UNIVERZITET U TUZLI

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

ODSJEK: HEMIJA

Masena spektrometrija u identifikaciji i karakterizaciji proteina

(TOF i MALDI spektroskopija)

Masena spektrometrija (Mass spectrometry - MS) je analitička metoda za razdvajanjeioniziranih molekula na osnovu razlike u omjeru mase i naboja (m/z).

Radijus putanje (r) nabijene čestice koja se kreće kroz magnetno polje ovisi o gustoćimagnetnog toka (B), naboju (z) i brzini čestice (v) pri čemu je centripetalna sila (Fc)koja djeluje na česticu uravnotežena silom magnetnog polja (Fm).

Radijusi putanja čestica jednakog naboja koje se kreću jednakom brzinom krozmagnetno polje konstantne jakosti su proporcionalni masi čestica što omogućujeda se iz radijusa putanja čestica odrede njihove relativne mase.m1 : m2 : m3 : ..... = r1 : r2 : r3 : .....

Molekule uzorka se najprije ioniziraju, zatim u električnom polju ubrzavaju i uvode uodabirač brzine koji se sastoji od električnog polja i na njega okomito postavljenogmagnetnog polja. Kada su ova polja jednake jakosti kroz izlaz odabirača brzine mogu proći samo ioni određene brzine (v).proći samo ioni odrenene brzine (v).

Ioni iste brzine nadalje kroz magnetno polje putuju zakrivljenim putanjama čiji se radijusiodnose kao njihove mase i konačno detektiraju na kolektoru koji se pomiče cijelomširinom polja.U drugoj izvedbi MS mijenja se jakost napona (i/ili magnetnog polja) tako da ioni različitihmasa imaju jednaku putanju (fiksni položaj detektora) pa se iz odnosa veličina naponapri kojima dolaze do detektora izračuna odnos njihovih masa.

2

3

1. Ionizatori

Uzorci se u ionizator mogu unositi direktno ili se prije razdvojiti na komponente nekomkromatografskom metodom (HPLC, GC, CE).Metode ionizacije se razlikuju ovisno o sastavu uzorka i njegovom afinitetu za primanjeodnosno otpuštanje protona. Tako se proton akceptori (npr. proteini, peptidi i sl.) prevodeu kationski, a proton donori (npr. šećeri, oligonukleotidi i sl.) u anionski oblik.Tijekom ionizacije se mogu dobiti jednostruko ili višestruko nabijene molekule ovisno obroju grupa koje mogu ionizirati.Količine i koncentracije uzorka potrebne za analizu se razlikuju ovisno o metodi koja sekoristi (1 – 10 μl otopine; koncentracije 1 fmol – 10 pmol).

1.1.Fast Atom Bombardment (FAB) je najstarija blaga ionizacijska metoda koja se koristiza velike biološke molekule koje teško prelaze u plinovito stanje.Uzorak se otopi u nehlapivom matriksu i nanese na metalnu pločicu u ionizatoru te bombardira fokusiranom zrakom atoma (Xe, Cs+, glicerol-NH4+). Udar zrake dovodi do raspršivanja molekula uzorka i matriksa u plinovitu fazu pri čemu se glavnina energije potroši na molekulama matriksa pa ne dolazi do značajnijeg frakcioniranja molekula uzorka. Istodobno dolazi do ionizacije molekula uzorka.

4

1.2.Electrospray Ionization (ESI) se koristi za velike biološke molekule koje teško prelazeu plinovito stanje i ioniziraju.Uzorak se otopi u polarnom hlapivom otapalu i pod visokim tlakom, brzinom 1–20 μl/min,tjera kroz kapilaru na čiji je vrh priključeno jako električno polje (3-4 kV). Na izlazu izkapilare se uzorak raspršuje u aerosol jako nabijenih kapi koje se zatim provode krozstruju vrućeg plina pri čemu otapalo isparava pa se kapi raspršuju u još sitnije kapljicesve dok se ne dobiju pojedinačne ionizirane molekule.

1.3.Matrtix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI)( matricom potpomognuta laserska desorpcija/ionizacija), je slabo invanzivna metoda za ionizaciju molekula koristi se za termolabilne, nehlapive molekule velike molekulske mase. Kao matrica se koriste otopine određenih tvari u smjesi vode i organskog otapala. Analit je otopljen u matrici. Na matricu se djeluje laserom, najčešće dušikovim laserom. Matrica štiti analit od lasera, a njezinim isparavanjem i ionizacijom, ona prenosi dio naboja na analit, ionizirajući ga. MALDI tehnika je pogodna za ionizaciju biomolekula i velikih organskih molekula.

5

Uzorci su učitani na metalne ploče za analizu na instrumentu.  Uzorak koncentracija od 1 mg / ml je idealan i obično je za analizu potrebno od jednan do deset picomola. Uzorak se pomješa sa matriksom ( u omjeru 1:1000), nanese na pločicu u analizatoru ina njega usmjeri laserska zraka (dušikov, UV ili IR laser) pri čemu glavninu energijeapsorbira matriks koji se zbog toga brzo zagrijava. Uzorak pri tome isparava i ionizira se.Postoji mnogo različitih matrica koje se mogu koristiti za MALDI. Neki od najčešćih su Sinapinska kiselina (SK) za uzorak proteina, alfa-cijano-4-hidroksicinamic kiselina (ACH) za uzorak peptida, a 09:01 mješavina 2,5-Dihidroksibenzoična kiselina i 2-hidroksi-5- metoksbenzoic kiselina (sDHB) za uzorke ugljikohidrata i proteina. 

MALDI tehnologija ima različitu primjenu u područiju biohemije. Može se koristiti za lako praćenje I optimiziranje enzimske probave, za karakterizaciju protein ili se mogu koristiti za kontrolu kvaliteta u sintezi peptide.  MALDI je bio također korišten kao metoda sekvencioniranja N-terminal i terminal C-proteina / peptide.

6

2. AnalizatoriRazličiti tipovi analizatora se razlikuju prema principu rada, opsegu razdvajanja m/z,preciznosti i rezoluciji.Rezolucija (R) je sposobnost analizatora da razdvoji ione bliskih m/z omjera.

7

2.1.Quadrupol (Q) analizator se sastoji od 4 metalna štapića rasporenena u dva okomitopoložena para. Jedan par štapića je spojen na odreneni konstantni napon i promjenjivuradiofrekvenciju, a drugi ima napon i radiofrekvenciju suprotne polarnosti. Ioni prolazekroz središte kvadrupola i pri datim uvjetima napona i frekvencije samo ioni odrenenogomjera m/z imaju stabilnu putanju i prolaze do detektora. Frekvencija se varira kako bise ioni različitih m/z doveli u fokus detektora. Opseg m/z koji se mogu analizirati naovaj način ovisi o duljini i promjeru štapića.

8

2.2.Time of Flight (TOF) analizator se može koristiti za gotovo neograničen rasponmolekulskih masa, vrlo je brz i ima ekstremno visoku osjetljivost. TOF analizator (engl. Time of flight) ubrzava jone iz jonizatora pomoću homogenog električnog polja. Lakši joni se jače ubrzavaju i prvi dolaze do detektora. Pretraživanje je ostvareno kašnjenjem težih jona iz analizatora. Zbog toga je ova metoda brza, ali ima manje razlučivanje od električnog ili magnetskog sektora. Ioni se u analizator unose direktno iz ESI ili MALDI uključivanjem jakog električnog akceleracijskog polja koje daje kinetičku energiju ionima. Ioni putuju kroz vakuumsku cijev do detektora, pri čemu su ioni sa manjim m/z brži pa dolazi do razdvajanja prema molekulskoj masi.

9

U svrhu poboljšanja rezolucije i preciznosti mjerenja može se pri kraju cijevi ugraditi serijaelektričkih polja (tzv. ionsko ogledalo ili reflekton) koja odbijaju ione nazad u cijev pododrenenim kutom te se ioni konačno fokusiraju na reflektronskom detektoru.

10

2.3.Tandem MS (MS/MS ; QQQ; MS/Q ; Q/TOF itd.) je spoj dvaju ili više analizatora useriju pri čemu se mogu koristiti istovrsni ili kombinacije različitih tipova analizatora.Najčešće se koriste dva analizatora izmenu kojih se nalazi komora za fragmentaciju ukojoj se ioni uzorka bombardiraju molekulama inertnog plina pri čemu dolazi dofragmentacije iona uzorka (Collision Induced Dissociation CID).Na ovaj način mogu se dobiti informacije o strukturi molekula i detektirati odrenenispojevi u složenim smjesama na osnovu njihovog specifičnog uzorka fragmentiranja.Upotreba MS u analitici proteina: - identifikacija proteina- odrenivanje čistoće uzorka- detekcija supstitucija aminokiselina- praćenje postsintetskih modifikacija- odrenivanje broja disulfidnih veza- praćenje enzimskih reakcija- praćenje razgradnje i kemijskih modifikacija proteina- potvrnivanje sekvence (karakterizacija peptida)- praćenje smatanja proteina- detekcija ligand-protein interakcija- odrenivanje makromolekulske strukure protein

Postupak identifikacije proteina:1. određivanje mase cijele molekule (ESI –TOF)2. proteoliza proteina na peptide veličine do 2500 Da3. očitavanje mase peptida (ESI-TOF) u smjesi (˝mapa petida˝ ili ˝MS fingerprint˝)4. ponovno propuštanje peptida u tandem MS/MS modu (ESI Q-TOF) uključujućifragmentaciju peptida (CID) što omogućuje odrenivanje sekvence peptida5. pretraživanje baza podataka posebnim algoritmima

11

Sekvenciranje peptida (˝Protein Ladder Sequencing˝ ) veličine do 30 aminokiselinskihostataka može se provesti kombinacijom Edmanove odgradnje i analize smjese peptidapomoću MALDI -TOF MS.Od otkrića elektroraspršenja (ESI) i matricom pomognute ionizacije uz desorpciju laserskim zra čenjem (MALDI) spektrometrija masa postala je iznimno važna tehnika u analizi bioloških makromolekula. Tačno određivanje mase peptida ili proteina omogućuje identifikaciju proteina, određivanje aminokiselinskog slijeda, identifikaciju i određivanje položaja posttranslacijske modifikacije (glikozilacija, nastajanje disulfidnih mostova, fosforilacija itd.), određivanje mutacija te provjeru strukture i čistoće proteina dobivenih genetskim inženjeringom. Nadalje, spektrometrija masa primjenjuje se i u istraživanju različitih interakcija između proteina i iona metala, malih organskih molekula i različitih bioloških spojeva. Određuje se stehiometrija nastalih nekovalentnih kompleksa, afinitet i konformacijske promjene povezane s navedenim interakcijama. Spektrometrija masa široko se primjenjuje u farmaceutskoj industriji u ispitivanju malih organskih molekula kao potencijalnih lijekova ali i biofarmaceutika, većinom rekombinantnih proteina kao npr. inzulina, interferona itd. U tu svrhu koriste se spektri masa kao i spektri dobiveni tandemnom spektrometrijom masa, MS/MS ili MSn.Granica određivanja bioloških spojeva tehnikama MALDI i ESI nalazi se između femtomola i pikomola, a ovisi o prirodi uzorka, načinu priprave i čistoći uzorka. Biološki uzorci obično su razrijeđene otopine peptida ili proteina i onečišćenja (nehlapljivi puferi, detergenti, soli itd.). Onečišćenja mogu smanjiti ili u potpunosti prigušiti intenzitet željenog iona, grade adukte s ionima analita i time utječu na osjetljivost ali i na tačnost metode ukoliko ioni adukta nisu dovoljno dobro odijeljeni od iona analita.

12

3.MALDI-TOF Mass AnalizaMatrix Assisted Graovac / ionizaciju Time-of-Let (MALDI-TOF) je tehnika masene analize koju je razvio profesor Franz Hillenkamp i dr. Michael Karas na Sveučilišta u Münsteru u Njemačkoj. Objekt ima Perseptive Biosystems (Primijenjena Biosystems) Voyager DE-PRO. MALDI nudi brz i jednostavan način masovno analize koristeći minimalnu količinu uzorka. Prncipi koji su uključeni u analizi MALDI-TOF mase može se vidjeti na slici:

13

SADRŽAJ:

Masena spektrometrija.....................................................................................................................21.Ionizatori...........................................................................................................................41.1.Fast Atom Bombardment(FAB).........................................................................................41.2.Electrospray Ionization(ESI)............................................................................................51.3.Matrix Assisted Desorption/Ionization(MALDI)...................................................................52.Analizatori........................................................................................................................72.1.Quadrupol(Q)..............................................................................................................................82.2.Time of Flight(TOF)analizator........................................................................................92.3.Tandem MS...........................................................................................................................113.MALDI-TOF Masena Analiza...........................................................................................13

14