-T

2012

Geneterapia Historia

1990, 1993, 2000 // ADA deficiency

F Anderson, M Blaese // C Bordignon

1997, 2000, Critical limb ischemia

J Isner († 4.11.2001), I Baumgartner, Circulation

19981998, Restenosis

V Dzau, HGT 1998

Dzau, 1999

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan

Rodriguez-T

2012

Geneterapia Historia

1990, 1993, 2000 // ADA deficiency

F Anderson, M Blaese // C Bordignon

Anderson, 1990

Bordignon, 2000 (ESGT, Stockholm)

proves efficacy of the same protocol

1997, 2000, Critical limb ischemia

J Isner († 4.11.2001), I Baumgartner, Circulation

1998

Isner, 1998

1998, Restenosis

V Dzau, HGT 1998

Dzau, 1999

1999, Crigler Njiar (animal)

C Steer, PNAS 1999

Kmiec, 1999

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan

Rodriguez-T

2012

Geneterapia Historia

1990, 1993, 2000 // ADA deficiency

F Anderson, M Blaese // C Bordignon

Anderson, 1990

Bordignon, 2000 (ESGT, Stockholm)

proves efficacy of the same protocol

1997, 2000, Critical limb ischemia

J Isner († 4.11.2001), I Baumgartner, Circulation

1998

Isner, 1998

1998, Restenosis

V Dzau, HGT 1998

Dzau, 1999

1999, Crigler Njiar (animal)

C Steer, PNAS 1999

Kmiec, 1999

2000, Hemophilia

M Kay, K High

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan

Rodriguez-T

2012

Geneterapia Historia

1990, 1993, 2000 // ADA deficiency

F Anderson, M Blaese // C Bordignon

Anderson, 1990

Bordignon, 2000 (ESGT, Stockholm)

proves efficacy of the same protocol

1997, 2000, Critical limb ischemia

J Isner († 4.11.2001), I Baumgartner, Circulation

1998

Isner, 1998

1998, Restenosis

V Dzau, HGT 1998

Dzau, 1999

1999, Crigler Njiar (animal)

C Steer, PNAS 1999

Kmiec, 1999

2000, Hemophilia

M Kay, K High

2000, SCID

A Fischer, Science April 2000

Fischer, 2000

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan

Rodriguez-T

2012

Geneterapia Historia

1990, 1993, 2000 // ADA deficiency

F Anderson, M Blaese // C Bordignon

Anderson, 1990

Bordignon, 2000 (ESGT, Stockholm)

proves efficacy of the same protocol

1997, 2000, Critical limb ischemia

J Isner († 4.11.2001), I Baumgartner, Circulation

1998

Isner, 1998

1998, Restenosis

V Dzau, HGT 1998

Dzau, 1999

1999, Crigler Njiar (animal)

C Steer, PNAS 1999

Kmiec, 1999

2000, Hemophilia

M Kay, K High

2000, SCID

A Fischer, Science April 2000

Fischer, 2000

2000, correction Apo E4 (animal model)

G. Dickson, ESGT congress, 7.10.2000

Stockholm

Dickson, 2000

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan

Rodriguez-T

2012

Geneterapia Historia

1990, 1993, 2000 // ADA deficiency

F Anderson, M Blaese // C Bordignon

Anderson, 1990

Bordignon, 2000 (ESGT, Stockholm)

proves efficacy of the same protocol

1997, 2000, Critical limb ischemia

J Isner († 4.11.2001), I Baumgartner, Circulation

1998

Isner, 1998

1998, Restenosis

V Dzau, HGT 1998

Dzau, 1999

1999, Crigler Njiar (animal)

C Steer, PNAS 1999

Kmiec, 1999

2000, Hemophilia

M Kay, K High

2000, SCID

A Fischer, Science April 2000

Fischer, 2000

2000, correction Apo E4 (animal model)

G. Dickson, ESGT congress, 7.10.2000

Stockholm

Dickson, 2000

2000, correction Parkinson (animal model)

P Aebischer, Science, Nov 2000

Aebischer, 2000

Inmunodeficiencia Combinada Severa Ligada al X

La IDCS-X es una inmunodeficiencia primaria

producida por la mutación del gen del receptor

gama común de IL2. El gen IL2RGAMMA es un

receptor para varias citoquinas. Este gen presenta

variantes que al momento alcanzan los 136 tipos.

Los pacientes presentan un compromiso profundo

del sistema inmunitario con afectación dela

inmunidad celular y humoral.

El gen ha sido mapeado en la región Xq13.1.

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan Rodriguez-T

2012

1

2

3 3

IL-2

gcsubunidad especifica

JAK3JAK1

STATSTAT

44

gen

6nucleo

membrana celular

5

IL-4

IL-7

IL-9

IL-15 desarrollo celulas NK

hematopoyesis

desarrollo celulas T

diferenciacion celular B

homeostasis celular T periferica

IL-21 maduracion/activacion celular T/B/NK

IL-2R IL-4R IL-7R IL-9R IL-15R

bg g g g

g IL-15IL-9IL-7IL-4IL-2

b

a

JAK1 JAK1 JAK1

JAK1

a

JAK3 JAK3 JAK3 JAK3 JAK3

T cell

homeostasis

T cell

development

HaematopoiesisTerminal B cell

maturation

NK cell

development

JAK1

g

JAK3

IL-21

IL-21R

T/B/NK cells

activation

a

JAK1

Otras moleculas putativas involucradas en T-B+ SCID

debido a defectos de la transducción de señales de citoquinas

David Vetter

WILCO CONRADI

WILCO CONRADI

C:\Users\Juan Rodriguez-Tafur\Desktop\WILCO

En estos estudios, el ADNc γc se colocó bajo el control de la LTR vírica, y el MLVdefectuoso fue producido utilizando líneas celulares. Después de extensos estudiospreclínicos, 10 niños menores de 1 año se inscribieron entre 1999 y 2002 en un ensayodel gen SCID-X1 para terapia clínica.

En 9 de los 10 pacientes, la transferencia de genes γc en las células CD34 + resultó en laaparición linfocitos T y NK con el gen corregido. En 7 de los 9 pacientes que desarrollaronlas células T, y estas alcanzaron niveles normales al cabo de 3 meses y han permanecidoasí desde entonces, de acuerdo con los ultimos seguimientos.

Otros 2 pacientes sólo experimentan la reconstitución parcial de las células T,probablemente debido al menor número de células CD34 + con celulas γc + por kg querecibieron, lo que indica que una dosis umbral de células precursoras transducidas fuenecesario para lograr la reconstitución completa de las células T.

Ahora bien, 7.5 años más tarde, estos 7 pacientes mantener un sistema inmunefuncional, lo que les permite llevar una vida normal. La diversidad del repertorio decélulas T y las funciones de las células T se ha observado durante este período.

Ensayos terapéuticos con

el gen de SCID

Hasta la fecha, 17 de los 20 inscritos SCID-X1 pacientes han sido tratados con éxito enlos ensayos clínicos de Londres y París. Del mismo modo, la deficiencia de ADA tambiénse ha tratado con éxito utilizando un enfoque similar, que también se requiere laquimioterapia suave antes de someterse a la terapia génica. La inmunodeficiencia fueparcialmente o totalmente corregido en los 9 pacientes.

Se observó en la mayoría los vectores transgénicos integrados dentro de los genes.Esto podría ser una ventaja mejorando la transcripción del gen insertado.

Mutagénesis de inserción ocurrió en 3 pacientes con SCID-X1, la transferencia del genγc en las células CD34 + dio lugar a la proliferación clonal de células T que se convirtióen clínicamente evidente después de 3 años, lo que lleva a la muerte de un paciente,que fue controlado por la quimioterapia en otros 2 pacientes.

Estas complicaciones graves claramente son el resultado de la integración retroviralque condujo a una expresión aberrante del dominio del proto-oncogen LIM sólo 2(LMO2) en los 2 primeros casos observados.

Ensayos terapéuticos con

el gen de SCID

.

Mapa del gen LMO2 de activación de las inserciones de retrovirus vector.Los loci de inserción retroviral en las clonas de los primeros 2 casos de proliferaciónmonoclonal que se produjo en clonas de pacientes P4 y P5 se caracterizaron por PCR desecuenciación de la secuencia 5 'inserción fusión de la secuencia del gen LAM. Elpotenciador de la actividad el LTR provírico permitio la hiperexpresión de LMO2transcripciones de la esperada 3,3 kb de tamaño, así como la producción de una cantidadalta de proteína LMO2 normal.

Boy Living in Bubble Develops

Leukemia From Experimental Therapy

One of the first children in Britain to receive pioneering gene

therapy for an immune system disorder has developed

leukemia as a result of his treatment.

News of the Week

GENE THERAPY:

Second Child in French Trial Is Found to Have Leukemia

Eliot Marshall- For the second time in 4 months, a child has developed a

leukemia-like disease after receiving gene therapy at the Necker Hospital for

Sick Children in Paris. Concerned about the safety of such trials, the panel that

monitors U.S. research in the field scheduled a public meeting this week to

review the clinical data and weigh its next steps. Science 17 January 2003

El ensayo clinico se detuvo!

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan Rodriguez-T

2012

UPenn, Sept. 19, 1999, J. Wilson:in a trial with adenovirus mediated gene transfer to treat OTC

deficiency ornithine transcarbamylase ( (liver) one patient (Jesse

Gelsinger) died of a severe septic shock. Many trials were put on

hold for several months (years).

Cuatro lecciones amargas, pero solo un

tratamiento relacionado a muerte.

NY May 5, 1995, R. Crystal: in a trial with adenovirus mediated gene transfer to treat cystic

fibrosis (lung) one patient developed a mild pneumonia-like

condition and recovered in two weeks. The trial interrupted and

many others on hold.

Paris, Oct 2, 2002, A Fischer:in a trial with retrovirus mediated gene transfer to treat SCID

(bone marrow) one patient developed a leukemia-like condition.

The trial has been suspended to clarify the issue of insertional

mutagenesis, and some trials in US and Germany have been put

on hold.

Paris, Jan 14, 2003, A Fischer:a second patient of the cohort of 9 comes up with a similar

disease than the one reported in october 2002. 30 trials in USA

are temporarily suspended

Subidas y bajadas en el estado actual de la

Terapia Génica

Alto

Bajo

apre

cia

cio

n

reporte

NIH

Motulski

Lentivectores

en pre-clinica

Adeno III

J. Isner

ADA

R. Crystal

Adeno I

90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02

V.Dzau

A. Fischer

M. Kaylentivectores

en clinica?

C Bordignon

03

Eventos

Adversos

en

Paris

J. Wilson

J. Gelsinger

Fac. Med.

UNMSM

Dr. Juan Rodriguez-T

2012

TECNICAS EN BIOLOGIA

MOLECULAR

Southern Blot

Northern Blot

Westhern Blot

ELECTROFORESIS

Dogma central de la Biología Molecular

ADN ARN Proteína

Southern

Blot

Northern

Blot

Westhern

Blot

Edwin Southern

Oxford University, UK

Southern Blot

Propiedades estructurales del DNA

5’p OH3’

3’OH p5’

Las hebras de una molecula de DNA son Antiparalelas y complementarias

Complementaridad del DNA

T

A C

G T

A

T

A

C

G T

A

C

G C

GT

A

5’p

p 5’

OH3’

3’ OH

Puentes

Hidrógeno

T

A C

G T

A

T

A

C

G T

A

C

G C

GT

A

25°C

T G T T C A G CA

A C A A G T C GT

95°C

T

A C

G T

A

T

A

C

G T

A

C

G C

GT

A

25°C

Desnaturalización/reasociación del DNA

T

A C

G T

A

T

A

C

G T

A

C

G C

GT

A

25°C

T G T T C A G CA

A C A A G T C GT

25°C

T

A C

G T

A

T

A

C

G T

A

C

G C

GT

A

25°C

Desnaturalización/reasociación del DNA

T

A C

G T

A

T

A

C

G T

A

C

G C

GT

A

25°C

T G T T C A G CA

A C A A G T C GT

T

A C

G T

A

T

A

C

G T

A

C

G C

GT

A

25°C

Desnaturalización/reasociación del DNA

T

A C

G T

A

T

A

C

G T

A

C

G C

GT

A

25°C

T G T T C A G CA

A C A A G T C GT

95°C

T

A C

G T

A

T

A

C

G T

A

C

G C

GT

A

25°C

Desnaturalización/reasociación del DNA

T

A C

G T

A

T

A

C

G T

A

C

G C

GT

A

25°C

T G T T C A G CA

A C A A G T C GT

25°C

T

A C

G T

A

T

A

C

G T

A

C

G C

GT

A

25°C

Desnaturalización/reasociación del DNA

T G T T C A G CA

AC AAG T CG T

Reasociación solo con cadenas complementarias

Hibridación

• Es la unión de dos cadenas de ácidos nucleicos complementarias para formar un duplex o molécula de cadena doble.

• Posibles híbridaciones

DNA-DNA

DNA-RNA

RNA-RNA

dsDNA ssDNA apareamiento inicial

dsDNA

DesnaturalizaciónReasociación

Renaturalización

T° T°

Sondas

• Una sonda es un fragmento de DNA que:

– Se puede marcar para ser identificado y medido

– Se hibrida a un DNA gracias a su complementaridad

• Tipo de marcajes

– Radioactivo (32P, 35S, 14C, 3H)

– Fluorescente

– Biotinilación (avidina-streptavidina)

• Hibridación de DNA inmobilizado en filtros (nylon)

Southern Blot

Nucleasas

Endonucleasa

5’ Exonucleasa 3’ Exonucleasa

Southern Blot

Enzima de Restriccion

ADN de variostamaños

Electroforesis en gel de agarosa

gel

Desnaturalizar - transferir a papel filtro.

blot

Hibridizar con la sonda

Visualizar

Desnaturalizar- transferir a papel filtro.

blot

Southern (y Northern) blot:

1. Electroforesis

Southern (y Northern) blot:

2. Transferir a papel filtro/membrana

Southern (y Northern) blot:

3. Hibridización a una sonda única marcada

Slot Blot

Southern Blot

Northern Blot

•Técnicamente es muy similar al Southern Blot,

la gran diferencia es que el ácido nucleico

inmobilizado en la membrana es ARN.

•Se utiliza primordialmente para el estudio de

la expresión de mRNA.

Northern Blot

Expresión del RNA mensajero del

transportador de colina murino mCHT

Westhern Blot

•Proteínas inmovilizadas en una membrana

(usualmente nitrocelulosa)

•Esta vez se utiliza para detectar las

proteínas un anticuerpo que esta marcado

con una enzima o un fluorocromo.

Westhern Blot

Ejemplos de Western Blots

Inducción de la

expresión de

un proteína

Verificar la

identidad de

una proteína

Dx de

enfermedades

infecciosas

Señalización

celular

Técnica de RT-PCR

C:\Users\Juan Rodriguez-Tafur\Desktop\transcriptasa reversa

Electroforesis en gel de células individuales (SCGE) o

Ensayo Cometa

Ensayo Cometa:

• Desarrollado originalmente para

evaluar el daño sobre el ADN en

células individuales

(Östling y Johanson 1984).

• Modificado posteriormente para

detectar tipos específicos de daño en el

ADN.

Evaluación de los resultados:

Clasificación visual de los cometas:

-Las células se clasifican en 4 o 5 tipos (Collins y col.; Kobayashi y col.)

de acuerdo al grado de daño que presenten.

-Tipo I : -Tipo II:

no dañadas poco dañadas

-Tipo III : -Tipo IV:

dañadas muy dañadas.

Aplicaciones el ensayo:

• Estudios de Genotoxicidad

• Apoptosis

• Biomonitoreo ambiental

• Reparación del ADN

• Daño oxidativo

Muchas Gracias…….

Dr. Juan Rodríguez-Tafur Dávila

jrodriguezt@unmsm.edu.pe

rodrigueztafur@hotmail.com

rodrigueztafur@gmail.com