View
22
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
PROTEOMIKA U DIJAGNOSTICISOLIDNIH TUMORA
DANICA MATIŠIĆ
Medical
Diseases
Phenotypes Procedure /
ProtocolsDrug
InteractionNutrition
Patient profile
FunctionRole LocationStructure
PROTEOMIKA U DIJAGNOSTICI SOLIDNIH TUMORA
U genima je zapisan programrazvitka i djelovanja živog organizma,a proteini su molekule koje ostvaruju
genetički zapis.
ProteomesProteomes
Duplication
Population
Variation
Regulatory
Networks
Expression
Syntesy
Gene
GenomesGenomes
Somatic
Variation
Structure
OrthologsParalogs
Expression Pathways
InteractionsProteinStructure
Ni jedne ni druge molekule nisu žive, živa je samo cjelina
sastavljena od biopolimera, iona i metabolita koji su upleteni u složenu mrežu prostornih i
vremenskih interakcija čiji rezultat je život
Što je proteom? Prote in+ gen om proteom
Proteom je proteinski komplement genoma ioznačava proteine izražene genomomoznačava proteine izražene genomom
Proteom se mijenja - s vremenom- ovisno o lokaciji- ovisno o utjecaju okoliša
© 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter
Put od DNA do proteina
PROTEOMIKA-nauka koja se bavi proučavanjem struktura, funkcija,interakcija kao i ostalih faktoraunutar proteoma naziva se proteomika
Koristeći proteomiku i ostale –omike želi se:
- uspoređivanjem vidjeti, postoji li razlika u ekspresijskom profilu podtipova određenih tumora ili postoji li razlika u koncentraciji nekih proteina u stanicama koje su bile izložene djelovanju novih „pametnih“ eksperimentalnih lijekova;
- otkrivanjem potvrditi, postojanje određene podskupine gena ili proteina kod nekih bolesti karakterističnog ekspresijskog profila. Postoje tako podaci o otkrivanju nepoznate podvrste limfoma na temelju ekspresijskog profila pojedinih skupina gena;
- predviđanjem fenotipa, prema podacima dobivenih analizom ekspresijskog profila, procijeniti koji će bolesnik dobro podnijeti terapiju a koji će pokazivati teške simptome.
PROTEOMIKA
je složena tehnologija i objedinjuje veliki broj raznih metoda da bi se željeni proteini biomarkeri razdvojili iz smjese proteina, identificirali i karakterizirali.
Za kvalitativnu kao i kvantitativnu analizu razdvojenog Za kvalitativnu kao i kvantitativnu analizu razdvojenog proteomskog ekspresijskog profila koriste se mnogi sofisticirani instrumenti kao i posebni računalni programi.
Da bi se razdvojeni proteini identificirali koriste se metode mikrosekvencioniranja kao i masene spektrometrije. Svi se dobiveni podaci pohranjuju u posebnim bazama podataka a međusobne veze proteina i sekvence DNA kao i podaci o mapiranju obrađuje bioinformatika
METODE KOJE SE PRIMJENJUJU U PROTEOMICI
ključna zadaća proteomike:
-otkrivanje pojedinih biomarkera, koji nam pomažu dijagnosticirati razne bolesti kao što su tumori, autoimune ili infektivne bolesti, u ranoj fazi nastanka
Žive stanice u svakom trenutku sadrže tisuće različitih proteina te ako pojedine Žive stanice u svakom trenutku sadrže tisuće različitih proteina te ako pojedine proteine želimo analizirati moramo ih razdvojiti iz tih vrlo složenih smjesa na njihove komponente.
Za taj prvi korak koristi se - jednodimenzionalna SDS elektroforeza na poliakrilamidnom gelu
- 1 D SDS-PAGE-- dvodimenzionalna SDS elektroforeza na poliakrilamidnom gelu
– 2D SDS –PAGE-
- razdvaja složenije smjese. Dvodimenzionalnom elektroforezom možemo identificirati promjene u proteomu koje su nastale npr. zbog rasta tumora.
Dosadašnja iskustva pokazuju da je praćenje profila ekspresije nekog sustava proteina odjednom,
važnije od informacija o ponašanju bilo kojeg pojedinačnog genetičkog elementa.
1000 1500 2000
Mass (m/z)
Izdvajanje segmenta od interesa;pranje; razgradnja
2-D-elf; bojenje proteina;skeniranje
Mass (m/z)
Izdvajanje peptida;analiza mase
Pretraživanje baze podataka
2.3E+4
70
80
90
100
Spec #1 MC=>BC=>NR(2.00)[BP = 1161.7, 23082]
1161.6808
uzorak pre frakcioniranje razdvajanje procesiranje analiza informatika
PROTEOMIKA: redoslijed identifikacije proteina
799.0 1439.4 2079.8 2720.2 3360.6 4001.0
Mass (m/z)
00
10
20
30
40
50
60
% In
ten
sit
y
1795.9090
1149.5944
842.5437
896.5185 1193.61211553.6477
2211.14411055.5725
1409.74321196.68311932.9750
2396.1525 2780.98671986.9888 2226.17453338.7259
LC/analiza mase
Staničnakultura
Frakcije organela
Razdvajanje proteina Digestija
Baza podataka
– pretraživanje
799.0 1439.4 2079.8 2720.2 3360.6 4001.0
Mass (m/z)
0
2.3E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
ten
sit
y
Spec #1 MC=>BC=>NR(2.00)[BP = 1161.7, 23082]
1161.6808
1795.9090
1149.5944
842.5437
896.5185 1193.61211553.6477
2211.14411055.5725
1409.74321196.68311932.9750
2396.1525 2780.98671986.9888 2226.17453338.7259
Protein Identification, Instruments and Methodes, Dado Nemet, 2012.
METODE KOJE SE PRIMJENJUJU U PROTEOMICI
Osnovna kvalitativna i kvantitativna analitička tehnika za mjerenje širokog spektra klinički relevantnih proteina je
masena spektrometrija-MS
Masena spektrometrija je metoda koja može predstavljati samostalnipostupak za identificiranje biomarkera ili predstavlja drugi korak zaidentificiranje biomarkera nakon elektroforetskog razdvajanja proteina.
Masena spektrometrija-MS
MS je analitička metoda za razdvajanje ioniziranih molekula na osnovu razlike uomjeru mase i naboja – m/z
Radijus putanje (r) nabijene čestice koja se kreće kroz magnetno polje ovisi o gustoći magnetnog toka (B), naboju (z) i brzini čestice (v) pri čemu je centripetalna sila (Fc) koja djeluje na česticu uravnotežena silom magnetnog polja (Fm)
r = mvBz
Radijus putanja čestica jednakog naboja koje se kreću jednakom brzinom kroz magnetno polje konstantne jakosti su proporcionalni masi čestica što omogućuje da se
v2rFc = m
r =Bz
su proporcionalni masi čestica što omogućuje da se iz radijusa putanja čestica odrede njihove relativne mase
Fm = B z v m1 : m2 : m3 .... = r1: r2: r3
Molekule uzorka se najprije ioniziraju, zatim u električnom polju ubrzavaju i uvode u odabirač brzine koji se sastoji od električnog polja i na njega okomito postavljenog magnetnog polja. Kada su ova polja jednake jakosti kroz izlaz odabirača brzine mogu proći samo ioni određene brzine (v).
Fm = Bzv
Fe = E zv = E
B
Fe = sila električnog polja
Fm = sila magnetnog polja
E = jakost električnog polja
MASENA SPEKTROMETRIJA – MS se sastoji od 3 osnovna dijela
1.Izvor iona - fast Atom Bombardment – FAB - electrospray ionization – ESI- Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – MALDI- Surface –Enhanced Laser Desorption/ Ionization – SELDI- Surface –Enhanced Laser Desorption/ Ionization – SELDI
2.Analizator masa – Quadrupol – Q- Time of Flight – TOF- Tandem SM – QQQ; MS/Q; Q/TOF
3.Detektor - elektronsko pojačalo- scintilacijski brojač
Ionizacija
Analizator mase
Sortiranje mase (filtriranje)
Detektoriona
Detekcija
Izvor iona
Detektiraniioni
Stvaranje iona(nabijene molekule)
Sortiranje iona prema masi (m/z)
Osnovne komponente masene spektrometrije
Vakuum omotač
Ulaz uzorka
Uzorci:tekući - ESIkruti - MALDIplinoviti - GC
Detektiraniioni(nabijene molekule)
Relativna
gustoć
a
m/z50000 150000
MH+
(M+2H)2+
Spektar maseProcesuiranje podataka
High Voltage
charged droplets form
+ –
+ +
Vacuum Interface
Elektrosprej ionizacija - ESI (Electro Sprey Ionization) - izvor ionaje ionizacija koja ionizira analit u obliku otopine. Kao otopalo se koristi neka tvar koja je hlapljivija od analita. Otopljen analit stvara ione u otopini. Otopina se propušta kroz kapilaru u prostor pod vakuumom. Kada otopina uđe u evakuiranu komoru, ona se raspršuje u aerosol, zbog odbijanja iona u otopini. Otapalo isparava s kapljicama, ostavljajući ione analita. Ova tehnika se koristi za ionizaciju makromolekula, jer se one vrlo lako fragmentiraju
Sample Flow
Nebulizer Gas
++
++ –
++–
+
+
++
+
++
+
++
+
++
+
+
Ionsreleased
To MS
Spray
MALDI – TOF
- izvor iona
MALDI–TOF spektrometrija masa
1. Proteinski uzorak, uklopljen uodgovarajući matriks ionizira selaserom.
2. Električno polje ubrzava nastaleione na njihovu putu prema detektoruione na njihovu putu prema detektoru
3. Najlakši ioni stižu prvi
4. Ionizirajući laser pokreće sat kojimjeri vrijeme putovanja iona – timeof flight – TOF
Slika uzeta iz: J. T. Watson,Introduction to Mass Spectrometry,3d ed. (Lippincott-Raven, 1997), p.279.
5/11/2014 15
MALDI: Matrix Assisted Laser
Desorption Ionization
1. Sample (A) is mixed with
excess matrix (M) and dried
on a MALDI plate.
2. Laser flash ionizes matrix
molecules.
hνννν
LaserSample plate
molecules.
3. Sample molecules are ionized
by proton transfer from
matrix:
MH+ + A � M + AH+.
AH+
+20 kV
Variable Ground
Grid Grid
SELDI – TOF- izvor ionapoboljšanu MALDI metodu predstavlja SELDI (Surface-Enhanced Laser Desorption Ionization) metoda
Kemijski nosači
Biokem. nosači
hidrofobne mol. ioni hidrofilne mol. metali
receptor ligand enzim antitijela DNK protein
detektorlaser
TOF
- +
Analizator masa - kvadropol
Korištenjem radio frekvencije i voltaže direktne struje kvadropol funkcionira kao filter masa
Kvadropol se sastoji od:
•četiri paralelne, metalne valjkaste •četiri paralelne, metalne valjkaste elektrode od kojih dvije i dvije suprotne imaju isti naboj
•te promjenjivog elektromagnetskog polja koje omogućuje da jedan po jedan ion određenog m/z prođe duž osi kvadropola do pojačala detektora
•skenirati se mogu sve mase ili samo jedna fiksna masa
m1m3m4 m2m3
m1
m4
m2
Analizator masa - kvadropol
skeniranje svih masa
skeniranje samo jedne mase
m2 m2 m2 m2m3
m1
m4
m2
Analizator masa - TOF - Time of Flight - analizator se može koristiti za gotovo neograničen raspon molekulskih masa, vrlo je brz i ima ekstremno visoku osjetljivost. Ioni se u analizator unose direktno iz ESI ili MALDI uključivanjem jakog električnog akceleracijskog polja koje daje kinetičku energiju ionima. Ioni putuju kroz vakuumsku cijev do detektora, pri čemu su ioni sa manjim m/z brži pa dolazi do razdvajanja prema molekulskoj masi
Analizator masa -MS/MS: Tandem Mass Spectrometryomogućuje informacije o bazičnoj strukturi sastojaka smjese proteina
Ionizacija uzorka
Selekcija masa Fragmentacija
Analiza fragmenata
Primjenom dva ili više koraka analize masa, pomaknutih u određenom vremenskom razmaku- u istom instrumentu- razdvaja se iz smjese jedan analit od interesa, generiraju fragmenti te dobiva informacija o strukturi istog
Analizator masa -MS/MS: Tandem Mass Spectrometryomogućuje informacije o bazičnoj strukturi sastojaka smjese proteina
Laser, 200 Hz
Ionizacija Selekcija masaFragmentacija Analiza
fragmenata
Primjenom dva ili više koraka analize masa, pomaknutih u određenom vremenskom razmaku- u istom instrumentu- razdvaja se iz smjese jedan analit od interesa, generiraju fragmenti te dobiva informacija o strukturi istog
Analizator mase
skeniranje
772.913 Full MS scan
Analizator masa -MS/MS: Tandem Mass Spectrometryomogućuje informacije o bazičnoj strukturi sastojaka smjese proteina
SkeniranjeDissocijacijainduciranakolizijom - (CID)
Selekcijaiona
Product ion scan (product of 772.9)
MALDI TOF/TOF® Mass Spectrometer:
AutomatedSample Loader
FastSampleStage
Collision Cell
200 HzLaser Patented
MassAnalyzer
2-400 eV (@ m/z 1000 precursor)Maximum collision energy (CM frame)
0-2Average number of effective collisions
He, Ne, Kr, Ar, XeCollision gas0-3 keVCollision energy (Lab frame)Collision energy (Lab frame)
Ukupni ionski kromatogram organskih kiselina, spektri m/z iona u uzorku identificirani u SCAN modu
Ukupni ionski kromatogram (TIC, engl total ion chromatogram)organskih kiselina u urinu bolesnika s metilmalonskom acidemijom, SCAN mode
Perf
orm
ance
MALDIMALDI
OO--MALDIMALDI
Informatics Software andServices for Proteomics
Perf
orm
ance
ESIESIQ TRAPQ TRAP
Izvor iona
PRIMJENA PROTEOMIKE U DIJAGNOSTICI SOLIDNIH TUMORA
- Jedan od glavnih ciljeva onkologije je razvoj biomarkera koji biomogućili jednostavnim i manje invazivnim metodama rano
- identificirati potencijalni rizik razvoja raka - identificirati potencijalni rizik razvoja raka - precizno procijenjivanje stupnja bolesti- praćenjem terapije
Klinička istraživanja koriste SELDI – TOF - MS za otkrivanje s visokom osjetljivošću i specifičnošću različitih tipova karcinoma npr. pankreasa, kolorektalnog trakta, vrata maternice, dojke, mozga kao i razlikovanje raznih infektivnih bolesti.
PRIMJENA PROTEOMIKE U DIJAGNOSTICI SOLIDNIH TUMORA
Tumor pankreasa - ima vrlo lošu prognozu u kasnom kliničkom stadiju bolesti
Rezultati raznih istraživanja su pokazali da je SELDI MS korisna metoda u dijagnozi i otkrivanju tumora pankreasa
Tumor pankresa pokazuje najnižu stopu preživljavanja među solidnim tumorima pa je rana detekcija ključna za uspješno liječenje ove bolesti
Honda K. usporedio je plazma proteom između bolesnika s tumorom pankreasa i zdravihHonda K. usporedio je plazma proteom između bolesnika s tumorom pankreasa i zdravihkontrolnih ispitanika koristeći SELDI metodu u kombinaciji sa hibrid kvadropol TOF MS.
Ispitana je skupina od: 71 kontrolnog ispitanika i 71 bolesnika Pri tome su nađena četiri masena pika: kod 8766, 17272, 28080 i 14779 m/z čiji se
intenzitet značajno razlikovao (Mann-Witney U test, p< 0,01) te takoprecizno odvojio skupinu kontrolnih ispitanika od bolesnih sa osjetljivošću od
97,2 % i specifičnošću od 94,4 %.Ehmann M. je, uspoređujući 96 bolesnih ispitanika i 96 kontrolnih,pokazao da postojivrlo dobra sukladnost s rezultatima studije koju je proveo Honda K. Nađeni su pikovi kod
8700, 17270 i 28090 m/z što je vrlo blizu nalazima u studiji Honde.
Ovakvi rezultati dviju neovisnih studija afirmiraju SELDI TOF metodu kao pouzdanu metodu za profiliranje serum proteina.
PRIMJENA PROTEOMIKE U DIJAGNOSTICI SOLIDNIH TUMORA
Kolorektalni tumori su na trećem mjestu po smrtnosti među tumorima
- javljaju se jednako i kod muškaraca i kod žena. - pokazuju visoku agresivnost u napredovanju i visoki potencijal metastaziranja - vrlo važno rano otkrivanje samog tumora
SELDI metoda bila je provedena s biološkim materijalom kao što je serum, puna krv, urin,stolica ili uzorak tkiva. Rezultati različitih studija pokazali su za diferencijalne ekspresijeiste vrijednosti m/z u kolorektalnom tumoru, iako su korišteni čipovi različitih nosačaiste vrijednosti m/z u kolorektalnom tumoru, iako su korišteni čipovi različitih nosača
Nađeno je da promjene proteoma mogu biti detektirane u ranom stadiju - A i B Duke stad.
Ward D. G. je proveo studiju na uzorcima urina, koristeći kombinaciju SELDI i MALDI metode te pri tom izdvojio 19 pikova od početnih 100 koji su pokazali značajnu razliku među kontrolnim i bolesnim ispitanicima. Nađena je osjetljivost od 78 % i specifičnost od 87 %, pikovi s vrijednostima m/z od6086, 11750, 11960, 39480 i 53760 Da su pokazali vrlo dobru korelaciju sa ranimstadijima kolorektalnog tumora.
PRIMJENA PROTEOMIKE U DIJAGNOSTICI SOLIDNIH TUMORA
Tumori vrata maternice su treći po učestalosti kod žena starijih od 25 godina.
Pokazano je da humani papiloma virus (HPV), igra glavnu ulogu u razvoju tumora vrata maternice.
Melle C. je koristeći protein čip tehnologiju u analizi čistih mikro –rezova tumorskih stanica sa i bez HPV infekcije, našao rezova tumorskih stanica sa i bez HPV infekcije, našao diskriminirajući profil proteina koji razlikuje aktiviranu infekciju.
Studija je potvrdila onkogeni potencijal HPVa. proučavanjem rezultata različitih studija može se reći da su rezultatipokazali dobru korelaciju.
PRIMJENA PROTEOMIKE U DIJAGNOSTICI SOLIDNIH TUMORA
Tumor dojke je na drugom mjestu smrtnosti u ženskojpopulaciji
Rana detekcija tumora dojke je esencijalna u smanjenu smrtnosti
- nalaz profila proteina presudan za razlikovanje rizičnih bolesnica - pomoć u traženju individualizirane terapije
SELDI – TOF MS koristi različite uzorke od tkiva, plazme, seruma, aspirata bradavica do duktalnog lavažata
Profil proteina tkiva reflektira najranije promijene određenegenetičkim mutacijama koje dovode do tumora dojke
PRIMJENA PROTEOMIKE U DIJAGNOSTICI SOLIDNIH TUMORA
Prateći rezultate studija koje se provode, možemo reći dasu isto tako ohrabrujući rezultati nađeni i kod testiranjaostalih tumora kao što je tumor mozga, kože
SELDI – TOF metoda ima značajne prednosti u otkrivanjuSELDI – TOF metoda ima značajne prednosti u otkrivanjubiomarkera i služi kao „prva linija“ u otkrivanju istih ali se za jasniju identifikaciju i validaciju proteinskih profilačesto koristi u kombinaciji s 2 D elektroforezom kao iMALDI-TOF/TOF.
Može se zaključiti da je upotreba proteomike u otkrivanjubiomarkera tumora jedna od glavnih opcija
Recommended