PROTEOMIKA U DIJAGNOSTICISOLIDNIH TUMORA

DANICA MATIŠIĆ

Medical

Diseases

Phenotypes Procedure /

ProtocolsDrug

InteractionNutrition

Patient profile

FunctionRole LocationStructure

PROTEOMIKA U DIJAGNOSTICI SOLIDNIH TUMORA

U genima je zapisan programrazvitka i djelovanja živog organizma,a proteini su molekule koje ostvaruju

genetički zapis.

ProteomesProteomes

Duplication

Population

Variation

Regulatory

Networks

Expression

Syntesy

Gene

GenomesGenomes

Somatic

Variation

Structure

OrthologsParalogs

Expression Pathways

InteractionsProteinStructure

Ni jedne ni druge molekule nisu žive, živa je samo cjelina

sastavljena od biopolimera, iona i metabolita koji su upleteni u složenu mrežu prostornih i

vremenskih interakcija čiji rezultat je život

Što je proteom? Prote in+ gen om proteom

Proteom je proteinski komplement genoma ioznačava proteine izražene genomomoznačava proteine izražene genomom

Proteom se mijenja - s vremenom- ovisno o lokaciji- ovisno o utjecaju okoliša

© 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter

Put od DNA do proteina

PROTEOMIKA-nauka koja se bavi proučavanjem struktura, funkcija,interakcija kao i ostalih faktoraunutar proteoma naziva se proteomika

Koristeći proteomiku i ostale –omike želi se:

- uspoređivanjem vidjeti, postoji li razlika u ekspresijskom profilu podtipova određenih tumora ili postoji li razlika u koncentraciji nekih proteina u stanicama koje su bile izložene djelovanju novih „pametnih“ eksperimentalnih lijekova;

- otkrivanjem potvrditi, postojanje određene podskupine gena ili proteina kod nekih bolesti karakterističnog ekspresijskog profila. Postoje tako podaci o otkrivanju nepoznate podvrste limfoma na temelju ekspresijskog profila pojedinih skupina gena;

- predviđanjem fenotipa, prema podacima dobivenih analizom ekspresijskog profila, procijeniti koji će bolesnik dobro podnijeti terapiju a koji će pokazivati teške simptome.

PROTEOMIKA

je složena tehnologija i objedinjuje veliki broj raznih metoda da bi se željeni proteini biomarkeri razdvojili iz smjese proteina, identificirali i karakterizirali.

Za kvalitativnu kao i kvantitativnu analizu razdvojenog Za kvalitativnu kao i kvantitativnu analizu razdvojenog proteomskog ekspresijskog profila koriste se mnogi sofisticirani instrumenti kao i posebni računalni programi.

Da bi se razdvojeni proteini identificirali koriste se metode mikrosekvencioniranja kao i masene spektrometrije. Svi se dobiveni podaci pohranjuju u posebnim bazama podataka a međusobne veze proteina i sekvence DNA kao i podaci o mapiranju obrađuje bioinformatika

METODE KOJE SE PRIMJENJUJU U PROTEOMICI

ključna zadaća proteomike:

-otkrivanje pojedinih biomarkera, koji nam pomažu dijagnosticirati razne bolesti kao što su tumori, autoimune ili infektivne bolesti, u ranoj fazi nastanka

Žive stanice u svakom trenutku sadrže tisuće različitih proteina te ako pojedine Žive stanice u svakom trenutku sadrže tisuće različitih proteina te ako pojedine proteine želimo analizirati moramo ih razdvojiti iz tih vrlo složenih smjesa na njihove komponente.

Za taj prvi korak koristi se - jednodimenzionalna SDS elektroforeza na poliakrilamidnom gelu

- 1 D SDS-PAGE-- dvodimenzionalna SDS elektroforeza na poliakrilamidnom gelu

– 2D SDS –PAGE-

- razdvaja složenije smjese. Dvodimenzionalnom elektroforezom možemo identificirati promjene u proteomu koje su nastale npr. zbog rasta tumora.

Dosadašnja iskustva pokazuju da je praćenje profila ekspresije nekog sustava proteina odjednom,

važnije od informacija o ponašanju bilo kojeg pojedinačnog genetičkog elementa.

1000 1500 2000

Mass (m/z)

Izdvajanje segmenta od interesa;pranje; razgradnja

2-D-elf; bojenje proteina;skeniranje

Mass (m/z)

Izdvajanje peptida;analiza mase

Pretraživanje baze podataka

2.3E+4

70

80

90

100

Spec #1 MC=>BC=>NR(2.00)[BP = 1161.7, 23082]

1161.6808

uzorak pre frakcioniranje razdvajanje procesiranje analiza informatika

PROTEOMIKA: redoslijed identifikacije proteina

799.0 1439.4 2079.8 2720.2 3360.6 4001.0

Mass (m/z)

00

10

20

30

40

50

60

% In

ten

sit

y

1795.9090

1149.5944

842.5437

896.5185 1193.61211553.6477

2211.14411055.5725

1409.74321196.68311932.9750

2396.1525 2780.98671986.9888 2226.17453338.7259

LC/analiza mase

Staničnakultura

Frakcije organela

Razdvajanje proteina Digestija

Baza podataka

– pretraživanje

799.0 1439.4 2079.8 2720.2 3360.6 4001.0

Mass (m/z)

0

2.3E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sit

y

Spec #1 MC=>BC=>NR(2.00)[BP = 1161.7, 23082]

1161.6808

1795.9090

1149.5944

842.5437

896.5185 1193.61211553.6477

2211.14411055.5725

1409.74321196.68311932.9750

2396.1525 2780.98671986.9888 2226.17453338.7259

Protein Identification, Instruments and Methodes, Dado Nemet, 2012.

METODE KOJE SE PRIMJENJUJU U PROTEOMICI

Osnovna kvalitativna i kvantitativna analitička tehnika za mjerenje širokog spektra klinički relevantnih proteina je

masena spektrometrija-MS

Masena spektrometrija je metoda koja može predstavljati samostalnipostupak za identificiranje biomarkera ili predstavlja drugi korak zaidentificiranje biomarkera nakon elektroforetskog razdvajanja proteina.

Masena spektrometrija-MS

MS je analitička metoda za razdvajanje ioniziranih molekula na osnovu razlike uomjeru mase i naboja – m/z

Radijus putanje (r) nabijene čestice koja se kreće kroz magnetno polje ovisi o gustoći magnetnog toka (B), naboju (z) i brzini čestice (v) pri čemu je centripetalna sila (Fc) koja djeluje na česticu uravnotežena silom magnetnog polja (Fm)

r = mvBz

Radijus putanja čestica jednakog naboja koje se kreću jednakom brzinom kroz magnetno polje konstantne jakosti su proporcionalni masi čestica što omogućuje da se

v2rFc = m

r =Bz

su proporcionalni masi čestica što omogućuje da se iz radijusa putanja čestica odrede njihove relativne mase

Fm = B z v m1 : m2 : m3 .... = r1: r2: r3

Molekule uzorka se najprije ioniziraju, zatim u električnom polju ubrzavaju i uvode u odabirač brzine koji se sastoji od električnog polja i na njega okomito postavljenog magnetnog polja. Kada su ova polja jednake jakosti kroz izlaz odabirača brzine mogu proći samo ioni određene brzine (v).

Fm = Bzv

Fe = E zv = E

B

Fe = sila električnog polja

Fm = sila magnetnog polja

E = jakost električnog polja

MASENA SPEKTROMETRIJA – MS se sastoji od 3 osnovna dijela

1.Izvor iona - fast Atom Bombardment – FAB - electrospray ionization – ESI- Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – MALDI- Surface –Enhanced Laser Desorption/ Ionization – SELDI- Surface –Enhanced Laser Desorption/ Ionization – SELDI

2.Analizator masa – Quadrupol – Q- Time of Flight – TOF- Tandem SM – QQQ; MS/Q; Q/TOF

3.Detektor - elektronsko pojačalo- scintilacijski brojač

Ionizacija

Analizator mase

Sortiranje mase (filtriranje)

Detektoriona

Detekcija

Izvor iona

Detektiraniioni

Stvaranje iona(nabijene molekule)

Sortiranje iona prema masi (m/z)

Osnovne komponente masene spektrometrije

Vakuum omotač

Ulaz uzorka

Uzorci:tekući - ESIkruti - MALDIplinoviti - GC

Detektiraniioni(nabijene molekule)

Relativna

gustoć

a

m/z50000 150000

MH+

(M+2H)2+

Spektar maseProcesuiranje podataka

High Voltage

charged droplets form

+ –

+ +

Vacuum Interface

Elektrosprej ionizacija - ESI (Electro Sprey Ionization) - izvor ionaje ionizacija koja ionizira analit u obliku otopine. Kao otopalo se koristi neka tvar koja je hlapljivija od analita. Otopljen analit stvara ione u otopini. Otopina se propušta kroz kapilaru u prostor pod vakuumom. Kada otopina uđe u evakuiranu komoru, ona se raspršuje u aerosol, zbog odbijanja iona u otopini. Otapalo isparava s kapljicama, ostavljajući ione analita. Ova tehnika se koristi za ionizaciju makromolekula, jer se one vrlo lako fragmentiraju

Sample Flow

Nebulizer Gas

++

++ –

++–

+

+

++

+

++

+

++

+

++

+

+

Ionsreleased

To MS

Spray

MALDI – TOF

- izvor iona

MALDI–TOF spektrometrija masa

1. Proteinski uzorak, uklopljen uodgovarajući matriks ionizira selaserom.

2. Električno polje ubrzava nastaleione na njihovu putu prema detektoruione na njihovu putu prema detektoru

3. Najlakši ioni stižu prvi

4. Ionizirajući laser pokreće sat kojimjeri vrijeme putovanja iona – timeof flight – TOF

Slika uzeta iz: J. T. Watson,Introduction to Mass Spectrometry,3d ed. (Lippincott-Raven, 1997), p.279.

5/11/2014 15

MALDI: Matrix Assisted Laser

Desorption Ionization

1. Sample (A) is mixed with

excess matrix (M) and dried

on a MALDI plate.

2. Laser flash ionizes matrix

molecules.

hνννν

LaserSample plate

molecules.

3. Sample molecules are ionized

by proton transfer from

matrix:

MH+ + A � M + AH+.

AH+

+20 kV

Variable Ground

Grid Grid

SELDI – TOF- izvor ionapoboljšanu MALDI metodu predstavlja SELDI (Surface-Enhanced Laser Desorption Ionization) metoda

Kemijski nosači

Biokem. nosači

hidrofobne mol. ioni hidrofilne mol. metali

receptor ligand enzim antitijela DNK protein

detektorlaser

TOF

- +

Analizator masa - kvadropol

Korištenjem radio frekvencije i voltaže direktne struje kvadropol funkcionira kao filter masa

Kvadropol se sastoji od:

•četiri paralelne, metalne valjkaste •četiri paralelne, metalne valjkaste elektrode od kojih dvije i dvije suprotne imaju isti naboj

•te promjenjivog elektromagnetskog polja koje omogućuje da jedan po jedan ion određenog m/z prođe duž osi kvadropola do pojačala detektora

•skenirati se mogu sve mase ili samo jedna fiksna masa

m1m3m4 m2m3

m1

m4

m2

Analizator masa - kvadropol

skeniranje svih masa

skeniranje samo jedne mase

m2 m2 m2 m2m3

m1

m4

m2

Analizator masa - TOF - Time of Flight - analizator se može koristiti za gotovo neograničen raspon molekulskih masa, vrlo je brz i ima ekstremno visoku osjetljivost. Ioni se u analizator unose direktno iz ESI ili MALDI uključivanjem jakog električnog akceleracijskog polja koje daje kinetičku energiju ionima. Ioni putuju kroz vakuumsku cijev do detektora, pri čemu su ioni sa manjim m/z brži pa dolazi do razdvajanja prema molekulskoj masi

Analizator masa -MS/MS: Tandem Mass Spectrometryomogućuje informacije o bazičnoj strukturi sastojaka smjese proteina

Ionizacija uzorka

Selekcija masa Fragmentacija

Analiza fragmenata

Primjenom dva ili više koraka analize masa, pomaknutih u određenom vremenskom razmaku- u istom instrumentu- razdvaja se iz smjese jedan analit od interesa, generiraju fragmenti te dobiva informacija o strukturi istog

Analizator masa -MS/MS: Tandem Mass Spectrometryomogućuje informacije o bazičnoj strukturi sastojaka smjese proteina

Laser, 200 Hz

Ionizacija Selekcija masaFragmentacija Analiza

fragmenata

Primjenom dva ili više koraka analize masa, pomaknutih u određenom vremenskom razmaku- u istom instrumentu- razdvaja se iz smjese jedan analit od interesa, generiraju fragmenti te dobiva informacija o strukturi istog

Analizator mase

skeniranje

772.913 Full MS scan

Analizator masa -MS/MS: Tandem Mass Spectrometryomogućuje informacije o bazičnoj strukturi sastojaka smjese proteina

SkeniranjeDissocijacijainduciranakolizijom - (CID)

Selekcijaiona

Product ion scan (product of 772.9)

MALDI TOF/TOF® Mass Spectrometer:

AutomatedSample Loader

FastSampleStage

Collision Cell

200 HzLaser Patented

MassAnalyzer

2-400 eV (@ m/z 1000 precursor)Maximum collision energy (CM frame)

0-2Average number of effective collisions

He, Ne, Kr, Ar, XeCollision gas0-3 keVCollision energy (Lab frame)Collision energy (Lab frame)

Ukupni ionski kromatogram organskih kiselina, spektri m/z iona u uzorku identificirani u SCAN modu

Ukupni ionski kromatogram (TIC, engl total ion chromatogram)organskih kiselina u urinu bolesnika s metilmalonskom acidemijom, SCAN mode

Perf

orm

ance

MALDIMALDI

OO--MALDIMALDI

Informatics Software andServices for Proteomics

Perf

orm

ance

ESIESIQ TRAPQ TRAP

Izvor iona

PRIMJENA PROTEOMIKE U DIJAGNOSTICI SOLIDNIH TUMORA

- Jedan od glavnih ciljeva onkologije je razvoj biomarkera koji biomogućili jednostavnim i manje invazivnim metodama rano

- identificirati potencijalni rizik razvoja raka - identificirati potencijalni rizik razvoja raka - precizno procijenjivanje stupnja bolesti- praćenjem terapije

Klinička istraživanja koriste SELDI – TOF - MS za otkrivanje s visokom osjetljivošću i specifičnošću različitih tipova karcinoma npr. pankreasa, kolorektalnog trakta, vrata maternice, dojke, mozga kao i razlikovanje raznih infektivnih bolesti.

PRIMJENA PROTEOMIKE U DIJAGNOSTICI SOLIDNIH TUMORA

Tumor pankreasa - ima vrlo lošu prognozu u kasnom kliničkom stadiju bolesti

Rezultati raznih istraživanja su pokazali da je SELDI MS korisna metoda u dijagnozi i otkrivanju tumora pankreasa

Tumor pankresa pokazuje najnižu stopu preživljavanja među solidnim tumorima pa je rana detekcija ključna za uspješno liječenje ove bolesti

Honda K. usporedio je plazma proteom između bolesnika s tumorom pankreasa i zdravihHonda K. usporedio je plazma proteom između bolesnika s tumorom pankreasa i zdravihkontrolnih ispitanika koristeći SELDI metodu u kombinaciji sa hibrid kvadropol TOF MS.

Ispitana je skupina od: 71 kontrolnog ispitanika i 71 bolesnika Pri tome su nađena četiri masena pika: kod 8766, 17272, 28080 i 14779 m/z čiji se

intenzitet značajno razlikovao (Mann-Witney U test, p< 0,01) te takoprecizno odvojio skupinu kontrolnih ispitanika od bolesnih sa osjetljivošću od

97,2 % i specifičnošću od 94,4 %.Ehmann M. je, uspoređujući 96 bolesnih ispitanika i 96 kontrolnih,pokazao da postojivrlo dobra sukladnost s rezultatima studije koju je proveo Honda K. Nađeni su pikovi kod

8700, 17270 i 28090 m/z što je vrlo blizu nalazima u studiji Honde.

Ovakvi rezultati dviju neovisnih studija afirmiraju SELDI TOF metodu kao pouzdanu metodu za profiliranje serum proteina.

PRIMJENA PROTEOMIKE U DIJAGNOSTICI SOLIDNIH TUMORA

Kolorektalni tumori su na trećem mjestu po smrtnosti među tumorima

- javljaju se jednako i kod muškaraca i kod žena. - pokazuju visoku agresivnost u napredovanju i visoki potencijal metastaziranja - vrlo važno rano otkrivanje samog tumora

SELDI metoda bila je provedena s biološkim materijalom kao što je serum, puna krv, urin,stolica ili uzorak tkiva. Rezultati različitih studija pokazali su za diferencijalne ekspresijeiste vrijednosti m/z u kolorektalnom tumoru, iako su korišteni čipovi različitih nosačaiste vrijednosti m/z u kolorektalnom tumoru, iako su korišteni čipovi različitih nosača

Nađeno je da promjene proteoma mogu biti detektirane u ranom stadiju - A i B Duke stad.

Ward D. G. je proveo studiju na uzorcima urina, koristeći kombinaciju SELDI i MALDI metode te pri tom izdvojio 19 pikova od početnih 100 koji su pokazali značajnu razliku među kontrolnim i bolesnim ispitanicima. Nađena je osjetljivost od 78 % i specifičnost od 87 %, pikovi s vrijednostima m/z od6086, 11750, 11960, 39480 i 53760 Da su pokazali vrlo dobru korelaciju sa ranimstadijima kolorektalnog tumora.

PRIMJENA PROTEOMIKE U DIJAGNOSTICI SOLIDNIH TUMORA

Tumori vrata maternice su treći po učestalosti kod žena starijih od 25 godina.

Pokazano je da humani papiloma virus (HPV), igra glavnu ulogu u razvoju tumora vrata maternice.

Melle C. je koristeći protein čip tehnologiju u analizi čistih mikro –rezova tumorskih stanica sa i bez HPV infekcije, našao rezova tumorskih stanica sa i bez HPV infekcije, našao diskriminirajući profil proteina koji razlikuje aktiviranu infekciju.

Studija je potvrdila onkogeni potencijal HPVa. proučavanjem rezultata različitih studija može se reći da su rezultatipokazali dobru korelaciju.

PRIMJENA PROTEOMIKE U DIJAGNOSTICI SOLIDNIH TUMORA

Tumor dojke je na drugom mjestu smrtnosti u ženskojpopulaciji

Rana detekcija tumora dojke je esencijalna u smanjenu smrtnosti

- nalaz profila proteina presudan za razlikovanje rizičnih bolesnica - pomoć u traženju individualizirane terapije

SELDI – TOF MS koristi različite uzorke od tkiva, plazme, seruma, aspirata bradavica do duktalnog lavažata

Profil proteina tkiva reflektira najranije promijene određenegenetičkim mutacijama koje dovode do tumora dojke

PRIMJENA PROTEOMIKE U DIJAGNOSTICI SOLIDNIH TUMORA

Prateći rezultate studija koje se provode, možemo reći dasu isto tako ohrabrujući rezultati nađeni i kod testiranjaostalih tumora kao što je tumor mozga, kože

SELDI – TOF metoda ima značajne prednosti u otkrivanjuSELDI – TOF metoda ima značajne prednosti u otkrivanjubiomarkera i služi kao „prva linija“ u otkrivanju istih ali se za jasniju identifikaciju i validaciju proteinskih profilačesto koristi u kombinaciji s 2 D elektroforezom kao iMALDI-TOF/TOF.

Može se zaključiti da je upotreba proteomike u otkrivanjubiomarkera tumora jedna od glavnih opcija